Summary
هنا هو بروتوكول لإنشاء احتشاء البونتين الحاد في نموذج الفئران عن طريق التحفيز الكهربائي مع نبضة واحدة.
Abstract
احتشاء بونتين هو النوع الفرعي الأكثر شيوعا في الدورة الدموية الخلفية، في حين أن هناك يفتقر إلى نموذج القوارض يحاكي احتشاء البونتين. تقدم هنا هو بروتوكول لإنشاء بنجاح نموذج الفئران من احتشاء البونتين الحادة. وتستخدم الفئران التي تزن حوالي 250 غرام، ويتم حقن مسبار مع غغم معزول في البون باستخدام جهاز ستيريو. يتم إنتاج الآفة عن طريق التحفيز الكهربائي مع نبضة واحدة. يتم استخدام نقاط Longa ، ودرجة بيردرسون ، واختبار توازن الحزمة لتقييم العجز العصبي. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام اختبار الاستئصال المصمّم لإزالة المواد اللاصقة لتحديد وظيفة المُنَسِّيّة، ويُستخدم اختبار موضع الأطراف لتقييم اللياقة. ثم يتم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي لتقييم الاحتشاء في الجسم الحي، ويستخدم تلطيخ TTC لتأكيد احتشاء في المختبر. هنا، يتم تحديد احتشاء ناجح يقع في الأساس anterolateralالبصورة من البونات الرسترالية. في الختام، يتم وصف طريقة جديدة لإنشاء نموذج فئران احتشاء البونتين الحاد.
Introduction
منذ 1980s، وقد استخدمت على نطاق واسع في الانسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) نموذج الناجمة عن خيوط السيليكون في أبحاث السكتة الدماغية الأساسية1. كما استخدمت أساليب أخرى (أي خياطة فرع واحد من MCA2 والتشكيل البؤري المستحث ضوئياً). وقد تم استخدام هذه النماذج في نماذج السكتة الدماغية MCA، وساهمت بشكل كبير في التحقيقات في الآليات الفسيولوجية للمعالجة المرضية الكامنة والسكتة الدماغية المحتملة. على الرغم من وجود قيود على هذهالنماذجالتجريبية 3،4، وقد استخدمت هذه الأساليب العديد من المختبرات5،6. نماذج السكتة الدماغية MCA القائم على تمثل السكتة الدماغية في الدورة الدموية الأمامية; ومع ذلك، فقد حققت تقارير قليلة نماذج تحاكي السكتة الدماغية في الدورة الدموية الخلفية7.
هناك اختلافات كبيرة بين المسببات، والآليات، والمظاهر السريرية، والتكهن بين السكتات الدماغية الدورة الدموية الأمامية والخلفية8. ولذلك، لا يمكن تطبيق النتائج المستمدة من نماذج السكتة الدماغية الدورة الدموية الأمامية لسكتة الدورة الدموية الخلفية. على سبيل المثال، تم تمديد نافذة وقت إعادة الضخ للدورة الأمامية إلى 6 ساعة، مع جزء صغير من الدراسات تمتد إلى 24 ساعة استناداً إلى نتائج التصوير9. ومع ذلك، قد يكون الإطار الزمني لتداول الخلفية أطول من 24 ساعة، وفقا لتقارير سابقة10 وتجاربنا السريرية الخاصة. يجب دراسة هذه النافذة الزمنية الممدودة وإعادة الضخ وتأكيدها في النماذج التجريبية.
فيما يتعلق السكتات الدماغية الدورة الدموية الخلفية، احتشاء البونتين هو النوع الفرعي الأكثر شيوعا، وتمثل 7٪ من جميع حالات السكتة الدماغية الإقفاري11،12. وفقا لتضاريس الاحتشاء ، وتنقسم الاحشاء البونتين في الاحشاء معزولة وغير معزولة البونتين في الاحشاء13. يتم تصنيف احتشاءات البونتين المعزولة إلى ثلاثة أنواع استنادًا إلى الآليات الأساسية: مرض الشريان الكبير (LAD) ، مرض فرع الشريان الباسيلاري (BABD) ، ومرض الشريان الصغير (SAD). وقد استمدت معرفة آليات وتجليات وتكهن احتشاء البونتين من التحقيقات السريرية للحالات14. ومع ذلك ، كان نموذج القوارض يحاكي احتشاء البونتين أقل بحثًا.
في الدراسات السابقة، تم استكشاف إصابة tegmentum الدماغ المنتشر التي تنطوي على الـ pons7. حاولت إحدى المجموعات إنشاء نموذج احتشاء بونتين عن طريق ربط الشريان الباسيلاري (BA)15. مجموعة أخرى تستخدم 10-0 خياطة أحادية النايلون لligate انتقائيا أربع نقاط من مكتبة الإسكندرية القريبة بشكل انتقائي16. هذا النموذج يحاكي LAD، ولكن معظم الاحتشاء البونتين نتيجة من BABD وDD. بالإضافة إلى ذلك، فإن الربط الانتقائي لمكتبة الإسكندرية هو عملية جراحية معقدة ومعدل وفيات مرتفع.
تقدم هنا هو بروتوكول مفصل لسهلة الأداء، استنساخها بسهولة، وناجحة نموذج الفئران من احتشاء البونتين الحادة عن طريق التحفيز الكهربائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت مراجعة البروتوكول والموافقة عليه من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات التابعة للمؤسسة التابعة للمستشفى الثانى التابع لجامعة قوانغتشو الطبية ، وهى مؤسسة معتمدة من قبل الرابطة . تم توفير الفئران من قبل مركز الحيوان في جامعة الطب الجنوبية.
1. الحيوان
- استخدام الذكور البالغين Sprague-Dawley الفئران وزنها 250 ± 10 غرام.
- عند النقل، منزل الفئران لمدة أسبوع على الأقل قبل الجراحة تحت ظروف بيئية خاضعة للرقابة مع درجة حرارة محيطة من 25 درجة مئوية، والرطوبة النسبية من 65٪، و 12 ساعة / 12 ساعة دورة خفيفة / داكنة.
- توفير الغذاء والماء الإعلانية libitum.
2. إنشاء احتشاء في الـpons
- وزن الفئران قبل الجراحة وتقييم الأداء العصبي وفقا للاختبارات السلوكية الموضحة أدناه (القسم 3).
- سخني وسادة التدفئة مباشرة قبل التخدير.
- إرفاق الحفر الجمجمة إلى حامل على إطار stereotaxic.
- حقن intraperitoneally الفئران مع 50 ملغ / كغ الكيتامين و 5 ملغم / كغ xylazine. تحقق من عدم وجود استجابة إصبع إصبع.
- جبل الفئران على إطار stereotaxic في موقف عرضة. ضع قضبان الأذن فوق قناة الأذن لتأمين الرأس. تأكد من أن الجمجمة يتم الاحتفاظ أفقيا لتجنب أي انحراف من الحقن.
- الحفاظ على التخدير عن طريق ايزوفلوران (100٪ الأكسجين، 2.5٪ isoflurane) عن طريق مرفق مخروط الأنف stereotaxic للفئران مع منافذ مدخل ومنافذ مخرج. الحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية باستخدام وسادة التدفئة ومراقبة درجة الحرارة طوال العملية.
- استخدام مرهم العين لمنع تجفيف القرنية. استخدام ملقط لقرصة قليلا الكفوف لضمان عدم وجود استجابة للألم.
- حلق شعر الجمجمة مع ماكينة حلاقة صغيرة. تطبيق فرك الكلورهيكسيدين الجراحية بطريقة دائرية بدءا من موقع شق الجراحية وتناوب الخارج.
- جعل شق خط الوسط 3 سم مع مشرط من خط من canthus الجانبية الثنائية إلى 0.5 سم وراء فونتانيل الخلفي، والتي ينبغي أن تكون علامة قلم علامة الجراحية.
- استخدم مسحة قطنية لإزالة الدم.
- ضع قطعة من الشريط الجراحي وضعت على كل جانب من الجلد رفرف لفضح فروة الرأس (الشكل 1).
- إزالة بلطف الأنسجة الضامة من عظم الجمجمة مع مسحة القطن انخفض في 0.9٪ كلوريد. إذا لم تتم إزالتها، سوف تحصل على اشتعلت الأنسجة الضامة في الحفر.
- تحديد bregma. اختار النقطة المركزية من bregma كنقطة الأصل ووضع علامة عليه باستخدام غرامة تلميح قلم علامة الجراحية السوداء.
- ضع تمرينًا في 6.0 ملم AP، 2.0 ملم ML (يتراوح من 0.5 إلى 3.0 مم، الشكل 2A).
- إجراء استئصال القحف (1 ملم قطر) باستخدام الحفر التلقائي. المضي قدما بعناية، لأن هذه النقطة قريبة من الجيوب الأنفية الوريدية.
- إزالة الحفر من الإطار stereotaxic.
- ضع مسبار 22 G مع غد معزول في إطار مجسم(الشكل 3A). يجب وضع طرف المسبار 2 ملم فوق النهاية القريبة من العادم (الشكل 3A, B; الشكل 2 ب).
- تأكد من أن اغدغ يدخل الدماغ 7 ملم (7 ملم DV, الشكل 2B; الشكل 1C).
- تقدم المسبار على طول اغدغة (الشكل 1D) حتى غيض من التحقيق هو 9 مم تحت سطح الدماغ (الشكل 2D).
- توصيل الأقطاب الكهربائية إلى محفز كهربائي (الشكل 3C). ربط الأنود إلى التحقيق كما هو مبين في الشكل 1D. ربط الكاثود إلى الفئران (عادة إلى الأذن من الفئران).
- تشغيل محفز كهربائي وإعداد المعلمات التالية: عرض نبضة واحدة = 4,050 مللي ثانية; الجهد = 50 V؛ وتيار = 4 mA (الشكل 3C). أثناء التحفيز الكهربائي، سوف يظهر الجرذ يرتجف. في هذه الدراسة، لم يتم تشغيل الجهاز فئران مجموعة التحكم المستخدمة للاختبارات السلوكية، التصوير بالرنين المغناطيسي، و TTC.
- اترك المسبار في موضعه لمدة 5 دقائق بعد التحفيز.
- إزالة التحقيق من الدماغ (الشكل 1F).
- استخدم أسمنت العظام لتغطية استئصال القحف. السماح للأسمنت لتجف قبل الجرح خياطة.
- خياطة الجرح مع خيوط خياطة بولي أميد 4-0. بعد ثلاثة أو أربعة stiches، التعادل 2-1-1 عقدة جراحية قياسية.
- حقن الفئران مع البنسلين (0.25 مل، 80 وحدة دولية المخفف في 4 مل من المالحة) intraperitoneally لمنع العدوى.
- حقن الفئران تحت الجلد مع ميلوكسيكام بجرعة من 2 ملغ / كغ ثم كرر كل 24 ساعة.
- مراقبة الفئران كل 15 دقيقة حتى مستيقظا تماما وإعادتها إلى القفص مع وسادة التدفئة. توفير حرية الوصول إلى الطعام والماء حتى التضحية.
ملاحظة: يجب أن تتبع جميع الإجراءات المبادئ الجراحية العقيمة. قبل الجراحة، ضعي فوق فرك وقناع جراحي وقفازات معقمة بعد فرك جراحي من اليدين. الحفاظ على المواد خياطة معقمة داخل الحقل العقيمة في جميع الأوقات.
3. الاختبارات السلوكية
- لونغا يسجل17
- ضع الفئران على سطح الطاولة.
- وسجل الدرجات على النحو التالي: 0 = لا يوجد عجز عصبي؛ 0 = نقص عصبي؛ 0 = نقص عصبي؛ 0 = نقص عصبي؛ 0 = نقص عصبي؛ 0 = نقص عصبي؛ 1 = الفشل في تمديد تماما forepaw contralateralral، وهو نقص عصبي بؤري معتدل؛ 2 = الدوران إلى اليسار، وهو نقص عصبي بؤري معتدل؛ 3 = السقوط إلى اليسار ، وهو عجز شديد في التنسيق ؛ 4 = لا يمشي عفوية ومستوى الاكتئاب من الوعي.
- بيردرسون النتيجة18
- عقد الفئران من الذيل والسماح forelimbs الوصول إلى طاولة. تسجيل الدرجات على النحو التالي: 0 = كلا الطرفين وصلت إلى الجدول; 1 = طرف واحد فقط يصل إلى الطاولة.
- وضع الحيوان على سطح خشن. تسجيل عشرات على النحو التالي: 0 = قبضة قوية على سطح خشنة مع مقاومة جيدة عندما دفعت; 1 = مقاومة طفيفة ينظر فقط في مخلب واحد; 2 = لا توجد مقاومة عند دفعها في اتجاه واحد.
- ضع الجرذ في منطقة مغلقة (18 في × 36 في) والسماح لها بالتجول بحرية. تسجيل الدرجات على النحو التالي: 0 = المشي على طول العلبة دون الدوران؛ 0 = السير على طول العلبة دون الدوران؛ 0 = السير على طول العلبة دون الدوران؛ 0 = السير على طول العلبة دون الدوران؛ 0 = السير على طول العلبة دون الدوران؛ 0 1 = المشي على طول العلبة مع الدوران؛ 2 = لا يمكن السير على طول العلبة ولكن يمكن أن دائرة; 3 = لا يمكن أن تتحرك كثيرا. استخدم مجموع درجات التقييم من كل مهمة كدرجة تقييم نهائية.
- اختبار شعاع التوازن19
- تأكد من أن الجهاز يتكون من 3 سم و 70 سم شعاع طويل و 20 سم فوق الأرض. ضع صندوقًا مظلمًا في الطرف البعيد من الشعاع مع مدخل ضيق.
- وضع مولد الضوضاء البيضاء ومصدر الضوء الساطع في بداية الشعاع. واستخدمت الضوضاء والضوء لتحفيز الفئران لاجتياز شعاع ودخول مربع الهدف.
- إنهاء المحفزات عندما تدخل الحيوانات مربع مظلمة. تسجيل الكمون للوصول إلى مربع الهدف (في ثوان) وأداء hindlimb من الفئران عند اجتياز شعاع.
- تسجيل الدرجات لكل أداء على النحو التالي: 0 = أرصدة مع وضع ثابت; 1 = قبضات جانب من شعاع; 2 = العناق شعاع و1 أطراف يسقط من شعاع; 3 = العناق شعاع واثنين من أطرافه تقع من شعاع، أو يدور على شعاع بعد > 60 s; 4 = محاولات لتحقيق التوازن على شعاع ولكن يقع قبالة بعد > 40 s; 5 = محاولات لتحقيق التوازن على شعاع ولكن يقع قبالة بعد > 20 s; و 6 = يقع قبالة، أي محاولة لتحقيق التوازن أو التمسك شعاع بعد <20 s.
- إزالة لاصقة اختبار somatosensory20
- ضع الفئران في مربع زجاج شبكي واضح والسماح لهم باستكشاف البيئة الجديدة لمدة 2 أو 3 دقائق.
- وضع 10 مم اللون الأخضر قطرها ملصق لاصق على السطح الداخلي لكل forelimb فوق الإبهام وعلى المعصم.
- ارجع الفئران إلى مربع زجاج شبكي.
- تسجيل الوقت للجرذ لإزالة التسمية الأولى وجميع التسميات الأخرى، على التوالي. السماح بحد أقصى 3 دقائق. وينبغي إجراء الاختبار 2x في التدريب.
- اختبار وضع الأطراف
- عقد الفئران في وضع أفقي ومنع الحركة.
- مرة واحدة الفئران يفقد الاتصال مع سطح الجدول (حركة الأطراف السلبية)، وتطبيق المحفزات اللمسية وروبروبيوبسيبي ل مخلب مع حافة الجدول.
- تقييم موضع مخلب (نجاح أو فشل) على حافة الجدول.
- تسجيل الدرجات على النحو التالي: 0 = لا موضع؛ 0 = لا يوجد موضع؛ 1= 10= 100= 100= 10= 0.5 = وضع غير مكتمل و/أو متأخر؛ 1 = الموضع الفوري والكامل.
4. تأكيد فيركت بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي
- إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي 24 ساعة بعد الجراحة.
- تخدير الفئران بواسطة ايزوفلوران (5٪ للحث، 1٪ - 1.5٪ للصيانة).
- تأمين رأس الفئران في لفائف صفيف الدماغ الفئران وجنبا إلى جنب مع لفائف حجم الإرسال فقط.
- ضع الملف والجرذ في ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي. تأمين الفئران داخل المهد باستخدام الأسنان والأذن القضبان.
- الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية أثناء إجراء المسح بالرنين المغناطيسي باستخدام سترة حرارية الدائرة المغلقة.
- استخدم تسلسلاً تجريبياً لضمان الهندسة الصحيحة.
- جمع الأشعة T2-المرجح باستخدام تسلسل صدى سريع الدوران: صدى الوقت (TE) = 33 مللي ثانية; تكرار الوقت (TR) = 8000 مللي ثانية ؛ مجال الرؤية = 30 مم × 30 مم؛ مصفوفة الاستحواذ = 512 × 512؛ 50 شريحة؛ 0.4 مم سميكة.
- جمع أربع طلقات تدور صدى التصوير بلا تخطيط DWI بمسح: صدى الوقت = 30.5 مللي ثانية; وقت التكرار = 8000 مللي ثانية؛ المصفوفة = 96 × 96؛ مجال الرؤية = 25 مم × 25 مم؛ ثلاثة اتجاهات = x، y، z؛ القيم ب = 0 1,000 s/mm2 و 1,000 s/mm2; 50 شريحة محورية متجاورة؛ 0.4 مم سميكة.
- أعيدوا الفئران إلى القفص
5. تأكيد infarct من قبل تلطيخ TTC
- التضحية الفئران في نقطة زمنية وفقا للتصميم التجريبي. في هذه التجربة، ضحينا الفئران 24 ساعة بعد الجراحة.
- إعداد حل TTC 2٪ قبل التضحية. إضافة 0.2 مسحوق TTC 0.2 ز إلى 10 مل 0.01 م PBS (pH 7.4). نقل التخفيف إلى طبق 10 سم مغطاة ورق الفضة و اسخِر مسبقاً إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- تعريض الفئران إلى 5٪ isoflurane حتى فقدان الوعي. ثم، يعرض الجرذ إلى CO2 (20٪ -30٪ من حجم القفص في الدقيقة) حتى توقف التنفس، ثم الحفاظ على 2 دقيقة من التعرض CO2.
- استخدام العلامات التالية لتأكيد الموت: لا ارتفاع وسقوط الصدر، لا ضربات القلب واضح، وضعف لون الغشاء المخاطي، لا استجابة لقرصة إصبع قدم، تغيير اللون أو التعتيم في العينين.
- إجراء خلع عنق الرحم.
- تأمين الحيوانات عن طريق تسجيل الكفوف على منصة معقمة. إنشاء شق منتصف الخط من الترقوة إلى hypogastrium وشق الجانبي من xiphoid إلى اليسار على طول القفص الصدري. جعل قطع في الحجاب الحاجز أيضا على طول القفص الصدري وشق منتصف الصدر لفضح القلب.
- قم بتوصيل طرف إبرة (27 G) بمضخة ضخ تحتوي على 0.01 M PBS عند 4 درجات مئوية في البطين الأيسر.
ملاحظة: تقدم الطرف على طول الحافة اليسرى من البطين لتجنب دخول الأذين. بدوره على مضخة الضخ لضمان تلميح في البطين الأيسر وقطع الأذين الأيمن. إذا كان السائل يستنزف من الأنف، فإن الطرف في الأذين ويحتاج إلى تعديل أو إعادة إدراجه. - استخدام ما يقرب من 100 مل من 0.01 م PBS، والحفاظ على 4 درجة مئوية للضخ. إيقاف مضخة الضخ إلى أن يتحول الكبد إلى اللون الأبيض.
- قطع رأس الفئران وتشريح العقول كلها باستخدام مقص ملقط. إزالة أي ماء من سطح الدماغ مع ورقة النشاف.
- تخزين الدماغ كله في -80 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (قطع أقسام الدماغ هو أسهل بعد التجميد).
ملاحظة: يمكن تخطي هذه الخطوة إذا كان يمكن قطع أقسام الدماغ بشكل جيد دون تجميد. - ضع الدماغ في المصفوفة مع الجانب الظهري.
- تحديد ثقب في سطح الدماغ كما هو مبين في الشكل 1G وإدراج شفرة الفولاذ المقاوم للصدأ 0.21 مم سميكة. عادة، أكبر منطقة احتشاء هو في الطائرة من التحقيق; وهكذا، ينبغي إدراج شفرة واحدة في هذه المنطقة.
- أدخل الشفرات الأخرى على فاصل زمني 2 مم.
- في وقت واحد إزالة ريش، في كل مرة، من المصفوفة ووضع الدماغ كله مع ريش في حل TTC في الطبق. إزالة ريش بعناية.
ملاحظة: هنا، لم يتم إزالة أقسام الدماغ بسهولة من السائل لأن بعض ماطر بيا المتبقية في الأساس cranii تدخلت مع قسم. إذا بقيت أي أقسام في المصفوفة ، استخدم ملعقة صغيرة لنقلها إلى الطبق. - ضع الطبق مع حل TTC وأقسام الدماغ في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
- تحقق من الطبق كل 5 دقائق وضمان عدم وجود تداخل بين المقاطع.
- إضافة 10 مل من 4% حل شبه شكلي إلى الطبق لإنهاء رد فعل TTC.
- توجيه المقاطع من الرسترالية إلى السد وأخذ الصور.
6 - الإحصاءات
- استخدم برنامج التحليل الإحصائي (على سبيل المثال، GraphPad Prism) لإجراء اختبار t-testالخاص بالطالب.
ملاحظة: يتم التعبير عن كافة البيانات على أنها تعني ± SE. يتم تحديد الاختلافات بين المجموعات باختبارات t-tالخاصة بـ Student ذات الطرفين (p < 0.05 المعرّفة على أنها دلالة إحصائية).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وخضعت ستة لبروتوكول الجراحة الموصوف أعلاه. مجموعة المراقبة كما هو مبين في الشكل 4 تتكون من ستة فئران. تم اشتقاق شرائح الدماغ الموضحة في الشكل 4 من جرذ واحد لكل مجموعة.
وأظهر المسح بالرنين المغناطيسي أن احتشاء كان موجودا في أساس البونات (الشكل 4A). منذ أن تم حقن المسبار 2 ملم إلى يسار خط الوسط ، تم تحديد مكان الاحتشاء بشكلٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍّيّ. هذا احتشاء يحاكي احتشاء البونتين anterolateral في المرضى (الشكل 4A). لأنه تم استخدام غمد معزول ، لم يكن هناك احتشاء وراء طرف المسبار بما في ذلك القشرة ، المخيخ ، وmisrbrain (الشكل 4A). كما كشفت صور DWI احتشاء البونتين الحاد(الشكل 4A).
وقد استخدمت تلطيخ TTC لتأكيد احتشاء 24 ح بعد الجراحة (الشكل 4A). مقارنة بمجموعة التحكم، كان حجم الاحتشاء أعلى بكثير(الشكل 4B).
تم قياس الدرجات السلوكية قبل وبعد الجراحة. يتم عرض درجات مجموعات النموذج التحكم والضوابط قبل وبعد الجراحة في الجدول 1. بسبب عدم وجود اختبار سلوكي محدد مصمم لتششاء البونتين ، تم استخدام درجة لونغا ، ودرجة بيردرسون ، واختبار شعاع التوازن لتقييم العجز العصبي. بالإضافة إلى ذلك، اختبار إزالة المواد اللصقية لتقييم وظيفة الحسية وكذلك اختبار موضع الأطراف لتقييم التبخر.
بالمقارنة مع مجموعة التحكم، والجرذان مع احتشاء البونتين حلقت إلى اليسار (الشكل 4A). كانت هناك اختلافات كبيرة في درجة لونغا (2.67 ± 0.52 مقابل. 0، ف < 0.05، الشكل 4C)،درجة بردرسون (2.67 ± 0.52 مقابل 0، ف < 0.05، الشكل 4D)،اختبار وضع الأطراف (4.67 ± 0.52 مقابل 0، P < 0.05، الشكل 4E)،درجة اختبار توازن الحزمة (118.33 ± 2.66 مقابل 10.17 ± 1.47، p < 0.05، الشكل 4F)،ومادة لاصقة إزالة درجة الاختبار somatosensory (2.33 ± 0.52 مقابل 12.0 ± 0، ف < 0.05، الشكل 4G)بين الفئران مع احتشاء البونتين وفئران المجموعة السيطرة.
الشكل 1: مؤسسة الاحتشاء. (أ) ثقب في الجمجمة. (ب) يتم نقل الـ(اَلْجَم) إلى الحفرة. (ج) حقن الدادم. (D) حقن المسبار. (E) يرتبط الأنود (السهم الأحمر). (F) تتم إزالة المسبار. (G) ثقب (السهم الأحمر) اليسار في سطح الدماغ. الرجاء الضغط هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
الشكل 2: موقع المسبار. (أ) مخطط تخطيطي للمواقع المجسمة: تشير الأسهم إلى التراجع عن رفرفات الجلد، وموقع بريغما، وتحديد مواقع الحفر. (ب) الرسم التخطيطي للأسدم والمسبار. (ج) موقع طرف من اأداد وضعت في الرواد. (د) موقع طرف المسبار الموضوع في الـ 1000. (هـ) التصميم التجريبي. الرجاء الضغط هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
الشكل 3: جهاز إنتاج الآفة. (أ) منفصلة من اأدف والتحقيق. (ب) التحقيق في الـ غاد. (ج) كان القطب الأزرق هو القطب الذي كان متصلا بالمسبار السدي؛ كان القطب الأحمر الكاثود. (د) محفز كهربائي. (هـ) الأدوات الجراحية. الرجاء الضغط هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
الشكل 4: النتائج التمثيلية. (A) تم تقييم الاحتشاء بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي مع T2 و DWI التسلسل في الجسم الحي ، وأكد TTC تلطيخ في المختبر 24 ساعة بعد الجراحة. احتشاء بونتين الحاد الموجود في البونات الأنترولاتالية اليمنى (خط منقط). أظهر الاختبار السلوكي أن الجرذ يدور حول الجانب الآخري من الآفة. (ب) حجم الاحتشاء. (C) نقاط طويلة. (D) درجة بيدرسون. (ه) وضع طرف الاختبار. (F) اختبار المشي شعاع التوازن. (G) إزالة لاصقة اختبار somatosensory. تمثل الأشرطة متوسط ± SD(p < 0.05 مقابل مجموعة التحكم). الرجاء الضغط هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
الشكل S1: احتشاء اللاكونار في البون. طول تلميح المسبار هو تقصير. يُظهر المسح بالرنين المغناطيسي احتشاء الثغرات في الـpons اليمنى. (A) T2 الصورة. (B) DWI الصورة. الرجاء الضغط هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
| فئران NO | لونغا النتيجة | بيردرسون النتيجة | اختبار شعاع التوازن | اختبار التنمّر المُصمّم لإزالة اللصق | اختبار وضع الأطراف | |||||
| قبل | بعد الجراحة | قبل | بعد الجراحة | قبل | بعد الجراحة | قبل | بعد الجراحة | قبل | بعد الجراحة | |
| احتشاء بونتين 1 | 0 | 3 | 0 | 2 | 0 | 5 | 6 | 120 | 12 | 2 |
| بونتين احتشاء 2 | 0 | 2 | 0 | 3 | 0 | 4 | 8 | 120 | 12 | 3 |
| بونتين احتشاء 3 | 0 | 3 | 0 | 3 | 0 | 5 | 8 | 116 | 12 | 2 |
| بونتين احتشاء 4 | 0 | 3 | 0 | 3 | 0 | 4 | 6 | 120 | 12 | 2 |
| احتشاء بونتين 5 | 0 | 3 | 0 | 2 | 0 | 5 | 7 | 114 | 12 | 2 |
| بونتين احتشاء 6 | 0 | 2 | 0 | 3 | 0 | 5 | 7 | 120 | 12 | 3 |
| التحكم 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| التحكم 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8 | 10 | 12 | 12 |
| التحكم 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 10 | 8 | 12 | 12 |
| التحكم 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7 | 11 | 12 | 12 |
| التحكم 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8 | 9 | 12 | 12 |
| التحكم 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 12 | 12 | 12 |
الجدول 1: الدرجات السلوكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توفر هذه الدراسة بروتوكولا لتوليد نموذج فئران البونتين الحاد. يمكن استخدام هذا النموذج للبحث عن التشخيص وإعادة التأهيل (بما في ذلك الألم المزمن بعد السكتة الدماغية) في مرضى السكتة الدماغية البونتين.
هناك عدة نقاط قوة لهذا الأسلوب. أولا، فإنه يوفر نموذج الفئران من احتشاء بونتين الحادة للدراسات المستقبلية. كما ذكر أعلاه، احتشاء البونتين هو نوع فرعي السكتة الدماغية الشائعة التي تلقت اهتماما أقل. وكان أحد أوجه القصور الرئيسية في أبحاث السكتة الدماغية عدم وجود نموذج احتشاء البونتين محددة. ثانيا ، بالمقارنة مع القائمة البونتين احتشاء نموذج الفئران عن طريق ربط BA15،16، يمكن تعديل هذا النموذج لتغيير الموقع والحجم من احتشاء وفقا للتصميم التجريبي. على سبيل المثال، يمكن تغيير طول الطرف بحيث يمتد الاحتشاء من سطح البون، كما هو الحال هنا.
بدلا من ذلك، يمكن أن تنشأ احتشاء الثغرات في البون عن طريق تقصير طول تلميح التحقيق(الشكل التكميلي 1). ويمكن أيضاً أن تُنشأ الاحشاءات في مواقع مختلفة من الـ 100 (أي احتشاء البونتينات السابقة) وفي مختلف الطبقات (أي الطبقات العليا والوسطى والسفلى) وفقاً للتصميم الطبوغرافي. في هذا النموذج، تم اختيار الطائرة البونتين العليا. ثالثاً، من السهل إنشاء هذا النموذج ويمتلك نسبة نجاح عالية. قد لا ينتج الربط بين مكتبة الإسكندرية احتشاء بسبب تداول الضمانات المحتمل15، ولكن هذا النموذج يؤسس الاحتشاء بمعدل نجاح مرتفع ، وهو أمر ضروري لنماذج بحثية موثوقة.
هناك بعض القيود من هذا الأسلوب. أولاً، الاحتشاء في هذا النموذج ليس ضربة حقيقية. السكتة الدماغية هي نتيجة لآفات الأوعية الدموية، اضطراب في محتويات الدم، أو خلل في تنظيم تدفق الدم الدماغي. يتم إنشاء احتشاء عن طريق آفة في البون التي لا تحدث تلقائيا. وبعبارة أخرى، لا يمكن استخدام هذا النموذج لمعالجة سبب حدوث السكتة الدماغية في البون. ثانياً، يتطلب هذا النموذج معدات خاصة، مثل الجهاز المنتج للآفات وجهاز التريوتكس.
في الختام، تثبت النتائج نجاح هذا النموذج في إنشاء نموذج تجريبي للسكتة الدماغية الحادة. استنادا إلى هذا النموذج الجديد، يمكن مواصلة التحقيق في فقدان الخلايا الناتجة والتكهن من احتشاء البونتين الحاد والسماح للتطورات العلاجية في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد حظيت هذه الدراسة بدعم مالي من المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم (81471181 و81870933) إلى جيانغ ومؤسسة العلوم الوطنية الصينية (رقم 81601011)، مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (رقم. BK20160345) إلى J. تشو والبرنامج العلمي للجنة الصحة البلدية قوانغتشو (20191A011083) إلى تشيو Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 sucture | Shanghai Jinzhong | Surgical instruments | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgical instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | Wear mask when using the system | |
| Bone cement | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Cured clamp | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| General tissue scissors | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 217181101 | |
| Lesion Making Device | Shanghai Yuyan | Making a lesion | |
| MRI system | Bruker Biospin | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Probe | Anke | Need some modification | |
| Q-tips | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Stereotaxic apparatus | RWD | ||
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| TTC | Sigma-Aldrich | BCBW5177 | For infarction confirmation in vitro |
References
- Zhu, J., et al. Suppression of local inflammation contributes to the neuroprotective effect of ginsenoside Rb1 in rats with cerebral ischemia. Neuroscience. 202, 342-351 (2012).
- Xu, X., et al. MicroRNA-1906, a Novel Regulator of Toll-Like Receptor 4, Ameliorates Ischemic Injury after Experimental Stroke in Mice. Journal of Neuroscience. 37, 10498-10515 (2017).
- McBride, D. W., Zhang, J. H. Precision Stroke Animal Models: the Permanent MCAO Model Should Be the Primary Model, Not Transient MCAO. Translational Stroke Research. , (2017).
- Liu, F., McCullough, L. D. Middle cerebral artery occlusion model in rodents: methods and potential pitfalls. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 464701 (2011).
- Jiang, Y., et al. A new approach with less damage: intranasal delivery of tetracycline-inducible replication-defective herpes simplex virus type-1 vector to brain. Neuroscience. 201, 96-104 (2012).
- Lopez, M. S., Vemuganti, R. Modeling Transient Focal Ischemic Stroke in Rodents by Intraluminal Filament Method of Middle Cerebral Artery Occlusion. Methods in Molecular Biology. 1717, 101-113 (2018).
- Pais-Roldan, P., et al. Multimodal assessment of recovery from coma in a rat model of diffuse brainstem tegmentum injury. NeuroImage. 189, 615-630 (2019).
- Merwick, A., Werring, D. Posterior circulation ischaemic stroke. The British Medical Journal. 348, 3175 (2014).
- Nogueira, R. G., et al. Thrombectomy 6 to 24 Hours after Stroke with a Mismatch between Deficit and Infarct. The New England Journal of Medicine. 378, 11-21 (2018).
- Wilkinson, D. A., et al. Late recanalization of basilar artery occlusion in a previously healthy 17-month-old child. Journal of Neurointerventional Surgery. 10, 17 (2018).
- Huang, R., et al. Stroke Subtypes and Topographic Locations Associated with Neurological Deterioration in Acute Isolated Pontine Infarction. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases: The Official Journal of National Stroke Association. 25, 206-213 (2016).
- Jiang, Y., et al. In-stent restenosis after vertebral artery stenting. International Journal of Cardiology. 187, 430-433 (2015).
- Huang, J., et al. Topographic location of unisolated pontine infarction. BMC Neurology. 19, 186 (2019).
- Banerjee, G., Stone, S. P., Werring, D. J. Posterior circulation ischaemic stroke. The British Medical Journal. 361, 1185 (2018).
- Wojak, J. C., DeCrescito, V., Young, W. Basilar artery occlusion in rats. Stroke: A Journal of Cerebral Circulation. 22, 247-252 (1991).
- Namioka, A., et al. Intravenous infusion of mesenchymal stem cells for protection against brainstem infarction in a persistent basilar artery occlusion model in the adult rat. Journal of Neurosurgery. , 1-9 (2018).
- Jiang, Y., et al. Intranasal brain-derived neurotrophic factor protects brain from ischemic insult via modulating local inflammation in rats. Neuroscience. 172, 398-405 (2011).
- Schaar, K. L., Brenneman, M. M., Savitz, S. I. Functional assessments in the rodent stroke model. Experiments in Translational and Stroke. 2, 13 (2010).
- Wu, L., et al. Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model. Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).
- Wen, Z., et al. Optimization of behavioural tests for the prediction of outcomes in mouse models of focal middle cerebral artery occlusion. Brain Research. 1665, 88-94 (2017).
