Summary
Plante morfonisk gener kan brukes til å forbedre genetisk transformasjon av recalcitrant genotyper. Beskrevet her er en Agrobacterium-mediertgenetisk transformasjon (QuickCorn) protokoll for tre viktige offentlige mais innavlede linjer.
Abstract
Demonstrert her er en detaljert protokoll for Agrobacterium-mediertgenetisk transformasjon av mais innavlede linjer ved hjelp av morfonisk gener Baby boom (Bbm) og Wuschel2 (Wus2). Bbm er regulert av maisfosfolipid transferase genet (Pltp) promotor, og Wus2 er under kontroll av en mais auxin-inducible (Axig1) arrangør. En Agrobacterium stamme bærer disse morfonisk gener på overføring DNA (T-DNA) og ekstra kopier av Agrobacterium virulence (vir) gener brukes til å infisere mais umodne embryo explants. Somatiske embryoer dannes på scutella av infiserte embryoer og kan velges ved ugressmiddelresistens og spiret inn i planter. Et varmeaktivert cre/loxP rekombinasjonssystem bygget inn i DNA-konstruksjonen gjør det mulig å fjerne morfonisk gener fra maisgenomet under et tidlig stadium av transformasjonsprosessen. Transformasjonsfrekvenser på henholdsvis ca. 14 %, 4 %og 4 % (antall uavhengige transgene hendelser per 100 infiserte embryoer) kan oppnås for w22, B73 og Mo17 ved hjelp av denne protokollen.
Introduction
Transformasjon er et grunnleggende verktøy for evaluering av fremmedgenuttrykk i mais og produksjon av genmodifiserte maislinjer for både forskning og kommersielle formål. Tilgang til høy gjennomstrømningstransformasjon kan lette det økte behovet for maismolekylære og cellulære biologistudier1. Evnen til å genetisk forvandle avlingsarter er avgjørende for både offentlige og private laboratorier. Dette gir både grunnleggende forståelse av genreguleringsmekanismer samt avlingsforbedring på global skala for å støtte en stadig voksende befolkning.
Oppdagelsen av at umodne embryoer fra mais kunne brukes til produksjon av regenerable callus oppsto i 19752. Siden denne åpenbaringen har de fleste skalerbare maistransformasjonsprotokoller krevd callusdannelse og utvelgelse før regenerering3. Under prosessen med genetisk transformasjon blir Agrobacterium-infiserteller biolistisk bombardert umodne embryoer dyrket på media for embryogene callus induksjon. Indusert calli blir deretter dyrket på selektive medier (f.eks. som inneholder et ugressmiddel) slik at bare forvandlede callus stykker er i stand til å overleve. Disse ugressmiddelresistente putative transgene calliene er bulket opp og regenerert til planter. Mens denne metoden er effektiv, er prosessen lang og arbeidskrevende, og det kan ta oppover 3 måneder å fullføre4. Enda viktigere, konvensjonelle mais transformasjon protokoller har en mye større begrensning, det vil si, bare et begrenset antall mais genotyper kan forvandles5,6.
Lowe et al.7,8 tidligere rapportert en "QuickCorn" transformasjon metode som ikke bare sterkt redusert varigheten av transformasjonsprosessen, men også utvidet listen over transformerbare genotyper. QuickCorn-metoden benytter maisortologer (Zm-Bbm og Zm-Wus2) av arabidopsistranskripsjonsfaktorene BABY BOOM (BBM)9 og WUSCHEL (WUS)10. Når de er innlemmet i transformasjonsvektorsystemet, fungerer disse genene synergisk for å stimulere embryogen vekst7.
QuickCorn-protokollen som er beskrevet i dette arbeidet var basert på protokollen i Jones et al11, som var en ytterligere forbedring av metoden rapportert av Lowe et al7,8. I den nåværende studien, en Agrobacterium stamme LBA4404 (Thy-) husing en binær vektor konstruere PHP81430(Figur 1) og tilbehør plasmid PHP7153912 brukes til transformasjon. T-DNA av PHP81430 inneholder følgende molekylære komponenter. (1) Transformasjonen selektiv markør genhra uttrykkskassett. Maishra (Zm-Hra) genet er et modifisert acetolaktase synthase (ALS) gen som er tolerant mot ALS-hemmende ugressmidler som sulfonylureaog imidazolinoner13,14. Zm-Hra-genet er regulert av sorghum ALS-promotoren8 og potetproteinasehemmeren II(pinII) terminator15. T-DNA inneholder også (2) en uttrykkskassett som har transformasjonen skjermbar markør genet ZsGreen. Dette grønne fluorescerende proteingenet ZsGreen fra Zoanthus sp. reef coral16 er regulert av en sorghum ubiquitin promotor/ intron og ris ubiquitin terminator.
I tillegg inneholder T-DNA (3) morfonisk genet Bbm uttrykkskassett. Bbm er en transkripsjonsfaktor forbundet med embryoutvikling9,17. Bbm er regulert av mais fosfolipid transferase protein (Pltp) promotør8 og ris T28 terminator18. Zm-Pltp er et gen med sterkt uttrykk i embryoet scutellar epitel, silkehår, og blad datterselskap celler (flankerer vaktcellene), lavt uttrykk i reproduktive organer, og ingen uttrykk i røtter8. Den inneholder også (4) morfonisk genet Wus2 uttrykkkassett. Wus2 er en annen transkripsjonsfaktor forbundet med vedlikehold av den apikale meristem19. Zm-Wus2 er under kontroll av en mais auxin-inducible promotor (Zm-Axig1)20 og mais In2-1 terminator21. Til slutt inneholder T-DNA (5) cre-loxP rekombinasjonssystemet. Cre recombinase genet22 er under kontroll av mais varme sjokk protein 17,7 (Hsp17.7)23 promotor og potet pinII terminator. To loxP nettsteder (i samme retning)24 flanke fire genuttrykkkassetter inkludert ZsGreen, cre, Bbm og Wus2.
Fordi tilstedeværelsen av morfonisk gener ikke er ønsket for plantemodenhet og påfølgende avkom, ble det varmeinduserte cre-loxP rekombinasjonssystemet bygget inn i T-DNA for å fjerne morfogenet fra maisgenomet for å tillate normal callus regenerering og planteutvikling. Ved varmebehandling fjerner uttrykket av CRE-protein alle transgenes bortsett fra Hra-utvalgsgenet. Vellykkede transformanter bør være ugressmiddelbestandige, men ZsGreen-negativ. For ytterligere å forbedre transformasjonsfrekvensen, har Agrobacterium-stammen også en ekstra tilbehørplasmid (PHP71539) som har ekstra kopier av Agrobacterium virulence (vir) gener12.
QuickCorn-metoden er forskjellig fra konvensjonelle maistransformasjonsprotokoller, da det ikke involverer et callus induksjonstrinn under transformasjon. I løpet av den første uken etter infeksjon med Agrobacteriumutvikler somatiske embryoer seg på scutellarepitelet til de infiserte umodne embryoene. Embryoene overføres deretter til et medium med hormoner som oppmuntrer til embryomodning og skyter formasjon. Raskt overføre de somatiske embryoer på modning / skyte formasjon medium hopper over den tradisjonelle callus scenen tidligere brukt for mais transformasjon og tillater direkte generasjon av T0 planter8. Sammenlignet med tidligere publiserte maistransformasjonsmetoder6, er QuickCorn-metoden raskere, mer effektiv og mindre genotypeavhengig. Ved hjelp av denne metoden er forankrede planter vanligvis klare til å overføre til jord på bare 5-7 uker, i stedet for de tre eller flere månedene som kreves av tradisjonelle protokoller. Formålet med denne artikkelen er å gi en grundig beskrivelse og demonstrasjon av metoden, noe som gjør det mulig for enklere replikering i en laboratorieinnstilling som vanligvis finnes i de fleste akademiske institusjoner.
Protocol
1. Vekst media forberedelse
- For nøyaktig vekst medium oppskrifter for denne protokollen, vennligst se tabell 1.
- For å forberede 1 L medier, plasser en 2 L beger på en røreplate og plasser en rørebar inni.
- Fyll begeret med 900 ml destillert vann og slå på rørplaten. Rørestangen skal spinne med middels hastighet.
- Vekt alle pulveriserte ingredienser og oppløs i et beger.
- Mål ut alle flytende ingredienser, om noen, og legg til begeret.
- Ta det endelige volumet til 1 L ved hjelp av destillert vann.
- Mål pH og juster etter oppskriftsspesifikasjoner.
- Hvis det formulerer et flytende vekstmedium, legges ingen agar til. Fest en filtersterilisator til en vakuumpumpe og hell væskevekstmediet gjennom filteret. Slå på pumpen og vent til all væske trekkes gjennom. Plasser en hette på beholderen og fest en etikett.
- Hvis du formulerer et solid vekstmedium, legger du agar direkte inn i en flaske eller kolbe etter at pH er justert.
- Hell 1 L flytende vekstmedium i en 2 L Erlenmeyer kolbe, eller del den i to 1 L autoklavable flasker (500 ml hver). Hvis to flasker brukes, deler du agaren og legger direkte til flaskene.
- Dekk kolbe med et pustende deksel, for eksempel to lag aluminiumsfolie, slik at damp kan unnslippe. Hvis du bruker en flaske, må du løsne skruelokket på toppen.
- Autoklavved 121 °C i 25 min.
- Etter autoklaving, fjern vekstmediet fra autoklaven og avkjøl til 55-60 °C (et vannbad satt til 55 °C kan gjøre dette enklere). Hold vekstmediet i flytende tilstand i noen timer til det er praktisk å helle plater.
- Når avkjølt, legg til alle poststerilisering stilsetningsstoffer (se tabell 1) og bland grundig.
- Etter at alle ingrediensene er lagt til, hell det angitte volumet i beholderen av valget i en laminar strømningshette.
- Vekstmedium kan helles i ønskede Petri-retter manuelt eller ved hjelp av et flytende dispenseringsapparat. Når du helles manuelt, anbefales det å overføre et stort volum autokvedt medium til et mindre sterilt beger (500 ml) for enkel håndtering.
- La vekstmediet avkjøles og stivne.
- Vekstmediet vil være tilgjengelig for bruk når det blir solid og brukes best neste dag etter tørking litt over natten i en steril strømningshette som stabler av lokket plater. Etter tørking over natten, overfør platene til plasthylser, brett over den løse enden, og hold dette på plass med en liten bit tape. Dette forhindrer overdreven tørking. Medium kan lagres i et kjølig, mørkt og rent miljø (4-16 °C) i opptil 1 måned.
2. Voksende donorplanter og høsting umodne ører
- Vokse alle offentlig tilgjengelig mais innavlet (dvs. B73, Mo17, eller W22) i et drivhus i 5,9 L (1,5 l) potter som inneholder et jordløst underlag. Bruk en fotoperiode på 16/8 (dag/natt), med en gjennomsnittlig temperatur på 25.5 °C i løpet av dagen og 20 °C om natten.
- Planter vannes etter behov og befruktes med en kontrollert frigjøringsgjødsel (N-P-K av 15-9-12), som enten kan innlemmes i jordblandingen eller legges til overflaten etter planting.
- Det tar vanligvis ca 70-90 dager etter frøspiring for ører å dukke opp. Når øreskudd dukker opp, dekker du dem med en skytepose for å hindre at ukontrollert pollinering oppstår.
- Omtrent 2-3 dager etter silke har dukket opp, og hvis pollen vil være tilgjengelig neste dag, kutte silke ved hjelp av saks som har blitt sterilisert i 70% etanol. Skjær silke og skall omtrent 2,5 cm under enden av skallbladene, hvor silkedukker opp. Pollinering kan utføres neste dag. Pass på å resterilisere saks mellom hvert øre.
- Når anthers kommer fra en dusk, dekk dusken med en duskpose og ikke-sklipapirklips på bunnen av posen rundt stilken.
- Neste morgen, forsiktig bøye anlegget over og trykke posen for å oppmuntre pollen til å bli utgitt.
- Fjern duskposen og brett toppen av posen over for å hindre at pollen rømmer. Det er generelt best å bag dusk en dag før den vil bli brukt (for å unngå oppbygging av død pollen og kaste anthers). Fersk pollen kan hentes fra dusker i ca 3-5 dager. Når anthers kommer fra de indre florets ved foten av dusk, vil den dusken sannsynligvis ikke produsere levedyktig pollen neste dag.
- Bruk pollen fra samme plante (selv) eller fra en annen plante av samme innavlede (sibbing).
- Fjern øreposen eller kutt enden av posen for å eksponere silke, og hell deretter pollen raskt fra duskposen på silke.
- Dekk øret med duskposen umiddelbart og stift bunnen av posen rundt stilken for å feste den. Det kan være nyttig å fysisk isolere planten fra blomstrende planter av forskjellige genotyper under pollinering for å forhindre krysspollinering. La duskposen stå på øret til det umodne øret er klart til å høste.
- 9-12 dager etter pollinering, skjerm ører for embryo størrelse. Skyv pollineringsposen opp stilken for å eksponere øret. Trekk forsiktig skallen ned for å eksponere kjerner på omtrent en tredjedel til en fjerdedel av omkretsen av øret og omtrent en tredjedel av avstanden ned øret. Kjerner nær spissen vil ikke være representativ for den gjennomsnittlige embryostørrelsen.
- Bruk en skalpell, skjær av hetten på en enkelt kjerne som ligner på de fleste andre kjerner i størrelse og farge.
- Bruk en slikkepott (med en linjal) til å fjerne embryoet som beskrevet i trinn 4.6. Mål lengden på embryoet ved hjelp av en innebygd linjal på slikkepotten eller en digital kaliper. Hvis embryoet er mellom 1, 5-2, 0 mm, høst øret. Hvis det er ~ 1,3 mm, kan øret være klar til å høste senere på dagen og kan kontrolleres igjen i ca 7-8 h.
3. Klargjøring av Agrobacterium suspensjon kultur for infeksjon
MERK: Agrobacterium-stammen LBA4404(Thy-) som inneholder PHP81430 (figur 1)og PHP7153912 lagres som glyserollager ved -80 °C. Disse materialene kan fås fra Corteva Agriscience gjennom en materialoverføringsavtale. LBA4404(Thy-) er en auxotrofisk stamme som trenger tymidin levert i vekstmediene. Den primære nytten av auxotroph Agro-stammen er for biocontainment formål. Det har den ekstra fordelen av å redusere Agro overvekst. Den auxotrofiske Agro-stammen vokser ikke uten ekstra tymidin. Likevel kan tymidin (antagelig) leveres av døende plantevev i kulturen. Derfor er det fortsatt behov for å gi et antibiotikum i mediet for å kontrollere auxotrofisk Agro helt. Det vil imidlertid være lettere å kontrollere på grunn av kompromittert vekst av den hjelpende stammen i fravær av tymidin.
- Fire dager før infeksjonsdatoen, start en "mor" plate fra glyserollager ved å stikke bakteriene på en YP-plate med 50 mg / L tymidin, 50 mg / L gentamicin, og 50 mg / L spectinomycin (Tabell 1). Inkuber "mor" platen i en 20 °C inkubator i 3 dager.
- En dag før infeksjonseksperimentet, lag en "arbeider" plate ved å velge en til fem kolonier fra "mor" plate og striping bakterier fra "mor" plate til en ny YP plate (med tymidin, gentamycin, og spectinomycin; Tabell 1).
- Streak den daglige "arbeider" plate i sekvensielle kvadranter og kjøre sløyfen 1x gjennom nettopp stripete området inn i den påfølgende kvadrant, gjenta for å danne kvadranter som har blitt serieløst utvannet. Inkuber "arbeider" platen over natten i en 27 ° C inkubator.
- Etter å ha fullført embryodisseksjon (trinn 4,8), bruk en løkke eller lignende verktøy for å samle Agrobacterium fra en region av "arbeider" plate hvor bakteriell vekst er synlig som tynne striper av kolonier.
MERK: Unngå områder av platen med en tett plen av bakteriell vekst. Agrobacterium veksten har trolig allerede begynt å avta i tette områder, mens i områdene med synlige kolonier bakteriene er i riktig vekstfase for infeksjon. - Heng de innsamlede bakteriene i et 50 ml rør som inneholder 10 ml væskemedium(tabell 1). Vortex å suspendere bakteriekulturen helt.
- Mål den optiske tettheten med en bølgelengde på 550 nm. Juster volumet til OD er mellom 0,35-0,45, og 0,4 er den optimale verdien.
MERK: Hvis OD er høyere enn 0,45, tilsett mer 700A flytende medium. Hvis OD er lavere enn 0,35, inokulere flere Agro kolonier i suspensjon kulturen.
4. Embryodisseksjon, infeksjon og samtidig dyrking
- Velg egnede ører for transformasjonseksperimenter; disse bør ha et godt frø sett og har embryoer som varierer i størrelse fra 1,5-2,0 mm. De høstes vanligvis mellom 9-12 dager etter pollinering. Høstede ører kan brukes frisk eller lagret i 1-4 dager ved 4 °C, selv om responskvaliteten sannsynligvis vil forringes gradvis med langvarig lagring utover den første dagen.
- Fjern skall og silke. Sett inn et håndtak i enten sokkelen eller toppen av øret. Håndtaket kan være et par tang, skrutrekker, etc.
- Plasser ørene i en stor beholder (f.eks. 2 L beger med håndtaket oppover, fyll beholderen med desinfeksjonsoppløsning. Desinfeksjonsoppløsning er 1,8 L av 20% kommersiell blekemiddel (1,65% natriumhypokloritt) og et par dråper overflateaktivt tween 20.
- Steriliser ørene inne i en lamial strømningsbenk. Etter 20 min, tøm blekemiddeloppløsningen og skyll ørene 3x (5 min hver) ved hjelp av en sjenerøs mengde sterilt destillert vann. Fjern vannet og la ørene tørke i flere minutter.
MERK: Det er viktig at ørene er helt nedsenket i blekemiddelløsningen i 20 min. Flytt ørene forsiktig rundt i blekemiddelløsningen av og til for å løsne luftbobler. - Forbered et 2 ml mikrocentrifugerør fylt med 700A flytende medium. Dette røret vil bli brukt til å samle de umodne embryoene.
- Ta øret og bruk en steril skalpell, fjern de øverste 1-2 mm av kjernekronene for å eksponere endosperm. Bruk en mikroslikkepott til å fjerne det umodne zygotiske embryoet (IZE). IZE vil bli plassert i kjernen, på siden vendt mot tuppen av øret, og i nærheten av vedlegget til cob. Bruk slikkepotten til å sette den inn i endospermen i perikarpen lengst unna embryoet, og vri deretter forsiktig oppover for å løsne endospermen og tillate fjerning av embryoet (Figur 2).
- Bruk slikkepotten til å overføre embryoet til røret som inneholder 700A væskemedium. Fortsett å gjøre dette til opptil 100 embryoer er samlet inn. Flere rør kan fylles (~ 100 embryoer / rør) før du fortsetter til neste trinn. På dette punktet bør Agrobacterium suspensjon være forberedt (se trinn 3.5).
- Fjern 700A væskemedium fra embryorøret med en 1 ml pipette. Tilsett friskt 700A medium for å vaske embryoene, og fjern deretter det mediet også.
- Tilsett 1 ml Agrobacterium suspensjon og vortex på en lav innstilling (3/10) for 30 s eller invertert rør 12x-15x å blande. La dette røret hvile horisontalt på benken i 5 min.
- Etter 5 min, overføre hele røret av embryoer og Agrobacterium suspensjon på en plate på 562V co-dyrking medium (Tabell 1). Dette kan oppnås ved å plassere platen på benken og raskt helle rørinnholdet på platen. Virvle forsiktig platen for å fordele embryoene og fjerne Agrobacterium suspensjon ved hjelp av en 1 ml pipette.
- Pass på at embryoene er plassert med scutellum (rund) side vendt oppover. Bruk eventuelt et forstørrelsesglass eller et dissekeringsomfang. Legg platene i plastbokser (19 cm x 28 cm x 5,1 cm) og inkuber platene over natten 16-18 timer ved 21 °C i mørket. Ingen individuell plateinnpakning ved hjelp av parafinfilm eller luftetape er nødvendig.
- Etter nattens meddyrking, flytt de infiserte embryoene, scutellum side opp, på hvilemedium 605T (Tabell 1). Plasser rundt 30 embryoer per tallerken. Inkuber platene ved 26-28 °C i mørket.
- Inkuber i 4-10 dager (7 dager foretrekkes). På dette tidspunktet kan utviklingen av somatiske embryoer observeres på overflaten av zygotic scutellum (Figur 3).
5. Valg, varmebehandling og regenerering
- Etter hvileperioden sjokkerer varme embryoene. Plasser boksen som inneholder platene av embryoer i en 45 °C inkubator med 70 % relativ fuktighet i 2 timer. Fjern deretter boksen fra 45 °C-inkubatoren og legg den mørke inkubatoren på 26-28 °C i 1-2 timer.
MERK: Hvis du ikke kan oppnå 70 % fuktighet i en inkubator, legg til et dobbelt lag med autoklerte papirhåndklær til bunnen av plateboksen og suge med autoklamt vann for å opprettholde fuktigheten i esken. Sett platene tilbake til esken oppå papirhåndklærne og forsegle lokket før du plasserer ved 45 °C. Bruk et lite digitalt hygrometer/termometer til å overvåke temperaturen og fuktigheten. - Overfør varmebehandlede IZEer fra hvilemediet til skyteformasjonsmediet (13329A) som inneholder 0,05 mg/l imazapyr som selektiv agent (tabell 1). Når du overfører, fjern coleoptiler, hvis de er tilstede, ved hjelp av fine spisstang eller kirurgisk saks.
- Plasser 10-15 embryoer per plate for å unngå overbefolkning. Oppbevar embryoene i dette mediet i 2 uker i den mørke inkubatoren på 26 °C.
- Overfør embryoene til rooting medium (13158; Tabell 1) i 1-2 uker. Plasser rundt åtte stykker per tallerken og inkuber i et lysrom eller lyskammer (16 dag/8 natt, 20-150 μmol/m2/s) ved 27 °C.
- Etter hvert som plantlets utvikler seg, plasserer du sterkere plantlets som inneholder både skudd og kraftige røtter på nye plater av rooting medium, plasser en plante per tallerken. Dette vil gi sterkere plantletvekst. Plasser platene i lysrommet eller lyskammeret i ytterligere 7-14 dager.
MERK: Fjern forsiktig eventuelle callus stykker forbundet med plantlet for å sikre at det er i god kontakt med mediet. - Etter hvert som planten blir mer kraftig, fjern planten fra rooting medium og skyll røttene med vann fra springen for å fjerne agar.
- Transplant individuelle planter i 3 i2 (~ 19 cm2)potter som inneholder en pre-fuktet jordløs substrat. Legg grytene i et brett (27 cm x 54 cm) med avløpshull og dekk leiligheten med en plastfuktighetskuppel. Dette akklimaringstrinnet kan oppnås enten i vekstkammeret eller i drivhus med vekstforhold beskrevet i § 2 (trinn 2.1) ovenfor.
6. Transplantasjon til drivhuset og produksjon av T1 frø
- Sjekk plantene 2x per dag. Vann etter behov. Sørg for at plantene verken tørkes ut eller overvannes. Opprettholde en litt tørr substrat oppfordrer rotvekst.
MERK: Fuktighetskuppelen kan fjernes 4-7 dager etter transplantasjon. Planter bør dyrkes i disse små potter før de har synlig gjenopprettet fra stresset av transplantasjon til jord. Dette bør ta ca 9-14 dager. - Transplant hele jordløs plugg og plantlet i en 1,5 gal (5,9 L) pott. Vedlikehold i drivhus og vann når jord føles tørt å ta på.
- Legg til en kontrollert frigjøringsgjødsel med N-P-K på 15-9-12 til potten, som enten kan innlemmes i substratblandingen eller påføres overflaten.
- Når øreskudd begynner å dukke opp fra planten, bruk en skytepose for å dekke øreskuddene. Pass på å bruke en pose som er halvgjennomsiktig slik at de nye silke kan observeres uten fjerning av posen. Skyteposen gjør det mulig for kontrollert pollinering å skje. Det er viktig å alltid bag transgene dusker.
- Etter silke dukker opp (1-2 dager), trim de dukket opp silke til en jevn lengde. Dette vil være ca 2,5 cm under toppen av huskbladene. Bruk et par ren saks som er sterilisert i 70% etanol. Ved å trimme silke, utvikler en jevn tuft neste dag for pollinering å skje.
- For et flertall av maisgenotyper er den optimale tiden for pollinering 2-3 dager etter dusk eller silkefremvekst.
- Samle pollen fra enten samme plante (hvis du er selvpollinert) eller fra en vill type av samme innavlet (hvis overløp eller innkrysset).
- Samle pollen i en dusk pose og bruke den til tuft av silke av T0 anlegget. Hvis pollen er fra en vill-type (ikke-transgenic) plante, plasser pollen i en vanlig brun duskpose. Hvis pollen er fra en transgen plante, plasser pollen i en grønn stripete pose for å indikere at pollen er transgen.
- Følg trinn 2.5-2.10 for avstemningsdetaljer.
- Omtrent 2 uker etter pollinering, fjern duskposene fra ørene, og la det tørke ned å begynne. For å tørke ned, slutt å vanne anlegget 21-25 dager etter pollinering. Du kan også trekke tilbake huskbladene for å eksponere frøet. Denne praksisen bidrar også til å forhindre mugg.
- Omtrent 45 dager etter pollinering, høstfrø og oppbevar i kjølelager ved 4-12 °C.
Representative Results
Demonstrert her er en trinnvis protokoll for Agrobacterium-mediert genetisk transformasjon av tre offentlige mais innavlede linjer (B73, Mo17 og W22) som har vært betydelig innen mais genetikk. Transformasjon av de tre innavlede linjene kunne ikke oppnås ved hjelp av konvensjonelle maistransformasjonsprotokoller5. Figur 1 og Figur 2 viser henholdsvis konstruksjons- og startmaterialer som brukes her. Ørene høstes vanligvis 9-12 dager etter pollinering. IZEer med lengder mellom 1,5 og 2,0 mm er de beste eksplantene for transformasjon for denne protokollen (figur 2).
Åtte dager etter infeksjon ble ZsGreen-som uttrykker somatiske embryoer visualisert under GFP-kanalen til et fluorescerende mikroskop (Figur 3). Infiserte IZEer ble utsatt for varmebehandling 8 dager etter infeksjon (trinn 5.1 og 5.2). Denne behandlingen induserte uttrykket av CRE recombinase som utskåret Bbm, Wus2, creog ZsGreen uttrykkkassetter flankert mellom de to loxP-områdene (figur 1). Det varmebehandlede vevet ble deretter dyrket på skyteformasjonsmedium som inneholdt ugressmiddelimazapyr for valg av forvandlet vev etter morfonisk genfjerning.
Spre vev med modne embryoer eller skyteknopper som var resistente mot imazapyr ble observert rundt 3-4 uker etter infeksjon (Figur 4). Noen imazapyrresistente vev var negative for ZsGreen, noe som tyder på at cre-medierteksisjon sannsynligvis skjedde i disse vevene ( Figur4). Etter at vevet ble flyttet til rooting medium og lys inkubasjon, skudd begynte å utvikle seg (Figur 5). Friske og kraftige voksende skudd med velutviklede røtter ble høstet (Figur 5). Noen vev syntes å ha flere skudd (Figur 5E, F, G). Denne typen "gresskledd" regenerant kan skyldes klonale planter som har identiske transgene integrasjonsmønstre. Molekylær biologisk analyse er nødvendig for å genotype disse plantene.
Alle tre offentlige innavlede linjer reagerte godt ved hjelp av denne protokollen, samt konstruksjonen som brukes i dette arbeidet. W22 produserte den høyeste frekvensen av imazapyrresistente skudd, med en frekvens på ca. 14 % (ca. 14 transgene skudd per 100 infiserte umodne embryoer). Både B73 og Mo17 produserte ca 4% transgene skudd. Disse frekvensene indikerer alle transgene skudd, inkludert begge plantene som bærer morfonisk gener og planter med morfonisk gen fjernet av CRE-mediert eksisjon.
Figur 1: Skjematisk representasjon av T-DNA-regionen i den binære plasmid PHP81430. RB = høyre T-DNA-grense; loxP = CRE recombinase målområdet; Axig1pro:Wus2 = mais auxin-inducible promoter (Zm-Axig1) + Zm-Wus2 + mais In2-1 terminator; Pltppro:Zm-Bbm = mais fosfolipid transferase protein (Zm-Pltp) promotor + Zm-Bbm + ris T28 terminator (Os-T28); Hsppro:cre = mais varme sjokk protein 17,7 promotor (Zm-Hsp17.7) + cre recombinase genet + potet proteinase hemmer EI (pinII) terminator; Ubipro:ZsGreen = sorghum ubiquitin promoter/intron (Sb-Ubi) + grønt fluorescerende protein ZsGreen gen + ris ubiquitin terminator (Os-Ubi); Hra kassett = sorghum acetolactase synthase (Sb-Als) promotor + mais Hra (Zm-Hra) gen + pinII terminator; LB = venstre T-DNA-grense; colE1, replikering opprinnelse av plasmid ColE125; SpecR = spectinomycin resistente genet aadA1 fra Tn21 for bakterievalg26; Rep A,B,C = replikeringsopprinnelse fra pRiA4 av Agrobacterium rhizogenes27. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Startmateriell. B73 ører høstet 12 dager etter pollinering (A). Umodne embryoer av B73 (B), Mo17 (C) og W22 (D). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Vevsutvikling på hvilemedium 1 uke etter infeksjon. Embryoer (8 dager etter infeksjon) under et florescencemikroskop (GFP-filter) som viser GFP som uttrykker somatiske embryoer av Mo17 (A) og W22 (B). Utviklevev (B73) under lyse felt (C) og GFP filter (D). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Vevsutvikling på modningsmedium med valg. En W22 modningsplate (A). Utviklevev (Mo17, 15 dager etter infeksjon) under lyse felt (B) og GFP-filter (C). Utviklevev (Mo17, 28 dager etter infeksjon) under lyse felt (D) og GFP-filter (E). Piler peker på regenererende vev som mangler GFP-uttrykk, noe som tyder på utskjæring av ZsGreen genet mellom loxP-stedene etter varmeindusert CRE-proteinaktivitet. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Vevsutvikling på rooting media. Skudd av W22 (A), B73 (B) og Mo17 (C,D). Hendelse med flere skudd (gresskledde regenerants) av B73 (E) og W22 (F,G). Skudd med røtter av B73 (H) og W22 (I). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Mediekomposisjoner for maistransformasjon. Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).
Discussion
Tradisjonelle protokoller for maistransformasjon følger paradigmet med isolerende umodne zygotiske embryoer for å produsere transgencallusvev, som regenereres til fruktbare planter4,6. Selv om dette er effektivt, kan callus-baserte protokoller være tidkrevende, og det tar ofte opptil 3 måneder for vevkulturprosessen å produsere planter. Det som gjør metoden presentert her betydelig er at den er callus-fri, effektiv, rask, og tillater regenerering av T0 planter i omtrent halvparten av tidsrammen. Det ser også ut til å være mindre genotypeavhengig og kan dermed være effektiv for de fleste offentlig tilgjengelige innavlete8,11.
Mens alle tiltak bør følges effektivt, er riktig vekst media forberedelse viktig. Vekstmediekomponenter må legges til på de riktige stadiene, både før- og post-autoklav, for å sikre at plantematerialet får riktig konsentrasjon av kjemikalier. Dette vil sikre at følsomme forbindelser som antibiotika ikke bryter ned. Det er også viktig at plantemateriale er plassert på riktig vekstmedium på hvert trinn, som angitt i protokollen. Ikke plassere materiale på riktig vekstmedium kan resultere i materiell død. I tillegg bør det unngås å plassere for mange embryoer eller utvikle vev på plater. Mens du plasserer dobbelt så mange vev stykker kan spare kostnadene for kjemikalier og Petri retter (og selv inkubator plass), veksten av vev i overfylte plater kan være alvorlig hemmet. Mens du utfører infeksjonen, bør det sikres at den optiske tettheten av Agrobacterium suspensjon er hensiktsmessig. Hvis bakteriell suspensjon tetthet er for lav, kan riktig infeksjon ikke forekomme.
Kvaliteten på startmaterieller er avgjørende for suksess i transformasjonsprotokoller. Ører som brukes til embryodisseksjon må være sunne, noe som betyr at planten som produserer dem er sunt. De må også ha et tilstrekkelig frøsett og være skadedyrs- og sykdomsfrie. Gamle Agrobacterium bør heller ikke brukes. "Mor" platen bør ikke være mer enn 2 uker gammel. Etter dette punktet bør en ny "mor" plate være stripete for å starte nye eksperimenter.
Selv om denne metoden har vist seg å være mindre genotypeavhengig, kan den ikke antas at alle linjer vil være like vellykkede. Det kan fortsatt være variasjon blant linjer samt forskjeller i suksess basert på konstruksjonen som brukes. Øre-til-øre-variabilitet er også uunngåelig når du arbeider med umodne embryoer, så ideelt sett bør eksperimenter bruke flere ører for å ta hensyn til dette. I dette arbeidet, inbred W22 utført best, med over ~ 14% transformasjon frekvens, etterfulgt av B73 og Mo17 (~ 4% hver). Lowe et al.8 rapporterte bruk av QuickCorn-protokollen for B73 og Mo17 transformasjon. I dette arbeidet varierte transformasjonsfrekvensene fra 9%-50% for B73 og 15%-35% for Mo17.
En mulighet for lavere transformasjonsfrekvenser for B73 og Mo17 observert i dette arbeidet kan tilskrives sesongmessige svingninger i ørekvaliteten. En annen forskjell mellom dette arbeidet og Lowe et al.8 er at ulike vektorkonstruksjoner ble brukt her. I Lowes arbeid ble morfonisk gener ikke fjernet fra de forvandlede plantene, men heller utviklingsmessig dempet i de senere stadiene. I dette arbeidet ble morfonisk gener fjernet 8 dager etter infeksjonen. Det er mulig at B73 og Mo17 kan trenge en lengre tilstedeværelse av Bbm/Wus2 for utvikling av somatiske embryoer.
Ved hjelp av denne metoden er det en mulighet for å oppnå ikke-transgene rømningsplanter, multimeriske innsettinger og upubliserte transgener. Disse plantene vil ikke ha en merkbart forskjellig fenotype, så deteksjon av PCR er nødvendig for å avgjøre om en plante er transgen. For å oppnå dette kan PCR-primere innenfor den utskårne regionen og primere flankere den utskårne regionen brukes. Flere uavhengige transformasjoner kan også produsere planter fra det samme umodne embryoet, noe som gjør fastsettelse av total uavhengig transformant utvinningsgrad vanskelig. Vår standard har vært å beregne en transformasjonshastighet basert på prøvetaking av en plante fra hvert umodne embryo som produserte planter og deler dette med antall embryoer smittet. Denne metoden undervurderer nesten helt sikkert det faktiske antallet uavhengige hendelser som er gjenopprettet som plantlets. Diskriminering mellom uavhengige hendelser fra samme embryo krever sekvensering av grenseregioner rundt transgenes, og dette vil være uoverkommelig dyrt og tidkrevende for de fleste applikasjoner; det kan imidlertid være tilfeller der disse dataene er nyttige.
Denne metoden for vev kultur transformasjon har vist seg å være svært effektiv, men problemer kan fortsatt oppstå. Hvis plantematerialet ikke reagerer, er det mulig at det er et problem med den bestemte innavlede linjen, noe som tyder på at variabler som vekstmediesammensetning og tidspunktet for subculturing krever justeringer. En annen variabel er riktig vektordesign og nøyaktig vektorkonstruksjon, hvis den opprinnelige vektoren endres. Det kan også være problemer med imazapyr følsomhet, som noen linjer er mer følsomme enn andre, og konsentrasjonen av imazapyr må kanskje justeres for å oppnå vellykket forvandlet planter.
I løpet av de siste 30 årene har maisvevskultur og transformasjonsprotokoller endret seg og utviklet seg; og det antas at denne forkortede protokollen vil fremme denne progresjonen. Denne metoden er effektiv for akademiske innstillinger fordi den er mindre tidkrevende enn tradisjonelle metoder. I tillegg krever det ikke høyt utdannede operatører, noe som gjør det mer mottagelig for utbredt distribusjon sammenlignet med tradisjonelle metoder. I fremtiden kan denne metoden kombineres med nye teknologier som genomteknikk.
Disclosures
Alicia Masters, William Gordon-Kamm og Todd Jones er ansatte i Corteva Agriscience som leverte protokollen og maisørene til B73, Mo17 og W22 som ble brukt i denne artikkelen. Forfatterne Minjeong Kang, Morgan McCaw, Jacob Zobrist og Kan Wang har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Corteva drivhusteamet for å gi mais umodne ører, Corteva media prep lab for å gi hjelp til å lage media, Ning Wang fra Corteva for hjelp med Agrobacterium konstruksjon, og Keunsub Lee fra Iowa State University for hjelp. Dette prosjektet ble delvis støttet av National Science Foundation Plant Genome Research Program Grant 1725122 og 1917138 til K.W., av Prediktiv Plante Phenomics Research Traineeship Program (National Science Foundation Grant DGE-1545453) til J.Z., av USDA NIFA Hatch-prosjektet #IOW04341, av State of Iowa-midler, og av Crop Bioengineering Center of Iowa State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4-D | Millipore Sigma | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (BAP) | Millipore Sigma | B3408 | |
| Acetosyringone | Millipore Sigma | D134406 | |
| Agar | Millipore Sigma | A7921 | |
| Aluminum foil | To cover the flask | ||
| Ammonium Sulfate | Millipore Sigma | A4418 | |
| Analytical balance | To weigh small quantities of chemicals | ||
| Autocalve | Primus (Omaha, NE) | PSS5-K | To autoclave media and tools |
| Bacterial culture loop (10 µl) | Fisher scientific | 22-363-597 | Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid |
| Bactoagar | BD bioscience | 214030 | |
| Beakers (1 L, 2 L, 4 L) | To mix the chemicals for media | ||
| Benomyl | Millipore Sigma | #45339 | |
| Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite) | Clorox | For seed sterilization | |
| Boric Acid | Millipore Sigma | B6768 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | |
| Carbenicillin | Millipore Sigma | C3416 | |
| Casein Hydrolysate | Phytotech | C184 | |
| Cefotaxime | Phytotech | C380 | |
| Conical tube (50 mL) | Fisher scientific | 06-443-19 | Contain liquid medium and Agro suspension |
| Cuvette (Semi-micro) | Fisher scientific | 14955127 | To hold liquid for measuring OD |
| Dicamba | Phytotech | D159 | |
| Digital hygrometer | Checking temperature and humidity for heat treatment | ||
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Millipore Sigma | 324503 | |
| Eppendorf tube (2.0 mL) | ThermoFischer Scientific | AM12475 | |
| Eriksson's Vitamins | Phytotech | E330 | 1000x in liquid |
| Ethanol (70%) | Sterilizing tools and surfaces | ||
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | F8263 | |
| Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12 | ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH) | A903206 | Fertilizer |
| Flask (2 L) | Pyrex | 10-090E | To autoclave media and tools |
| Flats (Standard 1020, open w/holes, 11"W x 21.37"L x 2.44"D) | Hummert International (Earth City, Mo) | 11300000 | Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome |
| Forceps (fine-tipped and large) | Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders | ||
| Gentamicin | Gold Biotechnologies | G-400 | |
| Glass bottle (1 L) | Pyrex | 06-414-1D | To autoclave medium |
| Graduated cylinder | To adjust volume of media | ||
| Imazapyr | Millipore Sigma | 37877 | |
| Incubator, 20 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection |
| Incubator, 27 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow co-cultivation plate and maize embryo culture |
| Incubator, 45 °C | Heat shock treatment | ||
| Insert TO Standard, pots | Hummert International (Earth City, Mo) | 11030000 | For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome |
| Laminar flow hood | Maintains sterile conditions | ||
| L-proline | Phytotech | P698 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | M1880 | |
| Maize inbred seed B73 | U.S National Plant Germplasm | id=47638 | |
| Maize inbred seed Mo17 | U.S National Plant Germplasm | id=15785 | |
| Maize inbred seed W22 | U.S National Plant Germplasm | id=61755 | |
| Manganese Sulfate Monohydrate | Millipore Sigma | M7899 | |
| Milli-Q Water purification systems | Millipore sigma | MILLIQ | For tissue culture grade water |
| MS Basal Medium | Millipore Sigma | M5519 | |
| MS Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | M5524 | |
| N6 Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | C1416 | |
| Paperclips, non-skid | Holding on tassel bags | ||
| Peptone | BD bioscience | 211677 | |
| Petri dish (100x15 mm) | Fisher scientific | FB0875713 | For bacteria culture medium |
| Petri dish (100x25 mm) | Fisher scientific | FB0875711 | For the plant tissue culture medium |
| pH meter | Fisher scientific | AB150 | To adjust pH of media |
| Pipette (1 mL) | ThermoFischer Scientific | 4641100N | |
| Plastic Boxes | The Container Store | 10048430 | For tissue culture storage and incubation |
| Plastic humidy dome (Humi-Dome) | Hummert International (Earth City, Mo) | 14385100 | Plastic cover for soil flat |
| Potassium Iodide | Millipore Sigma | 793582 | |
| Potassium Nitrate | Millipore Sigma | P8291 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Millipore Sigma | P5655 | |
| Scale | To weigh chemicals for media | ||
| Scalpel Blade (No. 11, 4 cm) | Thermo Scientific | 3120030 | remove the top of the kernel crowns for embryo dissection |
| Scalpel handle | Holding scalpel blades | ||
| Schenk & Hildebrandt Vitamin (S&H vitamin) | Phytotech | S826 | 100x powder |
| Scissors | Cutting ear shoots | ||
| Shoot bag (Canvasback- semi-transparent) | Seedburo (Des Plaines, IL) | S26 | Semi-transparent bag to cover ear shoots |
| Silver Nitrate | Millipore Sigma | S7276 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate | Millipore Sigma | M1651 | |
| Soiless substrate LC1 | SunGro Horticulture (Agawam, Ma) | #521 | For growing maize plants |
| Spatula (Double Ended Micro-Tapered) | Fischer Scientific | 2140110 | Dissecting embryos from kernels |
| Spatula (with spoon) | Fisher scientific | 14-375-10 | To measure chemicals for media |
| Spectinomycin | Millipore Sigma | S4014 | |
| Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis) | Thermo Scientific | 840-300000 | Measure OD of Agro suspension |
| Stirring bar | Fisher scientific | 14-513-67 | To mix media |
| Stirring hotplates | To mix media | ||
| Syringe (without needle, 60 mL) | Fisher scientific | 14-823-43 | For filter sterilization |
| Syringe filter (0.22 µm) | Fisher scientific | 09-720-004 | For filter sterilization |
| Tassel bag (Canvasback- brown) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514 | Bag to cover tassels of non-transgenic plants |
| Tassel bag (Canvasback-green stripe) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514G | Bag to cover tassels of transgenic plants |
| Thiamine HCl | Phytotech | T390 | |
| Thidiazuron | Phytotech | T888 | |
| Thymidine | Millipore Sigma | T1895 | |
| Timentin | Phytotech | T869 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | Cas #9005-64-5 | surfactant |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI0236 | Homogenizes liquids (Agro suspension) |
| Water bath (large - Precision model 186) | Fisher scientific | any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 °C | Keeps autoclaved media at optimal temperature |
| Weigh dish | Fisher scientific | 08-732-112 | To measure chemicals for media |
| Weighing paper | Fisher scientific | 09-898-12A | To measure chemicals for media |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP14222 | |
| Zeatin | Millipore Sigma | Z0164 |
References
- Zhao, Z. Y., et al. High throughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize. Molecular Breeding. 8 (4), 323-333 (2002).
- Green, C. E., Phillips, R. L. Plant regeneration from tissue cultures of maize. Crop Science. 15 (3), 417-421 (1975).
- Ji, Q., Xu, X., Wang, K. Genetic transformation of major cereal crops. International Journal of Developmental Biology. 57, 495-508 (2013).
- Frame, B., Warnberg, K., Main, M., Wang, K. Maize (Zea mays, L). Agrobacterium Protocols. Wang, K. , 3rd edition, Springer, USA. 101-117 (2015).
- Frame, B., et al. Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts. Plant Cell Reports. 25 (1), 1024-1034 (2006).
- Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Frontiers in Plant Science. 5 (379), (2014).
- Lowe, K. S., et al. Morphogenic regulators Baby boom and Wuschel improve monocot transformation. The Plant Cell. 28 (9), 1998-2015 (2016).
- Lowe, K. S., et al. Rapid genotypes independent maize transformation via direct somatic embryogenesis. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 54 (3), 240-252 (2018).
- Boutilier, K., et al. Ectopic expression of BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryonic growth. The Plant Cell. 14 (8), 1737-1749 (2002).
- Zuo, J., Niu, Q. W., Frugis, G., Chua, N. H. The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis. The Plant Journal. 30 (3), 349-359 (2002).
- Jones, T. J., et al. Maize transformation using the morphogenic genes Baby Boom and Wuschel2. Transgenic Plants. Kumar, S., Barone, P., Smith, M. , 81-93 (2019).
- Anand, A., et al. An improved ternary vector system for Agrobacterium-mediated rapid maize transformation. Plant Molecular Biology. 97 (1-2), 187-200 (2018).
- Ray, K., et al. Mutant acetolactate synthase gene is an efficient in vitro selectable marker for the genetic transformation of Brassica juncea (Oilseed Mustard). Journal of Plant Physiology. 161 (9), 1079-1083 (2004).
- Green, J. M., Hale, T., Pagano, M. A., Andreassi, J. L. II, Gutteridge, S. A. Response of 98140 corn with gat4621 and hra transgenes to glyphosate and ALS-inhibiting herbicides. Weed Science. 57 (2), 142-148 (2009).
- An, G., et al. Functional analysis of the 3' control region of the potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene. The Plant Cell. 1 (1), 115-122 (1989).
- Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nature Biotechnology. 17 (10), 969-973 (1999).
- Passarinho, P., et al. Target Genes Provide Diverse Entry Points into Cell Proliferation and Cell Growth Pathways. Plant Molecular Biology. 68 (3), 225-237 (2008).
- Bhyri, P., Khrishnamurthy, N., Narayanan, E., Nott, A., Sarangi, R. R. Novel plant terminator sequences. Patent Number US2014/0130205. , (2014).
- Laux, T., Mayer, K. F., Berger, J., Jürgens, G. The WUSCHEL gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis. Development. 122 (1), 87-96 (1996).
- Garnaat, C., Lowe, K., Roth, B. Zm-AXIG1-specific polynucleotides and methods of use. Patent Number WO2002006499. , (2002).
- Hershey, H. P., Stoner, T. D. Isolation and characterization of cDNA clones for RNA species induced by substituted benzenesulfonamides in corn. Plant Molecular Biology. 17 (4), 679-690 (1991).
- Abremski, K., Hoess, R. Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein. Journal of Biological Chemistry. 259 (3), 1509-1514 (1984).
- Sun, A. Q., et al. Cloning and Function Analysis of Small Heat Shock Protein Gene ZmHSP17.7 from Maize. ACTA Agronomica Sinica. 41 (3), 414 (2015).
- Sauer, B., Henderson, N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (14), 5166-5170 (1988).
- Hershfield, V., Boyer, H. W., Yanofsky, C., Lovett, M. A., Helinski, D. R. Plasmid ColEl as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3455-3459 (1974).
- Liebert, C. A., Hall, R. M., Summers, A. O. Transposon Tn21, flagship of the floating genome. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63 (3), 507-522 (1999).
- Nishiguchi, R., Takanami, M., Oka, A. Characterization and sequence determination of the replicator region in the hairy-root-inducing plasmid pRiA 4b. Molecular and General Genetics. 206 (1), 1-8 (1987).
