Summary
此处介绍的是通过单个脉冲的电刺激在大鼠模型中建立急性庞汀梗死的协议。
Abstract
庞汀梗死是后循环中最常见的中风亚型，而缺乏模仿庞汀梗死的啮齿动物模型。提供此为成功建立急性庞汀梗死大鼠模型的协议。使用重约250克的老鼠，使用立体气器将带绝缘护套的探针注入到庞体内。病变是由单个脉冲的电刺激产生的。Longa 分数、伯德森分数和梁平衡测试用于评估神经缺陷。此外，粘合去除体感测试用于确定感官运动功能，肢体放置测试用于评估自感知。然后使用 MRI 扫描来评估体内的梗塞，TTC 染色用于确认体外梗死。在这里，一个成功的梗死被识别，位于栖息的龙的外端基础。最后，提出了一种建立急性庞汀梗死大鼠模型的新方法。
Introduction
自 20 世纪 80 年代以来，硅胶导的中脑动脉闭塞（ MCAO ）模型在基础中风研究中得到了广泛的应用。还使用了其他方法（即：MCA2的一个分支的苏化和光化学诱发的焦梗死）。这些模型被人们从中可看做为基于MCA的中风模型，对研究中风和潜在治疗的病理生理机制大有贡献。虽然这些实验模型3、4,有局限性，但这些方法已被许多实验室5、6,使用。基于 MCA 的笔画模型表示前循环中的笔画;然而，很少有报道调查了模型模仿中风的后循环7。
前循环中风的病因、机理、临床表现和预后有显著差异。因此，前循环笔触模型得出的结果不能应用于后循环笔画。例如，前循环的再灌注时间窗口已延长至6小时，根据成像结果9，研究部分延长至24小时。然而，根据之前的报告10 和我们自己的临床经验，后循环的时间窗口可能超过24小时。这个拉长的再灌注时间窗口必须在实验模型中进一步研究和确认。
关于后循环中风，庞汀梗塞是最常见的亚型，占所有缺血性中风病例的71例，12例。根据梗塞地形，庞汀梗塞分为隔离和非隔离的庞汀梗塞13。孤立的庞汀梗塞根据基本机制分为三种类型：大动脉疾病（LAD）、罗勒动脉分支病（BABD）和小动脉疾病（SAD）。对14例庞汀梗死的临床调查，对庞汀梗死的机制、表现和预后有一些了解。然而，模仿庞汀梗死的啮齿动物模型却较少受到研究。
在以前的研究中，涉及庞的扩散脑干分段损伤已被探索7。一组试图通过连接罗勒动脉（BA）15，创建一个庞汀梗死模型。另一组使用10-0尼龙单丝缝合有选择地将近极BA的四点选择性地（16）的四点。此模型模仿 LAD， 但大多数庞廷梗死源于 BABD 和 SAD。此外，BA的选择性结扎是一个复杂的手术，具有很高的死亡率。
此处提供了一个详细的协议，用于通过电刺激进行易于执行、易于复制和成功的大鼠模型急性庞汀梗死。
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Protocol
该协议经广州医科大学第二附属医院动物护理与使用委员会审核通过。该委员会是AAACI认可的机构。这些老鼠是由南方医科大学动物中心提供的。
1. 动物
- 使用体重为250~10克的成年雄性斯普拉格-道利大鼠。
- 运输时，在控制环境条件下，在环境温度为25°C、相对湿度为65%和12小时/12小时光/暗循环的受控环境条件下，将大鼠在手术前至少1周。
- 提供食物和水。
2. 在庞斯中建立梗死
- 手术前称体重大鼠，根据下面描述的行为测试评估神经性能（第 3 节）。
- 麻醉前立即预热加热垫。
- 将头骨钻头连接到立体轴框架上的支架上。
- 内向注射大鼠50毫克/千克氯胺酮和5毫克/千克木胺。检查没有手趾捏响应。
- 将大鼠安装在立体声框架上，处于容易的位置。将耳杆放在耳道上方以固定头部。确保头骨保持水平，以避免注射有任何倾斜。
- 通过具有入口和出口口的大鼠的立体轴鼻锥附件，通过异氟兰（100% 氧气，2.5% 异氟）维持麻醉。使用加热垫将温度保持在 37°C，并在整个过程中监控温度。
- 使用眼药膏防止角膜干燥。使用钳子稍微捏紧爪子，以确保没有疼痛反应。
- 用微型剃须刀剃头骨的头发。从手术切口部位开始，向外旋转，以圆形方式涂抹氯己丁手术磨砂。
- 做一个3厘米的中线切口与手术刀从双边侧管线到0.5厘米后，后方丹勒，这应该用手术标记笔标记。
- 使用棉签去除血液。
- 将一块手术胶带放在皮肤皮瓣的每一侧，以暴露头皮（图1）。
- 用棉签轻轻取出头骨骨的结缔组织，浸在0.9%NaCl中。如果不取出，结缔组织将被夹在钻头中。
- 识别布雷格玛。选择啤酒的中心点作为原点，并使用细尖黑色手术标记笔标记它。
- 将钻头放在 6.0 mm AP、2.0 mm ML（范围为 0.5~3.0 mm，图 2A）。
- 使用自动钻头进行颅骨切除术（直径为 1 毫米）。请仔细操作，因为此点靠近静脉鼻窦。
- 从立体声框架中卸下钻头。
- 在立体轴框架中放置一个带绝缘护套的 22 G 探头（图 3A）。探头的尖端应放置在护套近端上方 2 mm（图3A，B;图2B）。
- 确保护套进入大脑 7 毫米（7 毫米 DV， 图 2B; 图1C.
- 沿着护套推进探针（图1D），直到探针尖端低于大脑表面9毫米（图2D）。
- 将电极连接到电气刺激器（图3C）。将阳极连接到探头，如图 1D 所示。将阴极连接到大鼠（通常连接到大鼠的耳朵）。
- 打开电气刺激器并设置以下参数：单脉冲宽度 = 4，050 ms;电压 = 50 V;和电流 = 4 mA （图 3C）在电刺激期间，大鼠会表现出颤抖。在这项研究中，对于用于行为测试、MRI和TTC的对照组大鼠，该设备未打开。
- 刺激后将探头留在位置 5 分钟。
- 从大脑中取下探针（图1F）。
- 使用骨水泥覆盖颅骨切除术。在缠绕之前，让水泥干燥。
- 用4-0聚酰胺缝合丝缝合伤口。三个或四个节后，打2-1-1标准手术结。
- 将青霉素注射给大鼠（0.25 mL，80 IU稀释于4 mL的盐水中）内，以防止感染。
- 以2mg/kg的剂量将小鼠皮下注射，然后每24小时重复一次。
- 每15分钟监测一次大鼠，直到完全清醒，然后用加热垫将它们返回到笼子。提供免费食物和水，直到牺牲。
注：所有程序应遵循无菌手术原则。手术前，在手术擦洗双手后戴上磨砂上衣、手术面罩和无菌手套。始终在无菌场内保持无菌缝合材料。
3. 行为测试
- 龙加得分17
- 把老鼠放在桌子的表面上。
- 记录分数如下： 0 = 无神经缺陷;1 = 未能完全扩展反向前爪，轻度焦点神经缺陷;2 = 向左盘旋，中度焦点神经缺陷;3 = 向左下降，严重焦点赤字;4 = 没有自发的行走和沮丧的意识水平。
- 伯德森得分18
- 抓住老鼠的尾巴，让前肢伸手找张桌子。记录分数如下： 0 = 两肢到达表;1 = 只有一个肢体到达表。
- 将动物放在粗糙的表面上。将分数记录如下：0 = 在推时在粗糙表面上具有很强的抓地力，阻力很大;1 = 仅见一只爪子的轻微阻力;2 = 向一个方向推进时无电阻。
- 将大鼠放在封闭区域（18 in = 36 in），并允许它自由漫游。将分数记录如下：0 = 行走整个机柜长度而不盘旋;1 = 盘旋走整个外壳长度;2 = 不能走外壳的长度，但可以圈;3 = 不能移动太多。使用每个任务的评估分数的总和作为最终评估分数。
- 平衡光束测试19
- 确保设备由 3 厘米宽和 70 厘米长的光束组成，且比地板高 20 厘米。将一个变暗的盒子放在横梁的远端，有一个狭窄的入口。
- 将白噪声发生器和明亮的光源放在光束的起动处。噪音和光线被用来激励老鼠穿过光束并进入目标框。
- 当动物进入黑暗的盒子时，终止刺激。记录延迟以到达目标框（以秒为单位）和大鼠在穿过光束时的后体性能。
- 将每项表演的分数记录如下：0 = 平衡与稳定的姿势;1 = 抓住光束的一侧;2 = 拥抱光束和 1 肢体从横梁上脱落;3 = 拥抱光束和两肢从光束脱落，或在 >60 s 后在横梁上旋转;4 = 尝试平衡光束，但在 >40 s 后脱落;5 = 尝试平衡光束，但在 >20 s 后脱落;和 6 = 脱落， 没有试图平衡或挂在光束后 <20s 。
- 粘合剂去除体感测试20
- 将大鼠放在一个清晰的有机玻璃盒中，让它们探索新的环境2或3分钟。
- 将直径为 10 mm 的绿色胶粘剂标签放在拇指上方和手腕上每个前肢的内表面。
- 把老鼠还到有机玻璃盒里
- 分别记录大鼠删除第一个标签和所有其他标签的时间。最多 3 分钟。测试应在培训中进行 2 次。
- 肢体放置测试
- 将大鼠保持水平位置，防止移动。
- 一旦大鼠与表表面（被动肢体运动）失去接触，使用触觉和自感知刺激对具有表边缘的爪子。
- 评估爪子（成功或失败）在表边缘的位置。
- 将分数记录如下： 0 = 无放置;0.5 = 未完成的和/或延迟放置;1 = 立即和完整的放置。
4. MRI 的梗死确认
- 手术后24小时进行MRI扫描。
- 用异氟兰化麻醉大鼠（5%用于感应，1%=1.5%用于维护）。
- 将鼠头固定到大鼠大脑阵列线圈中，并结合一个仅传输体积线圈。
- 将线圈和大鼠放在 MRI 扫描仪中。使用牙齿和耳杆将大鼠固定在底座内。
- 在 MRI 扫描过程中，使用闭路热护套将体温保持在 37 °C ± 0.5 °C。
- 使用先导序列确保几何体正确。
- 使用快速旋转回声序列收集 T2 加权扫描：回波时间 （TE） = 33 ms;重复时间 （TR） = 8，000 ms;视野 = 30 毫米 x 30 毫米;采集矩阵 = 512 = 512;50 片;0.4 毫米厚。
- 收集四枪自旋回波平面成像 DWI 扫描：回波时间 = 30.5 ms;重复时间 = 8000 ms;矩阵 = 96 = 96;视野 = 25 毫米 x 25 毫米;三个方向 = x， y， z;B 值 = 0 1，000 s/mm2 和 1，000 s/mm2;50个连续轴向片;0.4 毫米厚。
- 把老鼠关在笼子里。
5. TTC 染色的梗塞确认
- 根据实验设计在时间点牺牲大鼠。在这个实验中，我们在手术后24小时牺牲了老鼠。
- 在牺牲前准备 2% 的 TTC 解决方案。将 0.2 g TTC 粉末添加到 10 mL 0.01 M PBS （pH 7.4） 中。将稀释液转移到用银纸覆盖的 10 厘米盘中，并在水浴中预谋至 37 °C。
- 使大鼠暴露在5%的异氟，直到失去知觉。然后，将大鼠暴露在 CO2 中（每分钟笼体积的 20%~30%，直到呼吸停止，然后保持 2 分钟的 CO2 暴露。
- 使用以下迹象确认死亡：胸部无上升和下降，心跳无明显，粘膜颜色差，对双趾捏、眼睛颜色变化或不透明度无反应。
- 进行宫颈脱位。
- 通过将爪子贴在无菌平台上，保护动物。创建一个中线切口从锁骨到下部切口，以及从西腓到左沿肋骨的横向切口。在隔膜上也沿着肋骨和胸中线切口切口，以暴露心脏。
- 将针头（27 G）连接到左心室4°C时含有0.01 M PBS的灌注泵。
注：沿心室左边缘前进尖端，以避免进入中庭。打开灌注泵，确保尖端位于左心室，并切割右心房。如果液体从鼻孔排出，尖端位于中庭中，需要调整或重新插入。 - 使用约 100 mL 的 0.01 M PBS，保持在 4 °C 进行灌注。关闭灌注泵，直到肝脏变白。
- 斩首老鼠，用剪刀和钳子解剖整个大脑。用印迹纸去除大脑表面的任何水。
- 将整个大脑储存在-80°C1分钟（冷冻后切割大脑部分更容易）。
注：如果大脑部分可以很好地切割而不冻结，可以跳过此步骤。 - 将大脑放入矩阵中，将侧对处向上。
- 识别大脑表面的孔，如图 1G 所示， 并插入一个 0.21 毫米厚的不锈钢刀片。通常，梗塞的最大区域是探针的平面;因此，应在该区域中插入一个刀片。
- 以 2 mm 的间隔插入其他刀片。
- 同时从矩阵中同时取出刀片，将整个大脑与刀片放在菜中的TTC溶液中。小心地拆下刀片。
注：在这里，大脑部分不容易从液体中去除，因为一些残留的皮娅母体在基础颅骨干扰切节。如果矩阵中保留任何部分，请使用小铲子将它们转移到菜中。 - 将带TTC溶液和大脑部分的菜在37°C的水浴中。
- 每 5 分钟检查一次菜盘，确保部分没有重叠。
- 在盘中加入10 mL的4%的甲醛溶液，以终止TTC反应。
- 将部分从罗体定向到花根并拍照。
6. 统计
- 使用统计分析软件（例如 GraphPad 棱镜）执行学生 t-测试。
注：所有数据均以均值 = SE 表示。组之间的差异通过双尾学生 t检验（p < 0.05 定义为统计显著性）确定。
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Representative Results
六只动物接受了上述手术方案。图 4 所示的 对照组 由六只大鼠组成。图 4 所示的大脑 切片来自 每组一只大鼠。
MRI扫描显示，梗死位于庞的基座（图4A）。由于探头被注射到中线左侧 2 mm，因此梗塞被横向定位。这种梗死模仿了患者的异端蓬汀梗塞（图4A）。由于使用了绝缘护套，因此除了探针的尖端，包括皮层、小脑和中脑（图4A），没有梗塞。DWI图像还显示了急性庞汀梗死（图4A）。
TTC染色用于确认手术后24小时梗死（图4A）。与对照组相比，梗塞量明显较高（图4B）。
手术前和手术后的行为得分被测量。手术前和手术后对照组和错误模型组的分数见表 1。 由于缺乏为庞汀梗死设计的特定行为测试，使用朗加分数、伯德森评分和平衡梁测试来评估神经缺陷。此外，胶粘剂去除躯体感官测试，以评估感官运动功能，以及肢体放置测试，以评估自感知。
与对照组相比，有庞汀梗塞的老鼠在左边盘旋（图4A）。Longa 得分存在显著差异 （2.67 = 0.52 vs. 0， p < 0.05，图 4C）， Berderson 分数 （2.67 = 0.52 Figure 4Dvs. 0， p < 0.05，图4E），光束平衡测试p 分数（118.33 × 2.66 vs. 10.17 = 1.47，p < 0.05，p 图4F），和 胶粘剂去除体感测试分数（2.33 = 0.52 vs. 12.0 = 0，p < 0.05，图4G）大鼠与庞汀梗死大鼠和控制组大鼠之间。
图1：梗塞建立。 （A） 头骨上打的洞.（B） 护套被移到洞里。（C） 护套的喷射。（D） 探头的喷射。（E） 阳极（红色箭头）已连接。（F） 探头被移除。（G） 脑表面留下的孔（红箭头）。 请点击这里观看此视频。（右键单击即可下载。
图2：探头的位置。 （A） 立体轴位置的示意图：箭头指向皮瓣的缩回、布雷格玛的场地和钻头的定位。（B） 护套和探针的示意图。（C） 放置在庞的护套尖端的位置。（D） 放置在孔中的探针尖端的位置。（E） 实验设计。 请点击这里观看此视频。（右键单击即可下载。
图3：生产病变装置。 （A） 护套和探头的分离。（B） 护套中的探头。（C） 蓝色电极是连接到考达尔探头的阳极;红色电极是阴极。（D） 电气刺激器。（E） 手术器械。 请点击这里观看此视频。（右键单击即可下载。
图4：代表性结果。 （A） 梗塞由体内T2和DWI序列的MRI扫描评估，手术后24小时由TTC体外染色确认。位于右边龙（虚线）的急性庞汀梗塞。行为测试表明，大鼠在病变的对侧盘旋。（B） 梗塞量。（C） 长分.（D） 贝德森得分。（E） 肢体放置测试。（F） 平衡梁行走测试.（G） 胶粘剂去除体感测试。条形表示均值 = SD（p < 0.05 与对照组）。 请点击这里观看此视频。（右键单击即可下载。
图S1：拉库纳尔在庞斯梗死。探针尖端的长度正在缩短。MRI 扫描显示右庞的拉库纳尔梗死。（A） T2 图像。（B） DWI 图像。请点击这里观看此视频。（右键单击即可下载。
| 鼠号 | 龙加得分 | 伯德森得分 | 平衡光束测试 | 粘合去除体感测试 | 肢体放置测试 | |||||
| 前 | 手术后 | 前 | 手术后 | 前 | 手术后 | 前 | 手术后 | 前 | 手术后 | |
| 庞廷梗死 1 | 0 | 3 | 0 | 2 | 0 | 5 | 6 | 120 | 12 | 2 |
| 庞廷梗死 2 | 0 | 2 | 0 | 3 | 0 | 4 | 8 | 120 | 12 | 3 |
| 庞廷梗死 3 | 0 | 3 | 0 | 3 | 0 | 5 | 8 | 116 | 12 | 2 |
| 庞廷梗死 4 | 0 | 3 | 0 | 3 | 0 | 4 | 6 | 120 | 12 | 2 |
| 庞廷梗死 5 | 0 | 3 | 0 | 2 | 0 | 5 | 7 | 114 | 12 | 2 |
| 庞廷梗死 6 | 0 | 2 | 0 | 3 | 0 | 5 | 7 | 120 | 12 | 3 |
| 控制 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| 控制 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8 | 10 | 12 | 12 |
| 控制 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 10 | 8 | 12 | 12 |
| 控制 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7 | 11 | 12 | 12 |
| 控制 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8 | 9 | 12 | 12 |
| 控制 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 12 | 12 | 12 |
表1：行为分数。
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Discussion
本研究为生成急性庞汀梗死大鼠模型提供了一种方案。该模型可用于研究蓬汀中风患者的预后和康复（包括中风后慢性疼痛）。
这种方法有几个优点。首先，它为今后的研究提供了急性庞汀梗死的老鼠模型。如上所述，庞汀梗塞是一种常见的中风亚型，受到的关注较少。中风研究的一个主要缺点是缺乏特定的庞汀梗死模型。其次，与BA15、16的结扎现有庞汀梗死大鼠模型相比，该模型可以根据实验设计进行调整，以改变梗死的位置和体积。例如，可以更改尖端的长度，以便梗塞从 pons 的表面延伸，就像这里完成一样。
或者，可以通过缩短探针尖端的长度（补充图1）来建立孔中的拉库纳尔梗死。也可以根据地形设计在庞子的不同位置（即龙的异端孔梗塞）和庞斯的不同平面（即上、中、下平面）中创建梗塞。在此模型中，选择了上庞廷平面。第三，该模型易于建立，具有较高的成功率。英航的结扎可能不会产生梗死，由于潜在的附带循环15，但这种模式建立梗死在高成功率，这是可靠的研究模型至关重要。
此方法有一些限制。首先，此模型中的梗塞不是真正的中风。中风是血管病变、血液含量紊乱或脑血流调节功能障碍的结果。梗死是由不自发发生的庞然大精的病变引起的。换句话说，此模型不能用于解决笔画在 pons 中发生的原因。其次，该模型需要特殊设备，如病变生产装置和立体技术装置。
总之，这一发现证明该模型在建立实验性急性庞中风模型方面是成功的。基于这一新模型，可以进一步研究急性蓬汀梗死的细胞损失和预后，并为未来的治疗发展。
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Disclosures
无利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了中国自然科学基金（81471181和81870933）和江苏省自然科学基金（第81601011号）的财政支持（BK20160345）给朱J和广州市卫生局科学计划（20191A011083）给邱Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 sucture | Shanghai Jinzhong | Surgical instruments | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgical instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | Wear mask when using the system | |
| Bone cement | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Cured clamp | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| General tissue scissors | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 217181101 | |
| Lesion Making Device | Shanghai Yuyan | Making a lesion | |
| MRI system | Bruker Biospin | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Probe | Anke | Need some modification | |
| Q-tips | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Stereotaxic apparatus | RWD | ||
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| TTC | Sigma-Aldrich | BCBW5177 | For infarction confirmation in vitro |
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