Summary
Hier gepresenteerd is een protocol voor het vaststellen van acute pontine infarct in een rat model via elektrische stimulatie met een enkele puls.
Abstract
Pontine infarct is de meest voorkomende slag subtype in de achterste circulatie, terwijl er ontbreekt een knaagdier model nabootsen pontine infarct. Mits hier is een protocol voor het succesvol vaststellen van een rat model van acute pontine infarct. Ratten met een gewicht van ongeveer 250 g worden gebruikt, en een sonde met een geïsoleerde schede wordt geïnjecteerd in de pons met behulp van een stereotaxic apparaat. Een laesie wordt veroorzaakt door de elektrische stimulatie met een enkele puls. De Longa score, Berderson score, en balk balans test worden gebruikt om neurologische tekorten te beoordelen. Daarnaast wordt de kleefverwijdering somatosensorische test gebruikt om de sensorimotorische functie te bepalen, en de ledemaat plaatsing test wordt gebruikt om proprioceptie te evalueren. MRI-scans worden vervolgens gebruikt om het infarct in vivo te beoordelen, en TTC-kleuring wordt gebruikt om het infarct in vitro te bevestigen. Hier wordt een succesvol infarct geïdentificeerd dat zich in de anterolaterale basis van de rostralpons bevindt. Tot slot wordt een nieuwe methode beschreven om een acuut pontïneinfarct rat model vast te stellen.
Introduction
Sinds de jaren 1980, de middelste cerebrale slagader occlusie (MCAO) model geïnduceerd door siliconen filamenten is op grote schaal gebruikt in de fundamentele slag onderzoek1. Er zijn ook andere methoden gebruikt (d.w.z. het hechten van één tak van de MCA2 en fotochemisch geïnduceerde focale infarcten). Deze modellen zijn genoemd MCA-gebaseerde slagmodellen en hebben sterk bijgedragen aan onderzoeken van de pathofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan beroerte en potentiële therapieën. Hoewel er beperkingen van deze experimentele modellen3,4, deze methoden zijn gebruikt veel laboratoria5,6. Op MCA gebaseerde slagmodellen vertegenwoordigen een beroerte in de voorste circulatie; echter, weinig rapporten hebben onderzocht modellen nabootsen beroerte in de achterste circulatie7.
Er zijn significante verschillen tussen de etiologie, mechanismen, klinische manifestatie en prognose tussen voorste en achterste circulatieslagen8. Daarom kunnen de resultaten die zijn afgeleid van voorste circulatieslagmodellen niet worden toegepast op een circulatieslag achteraf. Zo is het reperfusietijdvenster voor voorste circulatie uitgebreid tot 6 uur, met een klein deel van de studies die zich uitstrekken tot 24 uur op basis van beeldvormingsbevindingen9. Echter, het tijdvenster voor achterste circulatie kan langer zijn dan 24 uur, volgens eerdere rapporten10 en onze eigen klinische ervaringen. Dit langwerpige reperfusietijdvenster moet verder worden bestudeerd en bevestigd in experimentele modellen.
Wat de achterste circulatieslagen betreft, is het pontijninfarct het meest voorkomende subtype, goed voor 7% van alle ischemische beroertegevallen11,12. Volgens infarcttopografie, pontine infarcten zijn verdeeld in geïsoleerde en niet-geïsoleerde pontine infarcten13. Geïsoleerde pontijn infarcten zijn gecategoriseerd in drie soorten op basis van de onderliggende mechanismen: grote slagaderziekte (LAD), basilarslagader tak ziekte (BABD), en kleine slagaderziekte (SAD). Kennis van de mechanismen, manifestatie en prognose van pontine infarct is afgeleid van klinische onderzoeken van gevallen14. Echter, een knaagdier model nabootsen pontine infarct is minder onderzocht.
In eerdere studies, diffuse hersenstam tegmentum letsel waarbij de pons is onderzocht7. Een groep probeerde een pontine infarct model te creëren via ligatie van de basilaire slagader (BA)15. Een andere groep gebruikte een 10-0 nylon monofilament hechting om selectief te ligate vier punten van de proximale BA selectief16. Dit model bootst LAD na, maar de meeste pontine infarcten zijn het gevolg van BABD en SAD. Bovendien is selectieve ligatie van de BA een ingewikkelde operatie en heeft een hoog sterftecijfer.
Hier is een gedetailleerd protocol voor een gemakkelijk uit te voeren, gemakkelijk gereproduceerd, en succesvolle rat model van acute pontine infarct door elektrische stimulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol werd beoordeeld en goedgekeurd door de Institution Animal Care and Use Committee van the Second Affiliated Hospital van guangzhou Medical University, een instelling geaccrediteerd door AAALACi. De ratten werden geleverd door het Animal Center van de Southern Medical University.
1.
- Gebruik volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht van 250 ± 10 g.
- Bij transport huisvesten de ratten ten minste 1 week voor de operatie onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden met een omgevingstemperatuur van 25 °C, relatieve vochtigheid van 65%, en 12 h/12 h licht/donker cyclus.
- Zorg voor voedsel en water ad libitum.
2. Vaststelling van een infarct in de pons
- Weeg de ratten voorafgaand aan de operatie af en beoordeel neurologische prestaties volgens de hieronder beschreven gedragstests (sectie 3).
- Verwarm het verwarmingskussen onmiddellijk voor anesthesie voor.
- Bevestig de schedelboor aan de houder op het stereotaxic frame.
- Intraperitoneally injecteren de ratten met 50 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine. Controleer op het ontbreken van teen-pinch reactie.
- Monteer de rat in een liggende positie op het stereotaxicframe. Plaats de oorbalken boven de gehoorgang om het hoofd vast te zetten. Zorg ervoor dat de schedel horizontaal wordt gehouden om scheeftrekking van de injectie te voorkomen.
- Houd anesthesie door isoflurane (100% zuurstof, 2,5% isoflurane) via een stereotaxic neuskegel bevestiging voor ratten met inlaat- en uitlaatpoorten. Houd de temperatuur op 37 °C met behulp van een verwarmingskussen en controleer de temperatuur gedurende de hele procedure.
- Gebruik oogzalf om het drogen van hoornvlies te voorkomen. Gebruik tangen om de poten iets te knijpen om ervoor te zorgen dat er geen pijnrespons is.
- Scheer het haar van de schedel met een micro-scheerapparaat. Breng chloorhexidine chirurgische scrub in een cirkelvormige manier te beginnen bij de chirurgische incisie site en draaien naar buiten.
- Maak een 3 cm middellijn incisie met een scalpel van de lijn van de bilaterale laterale canthus tot 0,5 cm achter de achterste fontanelle, die moet worden gemarkeerd door een chirurgische marker pen.
- Gebruik een wattenstaafje om een bloed te verwijderen.
- Plaats een stuk chirurgische tape geplaatst op elke kant van de huid flap om de hoofdhuid bloot(Figuur 1).
- Verwijder voorzichtig de bindweefsels van het schedelbot met een wattenstaafje gedoopt in 0,9% NaCl. Als niet verwijderd, zullen de bindweefsels verstrikt raken in de boor.
- Identificeer de bregma. Kies het centrale punt van de bregma als oorsprongspunt en markeer het met behulp van een fijne zwarte chirurgische markerpen.
- Plaats een boor op 6,0 mm AP, 2,0 mm ML (bereik van 0,5–3,0 mm, figuur 2A).
- Voer craniotomie (1 mm diameter) uit met behulp van een automatische boor. Ga voorzichtig te werk, want dit punt is dicht bij de veneuze sinus.
- Verwijder de boor uit het stereotaxic-frame.
- Plaats een 22 G sonde met een geïsoleerde schede in het stereotaxic frame(Figuur 3A). De punt van de sonde moet 2 mm boven het proximale uiteinde van de schede worden geplaatst (figuur 3A,B; Figuur 2B).
- Zorg ervoor dat de schede 7 mm (7 mm DV, figuur 2B; Figuur 1C).
- Ga de sonde langs de schede(figuur 1D) naar het puntje van de sonde 9 mm onder het oppervlak van de hersenen(figuur 2D).
- Sluit de elektroden aan op een elektrische stimulator(figuur 3C). Sluit de anode aan op de sonde zoals weergegeven in figuur 1D. Sluit de kathode aan op de ratten (meestal op het oor van de ratten).
- Zet de elektrische stimulator aan en stel de volgende parameters in: enkele pulsbreedte = 4.050 ms; spanning = 50 V; en huidige = 4 mA (figuur 3C). Tijdens elektrische stimulatie zal de rat beven vertonen. In deze studie werd het apparaat niet ingeschakeld voor controlegroepratten die werden gebruikt voor de gedragstests, MRI en TTC.
- Laat de sonde 5 minuten in positie na stimulatie.
- Verwijder de sonde uit de hersenen(figuur 1F).
- Gebruik botcement om de craniotomie te bedekken. Laat het cement drogen voordat de wond hecht.
- Hecht de wond met 4-0 polyamide hechting filamenten. Na drie of vier stiches, gelijkspel 2-1-1 standaard chirurgische knopen.
- Injecteer de ratten met penicilline (0,25 mL, 80 IE verdund in 4 mL zout) intraperitoneally om infectie te voorkomen.
- Injecteer de ratten onderhuids met meloxicam bij een dosis van 2 mg/kg en herhaal het vervolgens om de 24 uur.
- Controleer de ratten om de 15 minuten tot volledig wakker en breng ze terug naar de kooi met een verwarmingskussen. Geef gratis toegang tot voedsel en water tot het offer.
OPMERKING: Alle procedures moeten de aseptische chirurgische principes volgen. Vóór de operatie, op een scrub top, chirurgisch masker en steriele handschoenen na een chirurgische scrub van de handen. Houd te allen tijde steriel hechtmateriaal in het steriele veld.
3. Gedragstests
- Longa score17
- Plaats de ratten op het oppervlak van de tafel.
- Recordscores als volgt: 0 = geen neurologisch tekort; 1 = het niet volledig uitbreiden van contralaterale voorpoot, een mild focale neurologisch tekort; 2 = naar links cirkelend, een matig focale neurologisch tekort; 3 = naar links vallen, een ernstig brandpuntstekort; 4 = geen spontaan lopen en een depressief bewustzijnsniveau.
- Berderson score18
- Houd de rat bij de staart en laat de voorpoten uit te reiken voor een tafel. Nota van de scores als volgt: 0 = beide ledematen bereikt de tafel; 1 = slechts één ledemaat bereikt de tafel.
- Plaats het dier op een ruw oppervlak. Nota van de scores als volgt: 0 = een sterke greep op het ruwe oppervlak met een goede weerstand wanneer geduwd; 1 = een lichte weerstand slechts gezien in een poot; 2 = geen weerstand wanneer geduwd in een richting.
- Plaats de rat in een afgesloten gebied (18 in × 36 inch) en laat hem vrij rondlopen. Nota van de scores als volgt: 0 = loop de gehele lengte van de behuizing zonder te cirkelen; 1 = loop over de gehele lengte van de behuizing met cirkelen; 2 = kan niet lopen de lengte van de behuizing, maar kan cirkel; 3 = kan niet veel bewegen. Gebruik de som van de beoordelingsscores van elke taak als de uiteindelijke beoordelingsscore.
- Balansstraaltest19
- Zorg ervoor dat het apparaat bestaat uit een 3 cm brede en 70 cm lange balk en zich 20 cm boven de vloer bevindt. Plaats een verduisterde doos aan het uiteinde van de balk met een smalle toegangsweg.
- Plaats een witte ruisgenerator en heldere lichtbron aan het begin van de straal. Het geluid en het licht werden gebruikt om de rat te motiveren om de straal te doorkruisen en het doelvak in te voeren.
- Beëindig de prikkels wanneer de dieren in de verduisterde doos komen. Neem de latentie op om het doelvak (in seconden) en achterpootprestaties van de rat te bereiken bij het doorkruisen van de balk.
- Nota van de scores voor elke voorstelling als volgt: 0 = saldi met een stabiele houding; 1 = grijpzijde van de balk; 2 = knuffels balk en 1 ledemaat valt af van balk; 3 = knuffels balk en twee ledematen vallen van de balk, of spint op balk na >60 s; 4 = pogingen om te balanceren op balk, maar valt af na >40 s; 5 = pogingen om te balanceren op balk, maar valt af na >20 s; en 6 = valt af, geen poging om te balanceren of hangen aan balk na <20 s.
- Lijmverwijdering somatosensorische test20
- Plaats de ratten in een duidelijke plexiglas doos en laat ze de nieuwe omgeving te verkennen voor 2 of 3 min.
- Plaats een groen kleurkleeflabel met een diameter van 10 mm op het binnenoppervlak van elke voorpoot boven de duim en op de pols.
- Breng de ratten terug naar de plexiglas doos.
- Nota van de tijd voor de rat om het eerste etiket en alle andere labels te verwijderen, respectievelijk. Laat maximaal 3 min. De test moet 2x in training worden uitgevoerd.
- Ledemaat plaatsing test
- Houd de ratten in een horizontale positie en voorkom beweging.
- Zodra de rat het contact met het tafeloppervlak verliest (passieve ledemaatbeweging), breng dan tactiele en proprioceptieve stimuli aan op de poot met de tafelrand.
- Beoordeel de plaatsing van de poot (succes of falen) op de tafelrand.
- Nota van de scores als volgt: 0 = geen plaatsing; 0,5 = onvoltooide en/of vertraagde plaatsing; 1 = onmiddellijke en volledige plaatsing.
4. Infarct bevestiging door MRI
- Voer de MRI-scan 24 uur na de operatie.
- Verdoven de rat door isoflurane (5% voor inductie, 1%-1,5% voor onderhoud).
- Zet de rattenkop vast in een rat brain array coil en gecombineerd met een volumespoel met alleen overbrengen.
- Plaats de spoel en de rat in de MRI-scanner. Zet de rat in de wieg met behulp van de tand- en oorbalken.
- Houd de lichaamstemperatuur op 37 °C ± 0,5 °C tijdens de MRI-scanprocedure met behulp van een gesloten thermisch jasje.
- Gebruik een proefreeks om de juiste geometrie te garanderen.
- Verzamel T2-gewogen scans met behulp van een fast-spin echo sequentie: echo tijd (TE) = 33 ms; herhalingstijd (TR) = 8.000 ms; gezichtsveld = 30 mm x 30 mm; overnamematrix = 512 × 512; 50 plakjes; 0,4 mm dik.
- Verzamel een vier-shot spin-echo planar imaging DWI scans: echo tijd = 30,5 ms; herhalingstijd = 8000 ms; matrix = 96 × 96; gezichtsveld = 25 mm x 25 mm; drie richtingen = x, y, z; B-waarden = 0,000 s/mm2 en 1.000 s/mm2; 50 aaneengesloten axiale plakjes; 0,4 mm dik.
- Breng de ratten terug naar de kooi.
5. Infarct bevestiging door TTC kleuring
- Offer de ratten op het momentpunt volgens het experimentele ontwerp. In dit experiment offerden we de ratten 24 uur na de operatie op.
- Bereid een 2% TTC oplossing voor het offer. Voeg 0,2 g TTC-poeder toe aan de 10 mL 0,01 M PBS (pH 7.4). Breng de verdunning over in een schaal van 10 cm bedekt met zilverpapier en voorverwarmd tot 37 °C in een waterbad.
- Stel de rat bloot aan 5% isoflurane tot bewustzijnsverlies. Stel de rat vervolgens bloot aan CO2 (20%-30% van het volume van de kooi per min) totdat de ademhaling is gestopt en behoudt vervolgens 2 min CO2-blootstelling.
- Gebruik de volgende tekenen om de dood te bevestigen: geen stijgende en dalende borst, geen voelbare hartslag, slechte slijmvlieskleur, geen reactie op teenknijpen, kleurverandering of dekking in de ogen.
- Voer cervicale dislocatie uit.
- Zet de dieren vast door de poten op een steriel platform te tappen. Maak een middellijnincisie van het sleutelbeen naar het hypogastrium en een laterale incisie van de xiphoid naar links langs de ribbenkast. Maak een snede in het middenrif ook langs de ribbenkast en een thorax middellijn incisie om het hart bloot te stellen.
- Sluit de punt van een naald (27 G) aan op een perfusiepomp met 0,01 M PBS bij 4 °C in de linkerventrikel.
OPMERKING: Verschot de punt langs de linkerrand van de ventrikel om te voorkomen dat het atrium binnenkomt. Zet de perfusiepomp aan om ervoor te zorgen dat de punt zich in de linkerventrikel bevindt en snijd het rechteratrium door. Als de vloeistof uit het neusgat loopt, bevindt de punt zich in het atrium en moet deze worden aangepast of opnieuw worden geplaatst. - Gebruik ongeveer 100 mL van 0,01 M PBS, gehandhaafd op 4 °C voor perfusie. Zet de perfusiepomp uit totdat de lever wit wordt.
- Onthoofd de ratten en ontleed de hele hersenen met behulp van de schaar en tangen. Verwijder alle water van het hersenoppervlak met blotting papier.
- Bewaar de hele hersenen op -80 °C gedurende 1 min (het snijden van hersensecties is gemakkelijker na het invriezen).
LET OP: Deze stap kan worden overgeslagen als de hersensecties goed kunnen worden gesneden zonder bevriezing. - Plaats de hersenen in de matrix met de rugkant omhoog.
- Identificeer het gat in het oppervlak van de hersenen zoals weergegeven in figuur 1G en steek een roestvrij stalen 0,21 mm dik blad in. Meestal is het grootste gebied van infarct in het vlak van de sonde; Daarom moet in deze regio één mes worden ingebracht.
- Plaats de andere bladen met een interval van 2 mm.
- Verwijder tegelijkertijd de messen, allemaal tegelijk, uit de matrix en plaats de hele hersenen met de messen in de TTC-oplossing in de schotel. Verwijder de messen voorzichtig.
OPMERKING: Hier werden de hersensecties niet gemakkelijk uit de vloeistof verwijderd omdat sommige resterende pia mater in de basis cranii interfereerde met de doorsnede. Als er secties in de matrix blijven, gebruik dan een kleine spatel om ze over te brengen naar de schotel. - Plaats de schotel met TTC-oplossing en hersensecties in een waterbad op 37 °C.
- Controleer de schotel om de 5 minuten en zorg ervoor dat er geen overlap van secties.
- Voeg 10 mL van 4% paraformaldehydeoplossing toe aan de schotel om de TTC-reactie te beëindigen.
- Oriënteer de secties van de rostral naar caudal en neem foto's.
6. Statistieken
- Gebruik statistische analysesoftware (bijvoorbeeld GraphPad Prism) om de t-testvan een student uit te voeren.
OPMERKING: Alle gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SE. Verschillen tussen groepen worden bepaald met twee-tailed Student's t-tests(p < 0,05 gedefinieerd als statistische significantie).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zes dieren werden onderworpen aan het hierboven beschreven operatieprotocol. De controlegroep zoals weergegeven in figuur 4 bestond uit zes ratten. De hersenplakjes in figuur 4 zijn afgeleid van één rat per groep.
Uit de MRI-scan bleek dat het infarct zich bevond in de basis van de pons(figuur 4A). Aangezien de sonde 2 mm aan de linkerkant van de middellijn werd geïnjecteerd, werd het infarct zijdelings gevestigd. Dit infarct bootst anterolaterale pontine infarcten na bij patiënten (Figuur 4A). Omdat een geïsoleerde schede werd gebruikt, was er geen infarct buiten het puntje van de sonde met inbegrip van de cortex, cerebellum, en midbrain (Figuur 4A). DWI beelden bleek ook de acute pontine infarct (Figuur 4A).
TTC kleuring werd gebruikt om het infarct te bevestigen 24 uur na de operatie(Figuur 4A). In vergelijking met de controlegroep was het infarctvolume aanzienlijk hoger (figuur 4B).
Gedragsscores werden gemeten voor en na de operatie. De scores voor de controle- en infractmodelgroepen voor en na de operatie worden gepresenteerd in tabel 1. Vanwege het ontbreken van een specifieke gedragstest ontworpen voor pontine infarct, de Longa score, Berderson score, en balans balk test werden gebruikt om de neurologische tekorten te beoordelen. Bovendien, de lijm verwijderen somatosensorische test om de sensorimotorische functie te beoordelen, evenals ledemaat-plaatsing test om de proprioceptie te beoordelen.
Vergeleken met de controlegroep cirkelden de ratten met pontine-infarct naar links(figuur 4A). Er waren significante verschillen in Longa score (2,67 ± 0,52 vs. 0, p < 0,05, Figuur 4C),Berderson score (2,67 ± 0,52 vs. 0, p < 0,05, figuur 4D),ledemaat plaatsingstest (4,67 ± 0,52 vs. 0, p < lt; 0,05, figuur 4E), bundelbalanstestscore (118,33 ± 2,66 vs. 10,17 ± 1,47, p < 0,05, figuur 4F), en kleefverwijdering somatosensorische testscore (2,33 ± 0,52 vs. 12,0 ± 0, p < 0,05, figuur 4G) tussen ratten met pontine infarct en controlegroep ratten.
Figuur 1: Infarct. (A) Een gat gemaakt in de schedel. (B) De schede wordt verplaatst naar het gat. (C) Injectie van de schede. (D) Injectie van de sonde. (E) De anode (rode pijl) is verbonden. (F) De sonde wordt verwijderd. (G) Gat (rode pijl) links in het hersenoppervlak. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Figuur 2: Locatie van de sonde. (A) Schematisch diagram van stereotaxic-locaties: pijlen wijzen op het intrekken van huidkleppen, de plaats van Bregma en de positionering van de boor. (B) Schematisch diagram van de schede en sonde. (C) Plaats van de punt van de schede geplaatst in de pons. (D) Locatie van de punt van de sonde geplaatst in de pons. E) Experimenteel ontwerp. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Figuur 3: Laesieproducerend hulpmiddel. (A) Gescheiden van schede en sonde. (B) De sonde in de schede. (C) De blauwe elektrode was anode die was aangesloten op de staartsonde; de rode elektrode was kathode. (D) Elektrische stimulator. (E) Chirurgische instrumenten. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Figuur 4: Representatieve resultaten. (A) Het infarct werd beoordeeld door MRI-scans met T2 en DWI sequentie in vivo en werd bevestigd door TTC-kleuring in vitro 24 uur na de operatie. Acuut pontijninfarct in de rechter anterolaterale pons (stippellijn). Gedragstest toonde aan dat de rat omcirkelde naar de contralaterale kant van laesie. (B) Het volume van het infarct. (C) Lange score. (D) Bederson score. (E) Ledemaat plaatsing test. (F) Balans balk looptest. (G) Lijmverwijdering somatosensorische test. Balken vertegenwoordigen gemiddelde ± SD(p < 0,05 vs. controlegroep). Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Figuur S1: Lacunar infarct in de pons. De lengte van de sondepunt wordt korter. MRI-scan toont een lacunaire infarct in de juiste pons. (A) T2 beeld. (B) DWI beeld. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
| Rat NEE | Longa score | Berderson score | Balansstraaltest | Lijmverwijdering somatosensorische test | Limb-plaatsing test | |||||
| Pre | Na de operatie | Pre | Na de operatie | Pre | Na de operatie | Pre | Na de operatie | Pre | Na de operatie | |
| Pontine infarct 1 | 0 | 3 | 0 | 2 | 0 | 5 | 6 | 120 | 12 | 2 |
| Pontine infarct 2 | 0 | 2 | 0 | 3 | 0 | 4 | 8 | 120 | 12 | 3 |
| Pontine infarct 3 | 0 | 3 | 0 | 3 | 0 | 5 | 8 | 116 | 12 | 2 |
| Pontine infarct 4 | 0 | 3 | 0 | 3 | 0 | 4 | 6 | 120 | 12 | 2 |
| Pontine infarct 5 | 0 | 3 | 0 | 2 | 0 | 5 | 7 | 114 | 12 | 2 |
| Pontine infarct 6 | 0 | 2 | 0 | 3 | 0 | 5 | 7 | 120 | 12 | 3 |
| Controle 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| Controle 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8 | 10 | 12 | 12 |
| Controle 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 10 | 8 | 12 | 12 |
| Control 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7 | 11 | 12 | 12 |
| Control 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8 | 9 | 12 | 12 |
| Controle 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 12 | 12 | 12 |
Tabel 1: Gedragsscores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige studie biedt een protocol voor het genereren van een acute pontine infarct rat model. Dit model kan worden gebruikt voor onderzoek naar prognose en revalidatie (inclusief chronische pijn na beroerte) bij patiënten met een pausstreekstreek.
Er zijn verschillende sterke punten van deze methode. Ten eerste biedt het een ratmodel van een acuut pontïneinfarct voor toekomstige studies. Zoals hierboven vermeld, pontine infarct is een veel voorkomende beroerte subtype dat minder aandacht heeft gekregen. Een belangrijke tekortkoming van beroerte onderzoek is het ontbreken van een specifieke pontine infarct model. Ten tweede, in vergelijking met het bestaande pontine infarct rat model door ligatie van de BA15,16, kan dit model worden aangepast om de locatie en het volume van het infarct te veranderen volgens het experimentele ontwerp. Bijvoorbeeld, de lengte van de tip kan worden gewijzigd, zodat het infarct zich uitstrekt van het oppervlak van de pons, zoals hier gedaan.
Als alternatief kan een lacunair infarct in de pons worden vastgesteld door de lengte van de sondepunt te verkorten(supplementair figuur 1). Infarcten op verschillende plaatsen van de pons (d.w.z. anterosomeale pontine infarct) en in verschillende vlakken van de pons (d.w.z. bovenste, middelste en lagere vlakken) kunnen ook worden gecreëerd volgens het topografische ontwerp. In dit model werd gekozen voor het bovenste pontinevlak. Ten derde is dit model eenvoudig vast te stellen en heeft het een hoog slagingspercentage. Ligatie van de BA mag geen infarct veroorzaken als gevolg van de potentiële onderpandcirculatie15, maar dit model stelt het infarct vast op een hoog slagingspercentage, wat essentieel is voor betrouwbare onderzoeksmodellen.
Er zijn enkele beperkingen van deze methode. Ten eerste, het infarct in dit model is geen echte beroerte. Beroerte is een gevolg van vasculaire vaatletsels, verstoring van de bloedinhoud, of disfunctie van de regulering van de cerebrale bloedstroom. Het infarct wordt gecreëerd door een laesie in de pons die niet spontaan optreedt. Met andere woorden, dit model kan niet worden gebruikt om aan te pakken waarom de slag optreedt in de pons. Ten tweede vereist dit model speciale apparatuur, zoals het laesieproducerende apparaat en stereotaxic-apparatuur.
Tot slot bewijzen de bevindingen het succes van dit model bij het opzetten van een experimenteel acuut pons stroke model. Op basis van dit nieuwe model kan het resulterende celverlies en de prognose van een acuut pontïneinfarct verder worden onderzocht en toekomstige therapeutische ontwikkelingen mogelijk maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Deze studie werd financieel ondersteund door de National Science Foundation of China (81471181 en 81870933) aan Y. Jiang en de National Science Foundation of China (nr. 81601011), Natural Science Foundation van de provincie Jiangsu (nr. BK20160345) aan J. Zhu en door het Wetenschappelijk Programma van Guangzhou Municipal Health Commission (20191A011083) aan Z. Qiu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 sucture | Shanghai Jinzhong | Surgical instruments | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgical instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | Wear mask when using the system | |
| Bone cement | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Cured clamp | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| General tissue scissors | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 217181101 | |
| Lesion Making Device | Shanghai Yuyan | Making a lesion | |
| MRI system | Bruker Biospin | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Probe | Anke | Need some modification | |
| Q-tips | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Stereotaxic apparatus | RWD | ||
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| TTC | Sigma-Aldrich | BCBW5177 | For infarction confirmation in vitro |
References
- Zhu, J., et al. Suppression of local inflammation contributes to the neuroprotective effect of ginsenoside Rb1 in rats with cerebral ischemia. Neuroscience. 202, 342-351 (2012).
- Xu, X., et al. MicroRNA-1906, a Novel Regulator of Toll-Like Receptor 4, Ameliorates Ischemic Injury after Experimental Stroke in Mice. Journal of Neuroscience. 37, 10498-10515 (2017).
- McBride, D. W., Zhang, J. H. Precision Stroke Animal Models: the Permanent MCAO Model Should Be the Primary Model, Not Transient MCAO. Translational Stroke Research. , (2017).
- Liu, F., McCullough, L. D. Middle cerebral artery occlusion model in rodents: methods and potential pitfalls. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 464701 (2011).
- Jiang, Y., et al. A new approach with less damage: intranasal delivery of tetracycline-inducible replication-defective herpes simplex virus type-1 vector to brain. Neuroscience. 201, 96-104 (2012).
- Lopez, M. S., Vemuganti, R. Modeling Transient Focal Ischemic Stroke in Rodents by Intraluminal Filament Method of Middle Cerebral Artery Occlusion. Methods in Molecular Biology. 1717, 101-113 (2018).
- Pais-Roldan, P., et al. Multimodal assessment of recovery from coma in a rat model of diffuse brainstem tegmentum injury. NeuroImage. 189, 615-630 (2019).
- Merwick, A., Werring, D. Posterior circulation ischaemic stroke. The British Medical Journal. 348, 3175 (2014).
- Nogueira, R. G., et al. Thrombectomy 6 to 24 Hours after Stroke with a Mismatch between Deficit and Infarct. The New England Journal of Medicine. 378, 11-21 (2018).
- Wilkinson, D. A., et al. Late recanalization of basilar artery occlusion in a previously healthy 17-month-old child. Journal of Neurointerventional Surgery. 10, 17 (2018).
- Huang, R., et al. Stroke Subtypes and Topographic Locations Associated with Neurological Deterioration in Acute Isolated Pontine Infarction. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases: The Official Journal of National Stroke Association. 25, 206-213 (2016).
- Jiang, Y., et al. In-stent restenosis after vertebral artery stenting. International Journal of Cardiology. 187, 430-433 (2015).
- Huang, J., et al. Topographic location of unisolated pontine infarction. BMC Neurology. 19, 186 (2019).
- Banerjee, G., Stone, S. P., Werring, D. J. Posterior circulation ischaemic stroke. The British Medical Journal. 361, 1185 (2018).
- Wojak, J. C., DeCrescito, V., Young, W. Basilar artery occlusion in rats. Stroke: A Journal of Cerebral Circulation. 22, 247-252 (1991).
- Namioka, A., et al. Intravenous infusion of mesenchymal stem cells for protection against brainstem infarction in a persistent basilar artery occlusion model in the adult rat. Journal of Neurosurgery. , 1-9 (2018).
- Jiang, Y., et al. Intranasal brain-derived neurotrophic factor protects brain from ischemic insult via modulating local inflammation in rats. Neuroscience. 172, 398-405 (2011).
- Schaar, K. L., Brenneman, M. M., Savitz, S. I. Functional assessments in the rodent stroke model. Experiments in Translational and Stroke. 2, 13 (2010).
- Wu, L., et al. Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model. Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).
- Wen, Z., et al. Optimization of behavioural tests for the prediction of outcomes in mouse models of focal middle cerebral artery occlusion. Brain Research. 1665, 88-94 (2017).
