Summary
Hier wird ein Protokoll zur Etablierung eines akuten Pontininfarkts in einem Rattenmodell über elektrische Stimulation mit einem einzigen Impuls vorgestellt.
Abstract
Pontine Infarkt ist der häufigste Schlaganfall-Subtyp in der hinteren Zirkulation, während es an einem Nagetiermodell fehlt, das den Pontinininfarkt imitiert. Hier ist ein Protokoll zur erfolgreichen Etablierung eines Rattenmodells des akuten Pontininfarkts vorgesehen. Es werden Ratten mit einem Gewicht von etwa 250 g verwendet, und eine Sonde mit einem isolierten Mantel wird mit einem stereotaxic-Gerät in die Pons injiziert. Eine Läsion wird durch die elektrische Stimulation mit einem einzigen Impuls erzeugt. Der Longa-Score, der Berderson-Score und der Strahlbilanztest werden verwendet, um neurologische Defizite zu bewerten. Darüber hinaus wird der somatosensorische Klebstoffentfernungstest zur Bestimmung der sensorimotorischen Funktion und der Gliedmaßenplatzierungstest zur Beurteilung der Propriozeption verwendet. MRT-Scans werden dann verwendet, um den Infarkt in vivo zu bewerten, und TTC-Färbung wird verwendet, um den Infarkt in vitro zu bestätigen. Hierbei wird ein erfolgreicher Infarkt identifiziert, der sich in der anterolateralen Basis der rostralen Pons befindet. Zusammenfassend wird eine neue Methode beschrieben, um ein akutes Pontininfarkt-Rattenmodell zu etablieren.
Introduction
Seit den 1980er Jahren ist das durch Silikonfilamente induzierte Modell der mittleren Hirnarterie (MCAO) in der Grundlagenschlagforschung weit verbreitet1. Andere Methoden (d. h. die Adrinierung eines Zweiges des MCA2 und photochemisch induzierter Fokalinfarkt) wurden ebenfalls verwendet. Diese Modelle wurden als MCA-basierte Schlaganfallmodelle bezeichnet und haben wesentlich zu Untersuchungen der pathophysiologischen Mechanismen beigetragen, die Demonsteinen und potenziellen Therapeutika zugrunde liegen. Obwohl es Einschränkungen dieser experimentellen Modelle3,4, diese Methoden wurden viele Laboreverwendet 5,6. MCA-basierte Hubmodelle stellen einen Strich in der vorderen Zirkulation dar; Jedoch, wenige Berichte haben Modelle imitiert Schlaganfall in der hinteren Zirkulationuntersucht 7.
Es gibt signifikante Unterschiede zwischen der Ätiologie, Mechanismen, klinische Manifestation, und Prognose zwischen vorderen und hinteren KreislaufStriche8. Daher können die Ergebnisse, die aus vorderen Zirkulationshubmodellen abgeleitet wurden, nicht auf den hinteren Zirkulationshub angewendet werden. Zum Beispiel wurde das Reperfusionszeitfenster für die vordere Zirkulation auf 6 h erweitert, wobei ein kleiner Teil der Studien auf 24 h basierend auf bildgebenden Befunden9erweitert wurde. Allerdings kann das Zeitfenster für die hintere Zirkulation länger als 24 h sein, nach früheren Berichten10 und unsere eigenen klinischen Erfahrungen. Dieses längs ierte Reperfusionszeitfenster muss weiter untersucht und in experimentellen Modellen bestätigt werden.
In Bezug auf die hinteren Zirkulationsschläge ist der Pontininfarkt der häufigste Subtyp, der 7% aller ischämischen Schlaganfallfälle11,12ausmacht. Nach der Infarkttopographie werden Pontininfarkte in isolierte und nicht isolierte Pontininfarkte13unterteilt. Isolierte Pontininfarkte werden in drei Typen eingeteilt, die auf den zugrunde liegenden Mechanismen basieren: große Arterienkrankheit (LAD), Basilararterienzweigkrankheit (BABD) und kleine Arterienerkrankung (SAD). Das Wissen über die Mechanismen, Manifestation und Prognose des Pontininfarkts wurde aus klinischen Untersuchungen der Fälle14abgeleitet. Ein Nagetiermodell, das den Pontininfarkt imitiert, wurde jedoch weniger untersucht.
In früheren Studien, diffuse Hirnstamm tegmentum Verletzung mit den Pons wurde untersucht7. Eine Gruppe versuchte, ein Pontin-Infarktmodell über ligation der Basilararterie (BA)15zu schaffen. Eine andere Gruppe verwendete eine 10-0 Nylon-Monofilament-Naht, um selektiv vier Punkte des proximalen BA selektiv16zu ligan. Dieses Modell imitiert LAD, aber die meisten Pontininfarkte resultieren aus BABD und SAD. Darüber hinaus ist die selektive Ligation des BA eine komplizierte Operation und hat eine hohe Sterblichkeitsrate.
Hier ist ein detailliertes Protokoll für ein einfach durchzuführendes, leicht reproduzessives und erfolgreiches Rattenmodell des akuten Pontininfarkts durch elektrische Stimulation vorgesehen.
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Protocol
Das Protokoll wurde von der Institution Animal Care and Use Committee des Second Affiliated Hospital der Guangzhou Medical University, einer von AAALACi akkreditierten Institution, überprüft und genehmigt. Die Ratten wurden vom Animal Center der Southern Medical University zur Verfügung gestellt.
1. Tier
- Verwenden Sie erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 250 x 10 g.
- Beim Transport die Ratten mindestens 1 Woche vor der Operation unter kontrollierten Umgebungsbedingungen mit einer Umgebungstemperatur von 25 °C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 65 % und einem 12 h/12 h Hellen/Dunkel-Zyklus unterbringen.
- Geben Sie Essen und Wasser ad libitum.
2. Feststellung eines Infarkts in den Pons
- Wiegen Sie die Ratten vor der Operation und bewerten Sie die neurologische Leistung gemäß den unten beschriebenen Verhaltenstests (Abschnitt 3).
- Heizen Sie das Heizkissen unmittelbar vor der Anästhesie vor.
- Befestigen Sie den Schädelbohrer am Halter am stereotaxic Rahmen.
- Intraperitoneal injizieren die Ratten mit 50 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin. Überprüfen Sie, ob keine Toe-Pinch-Antwort besteht.
- Montieren Sie die Ratte in anfälliger Position auf den stereotaxic-Rahmen. Positionieren Sie die Ohrstangen über dem Gehörgang, um den Kopf zu sichern. Stellen Sie sicher, dass der Schädel horizontal gehalten wird, um eine Verzweigung der Injektion zu vermeiden.
- Halten Sie die Anästhesie durch Isofluran (100% Sauerstoff, 2,5% Isofluran) über eine stereotaxic Nasenkegelaufsatz für Ratten mit Ein- und Auslassöffnungen aufrecht. Halten Sie die Temperatur bei 37 °C mit einem Heizpad und überwachen Sie die Temperatur während des gesamten Verfahrens.
- Verwenden Sie Augensalbe, um hornhauttrocknung zu verhindern. Verwenden Sie Zangen, um die Pfoten leicht zu kneifen, um sicherzustellen, dass es keine Schmerzreaktion gibt.
- Rasieren Sie die Haare des Schädels mit einem Mikrorasierer. Chlorhexidin chirurgischepeeling in einer kreisförmigen Weise ab der chirurgischen Schnittstelle und rotierend nach außen.
- Machen Sie einen 3 cm Mittellinienschnitt mit einem Skalpell aus der Linie des seitlichen Canthus bis 0,5 cm hinter der hinteren Fontanelle, die durch einen chirurgischen Markerstift gekennzeichnet werden sollte.
- Verwenden Sie einen Wattestäbchen, um ein Blut zu entfernen.
- Legen Sie ein Stück CHIRURGISCHEs Klebeband auf jede Seite der Hautklappe, um die Kopfhaut auszusetzen (Abbildung 1).
- Entfernen Sie vorsichtig das Bindegewebe aus dem Schädelknochen mit einem Wattestäbchen in 0,9% NaCl getaucht. Wenn nicht entfernt, werden die Bindegewebe in der Bohrmaschine gefangen.
- Identifizieren Sie das Bregma. Wählen Sie den zentralen Punkt des Bregma als Ursprungspunkt und markieren Sie es mit einem schwarzen chirurgischen Markerstift mit feiner Spitze.
- Legen Sie einen Bohrer bei 6,0 mm AP, 2,0 mm ML (Bereich von 0,5–3,0 mm, Abbildung 2A).
- Führen Sie die Kraniotomie (1 mm Durchmesser) mit einem automatischen Bohrer durch. Gehen Sie vorsichtig vor, denn dieser Punkt ist nahe an der venösen Sinus.
- Entfernen Sie den Bohrer aus dem stereotaxic Rahmen.
- Legen Sie eine 22 G Sonde mit isoliertem Mantel in den stereotaxic Rahmen (Abbildung 3A). Die Spitze der Sonde sollte 2 mm über dem proximalen Ende des Mantels platziert werden(Abbildung 3A,B; Abbildung 2B).
- Stellen Sie sicher, dass der Mantel 7 mm (7 mm DV, Abbildung 2B; Abbildung 1C).
- Fahren Sie die Sonde entlang des Mantels (Abbildung 1D) so lange voran, bis sich die Spitze der Sonde 9 mm unter der Oberfläche des Gehirns befindet (Abbildung 2D).
- Schließen Sie die Elektroden an einen elektrischen Stimulator an (Abbildung 3C). Schließen Sie die Anode an die Sonde an, wie in Abbildung 1Ddargestellt. Verbinden Sie die Kathode mit den Ratten (in der Regel mit dem Ohr der Ratten).
- Schalten Sie den elektrischen Stimulator ein und stellen Sie die folgenden Parameter ein: Einzelpulsbreite = 4.050 ms; Spannung = 50 V; und Strom = 4 mA (Abbildung 3C). Während der elektrischen Stimulation zeigt die Ratte Zittern. In dieser Studie wurde das Gerät nicht für Kontrollgruppenratten aktiviert, die für die Verhaltenstests MRT und TTC verwendet wurden.
- Lassen Sie die Sonde nach der Stimulation 5 min in Position.
- Entfernen Sie die Sonde aus dem Gehirn (Abbildung 1F).
- Verwenden Sie Knochenzement, um die Kraniotomie zu bedecken. Lassen Sie den Zement trocknen, bevor sie verwunden.
- Die Wunde mit 4-0 Polyamid-Nahtfilamenten bedecken. Nach drei oder vier Stichen, binden 2-1-1 Standard chirurgische Knoten.
- Injizieren Sie die Ratten mit Penicillin (0,25 ml, 80 I.E. in 4 ml Saline) intraperitoneal verdünnt, um eine Infektion zu verhindern.
- Die Ratten subkutan mit Meloxicam in einer Dosis von 2 mg/kg injizieren und dann alle 24 stunden wiederholen.
- Überwachen Sie die Ratten alle 15 min, bis sie vollständig wach sind, und bringen Sie sie mit einem Heizkissen in den Käfig zurück. Bieten Sie freien Zugang zu Nahrung und Wasser bis zum Opfer.
HINWEIS: Alle Verfahren sollten den aseptischen chirurgischen Prinzipien folgen. Vor der Operation, setzen Sie auf einem Peeling-Top, chirurgische Maske und sterile Handschuhe nach einem chirurgischen Peeling der Hände. Bewahren Sie steriles Nahtmaterial im sterilen Feld zu jeder Zeit auf.
3. Verhaltenstests
- Longa-Punktzahl17
- Legen Sie die Ratten auf die Oberfläche des Tisches.
- Rekordwerte wie folgt: 0 = kein neurologisches Defizit; 1 = Versäumnis, die kontralaterale Vorpaw, ein leichtes fokales neurologisches Defizit, vollständig auszudehnen; 2 = kreisend nach links, ein moderates fokales neurologisches Defizit; 3 = nach links fallend, ein starkes Brennpunktdefizit; 4 = kein spontanes Gehen und ein depressives Bewusstseinsniveau.
- Berderson-Punktzahl18
- Halten Sie die Ratte am Schwanz und lassen Sie die Vorderbeine nach einem Tisch greifen. Notieren Sie die Ergebnisse wie folgt: 0 = beide Gliedmaßen erreicht enthemitieren die Tabelle; 1 = nur eine Gliedmaße erreicht die Tabelle.
- Legen Sie das Tier auf eine raue Oberfläche. Notieren Sie die Partituren wie folgt: 0 = ein starker Griff auf der rauen Oberfläche mit gutem Widerstand, wenn sie gedrückt werden; 1 = ein leichter Widerstand, der nur in einer Pfote zu sehen ist; 2 = kein Widerstand, wenn in eine Richtung gedrückt.
- Legen Sie die Ratte in einen geschlossenen Bereich (18 in 36 Zoll) und lassen Sie sie frei umherstreifen. Notieren Sie die Partituren wie folgt: 0 = gehen Sie die gesamte Länge des Gehäuses, ohne zu kreisen; 1 = die gesamte Länge des Gehäuses mit Kreisen zu gehen; 2 = kann nicht die Länge des Gehäuses laufen, sondern kann kreisen; 3 = kann sich nicht viel bewegen. Verwenden Sie die Summe der Bewertungsergebnisse aus jeder Aufgabe als endgültige Bewertungsbewertung.
- BalanceStrahltest19
- Stellen Sie sicher, dass das Gerät aus einem 3 cm breiten und 70 cm langen Träger besteht und 20 cm über dem Boden liegt. Platzieren Sie einen abgedunkelten Kasten am äußersten Ende des Balkens mit einem schmalen Eingang.
- Platzieren Sie einen weißen Rauschgenerator und eine helle Lichtquelle am Anfang des Balkens. Das Rauschen und Licht wurden verwendet, um die Ratte zu motivieren, den Strahl zu durchqueren und in den Torkasten zu gelangen.
- Beenden Sie die Reize, wenn die Tiere die abgedunkelte Box betreten. Zeichnen Sie die Latenz auf, um das Zielfeld (in Sekunden) zu erreichen, und beeinträchtigen Sie die Leistung der Ratte beim Durchqueren des Balkens.
- Zeichnen Sie die Ergebnisse für jede Leistung wie folgt auf: 0 = Salden mit stabiler Körperhaltung; 1 = greift seite des Balkens; 2 = Umarmungen Strahl und 1 Glied fällt vom Balken; 3 = Umarmungen Strahl und zwei Gliedmaßen fallen vom Balken, oder dreht sich auf Strahl nach >60 s; 4 = versucht, auf Balken auszugleichen, fällt aber nach >40 s ab; 5 = versucht, auf Balken auszugleichen, fällt aber nach >20 s ab; und 6 = fällt ab, kein Versuch, nach <20 s zu balancieren oder an Balken zu hängen.
- Klebstoffentfernung somatosensorischer Test20
- Legen Sie die Ratten in eine klare Plexiglasbox und lassen Sie sie die neue Umgebung für 2 oder 3 min erkunden.
- Legen Sie ein grünes Farbklebeetikett mit 10 mm Durchmesser auf die Innenseite jedes Vorderglies über dem Daumen und am Handgelenk.
- Bringen Sie die Ratten in die Plexiglasbox zurück.
- Zeichnen Sie die Zeit auf, zu der die Ratte das erste Etikett bzw. alle anderen Beschriftungen entfernt. Maximal 3 min. zulassen. Der Test sollte 2x im Training durchgeführt werden.
- Gliedmaßenplatzierungstest
- Halten Sie die Ratten in einer horizontalen Position und verhindern Sie Bewegung.
- Sobald die Ratte den Kontakt mit der Tischoberfläche verliert (passive Gliedmaßenbewegung), taktile und propriozeptive Reize auf die Pfote mit der Tischkante auftragen.
- Bewerten Sie die Platzierung der Pfote (Erfolg oder Fehler) auf der Tischkante.
- Notieren Sie die Ergebnisse wie folgt: 0 = keine Platzierung; 0,5 = unvollendete und/oder verspätete Platzierung; 1 = sofortige und vollständige Platzierung.
4. Infarktbestätigung durch MRT
- Führen Sie den MRT-Scan 24 h nach der Operation durch.
- Anästhetisieren Sie die Ratte durch Isofluran (5% für Dieduktion, 1%–1,5% für die Wartung).
- Sichern Sie den Rattenkopf in einer Rattenhirn-Array-Spule und kombiniert mit einer randgebundenen Volumenspule.
- Legen Sie die Spule und die Ratte in den MRT-Scanner. Sichern Sie die Ratte in der Wiege mit den Zahn- und Ohrbügeln.
- Halten Sie die Körpertemperatur während des MRT-Scanvorgangs mit einer wärmeumleitenden Ummantelung mit geschlossenem Kreislauf bei 37 °C bei 0,5 °C.
- Verwenden Sie eine Pilotsequenz, um die korrekte Geometrie sicherzustellen.
- Sammeln Sie T2-gewichtete Scans mit einer Schnellspin-Echosequenz: Echozeit (TE) = 33 ms; Wiederholungszeit (TR) = 8.000 ms; Sichtfeld = 30 mm x 30 mm; Erfassungsmatrix = 512 x 512; 50 Scheiben; 0,4 mm dick.
- Sammeln Sie eine Vier-Schuss-Spin-Echo planare Bildgebung DWI-Scans: Echozeit = 30,5 ms; Wiederholungszeit = 8000 ms; Matrix = 96 x 96; Sichtfeld = 25 mm x 25 mm; drei Richtungen = x, y, z; B-Werte = 0 1.000 s/mm2 und 1.000 s/mm2; 50 zusammenhängende axiale Scheiben; 0,4 mm dick.
- Bringen Sie die Ratten in den Käfig zurück.
5. Infarktbestätigung durch TTC-Färbung
- Opfern Sie die Ratten zum Zeitpunkt des Versuchsentwurfs. In diesem Experiment opferten wir die Ratten 24 h nach der Operation.
- Bereiten Sie eine 2% TTC-Lösung vor dem Opfer vor. 0,2 g TTC-Pulver zu den 10 ml 0,01 M PBS (pH 7,4) geben. Übertragen Sie die Verdünnung auf eine 10 cm Schale, die mit Silberpapier bedeckt und in einem Wasserbad auf 37 °C vorgewärmt wird.
- Setzen Sie die Ratte bis zum Verlust des Bewusstseins 5% Isoflurane aus. Dann setzen Sie die RatteCO2 (20%-30% des Volumens des Käfigs pro min) aus, bis die Atmung aufgehört hat, und halten Sie dann 2 minCO2-Exposition aufrecht.
- Verwenden Sie die folgenden Zeichen, um den Tod zu bestätigen: kein Auf- und Absinken der Brust, kein fühlbarer Herzschlag, schlechte Schleimhautfarbe, keine Reaktion auf Zehenkneifen, Farbveränderung oder Opazität in den Augen.
- Führen Sie zervikale Dislokation durch.
- Sichern Sie die Tiere, indem Sie die Pfoten auf einer sterilen Plattform kleben. Erstellen Sie einen Mittellinienschnitt vom Schlüsselbein zum Hypogastrium und einen seitlichen Schnitt vom Xiphoid nach links entlang des Brustkorbs. Machen Sie einen Schnitt in der Membran auch entlang der Brustkorb und ein Thorax Mittellinienschnitt, um das Herz zu belichten.
- Schließen Sie die Spitze einer Nadel (27 G) an eine Perfusionspumpe an, die 0,01 M PBS bei 4 °C im linken Ventrikel enthält.
HINWEIS: Steigen Sie die Spitze entlang der linken Kante des Ventrikels, um das Betreten des Atriums zu vermeiden. Schalten Sie die Perfusionspumpe ein, um sicherzustellen, dass sich die Spitze im linken Ventrikel befindet, und schneiden Sie das rechte Atrium. Wenn Flüssigkeit aus dem Nasenloch abfließt, befindet sich die Spitze im Atrium und muss eingestellt oder wieder eingesetzt werden. - Verwenden Sie ca. 100 ml 0,01 M PBS, bei 4 °C für die Perfusion gehalten. Schalten Sie die Perfusionspumpe aus, bis die Leber weiß wird.
- Enthaupten Sie die Ratten und sezieren Sie das ganze Gehirn mit der Schere und Zange. Entfernen Sie Wasser von der Gehirnoberfläche mit Blotting-Papier.
- Bewahren Sie das gesamte Gehirn 1 min bei -80 °C auf (das Schneiden von Hirnabschnitten ist nach dem Einfrieren einfacher).
HINWEIS: Dieser Schritt kann übersprungen werden, wenn die Gehirnabschnitte gut geschnitten werden können, ohne zu frieren. - Legen Sie das Gehirn in die Matrix mit der dorsalen Seite nach oben.
- Identifizieren Sie das Loch in der Oberfläche des Gehirns, wie in Abbildung 1G dargestellt, und legen Sie eine 0,21 mm dicke Klinge aus Edelstahl ein. Normalerweise befindet sich der größte Infarktbereich in der Ebene der Sonde; Daher sollte eine Klinge in diesen Bereich eingefügt werden.
- Legen Sie die anderen Klingen in einem Intervall von 2 mm ein.
- Entfernen Sie gleichzeitig die Klingen auf einmal aus der Matrix und legen Sie das gesamte Gehirn mit den Klingen in die TTC-Lösung in der Schale. Entfernen Sie die Klingen sorgfältig.
HINWEIS: Hier wurden die Hirnabschnitte nicht leicht aus der Flüssigkeit entfernt, da einige Restpia mater in der Basis cranii mit dem Schnitt störte. Wenn Abschnitte in der Matrix verbleiben, verwenden Sie einen kleinen Spachtel, um sie auf die Schale zu übertragen. - Legen Sie die Schale mit TTC-Lösung und Hirnpartien in ein Wasserbad bei 37 °C.
- Überprüfen Sie die Schale alle 5 min und stellen Sie sicher, dass sich die Abschnitte nicht überlappen.
- Fügen Sie 10 ml 4% Paraformaldehydlösung in die Schale, um die TTC-Reaktion zu beenden.
- Richten Sie die Abschnitte von der rostral encaudal und fotografieren.
6. Statistik
- Verwenden Sie statistische Analysesoftware (z. B. GraphPad Prism), um einen Schüler-t-Testdurchzuführen.
ANMERKUNG: Alle Daten werden als Mittelwert sS ausgedrückt. Unterschiede zwischen den Gruppen werden mit zweischwänzenden Studenten-t-Testsbestimmt (p < 0,05 definiert als statistische Signifikanz).
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Representative Results
Sechs Tiere wurden dem oben beschriebenen Operationsprotokoll unterzogen. Die Kontrollgruppe, wie in Abbildung 4 dargestellt, bestand aus sechs Ratten. Die in Abbildung 4 gezeigten Gehirnscheiben wurden von einer Ratte pro Gruppe abgeleitet.
Die MRT-Prüfung zeigte, dass sich der Infarkt auf der Basis der Pons befand (Abbildung 4A). Da die Sonde 2 mm links von der Mittellinie injiziert wurde, befand sich der Infarkt seitlich. Dieser Infarkt imitiert anterolaterale Pontininfarkte bei Patienten (Abbildung 4A). Da ein isolierter Mantel verwendet wurde, gab es keinen Infarkt jenseits der Spitze der Sonde einschließlich der Kortex, Kleinhirn und Midbrain (Abbildung 4A). DWI-Bilder zeigten auch den akuten Pontininfarkt (Abbildung 4A).
TTC Färbung wurde verwendet, um den Infarkt zu bestätigen 24 h post-surgery (Abbildung 4A). Im Vergleich zur Kontrollgruppe war das Infarktvolumen deutlich höher (Abbildung 4B).
Verhaltenswerte wurden vor und nach der Operation gemessen. Die Ergebnisse der Steuerungs- und Infract-Modellgruppen vor und nach der Operation sind in Tabelle 1 dargestellt. Aufgrund des Fehlens eines spezifischen Verhaltenstests für Pontininfarkt wurden der Longa-Score, der Berderson-Score und der Balance-Strahl-Test verwendet, um die neurologischen Defizite zu bewerten. Zusätzlich der somatosensorische Klebstoffentfernungstest zur Beurteilung der sensorimotorischen Funktion sowie der Gliedmaßenplatzierungstest zur Beurteilung der Propriozeption.
Im Vergleich zur Kontrollgruppe kreisten die Ratten mit Pontininfarkt nach links (Abbildung 4A). Es gab signifikante Unterschiede in longa-Score (2,67 x 0,52 vs. 0, p < 0,05, Abbildung 4C),Berderson-Score (2,67 x 0,52 vs. 0, p < 0,05, Abbildung 4D),Gliedmaßenplatzierungstest (4,67 x 0,52 vs. 0, p < 0,05, Abbildung 4E), Strahlbilanztestwert (118,33 x 2,66 vs. 10,17 x 1,47, p < 0,05, Abbildung 4F) und somatosensorischer Testwert für die Klebeentfernung (2,33 x 0,52 vs. 12,0 , 0, p < 0,05, Abbildung 4G) zwischen Ratten mit Pontininfarkt und Kontrollgruppenratten.
Abbildung 1: Infarkteinrichtung. (A) Ein Loch im Schädel. (B) Der Mantel wird in das Loch verschoben. (C) Injektion des Mantels. (D) Injektion der Sonde. (E) Die Anode (roter Pfeil) ist verbunden. (F) Die Sonde wird entfernt. (G) Loch (roter Pfeil) links in der Gehirnoberfläche. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Abbildung 2: Position der Sonde. (A) Schematische Darstellung der stereotaxic-Positionen: Pfeile zeigen auf das Zurückziehen von Hautklappen, die Stelle von Bregma und die Positionierung des Bohrers. (B) Schematische Darstellung des Mantels und der Sonde. (C) Lage der Indenspitze der Hülle. (D) Position der Spitze der Sonde, die in den Pons platziert ist. (E) Versuchsdesign. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Abbildung 3: Lesion-produzierendes Gerät. (A) Trennung von Mantel und Sonde. (B) Die Sonde im Mantel. (C) Die blaue Elektrode war Anode, die mit der Kaudalsonde verbunden war; die rote Elektrode war Kathode. (D) Elektrischer Stimulator. (E) Chirurgische Instrumente. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse. (A) Der Infarkt wurde durch MRT-Scanning mit T2- und DWI-Sequenz in vivo bewertet und durch TTC-Färbung in vitro 24 h nach der Operation bestätigt. Akuter Pontininfarkt in den rechten anterolateralen Pontons (gepunktete Linie). Der Verhaltenstest zeigte, dass die Ratte zur kontralateralen Seite der Läsion kreiste. (B) Das Infarktvolumen. (C) Lange Punktzahl. (D) Bederson Partitur. (E) Limb-Platzierungstest. (F) Balance-Strahl-Gehtest. (G) Somatosensorischer Klebstoffentfernungstest. Balken stellen den Mittelwert sD dar (p < 0,05 vs. Steuergruppe). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Abbildung S1: Lacunar-Infarkt in den Pons. Die Länge der Sondenspitze verkürzt sich. Das MRT-Scannen zeigt einen Lacunarinfarkt in den rechten Pons. (A) T2-Bild. (B) DWI-Bild. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
| Ratte NEIN | Longa-Punktzahl | Berderson-Score | Balance-Strahl-Test | Somatosensorischer Klebstoffentfernungstest | Limb-Placement-Test | |||||
| Pre | Post-Chirurgie | Pre | Post-Chirurgie | Pre | Post-Chirurgie | Pre | Post-Chirurgie | Pre | Post-Chirurgie | |
| Pontine Infarkt 1 | 0 | 3 | 0 | 2 | 0 | 5 | 6 | 120 | 12 | 2 |
| Pontine Infarkt 2 | 0 | 2 | 0 | 3 | 0 | 4 | 8 | 120 | 12 | 3 |
| Pontine Infarkt 3 | 0 | 3 | 0 | 3 | 0 | 5 | 8 | 116 | 12 | 2 |
| Pontine Infarkt 4 | 0 | 3 | 0 | 3 | 0 | 4 | 6 | 120 | 12 | 2 |
| Pontine Infarkt 5 | 0 | 3 | 0 | 2 | 0 | 5 | 7 | 114 | 12 | 2 |
| Pontine Infarkt 6 | 0 | 2 | 0 | 3 | 0 | 5 | 7 | 120 | 12 | 3 |
| Steuerung 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| Steuerung 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8 | 10 | 12 | 12 |
| Steuerung 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 10 | 8 | 12 | 12 |
| Steuerung 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7 | 11 | 12 | 12 |
| Steuerung 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8 | 9 | 12 | 12 |
| Steuerung 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 12 | 12 | 12 |
Tabelle 1: Verhaltenspunkte.
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Discussion
Die vorliegende Studie enthält ein Protokoll zur Erzeugung eines akuten Pontininfarkt-Rattenmodells. Dieses Modell kann für die Forschung zur Prognose und Rehabilitation (einschließlich chronischer Schmerzen nach dem Schlaganfall) bei Pontin-Schlaganfall-Patienten verwendet werden.
Es gibt mehrere Stärken dieser Methode. Erstens bietet es ein Rattenmodell des akuten Pontininfarkts für zukünftige Studien. Wie oben erwähnt, ist Pontininfarkt ein häufiger Schlaganfall-Subtyp, der weniger Aufmerksamkeit erhalten hat. Ein großes Manko der Schlaganfallforschung war das Fehlen eines spezifischen Pontininfarktmodells. Zweitens kann dieses Modell im Vergleich zum bestehenden Pontin-Infarkt-Rattenmodell durch Ligation der BA15,16angepasst werden, um die Position und das Volumen des Infarkts entsprechend dem experimentellen Design zu verändern. Beispielsweise kann die Länge der Spitze so geändert werden, dass sich der Infarkt von der Oberfläche der Pons erstreckt, wie hier geschehen.
Alternativ kann ein Lacunarinfarkt in den Pons durch Verkürzung der Länge der Sondenspitze festgestellt werden (Zusatzabbildung 1). Infarkte an verschiedenen Stellen der Pontons (d.h. anteromedialer Pontininfarkt) und in verschiedenen Ebenen der Pontons (d.h. obere, mittlere und untere Ebene) können ebenfalls nach dem topographischen Design erzeugt werden. In diesem Modell wurde die obere Pontinebene gewählt. Drittens ist dieses Modell leicht zu etablieren und verfügt über eine hohe Erfolgsquote. Die Ligation der BA darf aufgrund der potentiellen Kollateralzirkulation15keinen Infarkt erzeugen, aber dieses Modell legt den Infarkt mit einer hohen Erfolgsrate fest, was für zuverlässige Forschungsmodelle unerlässlich ist.
Es gibt einige Einschränkungen dieser Methode. Erstens ist der Infarkt in diesem Modell kein echter Schlaganfall. Schlaganfall ist eine Folge von Gefäßläsionen, Störung des Blutinhalts, oder Dysfunktion der Regulierung des zerebralen Blutflusses. Der Infarkt entsteht durch eine Läsion in den Pons, die nicht spontan auftritt. Mit anderen Worten, dieses Modell kann nicht verwendet werden, um zu adressieren, warum der Strich in den Pons auftritt. Zweitens erfordert dieses Modell spezielle Ausrüstung, wie die Läsion-produzierende Vorrichtung und stereotaxic-Gerät.
Zusammenfassend beweisen die Ergebnisse den Erfolg dieses Modells bei der Etablierung eines experimentellen Akut-Pons-Schlagmodells. Basierend auf diesem neuartigen Modell können der daraus resultierende Zellverlust und die Prognose eines akuten Pontininfarkts weiter untersucht werden und zukünftige therapeutische Entwicklungen ermöglichen.
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Disclosures
Kein Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der National Science Foundation of China (81471181 und 81870933) an Y. Jiang und die National Science Foundation of China (Nr. 81601011), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Nr. BK20160345) an J. Zhu und durch das Scientific Program der Guangzhou Municipal Health Commission (20191A011083) an Z. Qiu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 sucture | Shanghai Jinzhong | Surgical instruments | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgical instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | Wear mask when using the system | |
| Bone cement | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Cured clamp | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| General tissue scissors | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 217181101 | |
| Lesion Making Device | Shanghai Yuyan | Making a lesion | |
| MRI system | Bruker Biospin | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Probe | Anke | Need some modification | |
| Q-tips | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Stereotaxic apparatus | RWD | ||
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| TTC | Sigma-Aldrich | BCBW5177 | For infarction confirmation in vitro |
References
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