Summary
Plante morfoogene gener kan bruges til at forbedre genetisk transformation af genstridige genotyper. Beskrevet her er en Agrobacterium-medieretgenetisk transformation (QuickCorn) protokol for tre vigtige offentlige majs indavlede linjer.
Abstract
Demonstreret her er en detaljeret protokol for Agrobacterium-medieretgenetisk transformation af majs indavlede linjer ved hjælp af morfoogene gener Baby boom (Bbm) og Wuschel2 (Wus2). Bbm reguleres af promotoret til overførsel af majsphospholipid (Pltp),og Wus2 er under kontrol af en promotor for majs auxin-inducible (Axig1). En Agrobacterium stamme transporterer disse morfoogene gener på overførsel DNA (T-DNA) og ekstra kopier af Agrobacterium virulens (vir)gener bruges til at inficere majs umodne embryo explants. Somatiske embryoner dannes på scutella af inficerede embryoner og kan vælges ved herbicid resistens og spiret ind i planter. Et varmeaktiveret cre/loxP-rekombinationssystem, der er indbygget i DNA-konstruktionen, giver mulighed for fjernelse af morfoogene gener fra majsgenomet under et tidligt stadium af transformationsprocessen. Der kan opnås transformationsfrekvenser på henholdsvis ca. 14 %, 4 % og 4 % (antal uafhængige transgene hændelser pr. 100 inficerede embryoner) for henholdsvis W22, B73 og Mo17 ved hjælp af denne protokol.
Introduction
Transformation er et grundlæggende redskab til evaluering af fremmede genekspression i majs og fremstilling af genetisk modificerede majslinjer til både forskning og kommercielle formål. Adgang til høj gennemløbstransformation kan lette det øgede behov for undersøgelser af molekylær og cellulær majsbiologi1. Evnen til genetisk at omdanne plantearter er afgørende for både offentlige og private laboratorier. Dette giver både grundlæggende forståelse af genreguleringsmekanismer samt afgrødeforbedring på globalt plan for at støtte en stadigt voksende befolkning.
Opdagelsen af, at umodne embryoner fra majs kan anvendes til fremstilling af genanvendelige callus, stammer fra 19752. Siden denne åbenbaring, har de fleste skalerbare majs transformation protokoller kræves hård formation og udvælgelse forud for regenerering3. Under processen med genetisk transformation dyrkes Agrobacterium-inficeredeeller biolistiske-bombarderede umodne embryoner på medier til embryogene callus induktion. Inducerede calli er derefter dyrket på selektive medier (f.eks indeholdende et herbicid), således at kun transformerede hård stær stykker er i stand til at overleve. Disse herbicidresistente transgene calli er bulked op og regenereret til planter. Mens denne metode er effektiv, processen er lang og arbejdskrævende, og det kan tage op mod 3 måneder at fuldføre4. Endnu vigtigere er det, at konventionelle majstransformationsprotokoller har en langt større begrænsning,dvs.
Lowe et al.7,8 tidligere rapporteret en "QuickCorn" transformation metode, der ikke kun stærkt reduceret varigheden af transformationsprocessen, men også udvidet listen over transformerbare genotyper. QuickCorn-metoden anvender majsorthologs (Zm-Bbm og Zm-Wus2) af Arabidopsis transskription faktorer BABY BOOM (BBM)9 og WUSCHEL (WUS)10. Når disse gener indarbejdes i transformationsvektorsystemet, arbejder de synergistisk for at stimulere embryoogvækst7.
QuickCorn-protokollen, der er beskrevet i dette arbejde, var baseret på protokollen i Jones et al11, som var en yderligere forbedring af den metode , der blev rapporteret af Lowe etal. 7,8. I denne undersøgelse, en Agrobacterium stamme LBA4404 (Thy-) huser en binær vektor konstruktion PHP81430 (Figur 1) og tilbehør plasmid PHP7153912 bruges til transformation. T-DNA af PHP81430 indeholder følgende molekylære komponenter. (1) Transformationselektiv markør gen Hra udtryk kassette. Dette majs-Hra- (Zm-Hra-)gen er et modificeret acetolaktasesyntase-syntase (ALS), der er tolerant over for ALS-hæmmende herbicider såsom sulfonylureas og imidazolinoner13,14. Zm-Hra-genet reguleres af sorghum ALS-promotor8 og kartoffelproteinasehæmmer En II(pinII) terminator15. T-DNA indeholder også (2) et udtryk kassette besidder transformation screenable markør gen ZsGreen. Denne grønne fluorescerende protein gen ZsGreen fra Zoanthus sp. reef koral16 er reguleret af en sorghum ubiquitin promotor / intron og ris ubiquitin terminator.
Derudover indeholder T-DNA(3) det morfoogene genBbm ekspressionskassette. Bbm er en transskriptionsfaktor i forbindelse med embryoudvikling9,17. Bbm reguleres af majsfosfolipid transferase protein (Pltp) promotor8 og ris T28 terminator18. Zm-Pltp er et gen med stærkt udtryk i embryoscutellar epitel, silkehår og bladdatterselskabsceller (flankerende beskyttelsescellerne), lavt udtryk i reproduktive organer og intet udtryk i rødder8. Den indeholder også (4) det morfoogene gen Wus2 ekspressionskassette. Wus2 er en anden transskription faktor forbundet med vedligeholdelse af den apical meristem19. Zm-Wus2 er under kontrol af en majs auxin-utilgængelig promotor (Zm-Axig1)20 og majs In2-1 terminator21. Endelig indeholder T-DNA (5) cre-loxP rekombinationssystemet. Cre recombinase genet 22 er under kontrol af majs varmechok protein 17,7 (Hsp17.7)23 promotor og kartoffel pinII terminator. To loxP-steder (i samme retning)24 flanke fire genekspressionkassetter, herunder ZsGreen, cre, Bbm og Wus2.
Da tilstedeværelsen af morfoogene gener ikke ønskes for plantemodenhed og efterfølgende afkom, blev det varmeinducerede cre-loxP-rekombinationssystem indbygget i T-DNA'et for at fjerne morfoogene gener fra majsgenomet for at muliggøre normal callus regenerering og planteudvikling. Ved varmebehandling fjerner udtrykket CRE-protein alle transgener bortset fra Hra-markeringsgenet. Succesfulde transformatorer bør være herbicid-resistente, men ZsGreen-negativ. For yderligere at forbedre transformation frekvens, Agrobacterium stamme også havne en ekstra tilbehør plasmid (PHP71539), der har ekstra kopier af Agrobacterium virulence (vir) gener12.
QuickCorn-metoden er forskellig fra konventionelle majstransformationsprotokoller, da den ikke indebærer et callus induktionstrin under transformationen. I løbet af den første uge efter infektion med Agrobacterium,somatiske embryoner udvikle på scutellar epitel af de inficerede umodne embryoner. Embryonerne overføres derefter til et medium med hormoner, der fremmer fostermodning og skydedannelse. Overførsel af de somatiske embryoner til modnings-/skydedannelsesmediet springer hurtigt over den traditionelle hårdmodenfase , der tidligere blev anvendt til omdannelse af majs, og tillader direkte produktion af T0-planter8. Sammenlignet med tidligere offentliggjorte majs transformationmetoder6, QuickCorn metode er hurtigere, mere effektiv, og mindre genotype-afhængige. Ved hjælp af denne metode, rodfæstede planter er typisk klar til at overføre til jord på bare 5-7 uger, snarere end de tre eller flere måneder, der kræves af traditionelle protokoller. Formålet med denne artikel er at give en dybdegående beskrivelse og demonstration af metoden, der giver mulighed for lettere replikering i et laboratorium indstilling typisk findes i de fleste akademiske institutioner.
Protocol
1. Forberedelse af vækstmedier
- For nøjagtige vækst medium opskrifter til denne protokol, henvises til tabel 1.
- Til forberedelse 1 L af medier, placere en 2 L bæger på en røre plade og placere en røre bar indeni.
- Fyld bægerglas med 900 ml destilleret vand, og tænd for rørepladen. Rørestangen skal dreje med medium hastighed.
- Veje alle pulveriserede ingredienser og opløses i et bægerglas.
- Mål alle flydende ingredienser, hvis nogen, og tilsæt til bægeret.
- Bring det endelige volumen til 1 L ved hjælp af destilleret vand.
- Mål pH og justere til opskrift specifikationer.
- Hvis der formuleres et flydende vækstmedium, tilsættes der ingen agar. Fastgør en filtersterilisator til en vakuumpumpe, og hæld væskevækstmediet gennem filteret. Tænd for pumpen, og vent, indtil al væske trækkes igennem. Sæt en hætte på beholderen og fastgør en etiket.
- Hvis der formuleres et solidt vækstmedium, efter at pH'en er justeret, skal der tilføjes agar direkte til en flaske eller kolbe.
- Hæld 1 L væskevækst medium i en 2 L Erlenmeyer kolbe, eller opdele det i to 1 L autoklaverbare flasker (500 ml hver). Hvis der anvendes to flasker, skal du dele agaren og tilføje dem direkte til flaskerne.
- Dæk kolbe med et åndbart dæksel, såsom to lag aluminiumsfolie, så damp kan slippe ud. Hvis du bruger en flaske, skal skruelåget på toppen løsnes løst.
- Autoklave ved 121 °C i 25 min.
- Efter autoklavering fjernes vækstmediet fra autoklaven og afkøles til 55-60 °C (et vandbad sat til 55 °C kan gøre det lettere). Hold vækstmediet i flydende tilstand i et par timer, indtil det er praktisk at hælde plader.
- Når afkølet, tilsæt alle post sterilisation tilsætningsstoffer (se tabel 1)og bland grundigt.
- Når alle ingredienser er tilsat, hæld den angivne volumen i den foretrukne beholder i en laminar flow hætte.
- Vækstmedium kan hældes i de ønskede petriskåle manuelt eller ved hjælp af et flydende dispenserapparat. Når du hælder manuelt, anbefales det at overføre en stor mængde autoclaved medium til et mindre sterilt bægerglas (500 ml) for nem håndtering.
- Tillad vækst medium til afkøling og størkne.
- Vækstmediet vil være til rådighed til brug, når det bliver fast og bruges bedst den følgende dag efter tørring lidt natten over i en steril flowhætte som stakke af låge plader. Efter tørring natten overoverføres pladerne til plastærmer, fold over den løse ende og opbevar det på plads med en lille smule tape. Dette forhindrer overdreven tørring. Medium kan opbevares i et køligt, mørkt og rent miljø (4-16 °C) i op til 1 måned.
2. Dyrkning donorplanter og høst umodne ører
- Dyrk enhver offentligt tilgængelig majs indavlet (dvs. B73, Mo17, eller W22) i et drivhus i 1,5 gallon (5,9 L) potter, der indeholder en jordløs substrat. Brug en fotoperiode på 16/8 (dag/nat) med gennemsnitlige temperaturer på 25,5 °C i løbet af dagen og 20 °C om natten.
- Planter vandes efter behov og befrugtes med en kontrolleret udløsningsgødning (N-P-K på 15-9-12), som enten kan indarbejdes i jordblandingen eller tilsættes overfladen efter plantning.
- Det tager normalt omkring 70-90 dage efter frø spiring for ører at dukke op. Som øreskud opstår, dække dem med en skyde taske for at forhindre ukontrolleret bestøvning opstår.
- Omkring 2-3 dage efter silke er opstået, og hvis pollen vil være til rådighed den følgende dag, skære silke ved hjælp af en saks, der er blevet steriliseret i 70% ethanol. Skær silke og skaller omkring 2,5 cm under enden af skallerne blade, hvor silke opstår. Bestøvning kan udføres næste dag. Sørg for at resterilisere saksmellem hvert øre.
- Når anthers komme ud af en kvast, dække kvast med en kvast taske og ikke-udskridning papirclips i bunden af posen omkring stilken.
- Den næste morgen, forsigtigt bøje anlægget over og tryk posen for at tilskynde pollen til at blive frigivet.
- Fjern kvastposen, og fold toppen af posen over for at forhindre pollen i at slippe ud. Det er generelt bedst at taske kvast 1 dag før det vil blive brugt (for at undgå ophobning af døde pollen og kaste anthers). Frisk pollen kan indsamles fra kvaster i ca 3-5 dage. Når anthers komme ud af de indre buketter i bunden af kvast, at kvast vil sandsynligvis ikke producere levedygtige pollen den næste dag.
- Brug pollen fra samme plante (selfing) eller fra en anden plante af samme indavlede (sibbing).
- Fjern øreposen eller skær posens ende for at eksponere silke, og hæld derefter hurtigt pollen fra kvastposen på silke.
- Dæk øret med kvastposen med det samme, og hæfte stilbunden af posen omkring stilken for at fastgøre den. Det kan være nyttigt at fysisk isolere planten fra blomstrende planter af forskellige genotyper under bestøvning for at hjælpe med at forhindre krydsbestøvning. Lad kvastposen være på øret, indtil det umodne øre er klar til høst.
- 9-12 dage efter bestøvning, skærmører til embryostørrelse. Skub bestøvningtaske op stilken for at afsløre øret. Træk forsigtigt skallerne ned for at udsætte kernerpå omkring en tredjedel til en fjerdedel af omkredsen af øret og omkring en tredjedel af afstanden ned i øret. Kerner i nærheden af spidsen vil ikke være repræsentative for den gennemsnitlige embryo størrelse.
- Ved hjælp af en skalpel skal du skære hætten af en enkelt kerne, der ligner de fleste andre kerner i størrelse og farve.
- Brug en spatel (med en lineal) til at fjerne fosteret som beskrevet i trin 4.6. Mål længden af fosteret ved hjælp af en indbygget lineal på spatel eller en digital kaliper. Hvis fosteret er mellem 1,5-2,0 mm, skal øret høstes. Hvis det er ~ 1,3 mm, kan øret være klar til høst senere på dagen og kan kontrolleres igen i omkring 7-8 h.
3. Forberedelse Agrobacterium suspension kultur for infektion
BEMÆRK: Agrobacterium stammen LBA4404(Thy-) indeholdende PHP81430 (Figur 1) og PHP7153912 opbevares som en glycerol lager på -80 °C. Disse materialer kan fås ved henvendelse til Corteva Agriscience gennem en materialeoverførselsaftale. LBA4404(Thy-) er en auxotrofisk stamme, der har brug for thymidin leveres i vækstmedierne. Den primære nytte af auxotroph Agro stamme er til bioindeslutning formål. Det har den ekstra fordel at reducere Agro overvækst. Den auxotrofisk Agro stamme vokser ikke uden supplerende thymidin. Ikke desto mindre, thymidin kan (formentlig) leveres af døende plantevæv i kulturen. Derfor er der stadig behov for at give et antibiotikum i mediet til helt at kontrollere auxotrofiske Agro. Men, Det vil være lettere at kontrollere på grund af kompromitteret vækst af auxotrofisk stamme i mangel af thymidin.
- Fire dage før infektionsdatoen skal du starte en "mor"-plade fra glycerolbestanden ved at stribe bakterierne på en YP-plade med 50 mg/L thymidin, 50 mg/L gentamicin og 50 mg/L spectinomycin (tabel 1). Inkuber "mor"-pladen i en 20 °C-inkubator i 3 dage.
- En dag før infektionen eksperiment, forberede en "arbejder" plade ved at vælge en til fem kolonier fra "mor" plade og striber bakterier fra "mor" plade til en ny YP plade (med thymidin, gentamycin, og spectinomycin; Tabel 1).
- Streak den daglige "arbejder" plade i sekventielle kvadranter og køre løkken 1x gennem bare-stribet område i de successive kvadrant, gentage at danne kvadranter, der er blevet serielt fortyndet. Den "arbejdende" plade udover i en 27 °C-inkubator.
- Når embryodissektion (trin 4.8) er afsluttet, skal du bruge en løkke eller et lignende værktøj til at indsamle Agrobacterium fra en region af "arbejdspladen", hvor bakterievækst er synlig som tynde koloniers striber.
BEMÆRK: Undgå områder af pladen med en tæt græsplæne af bakterievækst. Den Agrobacterium vækst er sandsynligvis allerede begyndt at falde i tætte områder, mens der i de områder med synlige kolonier bakterierne er i den rette vækstfase for infektion. - Opbryd de opsamlede bakterier i et 50 ml rør, der indeholder 10 ml 700A flydende medium (tabel 1). Vortex at suspendere bakterier kultur helt.
- Mål den optiske tæthed ved en bølgelængde på 550 nm. Juster lydstyrken, indtil OD er mellem 0,35-0,45, med 0,4 er den optimale værdi.
BEMÆRK: Hvis OD er højere end 0,45, tilsættes mere 700A væskemedium. Hvis OD er lavere end 0,35, vaccinere flere Agro kolonier i suspension kultur.
4. Embryodissektion, infektion og samdyrkning
- Vælg egnede ører til transformationseksperimenter. disse skal have et godt frø sæt og har embryoner, der varierer i størrelse fra 1,5-2,0 mm. De er typisk høstet mellem 9-12 dage efter bestøvning. Høstede ører kan anvendes friske eller opbevares i 1-4 dage ved 4 °C, selv om responskvaliteten sandsynligvis vil forringes gradvist med langvarig opbevaring ud over den første dag.
- Fjern skaller og silke. Sæt et håndtag ind i enten bunden eller toppen af øret. Håndtaget kan være et par pincet, skruetrækker, osv.
- Placer ørerne i en stor beholder (f.eks. 2 L bægerglas med håndtaget opad, fyld beholderen med desinfektionsopløsning. Desinfektionsopløsning er 1,8 L 20% kommerciel blegemiddel (1,65% natriumhypochlorit) og et par dråber overfladeaktive Tween 20.
- Steriliser ørerne inde i en laminar flow bænk. Efter 20 min tømmes blegemiddelopløsningen og skylles ørerne 3x (5 min hver) ved hjælp af en generøs mængde sterilt destilleret vand. Fjern vandet og lad ørerne tørre i flere minutter.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at ørerne nedsænkes helt i blegemiddelopløsningen i 20 min. Flyt ørerne forsigtigt rundt i blegemiddelopløsningen lejlighedsvis for at løsne luftbobler. - Forbered et 2 ml mikrocentrifugerør fyldt med 700A væskemedium. Dette rør vil blive brugt til at indsamle de umodne embryoner.
- Tag øret og ved hjælp af en steril skalpel, fjern den øverste 1-2 mm af kernekronerne for at eksponere endospermen. Brug en mikrospatel til at fjerne det umodne zygotic embryo (IZE). IZE vil blive placeret i kernen, på siden vender mod spidsen af øret, og i nærheden af den vedhæftede fil til kolbe. Brug spatelen, indsætte den i endosperm i skrænten længst væk fra fosteret, derefter forsigtigt vride opad for at løsne endosperm og give mulighed for fjernelse af fosteret (Figur 2).
- Ved hjælp af spatelen overføres embryonet til det rør, der indeholder 700A-væskemediet. Fortsæt med at gøre dette, indtil der er indsamlet op til 100 embryoner. Flere rør kan fyldes (~ 100 embryoner / rør), før du fortsætter til næste trin. På dette tidspunkt bør Agrobacterium suspension være forberedt (se trin 3.5).
- Fjern 700A væskemedium fra embryorøret med en 1 ml pipette. Tilføj frisk 700A medium til at vaske embryoner, derefter fjerne dette medie så godt.
- Tilføj 1 ml af Agrobacterium suspension og vortex på en lav indstilling (3/10) for 30 s eller invertrør 12x-15x at blande. Lad dette rør hvile vandret på bænken i 5 min.
- Efter 5 min overføres hele rør af embryoner og Agrobacterium suspension på en plade af 562V co-dyrkning medium (tabel 1). Dette kan opnås ved at placere pladen på bænken og hurtigt hælde rørets indhold på pladen. Drej forsigtigt pladen for at fordele embryonerne, og fjern Agrobacterium suspensionen ved hjælp af en 1 ml pipette.
- Sørg for, at embryonerne placeres med scutellum (rund) side opad. Brug et forstørrelsesglas eller et dissekeringsområde, hvis det er nødvendigt. Pladerne anbringes i plastkasser (19 cm x 28 cm x 5,1 cm) og inkuberpladerne natten 16-18 timer ved 21 °C i mørke. Ingen individuel pladeindpakning ved hjælp af paraffinfilm eller udluftningstape er nødvendig.
- Efter co-dyrkning natten, flytte de inficerede embryoner, scutellum side op, på hvilemedium 605T (tabel 1). Anbring ca. 30 embryoner pr. plade. Inkuber pladerne ved 26-28 °C i mørke.
- Inkubere i 4-10 dage (7 dage foretrækkes). På dette tidspunkt kan udviklingen af somatiske embryoner observeres på overfladen af det zygotiske scutellum (figur 3).
5. Udvælgelse, varmebehandling og regenerering
- Efter hvileperioden chokerer varmeembryonerne. Kassen, der indeholder embryonernes plader, anbringes i en vækstuge med 45 °C med en relativ luftfugtighed på 70 % i 2 timer. Fjern derefter kassen fra 45 °C-inkubatoren, og anbringes i den mørke kuvøse på 26-28 °C i 1-2 timer.
BEMÆRK: Hvis det ikke er i stand til at opnå 70% fugtighed i en kuvøse, tilføje et dobbelt lag af autoclaved papirhåndklæder til bunden af pladen boksen og suge med autoclaved vand for at opretholde luftfugtigheden i kassen. Sæt pladerne tilbage på æsken oven på papirserne, og låget forsegles, før låget placeres ved 45 °C. Brug et lille digitalt hygrometer/termometer til at overvåge temperatur og fugtighed. - De varmebehandlede IZEs overføres fra hvilemediet til skydeformationsmediet (13329A), der indeholder 0,05 mg/L imazapyr, som selektiv agent (tabel 1). Når du overfører, fjerne coleoptiles, hvis de findes, ved hjælp af fine tip pincet eller kirurgisk saks.
- Placer 10-15 embryoner pr. plade for at undgå overbelægning. Opbevar embryonerne i dette medium i 2 uger i den mørke kuvøse på 26 °C.
- Overfør embryonerne til rodemedium (13158; Tabel 1) i 1-2 uger. Anbring ca. otte stykker pr. plade og inkuberes i et lyst rum eller lyskammer(16 dage/8 nat, 20-150 μmol/m 2/s) ved 27 °C.
- Efterhånden som planterne udvikler sig, placeres stærkere plantlets indeholdende både skud og kraftige rødder på nye plader af rodemedium, placer en plante pr. plade. Dette vil give mulighed for en stærkere vækst i plantlet. Placer pladerne i det lyse rum eller lys kammer i yderligere 7-14 dage.
BEMÆRK: Fjern forsigtigt alle hårdt stykker, der er forbundet med planten, for at sikre, at den er i god kontakt med mediet. - Efterhånden som planten bliver mere energisk, skal du fjerne planten fra rodemediet og skylle rødderne med postevand for at fjerne agar.
- Transplanter enkelte planter i 3 i2 (~ 19 cm2)potter, der indeholder et forvådt jordløst substrat. Placer gryderne i en bakke (27 cm x 54 cm) med afløbshuller, og dæk fladen med en plastikfugtighedskuppel. Dette akklimatiseringstrin kan opnås enten i vækstkammeret eller i drivhus med vækstbetingelser, der er beskrevet i afsnit 2 (trin 2.1) ovenfor.
6. Omplantning til drivhuset og produktion af T1 frø
- Kontroller planterne 2x om dagen. Vand efter behov. Sørg for, at planterne hverken tørres ud eller overvandes. Fastholdelse af et lidt tørt underlag fremmer rodvækst.
BEMÆRK: Fugtighedskuplen kan fjernes 4-7 dage efter transplantation. Planter bør dyrkes i disse små potter, indtil de synligt er kommet sig efter stress af transplantation til jord. Dette bør tage omkring 9-14 dage. - Transplanter hele det jordløse stik og plantlet i en 1,5 gal (5,9 L) gryde. Opretholde i drivhuset og vand, når jorden føles tør at røre ved.
- Tilføj en kontrolleret frigivelse gødning med N-P-K på 15-9-12 til puljen, som enten kan indarbejdes i substratet mix eller anvendes på overfladen.
- Når øreskud begynder at komme ud af anlægget, skal du bruge en skydepose til at dække øreskuddene. Sørg for at bruge en pose, der er halvgennemsigtig, så de nye silke kan observeres uden fjernelse af posen. Skydeposen giver mulighed for kontrolleret bestøvning. Det er vigtigt altid at taske transgene kvaster.
- Efter silke opstå (1-2 dage), trimme de fremkomne silke til en ensartet længde. Dette vil være omkring 2,5 cm under toppen af skallerne blade. Brug et par rene saks, der er blevet steriliseret i 70% ethanol. Ved at trimme silke, en ensartet tot udvikler den følgende dag for bestøvning at forekomme.
- For et flertal af majs genotyper, er det optimale tidspunkt for bestøvning er 2-3 dage efter kvast eller silke fremkomsten.
- Pollen indsamles fra enten den samme plante (hvis den er selvbestøvet) eller fra en vild type af samme indavlede (hvis overskæring eller overskæring).
- Indsamle pollen i en kvast taske og anvende det til totter af silke af T0 anlægget. Hvis pollen er fra en vild-type (ikke-transgene) plante, placere pollen i en almindelig brun kvast pose. Hvis pollen er fra en transgen plante, placere pollen i en grøn stribet pose for at angive, at pollen er transgen.
- Følg trin 2.5-2.10 for bestøvning detaljer.
- Omkring 2 uger efter bestøvning, fjerne kvast poser fra ørerne, og give mulighed for tør-down til at begynde. For at hjælpe med at tørre ned, stoppe vanding anlægget 21-25 dage efter bestøvning. Du kan også trække tilbage skallerne blade til at udsætte frø. Denne praksis hjælper også med at forhindre mug.
- Ca. 45 dage efter bestøvning, høst frø og opbevares i kølelager ved 4-12 °C.
Representative Results
Påvist her er en trin-for-trin protokol for Agrobacterium-medieretgenetisk transformation af tre offentlige majs indavlede linjer (B73, Mo17, og W22), der har været betydelig inden for majs genetik. Omdannelse af de tre indavlede linjer kunne ikke opnås ved hjælp af konventionelle majstransformationsprotokoller5. Figur 1 og figur 2 viser henholdsvis konstruktions- og udgangsmaterialerne, der anvendes her. Ører er generelt høstet 9-12 dage efter bestøvning. IZEs med længder på mellem 1,5-2,0 mm er de bedste explants for transformation til denne protokol (Figur 2).
Otte dage efter infektionen blev ZsGreen-udtrykkendesomatiske embryoner visualiseret under GFP-kanalen af et fluorescerende mikroskop (figur 3). Inficerede IZEs blev udsat for varmebehandling 8 dage efter infektion (trin 5.1 og 5.2). Denne behandling indekaldte udtryk for CRE rekombinase, der punktafgifter Bbm, Wus2, cre, og ZsGreen udtryk kassetter flankeret mellem de to loxP sites(Figur 1). Det varmebehandlede væv blev derefter dyrket på skuddannelsesmedium, der indeholdt herbicidimazapyr en markering af transformeret væv efter fjernelse af morfoogene genfjernelse.
Proliferating væv med modning embryoner eller skyde knopper, der var resistente over for imazapyr blev observeret omkring 3-4 uger efter infektion (Figur 4). Nogle imazapyr-resistente væv var negative for ZsGreen, hvilket tyder på, at cre-medieretexcision sandsynligvis fandt sted i disse væv ( Figur4). Efter væv blev flyttet til rode medium og lys inkubation, skud begyndte at udvikle (Figur 5). Sunde og energisk voksende skud med veludviklede rødder blev høstet (Figur 5). Nogle væv syntes at have flere skud(Figur 5E, F, G). Denne type "græsklædte" regenerant kan skyldes klonale planter med identiske transgene integrationsmønstre. Molekylær biologisk analyse er nødvendig for at genotype disse planter.
Alle tre offentlige indavlede linjer reagerede godt ved hjælp af denne protokol samt den konstruktion, der anvendes i dette arbejde. W22 producerede den højeste frekvens af imazapyr-resistente skud, med en frekvens på ca. 14% (ca. 14 transgene skud pr 100 inficerede umodne embryoner). Både B73 og Mo17 produceret omkring 4% transgene skud. Disse frekvenser indikerer alle transgene skud, herunder begge planter, der bærer de morfoogene gener og planter med det morfoogene gen, der fjernes af CRE-medieret excision.
Figur 1: Skematisk repræsentation af T-DNA-regionen i den binære plasmid PHP81430. RB = højre T-DNA-kant loxP = CRE rekombinase målsted; Axig1pro:Wus2 = majs auxin-uduelig promotor (Zm-Axig1) + Zm-Wus2 + majs In2-1 terminator; Pltppro:Zm-Bbm = majs phospholipid transferase protein (Zm-Pltp) promotor + Zm-Bbm + ris T28 terminator (Os-T28); Hsppro:cre = majs varmechok protein 17,7 promotor (Zm-Hsp17.7) + cre recombinase gen + kartoffel proteinase hæmmer II (pinII) terminator; Ubipro:ZsGreen = sorghum ubiquitin promotor/intron (Sb-Ubi) + grønt fluorescerende protein ZsGreen gen + ris ubiquitin terminator (Os-Ubi); Hra kassette = sorghum acetolactase syntase syntase (Sb-Als) promotor + majs Hra (Zm-Hra) gen + pinII terminator; LB = venstre T-DNA-kant colE1, replikation oprindelse plasmid ColE125; SpecR = spectinomycinresistent gen aadA1 fra Tn21 for bakterievalg26; Rep A,B,C = replikation oprindelse fra pRiA4 af Agrobacterium rhizogenes27. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Udgangsmaterialer. B73 ører høstet 12 dage efter bestøvning (A). Umodne embryoner af B73 (B), Mo17 (C) og W22 (D). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vævsudvikling på hvilemedium 1 uge efter infektion. Embryoner (8 dage efter infektion) under et florescence mikroskop (GFP-filter), der viser GFP, der udtrykker somatiske embryoner fra Mo17 (A) og W22 (B). Udvikling af væv (B73) under lysfelt (C) og GFP filter (D). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Vævsudvikling på modningsmedium med udvælgelse. En W22 modningsplade (A). Udvikling af væv (Mo17, 15 dage efter infektion) under lysfelt (B) og GFP filter (C). Udvikling af væv (Mo17, 28 dage efter infektion) under lysfelt (D) og GFP filter (E). Pile peger på regenererende væv, der mangler GFP udtryk, hvilket tyder på excision af ZsGreen genet mellem loxP steder efter varme-induceret CRE protein aktivitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Vævsudvikling på rodemedier. Skud af W22(A),B73(B), og Mo17(C, D). Begivenhed med flere skud (græsklædte regenerants) af B73(E)og W22(F,G). Skud med rødder B73 (H) og W22(I). Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Mediesammensætninger til transformation af majs. Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).
Discussion
Traditionelle protokoller for overførsel af majs følger paradigmet med at isolere umodne zygotiske embryoner til fremstilling af transgene hårdhudsvæv, som regenereres til frugtbare planter4,6. Mens dette er effektivt, kan callus-baserede protokoller være tidskrævende, og det tager ofte op til 3 måneder for vævskulturprocessen at producere planter. Hvad gør den metode, der præsenteres her betydelig, er, at det er callus-fri, effektiv, hurtig, og giver mulighed for regenerering af T0 anlæg i omtrent halvdelen af tidsrammen. Den synes også at være mindre genotypeafhængig og kan derfor være effektiv for de mest offentligt tilgængelige indavlede8,11.
Mens alle skridt bør følges effektivt, korrekt vækst medier forberedelse er bydende nødvendigt. Vækstmediekomponenter skal tilføjes i de korrekte faser, både før og efter autoklave, for at sikre, at plantematerialet får en korrekt koncentration af kemikalier. Dette vil sikre, at følsomme forbindelser som antibiotika ikke nedbrydes. Det er også vigtigt, at plantemateriale placeres på det korrekte vækstmedium på hvert trin, som angivet i protokollen. Hvis materiale ikke placeres på det korrekte vækstmedium, kan det resultere i materiel død. Desuden bør det undgås at placere for mange embryoner eller udvikle væv på plader. Mens placere dobbelt så mange væv stykker kan spare omkostningerne ved kemikalier og petriskåle (og endda inkubator rum), væksten af væv i overfyldte plader kan være alvorligt hæmmet. Under udførelsen af infektionen bør det sikres, at den optiske tæthed af Agrobacterium suspension er passende. Hvis bakteriesuspensionens tæthed er for lav, opstår der muligvis ikke korrekt infektion.
Kvaliteten af udgangsmaterialer er afgørende for succes i transformationsprotokoller. Ører, der anvendes til embryodissektion skal være sunde, hvilket betyder, at den plante, der producerer dem er sundt. De skal også have et passende frøsæt og være skadedyrsfri. Også, gamle Agrobacterium bør ikke anvendes. "Mor"-pladen må ikke være mere end 2 uger gammel. Efter dette punkt, bør en ny "mor" plade være stribet til at begynde nye eksperimenter.
Selv om denne metode har vist sig at være mindre genotypeafhængig, kan det ikke antages, at alle linjer vil få lige succes. Der kan stadig være variation mellem linjer samt forskelle i succes baseret på den konstruktion, der anvendes. Øre-til-øre variation er også uundgåelig, når du arbejder med umodne embryoner, så ideelt eksperimenter bør bruge flere ører til at tage højde for dette. I dette arbejde klarede indavlede W22 sig bedst med over ~14 % transformationsfrekvens efterfulgt af B73 og Mo17 (~4% hver). Lowe et al.8 rapporteret ved hjælp af QuickCorn protokol for B73 og Mo17 transformation. I dette arbejde varierede transformationsfrekvenserne fra 9%-50% for B73 og 15%-35% for Mo17.
En mulighed for de lavere transformationsfrekvenser for B73 og Mo17, der er observeret i dette arbejde, kan tilskrives sæsonudsving i ørekvaliteten. En anden forskel mellem dette arbejde og Lowe et al.8 er, at forskellige vektor konstruktioner blev brugt her. I Lowes arbejde blev morfoogene gener ikke fjernet fra de transformerede planter, men snarere udviklingsmæssigt bragt til tavshed i de senere faser. I dette arbejde blev de morfoogene gener fjernet 8 dage efter infektionen. Det er muligt, at B73 og Mo17 kan have brug for en længere tilstedeværelse af Bbm/Wus2 til udvikling af somatiske embryoner.
Ved hjælp af denne metode er der mulighed for at opnå ikke-transgene flugtplanter, flerkimiske indføringer og uudskillede transgener. Disse planter vil ikke have en mærkbart anderledes fænotype, så påvisning af PCR er nødvendig for at afgøre, om en plante er transgen. For at opnå dette kan pcr-primere inden for den udbårne region og primere, der flankerer den udfsagde region, anvendes. Flere uafhængige transformationer kan også producere planter fra samme umodne embryo, hvilket gør bestemmelse af total uafhængig transformerende inddrivelse sat vanskelig. Vores standard har været at beregne en omdannelseshastighed baseret på prøveudtagning af et anlæg fra hvert umodent embryon, der producerede planter og dividere dette med antallet af inficerede embryoner. Denne metode næsten helt sikkert undervurderer det faktiske antal uafhængige begivenheder inddrives som plantlets. Forskelsbehandling mellem uafhængige begivenheder fra samme embryo kræver sekventering af grænseregioner omkring transgener, og det vil være uoverkommeligt dyrt og tidskrævende for de fleste anvendelser. der kan dog være tilfælde, hvor disse data er nyttige.
Denne metode til vævkultur transformation har vist sig at være meget effektiv, men problemer kan stadig opstå. Hvis plantemateriale ikke reagerer, er det muligt, at der er et problem med den særlige indavlede linje, hvilket tyder på, at variabler såsom vækstmedier sammensætning og timing af subculturing kræver justeringer. En anden variabel er korrekt vektor design og præcis vektor konstruktion, hvis den oprindelige vektor ændres. Der kan også være problemer med imazapyr følsomhed, som nogle linjer er mere følsomme end andre, og koncentrationen af imazapyr kan være nødvendigt at justere for at opnå en vellykket omdannet planter.
I løbet af de sidste 30 år har majsvævskultur og transformationsprotokoller ændret sig og udviklet sig. og det menes, at denne forkortede protokol vil fremme denne progression. Denne metode er effektiv til akademiske indstillinger, fordi den er mindre tidskrævende end traditionelle metoder. Desuden kræver den ikke højtuddannede operatører, hvilket gør den mere modtagelig for udbredt distribution sammenlignet med traditionelle metoder. I fremtiden kan denne metode kombineres med nye teknologier såsom genomteknik.
Disclosures
Alicia Masters, William Gordon-Kamm, og Todd Jones er ansatte i Corteva Agriscience, der leverede protokollen og majs ører B73, Mo17, og W22 anvendes i denne artikel. Forfatterne Minjeong Kang, Morgan McCaw, Jacob Zobrist, og Kan Wang har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Corteva drivhus team for at give majs umodne ører, Corteva medier prep lab for at yde bistand til at gøre medierne, Ning Wang fra Corteva for hjælp med Agrobacterium konstruktion, og Keunsub Lee fra Iowa State University for at få hjælp. Dette projekt blev delvist støttet af National Science Foundation Plant Genome Research Program Grant 1725122 og 1917138 til KW, af Predictive Plant Phenomics Research Traineeship Program (National Science Foundation Grant DGE-1545453) til Z.Z., af USDA NIFA Hatch-projektet #IOW04341, af staten Iowa fonde, og af Crop Bioengineering Center of Iowa State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4-D | Millipore Sigma | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (BAP) | Millipore Sigma | B3408 | |
| Acetosyringone | Millipore Sigma | D134406 | |
| Agar | Millipore Sigma | A7921 | |
| Aluminum foil | To cover the flask | ||
| Ammonium Sulfate | Millipore Sigma | A4418 | |
| Analytical balance | To weigh small quantities of chemicals | ||
| Autocalve | Primus (Omaha, NE) | PSS5-K | To autoclave media and tools |
| Bacterial culture loop (10 µl) | Fisher scientific | 22-363-597 | Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid |
| Bactoagar | BD bioscience | 214030 | |
| Beakers (1 L, 2 L, 4 L) | To mix the chemicals for media | ||
| Benomyl | Millipore Sigma | #45339 | |
| Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite) | Clorox | For seed sterilization | |
| Boric Acid | Millipore Sigma | B6768 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | |
| Carbenicillin | Millipore Sigma | C3416 | |
| Casein Hydrolysate | Phytotech | C184 | |
| Cefotaxime | Phytotech | C380 | |
| Conical tube (50 mL) | Fisher scientific | 06-443-19 | Contain liquid medium and Agro suspension |
| Cuvette (Semi-micro) | Fisher scientific | 14955127 | To hold liquid for measuring OD |
| Dicamba | Phytotech | D159 | |
| Digital hygrometer | Checking temperature and humidity for heat treatment | ||
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Millipore Sigma | 324503 | |
| Eppendorf tube (2.0 mL) | ThermoFischer Scientific | AM12475 | |
| Eriksson's Vitamins | Phytotech | E330 | 1000x in liquid |
| Ethanol (70%) | Sterilizing tools and surfaces | ||
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | F8263 | |
| Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12 | ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH) | A903206 | Fertilizer |
| Flask (2 L) | Pyrex | 10-090E | To autoclave media and tools |
| Flats (Standard 1020, open w/holes, 11"W x 21.37"L x 2.44"D) | Hummert International (Earth City, Mo) | 11300000 | Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome |
| Forceps (fine-tipped and large) | Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders | ||
| Gentamicin | Gold Biotechnologies | G-400 | |
| Glass bottle (1 L) | Pyrex | 06-414-1D | To autoclave medium |
| Graduated cylinder | To adjust volume of media | ||
| Imazapyr | Millipore Sigma | 37877 | |
| Incubator, 20 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection |
| Incubator, 27 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow co-cultivation plate and maize embryo culture |
| Incubator, 45 °C | Heat shock treatment | ||
| Insert TO Standard, pots | Hummert International (Earth City, Mo) | 11030000 | For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome |
| Laminar flow hood | Maintains sterile conditions | ||
| L-proline | Phytotech | P698 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | M1880 | |
| Maize inbred seed B73 | U.S National Plant Germplasm | id=47638 | |
| Maize inbred seed Mo17 | U.S National Plant Germplasm | id=15785 | |
| Maize inbred seed W22 | U.S National Plant Germplasm | id=61755 | |
| Manganese Sulfate Monohydrate | Millipore Sigma | M7899 | |
| Milli-Q Water purification systems | Millipore sigma | MILLIQ | For tissue culture grade water |
| MS Basal Medium | Millipore Sigma | M5519 | |
| MS Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | M5524 | |
| N6 Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | C1416 | |
| Paperclips, non-skid | Holding on tassel bags | ||
| Peptone | BD bioscience | 211677 | |
| Petri dish (100x15 mm) | Fisher scientific | FB0875713 | For bacteria culture medium |
| Petri dish (100x25 mm) | Fisher scientific | FB0875711 | For the plant tissue culture medium |
| pH meter | Fisher scientific | AB150 | To adjust pH of media |
| Pipette (1 mL) | ThermoFischer Scientific | 4641100N | |
| Plastic Boxes | The Container Store | 10048430 | For tissue culture storage and incubation |
| Plastic humidy dome (Humi-Dome) | Hummert International (Earth City, Mo) | 14385100 | Plastic cover for soil flat |
| Potassium Iodide | Millipore Sigma | 793582 | |
| Potassium Nitrate | Millipore Sigma | P8291 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Millipore Sigma | P5655 | |
| Scale | To weigh chemicals for media | ||
| Scalpel Blade (No. 11, 4 cm) | Thermo Scientific | 3120030 | remove the top of the kernel crowns for embryo dissection |
| Scalpel handle | Holding scalpel blades | ||
| Schenk & Hildebrandt Vitamin (S&H vitamin) | Phytotech | S826 | 100x powder |
| Scissors | Cutting ear shoots | ||
| Shoot bag (Canvasback- semi-transparent) | Seedburo (Des Plaines, IL) | S26 | Semi-transparent bag to cover ear shoots |
| Silver Nitrate | Millipore Sigma | S7276 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate | Millipore Sigma | M1651 | |
| Soiless substrate LC1 | SunGro Horticulture (Agawam, Ma) | #521 | For growing maize plants |
| Spatula (Double Ended Micro-Tapered) | Fischer Scientific | 2140110 | Dissecting embryos from kernels |
| Spatula (with spoon) | Fisher scientific | 14-375-10 | To measure chemicals for media |
| Spectinomycin | Millipore Sigma | S4014 | |
| Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis) | Thermo Scientific | 840-300000 | Measure OD of Agro suspension |
| Stirring bar | Fisher scientific | 14-513-67 | To mix media |
| Stirring hotplates | To mix media | ||
| Syringe (without needle, 60 mL) | Fisher scientific | 14-823-43 | For filter sterilization |
| Syringe filter (0.22 µm) | Fisher scientific | 09-720-004 | For filter sterilization |
| Tassel bag (Canvasback- brown) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514 | Bag to cover tassels of non-transgenic plants |
| Tassel bag (Canvasback-green stripe) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514G | Bag to cover tassels of transgenic plants |
| Thiamine HCl | Phytotech | T390 | |
| Thidiazuron | Phytotech | T888 | |
| Thymidine | Millipore Sigma | T1895 | |
| Timentin | Phytotech | T869 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | Cas #9005-64-5 | surfactant |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI0236 | Homogenizes liquids (Agro suspension) |
| Water bath (large - Precision model 186) | Fisher scientific | any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 °C | Keeps autoclaved media at optimal temperature |
| Weigh dish | Fisher scientific | 08-732-112 | To measure chemicals for media |
| Weighing paper | Fisher scientific | 09-898-12A | To measure chemicals for media |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP14222 | |
| Zeatin | Millipore Sigma | Z0164 |
References
- Zhao, Z. Y., et al. High throughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize. Molecular Breeding. 8 (4), 323-333 (2002).
- Green, C. E., Phillips, R. L. Plant regeneration from tissue cultures of maize. Crop Science. 15 (3), 417-421 (1975).
- Ji, Q., Xu, X., Wang, K. Genetic transformation of major cereal crops. International Journal of Developmental Biology. 57, 495-508 (2013).
- Frame, B., Warnberg, K., Main, M., Wang, K. Maize (Zea mays, L). Agrobacterium Protocols. Wang, K. , 3rd edition, Springer, USA. 101-117 (2015).
- Frame, B., et al. Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts. Plant Cell Reports. 25 (1), 1024-1034 (2006).
- Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Frontiers in Plant Science. 5 (379), (2014).
- Lowe, K. S., et al. Morphogenic regulators Baby boom and Wuschel improve monocot transformation. The Plant Cell. 28 (9), 1998-2015 (2016).
- Lowe, K. S., et al. Rapid genotypes independent maize transformation via direct somatic embryogenesis. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 54 (3), 240-252 (2018).
- Boutilier, K., et al. Ectopic expression of BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryonic growth. The Plant Cell. 14 (8), 1737-1749 (2002).
- Zuo, J., Niu, Q. W., Frugis, G., Chua, N. H. The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis. The Plant Journal. 30 (3), 349-359 (2002).
- Jones, T. J., et al. Maize transformation using the morphogenic genes Baby Boom and Wuschel2. Transgenic Plants. Kumar, S., Barone, P., Smith, M. , 81-93 (2019).
- Anand, A., et al. An improved ternary vector system for Agrobacterium-mediated rapid maize transformation. Plant Molecular Biology. 97 (1-2), 187-200 (2018).
- Ray, K., et al. Mutant acetolactate synthase gene is an efficient in vitro selectable marker for the genetic transformation of Brassica juncea (Oilseed Mustard). Journal of Plant Physiology. 161 (9), 1079-1083 (2004).
- Green, J. M., Hale, T., Pagano, M. A., Andreassi, J. L. II, Gutteridge, S. A. Response of 98140 corn with gat4621 and hra transgenes to glyphosate and ALS-inhibiting herbicides. Weed Science. 57 (2), 142-148 (2009).
- An, G., et al. Functional analysis of the 3' control region of the potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene. The Plant Cell. 1 (1), 115-122 (1989).
- Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nature Biotechnology. 17 (10), 969-973 (1999).
- Passarinho, P., et al. Target Genes Provide Diverse Entry Points into Cell Proliferation and Cell Growth Pathways. Plant Molecular Biology. 68 (3), 225-237 (2008).
- Bhyri, P., Khrishnamurthy, N., Narayanan, E., Nott, A., Sarangi, R. R. Novel plant terminator sequences. Patent Number US2014/0130205. , (2014).
- Laux, T., Mayer, K. F., Berger, J., Jürgens, G. The WUSCHEL gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis. Development. 122 (1), 87-96 (1996).
- Garnaat, C., Lowe, K., Roth, B. Zm-AXIG1-specific polynucleotides and methods of use. Patent Number WO2002006499. , (2002).
- Hershey, H. P., Stoner, T. D. Isolation and characterization of cDNA clones for RNA species induced by substituted benzenesulfonamides in corn. Plant Molecular Biology. 17 (4), 679-690 (1991).
- Abremski, K., Hoess, R. Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein. Journal of Biological Chemistry. 259 (3), 1509-1514 (1984).
- Sun, A. Q., et al. Cloning and Function Analysis of Small Heat Shock Protein Gene ZmHSP17.7 from Maize. ACTA Agronomica Sinica. 41 (3), 414 (2015).
- Sauer, B., Henderson, N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (14), 5166-5170 (1988).
- Hershfield, V., Boyer, H. W., Yanofsky, C., Lovett, M. A., Helinski, D. R. Plasmid ColEl as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3455-3459 (1974).
- Liebert, C. A., Hall, R. M., Summers, A. O. Transposon Tn21, flagship of the floating genome. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63 (3), 507-522 (1999).
- Nishiguchi, R., Takanami, M., Oka, A. Characterization and sequence determination of the replicator region in the hairy-root-inducing plasmid pRiA 4b. Molecular and General Genetics. 206 (1), 1-8 (1987).
