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Neuroscience

विद्युत उत्तेजना द्वारा चूहों में तीव्र पोंटिन इंफार्क्शन की स्थापना

Published: August 27, 2020 doi: 10.3791/60783

Summary

यहां प्रस्तुत एक नाड़ी के साथ विद्युत उत्तेजना के माध्यम से एक चूहा मॉडल में तीव्र पोंटिन इंफार्क्शन स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल है।

Abstract

पोंटिन इंफार्क्शन पीछे के परिसंचरण में सबसे आम स्ट्रोक उपप्रकार है, जबकि पोंटिन इंफार्क्शन की नकल करने वाले कृंतक मॉडल का अभाव है। बशर्ते यहां तीव्र पोंटाइन इंफेक्शन के चूहे के मॉडल को सफलतापूर्वक स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। लगभग 250 ग्राम वजन वाले चूहों का उपयोग किया जाता है, और एक अछूता म्यान के साथ एक जांच एक स्टीरियोटैक्सिक उपकरण का उपयोग कर पोन में इंजेक्शन दिया जाता है। एक घाव एक ही नाड़ी के साथ विद्युत उत्तेजना द्वारा उत्पादित किया जाता है। लोंगा स्कोर, बर्डसन स्कोर और बीम बैलेंस टेस्ट का इस्तेमाल न्यूरोलॉजिकल डेफिसिट का आकलन करने के लिए किया जाता है । इसके अतिरिक्त, चिपकने वाले हटाने वाले सोमाटोसेंसरी परीक्षण का उपयोग संवेदी कार्य को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, और अंग प्लेसमेंट परीक्षण का उपयोग प्रोप्रोसेप्शन का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। इसके बाद वीवो में इंफार्क्शन का आकलन करने के लिए एमआरआई स्कैन का इस्तेमाल किया जाता है और वीट्रो में इंफेक्शन की पुष्टि के लिए टीटीसी स्टेनिंग का इस्तेमाल किया जाता है । यहां, एक सफल इंफेक्शन की पहचान की जाती है जो रोस्ट्रल पोन के एंटेरोटेरल आधार में स्थित है। अंत में, एक तीव्र पोंटाइन इंफेक्शन चूहा मॉडल स्थापित करने के लिए एक नई विधि का वर्णन किया गया है।

Introduction

1980 के दशक के बाद से, सिलिकॉन फिलामेंट्स द्वारा प्रेरित मध्य मस्तिष्क धमनी ऑक्क्लुसेशन (एमसीएओ) मॉडल का व्यापक रूप से बुनियादी स्ट्रोक अनुसंधान1में उपयोग किया गया है। अन्य तरीकों (यानी, एमसीए2 की एक शाखा और फोटोकेमेमिक रूप से प्रेरित फोकल इंफेक्शन) का भी उपयोग किया गया है। इन मॉडलों को एमसीए आधारित स्ट्रोक मॉडल कहा गया है और स्ट्रोक और संभावित चिकित्सा विज्ञान अंतर्निहित रोगविज्ञानी तंत्र की जांच में बहुत योगदान दिया है । यद्यपि इन प्रायोगिक मॉडलों की सीमाएं हैं3,4, इन पद्धतियों का उपयोग कई प्रयोगशालाओं में किया गया है5,6. एमसीए आधारित स्ट्रोक मॉडल पूर्वकाल परिसंचरण में एक स्ट्रोक का प्रतिनिधित्व करते हैं; हालांकि, कुछ रिपोर्टों के पीछे परिसंचरण7में स्ट्रोक नकल मॉडल की जांच की है .

पूर्ववर्ती और पीछे परिसंचरण स्ट्रोक8के बीच एटियोलॉजी, तंत्र, नैदानिक अभिव्यक्ति और पूर्वानुमान के बीच महत्वपूर्ण अंतर हैं। इसलिए, पूर्वकाल परिसंचरण स्ट्रोक मॉडल से प्राप्त परिणाम पीछे परिसंचरण स्ट्रोक के लिए लागू नहीं किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पूर्वकाल परिसंचरण के लिए रिफ्यूजन समय खिड़की को 6 घंटे तक बढ़ा दिया गया है, जिसमें अध्ययन का एक छोटा सा हिस्सा इमेजिंग निष्कर्षों के आधार पर 24 घंटे तक विस्तारित है9। हालांकि, पीछे परिसंचरण के लिए समय खिड़की 24 घंटे से अधिक समय हो सकता है, पिछले रिपोर्ट10 और हमारे अपने नैदानिक अनुभवों के अनुसार । इस विस्तारित ईंधन भरने का समय खिड़की का आगे अध्ययन किया जाना चाहिए और प्रायोगिक मॉडलों में पुष्टि की जानी चाहिए।

पीछे के परिसंचरण स्ट्रोक के बारे में, पोंटिन इंफार्क्शन सबसे आम उपप्रकार है, जो सभी इस्कीमिक स्ट्रोक के मामलों का 7% है11,,12। इंफेक्शन टोपोग्राफी के अनुसार, पोंटिन इंफार्क्शन को अलग-थलग और गैर-अलग पोंटिन इंफार्क्शन13में विभाजित किया गया है। अलग पोंटिन इंफार्क्शन को अंतर्निहित तंत्रों के आधार पर तीन प्रकारों में वर्गीकृत किया जाता है: बड़ी धमनी रोग (बालक), बेसिलर धमनी शाखा रोग (बीएडी), और छोटी धमनी रोग (एसएडी)। पोंटिन इंफेक्शन के तंत्र, अभिव्यक्ति और पूर्वानुमान का ज्ञान14मामलों की नैदानिक जांच से प्राप्त किया गया है। हालांकि, पोंटिन इंफार्क्शन की नकल करने वाले एक कृंतक मॉडल की जांच कम की गई है।

पिछले अध्ययनों में, पोन से जुड़े डिफ्यूज ब्रेनस्टेम टेगमेंटम चोट का पता लगाया गया है7। एक समूह ने बेसिलर धमनी (बीए)15के लिगेशन के माध्यम से एक पोंटिन इंफार्क्शन मॉडल बनाने का प्रयास किया । एक अन्य समूह ने 10-0 नायलॉन मोनोफिलमेंट सीवन का उपयोग किया ताकि वह चुनिंदा16समीपस्थ बीए के चार बिंदुओं को चुनिंदा रूप से लिगेट कर सके । यह मॉडल बालक की नकल करता है, लेकिन सबसे पोंटिन इंफार्क्शन बाबी और एसएडी से परिणाम देता है। इसके अलावा बीए की चुनिंदा लिगेशन एक जटिल सर्जरी है और इसकी मृत्यु दर अधिक है ।

यहां प्रदान की गई एक आसान प्रदर्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है, आसानी से पुन: पेश किया गया है, और विद्युत उत्तेजना द्वारा तीव्र पोंटिन इंफार्क्शन के सफल चूहा मॉडल है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल की समीक्षा की गई और ग्वांग्झू मेडिकल यूनिवर्सिटी के दूसरे संबद्ध अस्पताल की संस्था एनिमल केयर एंड यूज कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया, जो AAALACi द्वारा मान्यता प्राप्त संस्था है । चूहों को दक्षिणी चिकित्सा विश्वविद्यालय के पशु केंद्र द्वारा प्रदान किया गया था ।

1. पशु

  1. 250 ± 10 ग्राम वजनी वयस्क पुरुष स्प्राग-डावले चूहों का उपयोग करें।
  2. परिवहन पर, 25 डिग्री सेल्सियस के परिवेशी तापमान, 65% की सापेक्ष आर्द्रता, और 12 एच/12 एच प्रकाश/अंधेरे चक्र के साथ नियंत्रित पर्यावरणीय स्थितियों के तहत सर्जरी से पहले कम से कम 1 सप्ताह के लिए चूहों को घर करें।
  3. भोजन और पानी विज्ञापन लिबिटमप्रदान करें ।

2. पोन्स में इंफेक्शन की स्थापना

  1. सर्जरी से पहले चूहों का वजन करें और नीचे वर्णित व्यवहार परीक्षणों (धारा 3) के अनुसार न्यूरोलॉजिकल प्रदर्शन का आकलन करें।
  2. संज्ञाहरण से तुरंत पहले हीटिंग पैड को पहले से गरम करें।
  3. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर धारक को खोपड़ी ड्रिल संलग्न करें।
  4. इंट्रापेरिटोनली 50 मिलीग्राम/किलो केटामाइन और 5 मिलीग्राम/किलो जाइलाजिन के साथ चूहों को इंजेक्ट करें। अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया की कमी के लिए जांच करें ।
  5. प्रवण स्थिति में स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर चूहे को माउंट करें। सिर को सुरक्षित करने के लिए कान की नहर के ऊपर कान की सलाखों की स्थिति। सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन के किसी भी तिरछा से बचने के लिए खोपड़ी को क्षैतिज रखा जाता है।
  6. इनलेट और आउटलेट बंदरगाहों के साथ चूहों के लिए स्टीरियोटैक्सिक नाक शंकु लगाव के माध्यम से आइसोफ्लाणे (100% ऑक्सीजन, 2.5% आइसोफ्लुन) द्वारा संज्ञाहरण बनाए रखें। हीटिंग पैड का उपयोग करके तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें और पूरी प्रक्रिया में तापमान की निगरानी करें।
  7. कॉर्नियल सुखाने से रोकने के लिए आंखों का मरहम का प्रयोग करें। पंजे को थोड़ा चुटकी लेने के लिए संदंश का उपयोग करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि दर्द की प्रतिक्रिया न हो।
  8. खोपड़ी के बालों को माइक्रो शेवर से शेव करें। सर्जिकल चीरा साइट पर शुरू और जावक घूर्णन एक परिपत्र फैशन में क्लोरहेक्सीडीन सर्जिकल स्क्रब लागू करें।
  9. द्विपक्षीय पार्श्व कैंथस की रेखा से पीछे के फॉन्टेनसेल के पीछे 0.5 सेमी तक स्केलपेल के साथ 3 सेमी मिडलाइन चीरा बनाएं, जिसे सर्जिकल मार्कर पेन द्वारा चिह्नित किया जाना चाहिए।
  10. एक खून को हटाने के लिए एक कपास झाड़ू का प्रयोग करें।
  11. खोपड़ी(चित्रा 1)का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा के प्रत्येक तरफ रखा सर्जिकल टेप का एक टुकड़ा रखें।
  12. धीरे से 0.9% NaCl में डूबा एक कपास झाड़ू के साथ खोपड़ी की हड्डी से संयोजी ऊतकों को हटा दें। यदि नहीं हटाया जाता है, तो कनेक्टिव ऊतक ड्रिल में पकड़े जाएंगे।
  13. ब्रेग्मा की पहचान करें। मूल बिंदु के रूप में ब्रेग्मा के केंद्रीय बिंदु को चुना और इसे ठीक-ठाक काले सर्जिकल मार्कर पेन का उपयोग करके चिह्नित करें।
  14. 6.0 मिमी एपी, 2.0 मिमी एमएल (0.5-3.0 मिमी, चित्रा 2 ए)पर ड्रिल रखें।
  15. एक स्वचालित ड्रिल का उपयोग कर क्रैनियोटॉमी (1 मिमी व्यास) प्रदर्शन करें। ध्यान से आगे बढ़ें, क्योंकि यह बिंदु शिंयस साइनस के करीब है।
  16. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से ड्रिल निकालें।
  17. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम(चित्रा 3 ए)में एक अछूता म्यान के साथ एक 22 जी जांच रखें । जांच की नोक म्यान के समीपस्थ अंत से 2 मिमी ऊपर रखा जाना चाहिए(चित्रा 3ए, बी; चित्रा 2B)
  18. सुनिश्चित करें कि म्यान मस्तिष्क में प्रवेश करती है 7 मिमी (7 मिमी डीवी, चित्रा 2B; चित्रा 1C)
  19. जांच की नोक मस्तिष्क की सतह(चित्रा 2D)के नीचे 9 मिमी होने तकम्यान (चित्रा 1D)के साथ जांच को आगे बढ़ाएं।
  20. इलेक्ट्रोड को इलेक्ट्रिकल स्टिमुलेटर(चित्रा 3सी) सेकनेक्ट करें। एनोड को जांच से कनेक्ट करें जैसा कि चित्रा 1Dमें दिखाया गया है। कैथोड को चूहों (आमतौर पर चूहों के कान से) से कनेक्ट करें।
  21. विद्युत उत्तेजक को चालू करें और निम्नलिखित मापदंडों को सेट करें: एकल पल्स चौड़ाई = 4,050 मिलियन; वोल्टेज = 50 वी; और वर्तमान = 4 एमए(चित्रा 3C)। विद्युत उत्तेजना के दौरान, चूहा कांपने का प्रदर्शन करेगा। इस अध्ययन में, डिवाइस को व्यवहार परीक्षण, एमआरआई और टीटीसी के लिए उपयोग किए जाने वाले नियंत्रण समूह चूहों के लिए चालू नहीं किया गया था।
  22. उत्तेजना के बाद 5 मिनट के लिए स्थिति में जांच छोड़ दें।
  23. मस्तिष्क से जांच निकालें(चित्रा 1F)
  24. क्रैनियोटॉमी को कवर करने के लिए बोन सीमेंट का इस्तेमाल करें। घाव टांका लगाने से पहले सीमेंट को सूखने दें।
  25. 4-0 पॉलीमाइड सीवन फिलामेंट्स के साथ घाव को सीवन करें। तीन या चार स्टिच के बाद, 2-1-1 मानक सर्जिकल नॉट टाई करें।
  26. संक्रमण को रोकने के लिए चूहों को पेनिसिलिन (0.25 एमएल, 80 आईयू नमकीन के 4 एमएल में पतला) के साथ इंजेक्ट करें।
  27. चूहों को 2 मिलीग्राम/किलो की खुराक पर मेलोक्सीकम के साथ चमड़े के इंजेक्शन और फिर इसे हर 24 घंटे दोहराएं ।
  28. पूरी तरह से जागने तक हर 15 मिनट में चूहों की निगरानी करें और उन्हें हीटिंग पैड के साथ पिंजरे में वापस करें। बलिदान तक भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच प्रदान करें।
    नोट: सभी प्रक्रियाओं को एसेप्टिक सर्जिकल सिद्धांतों का पालन करना चाहिए। सर्जरी से पहले हाथों के सर्जिकल स्क्रब के बाद स्क्रब टॉप, सर्जिकल मास्क और बाँझ दस्ताने डाल दें। बाँझ क्षेत्र के भीतर बाँझ सीवन सामग्री हर समय बनाए रखें।

3. व्यवहार परीक्षण

  1. लोंगा स्कोर17
    1. चूहों को मेज की सतह पर रखें।
    2. इस प्रकार रिकॉर्ड स्कोर: 0 = कोई न्यूरोलॉजिक घाटा; 1 = पूरी तरह से कॉन्ट्रालेट्रल फोरेपॉ, एक हल्के फोकल न्यूरोलॉजिक घाटे का विस्तार करने में विफलता; 2 = बाईं ओर चक्कर, एक मध्यम फोकल न्यूरोलॉजिक घाटा; 3 = बाईं ओर गिरने, एक गंभीर केंद्र घाटा; 4 = कोई सहज चलना और चेतना का एक उदास स्तर।
  2. बर्डसन स्कोर18
    1. चूहे को पूंछ से पकड़ें और अग्रअंगों को एक मेज के लिए बाहर तक पहुंचने दें। स्कोर को इस प्रकार रिकॉर्ड करें: 0 = दोनों अंग तालिका में पहुंच गए; 1 = केवल एक अंग मेज तक पहुंचता है।
    2. जानवर को किसी न किसी सतह पर रखें। स्कोर को इस प्रकार रिकॉर्ड करें: 0 = धक्का दिए जाने पर अच्छे प्रतिरोध के साथ किसी न किसी सतह पर एक मजबूत समझ; 1 = एक मामूली प्रतिरोध केवल एक पंजा में देखा; 2 = कोई प्रतिरोध जब एक दिशा में धकेल दिया।
    3. चूहे को एक संलग्न क्षेत्र में रखें (× 36 में 18) और इसे स्वतंत्र रूप से घूमने की अनुमति दें। स्कोर को इस प्रकार रिकॉर्ड करें: 0 = चक्कर लगाए बिना बाड़े की पूरी लंबाई पर चलें; 1 = चक्कर के साथ बाड़े की पूरी लंबाई चलना; 2 = बाड़े की लंबाई नहीं चल सकता है, लेकिन सर्कल कर सकते हैं; 3 = ज्यादा नहीं ले जा सकते। अंतिम मूल्यांकन स्कोर के रूप में प्रत्येक कार्य से मूल्यांकन स्कोर के योग का उपयोग करें।
  3. शेष बीम परीक्षण19
    1. सुनिश्चित करें कि उपकरण में 3 सेमी चौड़ा और 70 सेमी लंबा बीम होता है और फर्श से 20 सेमी ऊपर होता है। एक संकीर्ण प्रवेश द्वार के साथ बीम के दूर अंत में एक अंधेरा बॉक्स रखें।
    2. बीम की शुरुआत में एक सफेद शोर जनरेटर और उज्ज्वल प्रकाश स्रोत रखें। चूहे को बीम को पार करने और गोल बॉक्स में प्रवेश करने के लिए प्रेरित करने के लिए शोर और प्रकाश का उपयोग किया गया था।
    3. जब जानवर अंधेरे बॉक्स में प्रवेश करते हैं तो उत्तेजनाओं को समाप्त करें। बीम को पार करते समय गोल बॉक्स (सेकंड में) और चूहे के हिंडलिम्ब प्रदर्शन तक पहुंचने के लिए विलंबता रिकॉर्ड करें।
    4. प्रत्येक प्रदर्शन के लिए स्कोर को इस प्रकार रिकॉर्ड करें: 0 = स्थिर मुद्रा के साथ संतुलन; 1 = बीम के पक्ष को पकड़ता है; 2 = आलिंगन बीम और 1 अंग बीम से दूर हो जाता है; 3 = आलिंगन बीम और दो अंग बीम से गिरते हैं, या बीम पर स्पिन के बाद >60 s; 4 = बीम पर संतुलन बनाने का प्रयास करता है लेकिन इसके बाद बंद हो जाता है>40 s; 5 = बीम पर संतुलन बनाने का प्रयास करता है लेकिन 20 s के बाद बंद हो जाता है; और 6 = बंद हो जाता है, कोई संतुलन या बीम पर लटका करने के बाद और लेफ्टिनेंट; 20 एस का प्रयास नहीं ।
  4. चिपकने वाला निष्कासन सोमाटोसेंसरी टेस्ट20 को
    1. चूहों को एक स्पष्ट प्लेक्सीग्लास बॉक्स में रखें और उन्हें 2 या 3 मिनट के लिए नए वातावरण का पता लगाने की अनुमति दें।
    2. अंगूठे के ऊपर और कलाई पर प्रत्येक अग्रभाग की अंदर की सतह पर एक 10 मिमी व्यास हरे रंग चिपकने वाला लेबल रखें।
    3. चूहों को प्लेक्सीग्लास बॉक्स में वापस करें।
    4. चूहे के लिए समय रिकॉर्ड करने के लिए पहले लेबल और अन्य सभी लेबल, क्रमशः हटा दें। अधिकतम 3 मिनट की अनुमति दें। यह परीक्षा प्रशिक्षण में 2x आयोजित की जानी चाहिए।
  5. अंग प्लेसमेंट परीक्षा
    1. चूहों को क्षैतिज स्थिति में रखें और आंदोलन को रोकें।
    2. एक बार जब चूहा टेबल सतह (निष्क्रिय अंग आंदोलन) के साथ संपर्क खो देता है, तो टेबल एज के साथ पंजा पर स्पर्श और प्रोप्रोसेप्टिव उत्तेजनाएं लागू करें।
    3. टेबल एज पर पंजा (सफलता या असफल) के प्लेसमेंट का आकलन करें।
    4. स्कोर को इस प्रकार रिकॉर्ड करें: 0 = कोई प्लेसमेंट नहीं; 0.5 = अधूरा और/या देरी से प्लेसमेंट; 1 = तत्काल और पूरा प्लेसमेंट।

4. एमआरआई द्वारा इनफाक्ट पुष्टि

  1. सर्जरी के बाद एमआरआई स्कैन 24 एच करें।
  2. आइसोफ्लुरेन (प्रेरण के लिए 5%, रखरखाव के लिए 1%-1.5%) द्वारा चूहे को एनेस्थेटाइज करें।
  3. चूहे के सिर को चूहे के मस्तिष्क सरणी कुंडली में सुरक्षित करें और संचारित-केवल मात्रा कुंडली के साथ संयुक्त करें।
  4. कुंडली और चूहे को एमआरआई स्कैनर में रखें। दांत और कान की सलाखों का उपयोग कर पालने के भीतर चूहे को सुरक्षित करें।
  5. बंद सर्किट थर्मल जैकेट का उपयोग कर एमआरआई स्कैनिंग प्रक्रिया के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर शरीर के तापमान को बनाए रखें।
  6. सही ज्यामिति सुनिश्चित करने के लिए एक पायलट अनुक्रम का उपयोग करें।
  7. एक फास्ट स्पिन इको अनुक्रम का उपयोग कर T2 भारित स्कैन ले लीजिए: इको टाइम (TE) = ३३ एमएस; पुनरावृत्ति समय (टीआर) = 8,000 एमएस; देखने का क्षेत्र = 30 मिमी x 30 मिमी; अधिग्रहण मैट्रिक्स = 512 × 512; 50 स्लाइस; 0.4 मिमी मोटी।
  8. एक चार शॉट स्पिन-इको प्लानर इमेजिंग DWI स्कैन ले लीजिए: इको टाइम = 30.5 एमएस; पुनरावृत्ति समय = 8000 एमएस; मैट्रिक्स = 96 × 96; देखने का क्षेत्र = 25 मिमी x 25 मिमी; तीन दिशाओं = एक्स, वाई, जेड; बी मान = 0 1,000 एस/मिमी2 और 1,000 एस/मिमी2; 50 समीपस्थ अक्षीय स्लाइस; 0.4 मिमी मोटी।
  9. चूहों को पिंजरे में लौटाएं।

5. टीटीसी धुंधला द्वारा इनफाक्ट पुष्टि

  1. प्रायोगिक डिजाइन के अनुसार समय बिंदु पर चूहों का त्याग करें। इस प्रयोग में हमने सर्जरी के बाद चूहों को 24 घंटे की कुर्बानी दी।
  2. कुर्बानी से पहले 2% टीटीसी सॉल्यूशन तैयार करें। 10 एमएल 0.01 एम पीबीएस (पीएच 7.4) में 0.2 ग्राम टीटीसी पाउडर जोड़ें। कमजोर पड़ने को सिल्वर पेपर से ढके 10 सेमी डिश में ट्रांसफर करें और पानी के नहाने में 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीवार्म्ड करें ।
  3. चेतना के नुकसान तक चूहे को 5% आइसोफ्लुनाणे में बेनकाब करें। फिर, सीओ2 (प्रति मिनट पिंजरे की मात्रा का 20%-30%) चूहे को बेनकाब करें जब तक कि सांस लेना बंद न हो जाए, फिर सीओ 2 एक्सपोजर के2 मिनट बनाए रखें।
  4. मृत्यु की पुष्टि करने के लिए निम्नलिखित संकेतों का उपयोग करें: छाती का कोई बढ़ना और गिरना, कोई स्पष्ट दिल की धड़कन, खराब म्यूकस झिल्ली रंग, पैर की अंगुली चुटकी, रंग परिवर्तन या आंखों में अस्पष्टता का कोई जवाब नहीं।
  5. सर्वाइकल अपभ्रंश करें।
  6. एक बाँझ मंच पर पंजे टेप द्वारा जानवरों को सुरक्षित करें। क्लैविकल से हाइपोगास्ट्रियम तक मिडलाइन चीरा बनाएं और रिबकेज के साथ बाईं ओर xiphoid से एक पार्श्व चीरा बनाएं। दिल को बेनकाब करने के लिए रिबकेज और छाती मिडलाइन चीरा के साथ डायाफ्राम में भी कटौती करें।
  7. एक सुई (27 जी) की नोक को बाएं वेंट्रिकल में 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.01 एम पीबीएस युक्त परफ्यूजन पंप से जोड़ें।
    नोट: एट्रियम में प्रवेश करने से बचने के लिए वेंट्रिकल के बाएं किनारे के साथ टिप को आगे बढ़ाएं। टिप बाएं वेंट्रिकल में है और सही आलिंद कटौती सुनिश्चित करने के लिए पर्फ्यूजन पंप चालू करें। यदि तरल पदार्थ नथुने से बाहर निकलता है, तो टिप एट्रियम में है और इसे समायोजित या फिर से स्थापित करने की आवश्यकता है।
  8. 0.01 एम पीबीएस के लगभग 100 एमएल का उपयोग करें, परफ्यूजन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया है। जब तक जिगर सफेद हो जाता है परफ्यूजन पंप बंद कर दें।
  9. चूहों को काटना और कैंची और संदंश का उपयोग कर पूरे दिमाग विच्छेदन। ब्लॉटिंग पेपर के साथ मस्तिष्क की सतह से किसी भी पानी को हटा दें।
  10. 1 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर पूरे मस्तिष्क को स्टोर करें (ठंड के बाद मस्तिष्क के वर्गों को काटना आसान है)।
    नोट: इस कदम को छोड़ दिया जा सकता है अगर मस्तिष्क वर्गों ठंड के बिना अच्छी तरह से काटा जा सकता है ।
  11. मस्तिष्क को पृष्ठीय पक्ष के साथ मैट्रिक्स में रखें।
  12. चित्रा 1G में दिखाए गए मस्तिष्क की सतह में छेद की पहचान करें और एक स्टेनलेस स्टील 0.21 मिमी मोटी ब्लेड डालें। आमतौर पर, इंफार्क्शन का सबसे बड़ा क्षेत्र जांच के विमान में है; इस प्रकार, इस क्षेत्र में एक ब्लेड डाला जाना चाहिए।
  13. 2 मिमी के अंतराल पर अन्य ब्लेड डालें।
  14. इसके साथ ही ब्लेड निकालें, सभी एक बार में, मैट्रिक्स से और पकवान में टीटीसी समाधान में ब्लेड के साथ पूरे मस्तिष्क जगह है। ब्लेड को ध्यान से निकालें।
    नोट: यहां, मस्तिष्क वर्गों को आसानी से तरल से नहीं हटाया गया क्योंकि आधार क्रैनआईआई में कुछ अवशिष्ट पिया मेटर ने सेक्शनिंग में हस्तक्षेप किया। यदि कोई भी वर्ग मैट्रिक्स में रहता है, तो उन्हें पकवान में स्थानांतरित करने के लिए एक छोटे स्पैटुला का उपयोग करें।
  15. 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में टीटीसी समाधान और मस्तिष्क वर्गों के साथ पकवान रखें।
  16. हर 5 मिनट में पकवान की जांच करें और वर्गों का कोई ओवरलैप सुनिश्चित करें।
  17. टीटीसी प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए डिश में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान के 10 एमएल जोड़ें।
  18. रोस्ट्रल से कौडल तक सेक्शन को ओरिएंट करें और तस्वीरें लें।

6. सांख्यिकी

  1. एक छात्र के टी-टेस्टकरने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, ग्राफपैड चश्मे) का उपयोग करें।
    नोट: सभी डेटा मतलब ± एसई के रूप में व्यक्त किए जाते हैं । समूहों के बीच मतभेद दो पूंछ छात्र टीपरीक्षण (पी और लेफ्टिनेंट; ०.०५ सांख्यिकीय महत्व के रूप में परिभाषित) के साथ निर्धारित कर रहे हैं ।

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Representative Results

छह जानवरों को ऊपर वर्णित सर्जरी प्रोटोकॉल के अधीन किया गया था । अंक 4 में दिखाए गए नियंत्रण समूह में छह चूहे शामिल थे। चित्रा 4 में दिखाए गए मस्तिष्क के स्लाइस प्रति समूह एक चूहे से प्राप्त किए गए थे।

एमआरआई स्कैनिंग से पता चला कि इंफार्क्शन पोन्स(चित्रा 4A)के आधार पर स्थित था । चूंकि जांच को मिडलाइन के बाईं ओर 2 मिमी इंजेक्ट किया गया था, इसलिए इंफार्क्शन पार्श्व में स्थित था। यह इंफार्क्शन रोगियों(चित्रा 4 ए)में एंटेरोलेटरल पोंटिन इंफेक्शन की नकल करता है। क्योंकि एक अछूता म्यान का उपयोग किया गया था, कॉर्टेक्स, सेरिबैलम, और मिडब्रेन(चित्रा 4A)सहित जांच की नोक से परे कोई इंफार्क्शन नहीं था। DWI छवियों को भी तीव्र पोंटिन इंफार्क्शन(चित्रा 4A) सेपता चला ।

टीटीसी धुंधला इंफार्क्शन 24 एच पोस्ट सर्जरी(चित्रा 4A)की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । नियंत्रण समूह की तुलना में, इंफार्क्शन की मात्रा काफी अधिक थी(चित्रा 4B)।

व्यवहार स्कोर से पहले और सर्जरी के बाद मापा गया । सर्जरी से पहले और बाद में नियंत्रण और इन्फ्राक्ट मॉडल समूहों के लिए स्कोर तालिका 1 में प्रस्तुत किए जाते हैं। पोंटिन इंफार्क्शन के लिए डिज़ाइन किए गए एक विशिष्ट व्यवहार परीक्षण की कमी के कारण, लोंगा स्कोर, बर्डसन स्कोर और बैलेंस बीम टेस्ट का उपयोग न्यूरोलॉजिकल घाटे का आकलन करने के लिए किया गया था। इसके अतिरिक्त, चिपकने वाला हटाने सोमाटोसेंसरी परीक्षण संवेदी समारोह के साथ-साथ अंग-प्लेसमेंट परीक्षण का आकलन करने के लिए प्रोप्रोसेप्शन का आकलन करने के लिए।

नियंत्रण समूह की तुलना में, पोंटिन इंफार्क्शन वाले चूहों ने बाईं ओर परिक्रमा की(चित्रा 4A)। लोंगा स्कोर (2.67 ± 0.52 बनाम) में महत्वपूर्ण अंतर थे। 0, पी एंड एलटी; 0.05, चित्रा 4C),बर्डसन स्कोर (2.67 ± 0.52 बनाम 0, पी एंड एलटी; 0.05, चित्रा 4D),अंग प्लेसमेंट टेस्ट (4.67 ± 0.52 बनाम 0, पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05, चित्रा 4E),बीम बैलेंस टेस्ट स्कोर (118.33 ± 2.66 बनाम 10.17 ± 1.47, पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05, चित्रा 4F),और पोंटिन इन्फेक्शन और कंट्रोल ग्रुप चूहों के साथ चूहों के बीच चिपकने वाले रिमूवल सोमाटोसेंसरी टेस्ट स्कोर (2.33 ± 0.52 बनाम 12.0 ± 0, पी एंड एलटी; 0.05, चित्रा 4G)

Figure 1
चित्रा 1: इंफेक्शन प्रतिष्ठान। (क)खोपड़ी में बना एक छेद। (ख)म्यान को छेद में ले जाया जाता है । (ग)म्यान का इंजेक्शन। (घ)जांच का इंजेक्शन । (ई)एनोड (लाल तीर) जुड़ा हुआ है। (च)जांच को हटा दिया जाता है । (जी)छेद (लाल तीर) मस्तिष्क की सतह में छोड़ दिया। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

Figure 2
चित्रा 2: जांच का स्थान। (क) स्टीरियोटैक्सिक स्थानों का योजनाबद्ध आरेख: तीर त्वचा के फ्लैप, ब्रेग्मा की साइट और ड्रिल की स्थिति के पीछे हटने की ओर इशारा करते हैं । (ख) म्यान और जांच का योजनाबद्ध आरेख । (ग) पोन्स में रखे गए म्यान की नोक का स्थान । (घ) पोनों में रखी गई जांच की नोक का स्थान । (ङ) प्रायोगिक डिजाइन। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

Figure 3
चित्रा 3: घाव-उत्पादक डिवाइस। (क) म्यान और जांच का अलग । (ख) म्यान में जांच । (ग) नीला इलेक्ट्रोड एनोड था जो कौडल प्रोब से जुड़ा हुआ था; लाल इलेक्ट्रोड कैथोड था। (घ) विद्युत उत्तेजक। (ङ) सर्जिकल उपकरण। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि परिणाम। (क)वीवो में टी2 और डीडब्ल्यूआई सीक्वेंस के साथ एमआरआई स्कैनिंग द्वारा इंफार्क्शन का आकलन किया गया था और सर्जरी के बाद टीटीसी स्टेन इन विट्रो 24 एच द्वारा पुष्टि की गई थी । दाहिने एंटेरोलेटरल पोन (बिंदीदार रेखा) में स्थित तीव्र पोंटिन इंफार्क्शन। व्यवहार परीक्षण से पता चला है कि चूहा घाव के विपरीत पक्ष की परिक्रमा करता है। (ख)इंफार्क्शन की मात्रा । (ग)लंबा स्कोर । (घ)बेडरसन स्कोर । (ई)अंग रखने का परीक्षण। (च)बैलेंस बीम वॉकिंग टेस्ट। (जी)चिपकने वाला हटाने सोमाटोसेंसरी टेस्ट । बार्स मतलब ± एसडी(पी एंड एलटी; 0.05 बनाम नियंत्रण समूह) का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

Supplemental Figure 1
चित्रा S1: पोन में कमी का नाता। जांच टिप की लंबाई छोटा है। एमआरआई स्कैनिंग से सही पोन्स में खामी दिखाई देती है। (A)टी-2 इमेज । (ख)डीडब्ल्यूआई इमेज । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

चूहा नहीं लोंगा स्कोर बर्डसन स्कोर बैलेंस बीम टेस्ट चिपकने-हटाने सोमाटोसेंसरी परीक्षण अंग-प्लेसमेंट परीक्षा
पूर्व सर्जरी के बाद पूर्व सर्जरी के बाद पूर्व सर्जरी के बाद पूर्व सर्जरी के बाद पूर्व सर्जरी के बाद
पोंटिन इंफेक्शन 1 0 3 0 2 0 5 6 120 12 2
पोंटिन इंफेक्शन 2 0 2 0 3 0 4 8 120 12 3
पोंटिन इंफेक्शन 3 0 3 0 3 0 5 8 116 12 2
पोंटिन इंफेक्शन 4 0 3 0 3 0 4 6 120 12 2
पोंटिन इंफेक्शन 5 0 3 0 2 0 5 7 114 12 2
पोंटिन इंफेक्शन 6 0 2 0 3 0 5 7 120 12 3
नियंत्रण 1 0 0 0 0 0 0 9 11 12 12
नियंत्रण 2 0 0 0 0 0 0 8 10 12 12
नियंत्रण 3 0 0 0 0 0 0 10 8 12 12
नियंत्रण 4 0 0 0 0 0 0 7 11 12 12
नियंत्रण 5 0 0 0 0 0 0 8 9 12 12
नियंत्रण 6 0 0 0 0 0 0 9 12 12 12

तालिका 1: व्यवहार स्कोर।

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Discussion

वर्तमान अध्ययन एक तीव्र पोंटिन इंफार्क्शन चूहा मॉडल पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है। इस मॉडल का उपयोग पोंटिन स्ट्रोक रोगियों में पूर्वानुमान और पुनर्वास (स्ट्रोक के बाद पुराने दर्द सहित) पर अनुसंधान के लिए किया जा सकता है।

इस विधि की कई शक्तियां हैं। सबसे पहले, यह भविष्य के अध्ययन के लिए तीव्र पोंटिन इंफार्क्शन का एक चूहा मॉडल प्रदान करता है। जैसा कि ऊपर बताया गया है, पोंटिन इंफार्क्शन एक आम स्ट्रोक उपप्रकार है जिस पर कम ध्यान दिया गया है। स्ट्रोक अनुसंधान की एक बड़ी कमी एक विशिष्ट पोंटिन इंफार्क्शन मॉडल की कमी रही है। दूसरा, बीए15,,16के लिगेशन द्वारा मौजूदा पोंटिन इंफार्क्शन चूहा मॉडल की तुलना में, इस मॉडल को प्रायोगिक डिजाइन के अनुसार इंफार्क्शन के स्थान और मात्रा को बदलने के लिए समायोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, टिप की लंबाई को बदला जा सकता है ताकि इंफार्क्शन पोन की सतह से फैली हो, जैसा कि यहां किया गया है।

वैकल्पिक रूप से, जांच टिप(पूरक चित्र 1)की लंबाई को छोटा करके पोन में एक कमी की कमी स्थापित की जा सकती है। पोन्स (यानी एंटेरोमेडियल पोंटिन इंफेक्शन) के विभिन्न स्थानों में और पोन (यानी, ऊपरी, मध्यम और निचले विमानों) के विभिन्न विमानों में भी स्थलाकृतिक डिजाइन के अनुसार बनाया जा सकता है। इस मॉडल में अपर पोंटिन प्लेन को चुना गया। तीसरा, इस मॉडल को स्थापित करने के लिए आसान है और एक उच्च सफलता दर के पास है । बीए का लिगेशन संभावित कोलैटरल सर्कुलेशन15के कारण इंफार्क्शन का उत्पादन नहीं कर सकता है, लेकिन यह मॉडल उच्च सफलता दर पर इंफार्क्शन स्थापित करता है, जो विश्वसनीय अनुसंधान मॉडलों के लिए आवश्यक है।

इस विधि की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, इस मॉडल में इंफेक्शन एक असली स्ट्रोक नहीं है। स्ट्रोक संवहनी वाहिका घावों, रक्त सामग्री की अशांति, या मस्तिष्क रक्त प्रवाह के विनियमन की शिथिलता का परिणाम है। इंफार्क्शन पोन्स में घाव से पैदा होता है जो अनायास नहीं होता है। दूसरे शब्दों में, इस मॉडल को संबोधित करने के लिए क्यों स्ट्रोक पोन में होता है इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है । दूसरा, इस मॉडल को विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, जैसे घाव पैदा करने वाले उपकरण और स्टीरियोटैक्सिक उपकरण।

अंत में, निष्कर्ष एक प्रयोगात्मक तीव्र पोन स्ट्रोक मॉडल की स्थापना में इस मॉडल की सफलता साबित करते हैं । इस उपन्यास मॉडल के आधार पर, परिणामस्वरूप सेल हानि और तीव्र पोंटिन इंफार्क्शन के पूर्वानुमान को आगे की जांच की जा सकती है और भविष्य के चिकित्सीय विकास के लिए अनुमति दी जा सकती है।

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Disclosures

हितों का कोई टकराव नहीं।

Acknowledgments

इस अध्ययन को नेशनल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (८१४७११८१ और ८१८७०९३३) से वाई जियांग और नेशनल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (नंबर ८१६०१०११), जियांग्सू प्रांत के नेचुरल साइंस फाउंडेशन (No) ने आर्थिक रूप से समर्थन दिया । BK20160345) जे झू के लिए और ग्वांग्झू नगर स्वास्थ्य आयोग (20191A011083) के वैज्ञानिक कार्यक्रम द्वारा जेड Qiu के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 sucture Shanghai Jinzhong Surgical instruments
Adhesive tape Shanghai Jinzhong Surgical instruments
Animal anesthesia system RWD Wear mask when using the system
Bone cement Shanghai Jinzhong Surgical instrument
Cured clamp Shanghai Jinzhong Surgical instrument
General tissue scissors Shanghai Jinzhong Surgical instrument
IndoPhors Guoyao of China Sterilization
Isoflurane RWD 217181101
Lesion Making Device Shanghai Yuyan Making a lesion
MRI system Bruker Biospin Confirmation of infarction in vivo
Needle holder Shanghai Jinzhong Surgical instrument
Penicilin Guoyao of China Infection Prevention
Probe Anke Need some modification
Q-tips Shanghai Jinzhong Surgical instrument
Shearing scissors Shanghai Jinzhong Surgical instrument
Stereotaxic apparatus RWD
Suture needle Shanghai Jinzhong Surgical instrument
Tissue holding forcepts Shanghai Jinzhong Surgical instrument
TTC Sigma-Aldrich BCBW5177 For infarction confirmation in vitro

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 162 पोंटिन इंफार्क्शन चूहा पोन मॉडल स्ट्रोक ब्रेनस्टेम पीछे परिसंचरण
विद्युत उत्तेजना द्वारा चूहों में तीव्र पोंटिन इंफार्क्शन की स्थापना
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Luo, M., Tang, X., Zhu, J., Qiu, Z., More

Luo, M., Tang, X., Zhu, J., Qiu, Z., Jiang, Y. Establishment of Acute Pontine Infarction in Rats by Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (162), e60783, doi:10.3791/60783 (2020).

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