Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Karakterisering single-molekyle konformationændringer under forskydning flow med fluorescens mikroskopi

Published: January 25, 2020 doi: 10.3791/60784
Automatic Translation
1, *2, *3, 3, 1,2, 1,4
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer en protokol for immobilisering af enkelte makromolekyler i mikrofluidiske enheder og kvantificereændringer i deres konformationer under forskydningsflow. Denne protokol er nyttig til at karakterisere biomekaniske og funktionelle egenskaber af biomolekyler såsom proteiner og DNA i et flowmiljø.

Abstract

Single-molekyle adfærd under mekanisk forstyrrelser er blevet karakteriseret bredt til at forstå mange biologiske processer. Metoder som atomkraftmikroskopi har imidlertid begrænset tidsmæssig opløsning, mens Förster resonansenergioverførsel (FRET) kun tillader, at konformationer udledes. Fluorescens mikroskopi, på den anden side, giver real-time in situ visualisering af enkelte molekyler i forskellige flow betingelser. Vores protokol beskriver trinene til at fange kropsbygningsændringer af enkelte biomolekyler under forskellige forskydningsflowmiljøer ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Forskydningsstrømmen skabes inde i mikrofluidiske kanaler og styres af en sprøjtepumpe. Som demonstrationer af metoden, von Willebrand faktor (VWF) og lambda DNA er mærket med biotin og fluorophore og derefter immobiliseret på kanalens overflade. Deres konformationer overvåges løbende under variabel forskydningsstrøm ved hjælp af total intern refleksion (TIRF) og mikroskopi af konfokal fluorescens. VWF's reversible optrævlingsdynamik er nyttige til at forstå, hvordan dens funktion reguleres i menneskeblod, mens kropsdannelsen af lambda DNA giver indsigt i makromolekylers biofysik. Protokollen kan også anvendes bredt til at studere adfærd polymerer, især biopolymerer, i varierende flow betingelser og til at undersøge reheologi af komplekse væsker.

Introduction

Mekanismer for, hvordan biomolekyler reagerer på miljømæssige stimuli er blevet undersøgt bredt. Især i et flowmiljø regulerer forskydnings- og langstrømskræfter konformationsændringerne og potentielt biomolekylernes funktion. Typiske eksempler omfatter forskydning-induceret optrævling af lambda DNA og von Willebrand faktor (VWF). Lambda DNA er blevet brugt som et redskab til at forstå kropsdynamik af individuelle, fleksible polymer kæder og reheologi af polymeropløsninger1,2,3,4. VWF er en naturlig flowsensor, der samler blodplader på sårsteder i blodkarrene med unormale forskydningshastigheder og flowmønstre. Optrævling af VWF er afgørende for aktivering af bindingen af blodplader til A1-domænet og kollagenbinding til A3-domænet. Desuden giver høj forskydnings-induceret A2 domæne udfolder sig kavalergang af VWF, som regulerer sin molekylvægt fordeling i omløb5,6. Således direkte visualisering af, hvordan disse molekyler opfører sig under flow kan i høj grad forbedre vores grundlæggende forståelse af deres biomekanik og funktion, som igen kan muliggøre nye diagnostiske og terapeutiske applikationer.

Typiske metoder til at karakterisere single-molekyle konformationer omfatter optiske / magnetiske pincet, atomkraft mikroskopi (AFM) og single-molekyle Förster resonans energioverførsel (FRET)7. Single-molekyle kraft spektroskopi er et kraftfuldt værktøj til at undersøge den kraft og bevægelse forbundet med konformationændringer af biomolekyler. Men det mangler evnen til at kortlægge samlede molekylære konforringer8. AFM er i stand til billeddannelse med høj rumlig opløsning, men er begrænset i tidsmæssig opløsning9,10. Desuden kan kontakt mellem spidsen og prøven forvirre svaret forårsaget af flow. Andre metoder som FRET og nanopore analyse bestemme enkelt-molekyle protein foldning og udfoldelse stater baseret på påvisning af intramolekylær afstand og udelukkede mængder. Disse metoder er dog stadig i deres vorden og begrænset i deres direkte observation af konforringer med et enkelt molekyle11,12,13,14.

På den anden side har direkte observation af makromolekyler med høj tidsmæssig og rumlig opløsning under fluorescensmikroskopi forbedret vores forståelse af enmolekyledynamik i mange biologiske processer15,16. For eksempel, Fu et al. nylig opnået samtidig visualisering af VWF forlængelse og blodplade receptor bindende for første gang. I deres arbejde blev VWF molekyler immobiliseret på overfladen af en mikrofluidic kanal gennem biotin-streptavidin interaktioner og afbildet under total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi ved varierende forskydning flow miljøer17. Ved hjælp af en lignende metode som Fu's, vi her viser, at konformationer af VWF og lambda DNA kan observeres direkte under både TIRF og konfokale fluorescens mikroskopi. Som vist i figur 1anvendes mikrofluidiske anordninger til at skabe og kontrollere forskydningsflow, og biomolekyler immobiliseres på kanalens overflade. Ved anvendelse af forskellige forskydningshastigheder registreres konformationer af samme molekyle for at måle forlængelseslængden, også vist i figur 1. Metoden kunne anvendes bredt til at udforske andre polymer adfærd under komplekse flow miljøer for både reologiske og biologiske undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af VWF

  1. Rekonstituere humanplasma VWF at forberede det til mærkning reaktioner. Der tilsættes 100 μL deioniseret (DI) vand til 100 μg lyophilized VWF for at skabe en 1 mg/ml VWF-aktieopløsning.
  2. Dialyze VWF lageropløsning for at fjerne overskydende glycin, og dermed øge biotin og fluorophore mærkning effektivitet.
    1. Overfør 50 μL VWF-lageropløsning til en 0,1 ml dialyseenhed med en 10.000 molekylvægtsafskæring og forsegling med hætte. Den resterende lageropløsning opbevares ved -20 °C. VWF-aktien vil være stabilt i op til 1 år ved -20 °C.
    2. Dialyse i 500 ml 1 x sterilt fosfatbuffered saltvand (PBS) (0,01 M dinatriumfosfat, 0,0018 monokaliumfosfat, 0,0027 M kaliumchlorid, 0,137 M natriumchlorid, pH 7,4 ved 25 °C) i 1 h ved 4 °C ved langsom omrøring. Gentag dialyse i en ekstra time ved hjælp af 500 ml frisk PBS.
  3. Start biotin mærkning reaktion. Forbered en 2 mM-opløsning af NHS-PEG4-biotin ved at opløse fasti-vandet umiddelbart før reaktionen. Hvis NHS-PEG 4-biotin forbliver i vand i længere tid, vil NHS-ester-gruppen hydrolyze og dermed reducere mærkningseffektiviteten.
    1. Der tilsættes 2,5 μL 2 mM NHS-PEG4-biotin til dialyseenheden, der indeholder VWF-lageropløsningen. Dette vil resultere i en 20-fold molar overskud af biotin i forhold til VWF monomerer. Vwf's primære aminer vil reagere med NHS-estergrupperne og dermed covalently binding til PEG4-biotingrupper via amidforbindelser.
    2. Anbring dialyseenheden inde i et mikrocentrifugerør på 1,5 ml. Forsegle dialyseenheden med den tilsvarende hætte. Fastgør rørdialysesamlingen med Parafilm. Hold dig oprejst og lad ved stuetemperatur i 40 min.
  4. Start fluorophore mærkning reaktion. Der fremstilles en 2,8 mM opløsning af Alexa 488 tetrafluorophenyl-ester (TFP-ester) fluorescerende farvestof (excitationmax = 498 nm, emissionmax = 519 nm) ved at opløse fluorophore fast stof i DI vand. Gør dette umiddelbart før reaktionen for at forhindre TFP-estergruppen i at hydrolysere.
    1. Der tilsættes 2,9 μL af 2,8 mM 488 fluorophore til dialyseenheden. Dette vil resultere i en 34-fold molar overskud af fluorophore i forhold til VWF monomerer. VWF's resterende primære aminer vil reagere med TFP-estergrupperne og dermed covalently binding til fluorophores via amidforbindelser.
    2. Der tilsættes 2,0 μL 1 M natriumbikarbonat (opløst i DI-vand) til dialyseenheden. Dette justerer reaktionens pH-værdi tættere på 8,0, hvilket øger effektiviteten af TFP-esteren og den primære aminreaktion.
    3. Fastgør dialyseenheden i et mikrocentrifugerør på samme måde som i trin 1.3.2. Opbevares i mørke for at forhindre fotoblegning og lad ved stuetemperatur i 1 time og 30 min.
  5. Dialyseenheden anbringes i 900 ml 1x steril PBS og dialyze natten over ved 4 °C. Dette vil give ca. 70 μL mærket VWF med en koncentration på 0,71 mg/ml eller 2,84 μM (monomerkoncentration).
  6. Overfør mærket VWF til et mikrocentrifugerør. Dæk røret med aluminiumsfolie og beskyt mod lys. Opbevares ved 4 °C. Ved langtidsopbevaring tilsættes antimikrobielt stof natriumazid til en endelig koncentration på 0,02 % (w/v).
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.

2. Forberedelse Lambda DNA

  1. Biotinylate lineær lambda DNA ved at fylde sine sammenhængende ende steder (cos sites) med biotin-14-dCTP nukleotider i henhold til standard protokoller, gentages her i trin 2,118. Udfyld resten af cos-stederne med dATP, dTTP og dGTP nukleotider.
    1. Forbered 1 mM opløsninger af dATP, dTTP, dGTP og biotin-14-dCTP i en 10x reaktion buffer (500 mM natriumchlorid, 100 mM Tris hydrochlorid, 100 mM magnesiumchlorid, 10 mM dithiothreitol, pH 7,9 ved 25 °C).
    2. 48 μL 500 ng/μL lambda DNA i et PCR-rør og opvarmes i 5 min ved 65 °C. Cos steder cirkulære lambda DNA vil adskille under varme, linearisere molekylet og gøre enkelt-strandede udhæng klar til biotinylation. Umiddelbart efter, sted på is for at forhindre cos steder fra re-annealing.
    3. Der tilsættes 5 μL 1 mM dATP, dTTP og dGTP og 4 μL 1 mM biotin-14-dCTP til lambda-DNA'et. Der tilsættes også 2,5 μL 5 U/μL Klenow Fragment (3'à5' exo-) for at katalysere DNA-syntesen.
    4. Inkuber reaktionsblandingen i 1 time ved 37 °C.
    5. Der tilsættes 1,2 μL 0,5 M EDTA. Derefter opvarmes reaktionsblandingen i 5 min ved 70 °C. Dette vil deaktivere Klenow Fragment og biotinylation reaktion.
  2. Fjern overskydende nukleotider fra lambda DNA ved hjælp af en spin kolonne, der kan rumme 10-70 μL og har en 6.000 molekyl vægt cut-off.
    1. Placer kolonnen inde i et 2 ml mikrocentrifugerør. Centrifuger søjlen og røret ved 1000 x g i 2 min. Bortskaf gennemstrømning, der opsamles i røret.
    2. Udskift kolonnebufferen med en 1x opløsning af den samme reaktionsbuffer fra trin 2.1.1. Gør dette ved at tilføje 500 μL 1x buffer til kolonnen. Centrifuge i 1 min ved 1000 x g. Udsmid flowet. Gentag disse 2 gange mere, så der i alt er tilføjet i alt 1500 μL til kolonnen.
    3. Placer kolonnen i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilføj forsigtigt løsningen fra trin 2.1.5 til kolonnens øverste lag. Centrifuge i 4 min ved 1000 x g.
    4. Gennemfør gennemløbet (40-70 μL) fra mikrocentrifugerøret, og anbringes i et PCR-rør. Dette indeholder den rensede, biotinylated lambda DNA.
  3. Label lambda DNA med fluorescerende YOYO-1 farvestof (excitationmax = 490 nm, emissionmax = 509 nm) i henhold til standard protokoller, gentages her i trin 2.3.120.
    1. Forbered en opløsning af YOYO-1 farvestof og lambda DNA med et farvestof til base par molar forholdet 1:10. Antag ingen DNA gik tabt i rensning trin til at beregne base par koncentration af lambda DNA. Lambda DNA i fuld længde har 48.502 grundpar.
      BEMÆRK: Hvis der for eksempel er fundet 50 μL opløsning fra trin 2.2.4, tilsættes 7,4 μL 500 μM YOYO-1 farvestof.
    2. Opløsningen opvarmes i 2 timer ved 50 °C i mørke for at fuldføre reaktionen.
    3. Dæk røret med aluminiumsfolie og beskyt mod lys. Opbevares ved 4 °C. Løsningen er nu klar til at blive injiceret i mikrofluidiske enheder.
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.

3. Oprettelse af mikrofluidic kanal forme i silicium wafer

  1. Brug fotolithografi til at skabe mikrofluidiske kanaler med passende dimensioner (figur 2) på en master silicium wafer i henhold til standard protokoller19.

4. Fremstilling af polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidic enhed

  1. Tilsæt 5 dele silikone elastomer base til 1 del hærdningsmiddel (ved masse) i en vejer båd. Rør indholdet grundigt i 1 min for at skabe præ-hærdet PDMS løsning.
  2. Placer master silicium wafer i en plastik Petri skål. Hæld PDMS-opløsningen over waferen for at skabe et lag på 5 mm. Dæk skålen og lad i en ekssikkator under vakuum i 1 time for at fjerne luftbobler.
  3. Inkubator dækket Petri skål ved 60 °C natten over for at helbrede PDMS i en fleksibel fast. Hærdning vil resultere i mikrofluidic kanaler støbt ind i PDMS på PDMS-wafer interface.
  4. Skær 20 x 10 mm rektangler ind i PDMS, omkring hver mikrofluidic kanal, ved hjælp af en barbermaskine. Fjern de rektangulære PDMS-blokke med pincet.
  5. Brug en 25 G stump ende nål med skærpede kanter til at punch et hul 0,5 mm i diameter i den ene ende af kanalen, og sørg for hullet går helt gennem PDMS blok(Figur 2). Brug en tynd nål til at slå PDMS ud fra hul. Gentag dette i den anden ende af kanalen. Dette vil skabe et indløb og udløb for flow gennem kanalen.
  6. Rengør overfladen af PDMS blok med vinyl renrum tape. Blæse komprimeret nitrogengas over en Nr. 1 1/2, 22 x 50 mm dæksel for at fjerne snavs.
  7. Anbring PDMS-blokken med kanalsiden op og dæksgriden i kammeret på en plasmabindingsmaskine. Start behandlingen.
  8. Når behandlingen er fuldført, skal du hurtigt placere PDMS-blokken på en dækseddel, så kanalen er i kontakt med slip'et. Tryk langs kanterne af blokken. Dæksel-PDMS-enheden anbringes på en kogeplade ved 115 °C i 15 minutter for at forstærke den permanente binding.
  9. Sæt 10 cm lange, 0,25 mm slanger i den indre diameter ind i udløbshullet øverst på PDMS-blokken. Dette gør det nemt for væske at flyde ud af kanalen. Enheden er nu færdig.

5. Behandling af overfladen af mikrofluidic enhed

  1. Tilføres <10 μL 10 μg/ml biotinylated bovine serum albumin (BSA-biotin) opløst i steril1x PBS i indløbet af mikrofluidic enhed til VWF eksperimenter. Tilføres <10 μL 1 mg/ml BSA-biotin til lambda DNA-eksperimenter. Hold et par mikroliter BSA-biotin tilbage i pipettespidsen efter injektionog lad spidsen forblive indlejret i fjorden.
    1. Hold altid en dråbe DI vand omkring spidsen. Dette vil forhindre luftbobler i at komme ind i kanalen. Påfør denne teknik, hver gang en ny løsning sprøjtes ind i kanalen.
    2. Tillad BSA-biotin at inkubere i enheden i 2 timer. BSA binder sig ikke specifikt til dækseloverfladen (figur 3A).
  2. Fjern pipettespidsen. Injicer <10 μL kaseinspærreopløsning ind i kanalen og lad den inkubere i 30 min. Kaseinen vil blokere alle friarealer, hvilket reducerer uspecifik binding af biomolekyler til overfladen (figur 3B).
  3. Tippen fjernes, og tilsprøjt <10 μL 10 μg/ml streptavidin opløses i steril 1x PBS i kanalen til VWF-forsøg. Brug 100 μg/ml streptavidin til lambda DNA-eksperimenter. Inkubere i 10 min. Streptavidin vil binde sig til biotingrupperne i BSA-biotin (figur 3C).
  4. Fjern spidsen og injicer <10 μL 1x vaskemiddelopløsning (0,05% Tween 20 i PBS) i kanalen for at vaske overskydende streptavidin væk.
  5. Tag spidsen og injicer <10 μL af enten 28,4 nM VWF fortyndet i kaseinopløsning eller lambda DNA fra trin 2.3.3. Inkubervwf i 3 min. Inkubator lambda DNA i 45 min (figur 3D).
  6. Tippen fjernes, og tilsprøjt <10 μL 5 mM gratis biotin fortyndet i kaseinopløsning. Gratis biotin vil blokere overskydende streptavidin binding s sites på kanalens overflade (Figur 3E).

6. Visualisering af VWF og Lambda DNA under fluorescensmikroskopi

  1. Forbered 1 ml kasein spærreopløsning med 2,2 mM protocatechuic syre og 37 nM protocatechuate-3,4-dioxygenase (for at minimere fotoblegning). Læg i en sprøjte og fastgør i en sprøjtepumpe. Tag 30 cm lange, 0,25 mm slanger i indre diameter, og fastgør den ene ende til sprøjtenålen. Flow i opløsningen for at fjerne luftbobler. Fastgør den anden ende af røret til indløbet af den mikrofluidiske enhed. Det anbefales at gøre dette 3 minutter efter trin 5.6.
  2. Vælg det højeste forstørrelsesmål (dvs. 60-100X) for et samlet internt refleksionsmikroskop (TIRF) eller konfokalfluorescensmikroskop. Tilføj en dråbe nedsænkning olie på sit mål, hvis det er nødvendigt. Placer den mikrofluidiske enhed på mikroskopscenen, så dæksgriden flugter med målet.
  3. Start brightfield mikroskopi. Juster fokus, så alle funktioner, så som snavs og bobler, er synlige. Juster derefter fasen i X- og Y-retningen, indtil kanten af den mikrofluidiske kanal er synlig og skærer rammen.
  4. Skift til 488-kanalen (FITC). Juster Z-niveau og TIRF vinkel efter behov, indtil de enkelte grønne, kugleformede molekyler kan skelnes. Disse er enten VWF eller lambda DNA molekyler.
  5. Juster eksponeringstiden og laserintensiteten for at visualisere fluorescerende molekyler uden at fotoblege dem for hurtigt. Juster kontrasten til også at visualisere molekyler mere klart.
  6. Start flow fra sprøjtepumpen, så kasein blokering løsning strømmer ind i kanalen og ud af stikkontakten. Gør dette præcis 5 minutter efter trin 5,6. Stop og start flow for at observere ændringerne i kropsbygning af molekyler. Ved påføring af flow skal der anvendes hastigheder på mellem 5.000 og 30.000 μL/h. Gentag dette i forskellige områder af den mikrofluidiske enhed. Fortsæt denne proces for at finde molekyler, der kan udvide og slappe af på flere cyklusser af standsning og start flow.
  7. Bemærk, hvor lang tid det tager for molekyler at nå maksimal forlængelse og helt slappe af i globules. Optag videoer af den kontinuerlige adfærd af molekyler under forskydning flow, vælge den bedste eksponeringstid, eksponering sfrekvens og video varighed, der vil fange hele spektret af udvidelsesadfærd og minimere fotoblegning.
  8. Gem videoerne som . AVI filer med en skalabar.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.

7. Billedanalyse af kropsændringer

  1. Vægforskydningshastigheden (Symbol 1) påføres makromolekyler ved hjælp af strømningshastigheden (Q) og højden (h) og bredden (w) på den rektangulære mikrofluidiske kanal. Brug følgende ligning til at gøre dette:
    Equation 1
  2. Bestemme længden af enhver biomolekyle under forskellige forskydning satser ved hjælp af en tilpasset MATLAB kode (se Supplerende filer). Opret en mappe med titlen videoer analyse, som omfatter følgende MATLAB koder: main.m, save_each_frame.m, get_length.m og get_length.fig. Opret en undermappe i videoer analyse med titlen videoer og tilføje . AVI filer, der skal analyseres ind i det.
  3. Åbn main.m ved hjælp af MATLAB 2019a og kør koden. Skriv navnet på den videofil, der skal analyseres i kommandovinduet under Indtast datafilen for at analysere:.
  4. I den åbnede grafiske brugergrænseflade (GUI) skal du angive en grænse (tekst i boksen øverst til højre i vinduet) til 20 og klikke på knappen Angiv tærskel for at bekræfte.
  5. Brug datamarkøren på den øverste værktøjslinje i vinduet til at vælge en pixel et vilkårligt sted på skaleringslinjen. Klik på Startpunkt i sektionen Skalersøjle til højre for vinduet. (x,y) placeringen af den valgte pixel vises til højre for knappen. Klik på knappen Pixelstørrelse (μm). Pixelstørrelsen skal kun måles én gang i hver video.
  6. Vælg en pixel på molekylet af interesse. Klik på Startpunkt i afsnittet VWF. Når placeringen af den valgte pixel vises i tekstboksen til højre, skal du klikke på Venstre ende, Højre ende og String længde for at få den molekylære længde i billedet.
    BEMÆRK: Dette trin kan bruges til at analysere kropsbygningsændringer af ethvert biomolekyle, på trods af at koden har et bestemt afsnit med navnet VWF.
  7. Dobbelttjek venstre og højre ende af molekylet. Zoom ind, og brug datamarkøren til at kontrollere pixelplaceringen af interesse. Vælg pixel manuelt som en afslutning, og genberegn længden (i pixel), når det er nødvendigt.
  8. Optag pixelstørrelsen i μm og strenglængden i pixeltal i et Excel-ark, og beregn strenglængden i μm.
  9. Gentag ovenstående trin for hvert billede. Brug sidste, Næste knap i nederste højre hjørne af GUI til at skifte mellem billeder i den samme videofil. Klik på Luk for at lukke GUI-vinduet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Observation af den dynamiske adfærd biomolekyler såsom VWF og lambda DNA er meget afhængig af at optimere deres binding til enhedens overflade. Inkubering overfladebehandlinger til de anbefalede tidspunkter i den mikrofluidiske enhed er afgørende for at opnå binding med et par forankringspunkter, således at molekyler frit kan udvide og slappe af ved skiftende flow. Hvis proteiner eller DNA er bundet for stærkt med flere forbindelser, vil de enten udvides til begrænsede længder eller slet ikke udvide. Dette sker især med VWF, når det forbliver uden flow på enhedens overflade i mere end 3 min før gratis biotin blokering. Jo længere VWF forbliver på overfladen stagnerende, jo mere VWF biotin grupper binder sig til overfladen streptavidin grupper og jo mindre fleksibilitet molekylet har at optrævle. Hvis molekyler er bundet for svagt, på den anden side, vil de løsne ved flow og forsvinde fra syne. Dette kan forekomme, hvis VWF eller lambda DNA er inkuberet for korte perioder, forårsager for få biotin-streptavidin interaktioner til at danne. Molekyler kan også bryde fri, når ekstremt høje forskydningsrater (>200.000 s-1)anvendes, hvilket svækker biotin-streptavidin interaktioner.

Et ideelt molekyle binder sig i en sådan grad, at det kan optrævle og slappe af på flere cyklusser af standsning og start flow. Fleksibiliteten af et molekyle til at ændre kropsbygning som denne er ofte påvist ved sin evne til at udvide til at øge længder som højere forskydning satser anvendes inden for en række stigende flow. Billeder af VWF opnået med TIRF mikroskopi viser dette forhold i Video 1. Forlængelsen versus forskydningshastighedskurven for det samme VWF-molekyle i figur 4 indfanger præcist det forskydningsinducerede opførsel af et VWF-molekyle og er nyttig til at karakterisere proteinets biomekaniske egenskaber. Billeder af lambda DNA opnået med konfokal fluorescens mikroskopi viser ligeledes øget forlængelse ved højere forskydningshastigheder og gradvis afslapning over 2 min, som det er fanget i Video 2 og Video 3. Lambda DNA's rekylegenskaber efter stoppet flow er også grafisk repræsenteret i figur 5.

Figure 1
Figur 1: Skemaer af enkeltmolekyleflowforsøg i mikrofluidic kanal under fluorescensmikroskopi. Kanalens overflade er belagt med BSA-biotin og blokeret med kasein. Streptavidin er bundet med biotin på kanalens overflade og også biotinylated VWF / lambda DNA til at immobilisere enkelte molekyler på overfladen. Som forskydning sat sats stiger fra A til C,molekylet er strakt fra en foldet tilstand til en aflang tilstand langs flow retning fra venstre mod højre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Mikrofluidic kanal dimensioner. PDMS's mikrofluidiske enheds form og struktur vises sammen med kanaldimensionerne. Kanalen er 50 μm i højden og spænder fra 0,1 til 1,0 mm i bredden. Indsnævringsområdet midt på kanalen er 0,7 mm i længden. Indløbet og udgangen er 0,5144 mm (25 G) i diameter. Flowretningen er fra venstre mod højre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Overfladebehandlingstrin til immobilisering af et enkelt molekyle. Alle trin forekommer ved stuetemperatur. (A). BSA-biotin er belagt på overfladen i 2 h. (B). Kasin sprøjtes ind i kanalen i 30 minutter for at blokere overfladen. (C). Streptavidin er inkuberet i kanalen i 10 min at binde med BSA-biotin. (D). Efter vask overskydende molekyler i de tidligere trin, fluorophore og biotin mærket VWF / lambda DNA injiceres i kanalen og immobiliseret gennem limning med streptavidin. (E). Gratis biotin flyder ind, blokerer ekstra streptavidin bindende steder for at minimere dens interferens med molekylet under kropsdannelse ændringer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: VWF's forlængeradfærd under forskydningsstrøm. Molekylet reversibly optrævler ved 7 forskellige forskydningsrater: 0 s-1,33.333 s-1,66.667 s-1,100.000 s-1,133.333 s-1, 166.667 s-1 og 200.000 s-1. Længden af det strakte molekyle stiger fra 0,52 μm ved nul forskydningshastighed til 3,44 μm ved 200.000 s-1 forskydningshastighed. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Afslapning adfærd lambda DNA efter forskydning flow stopper. Flow med 33.000 s-1 og 66.667 s-1 forskydningsrater påføres fra 0 til 30 s til det samme molekyle. Afslapning er registreret fra 30 s til 150 s. Ved 66.667 s-1 forskydningshastighed aflyser DNA-molekylet til 15,00 μm og slapper tilbage til 5,83 μm, efter at strømmen er blevet stoppet i 2 min. Ved 33.333 s-1 forskydningshastighed strækker molekylet sig kun til 8,75 μm og er 3,33 μm i længden efter 2 min afslapning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Video 1
Video 1: Reversibel optrævling af VWF under stigende forskydningshastigheder ved hjælp af total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Molekylet i midten af visningen reversibly optrævler til forskellige længde ved forskydning satser 33.333 s-1, 66.667 s-1,100.000 s-1 og 133.333 s-1. En sprøjtepumpe bruges til at styre den strømningshastighed, hvorfra forskydningshastigheder beregnes. Flowretningen er fra venstre mod højre. Billeder er taget med 15 s intervaller for at give fuldstændig afslapning og udvidelse processer. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade).

Video 2
Video 2: Afslapning af lambda DNA efter 33.333 s-1 forskydningsats. Billeder er taget under konfokal fluorescens mikroskopi. Lambda DNA er strakt under 33.333 s-1 forskydning flow og afslappet tilbage til en foldet tilstand efter strømmen er stoppet ved 30 s. Varigheden af afslapning er 2 min. Flow retning er fra venstre mod højre. Billeder er taget med 30 s intervaller i mellem. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade).

Video 3
Video 3: Afslapning af lambda DNA efter 66.667 s-1 forskydningsats. Indstillingerne er identiske med dem i Video 2 med undtagelse af den oprindelige forskydningshastighed. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade).

Supplerende filer: MATLAB-koder. Klik her for at hente denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at opnå data af et enkelt molekylerekonformationsændringer ved hjælp af fluorescensmikroskopi som beskrevet i denne metode er det afgørende at inkubere molekylet i den rette tid, minimere dets uspecifikke interaktioner med overfladen og etablere mikroskopindstillinger, der reducerer fotoblegning. Molekylets evne til frit at ændre kropsbygning er relateret til antallet af biotin-streptavidin interaktioner dannet mellem molekylet og overfladen. Som tidligere nævnt skal dette kontrolleres ved at inkubere molekylet uden flow i den rette tid. Derudover kan protein eller DNA ikke specifikt binde sig til dæksgridsen, hvis dækstrækket ikke blokeres effektivt. Uden den anbefalede blokeringsopløsning kan molekyler binde sig til glasset uden specifikt og ikke reagere på nogen strømningshastighed. Anvendelse af kaseinblokken under tidlig overfladebehandling og opretholdelse af dens tilstedeværelse under flow er afgørende for at reducere disse uspecifikke interaktioner. Endelig, fange den kontinuerlige, dynamiske adfærd af et enkelt molekyle kræver hyppige fluorophore spænding under billedoptagelse. Dette kan forårsage hurtig fotoblegning, hvis laserintensiteten, eksponeringstiden og eksponeringsfrekvensen er for høj. Det er derfor nødvendigt at justere disse indstillinger i tandem og strategize hvordan man kan reducere deres værdier uden at gå på kompromis med tid eller billedopløsning af dataene.

Hvis forlængelse og afslapning af molekylet ikke overholdes, bør yderligere trin følges. Inkuber molekylet i enheden i længere tid og kortere tid end hvad der anbefales i protokollen. For hver gang, der testes, varierer BSA-biotin og streptavidin koncentrationer efter faktorer på 10. Disse test kan være nødvendige for at optimere antallet af biotin-streptavidin forankringspunkter dannet mellem molekylet og overfladen. For eksempel, hvis biotin mærkning tæthed er meget høj, på grund af afvigelser fra de anbefalede koncentrationer eller reagenser i mærkningen protokol, kortere molekylær inkubationstid og lavere BSA-biotin og streptavidin koncentrationer kan være nødvendig. For yderligere at forbedre succesen af forsøget, scanne hele mikrofluidic enhed for molekyler, der reversibly optrævle. Overfladen må ikke behandles ensartet med streptavidin eller kaseinblok, hvilket får molekyler i visse områder til at have større optrævlingsreaktioner end andre.

Denne metode er begrænset af manglende oplysninger om molekylets størrelse og tetheringpunkter, vanskeligheden ved at producere 0 s-1 forskydningshastighed og den optiske opløsning af fluorescensmikroskoper. Tidligere arbejde har vist en stor variation i optrævling adfærd VWF, potentielt forklaret ved den brede fordeling i antallet og placeringen af biotin-streptavidin tether punkter og molekylvægten af hver VWF molekyle18. I øjeblikket kan den metode, vi præsenterer, ikke definere stivkrampepunkter og molekylstørrelse. Brownian dynamics simuleringer af en grovkornet VWF model offentliggjort af Wang et al. indarbejde disse variabler og kan køres sammen med eksperimentelle resultater for at forklare en sådan variation18. Desuden stopper flowet ikke øjeblikkeligt, når sprøjtepumpen stoppes, hvilket forvirrer observationen af rekyldynamik. Dette skyldes deformationen og den lette dilatation af PDMS-kanalen i den planlagte periode. Når pumpen er stoppet, fortsætter væsken med at flyde, indtil PDMS er helt afslappet. Et forbedret system bør bruge mere stive PDMS eller mikrokanaler fremstillet i hårde plastmaterialer, så væsken kan nå en 0 s-1 forskydningshastighed hurtigere. Endelig kan man kun løse molekyler, hvis størrelse er på samme størrelsesorden som den optiske opløsning af fluorescensmikroskopet, som måske ikke er mindre end nogle få hundrede nanometer. Således er der et minimumskrav til molekyle, der kan observeres direkte med denne metode.

Den nuværende protokol vedrører hovedsagelig kvantificering af kropsændringer af protein- og DNA-molekyler under fysiologisk flow. Men metoden kan også bruges til at visualisere real-time interaktioner mellem biologiske molekyler og yderligere karakterisere protein og DNA-funktion. For eksempel har Fu et al. vist, at tøjret VWF kan aktivere under høj forskydning sitre flow og yderligere fange blodplade vedhæftning molekyle GPIbα under varierende flow betingelser17. Denne bindende begivenhed bevares, selv når VWF er bundet til overfladen ved hjælp af biotin-streptavidin-forbindelser, der viser effektiviteten af denne protokol til at studere fysiologisk relevante funktioner og mekanikere17. Lignende mekanistisk indsigt kunne opnås, mens man studerer samspillet mellem optrævlet DNA og regulerende proteiner i flowmiljøer21,22. Derudover vedrører vores metode for det meste observere kropsændringer i makromolekyler. Ikke desto mindre kunne man tilpasse det med henblik på at studere mindre molekyler, der er store nok til at blive løst under fluorescens mikroskopi. For eksempel, ved noncovalently eller kovalent vedhæfte et lille molekyle til en meget større, immobiliseret lambda DNA, kunne man øge forskydning-følsomhed af de mindre molekyle og lettere observere dens adfærd. Afslutningsvis giver andre karakteriseringsmetoder med et enkelt molekyle, såsom AFM eller optiske pincet, data med høj opløsning om makromolekylers strukturelle og funktionelle egenskaber; Disse alternative metoder kan dog ikke observere de dynamiske, kropslige ændringer af proteiner og DNA, der finder sted i et fysiologisk flowmiljø, som det fremgår af denne protokol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af en National Science Foundation-legat DMS-1463234, National Institutes of Health grants HL082808 og AI133634 og Lehigh Universitys interne finansiering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Labeling Kit Invitrogen A30006
Bio-Spin P-6 Gel Columns Bio-Rad 7326221
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Use as free biotin in Step 5.6
Biotin-14-dCTP AAT Bioquest 17019
BSA-Biotin Sigma-Aldrich A8549
Coverslips VWR 48393-195 No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP Set Invitrogen 10297018
Float Buoys for Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69588
Klenow Fragment (3'→5' exo-) New England BioLabs M0212S Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2
Lambda DNA New England BioLabs N3011S
Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69570 10K MWCO, 0.1 mL volume
NEBuffer 4 New England BioLabs B7004S
NHS-PEG4-Biotin Thermo Scientific 21330
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase Sigma-Aldrich P8279
Protocatechuic acid Santa Cruz Biotechnology sc-205818
Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication The Dow Chemical Company 4019862
Streptavidin Sigma-Aldrich 85878
The Blocking Solution CANDOR Bioscience 110 050 Use as casein blocking solution throughout protocol
Vinyl Cleanroom Tape Fisher Scientific 19-120-3217
von Willebrand Factor, Human Plasma Millipore Sigma 681300
YOYO-1 Dye AAT Bioquest 17580
0.25 mm Inner Diameter Tubing Cole-Parmer EW-06419-00
25 Gauge Needle Thomas Scientific JG2505X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
  2. Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
  3. LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
  4. Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
  5. Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
  6. Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
  7. Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
  8. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  9. Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
  10. Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
  11. Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
  12. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  13. Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
  14. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
  15. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  16. Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
  17. Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
  18. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
  19. Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).
  20. Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
  21. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  22. Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).

Tags

Bioengineering von Willebrand faktor lambda DNA mikrofluidics forskydningflow TIRF konfokal fluorescens mikroskopi
Karakterisering single-molekyle konformationændringer under forskydning flow med fluorescens mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pisapati, A. V., Wang, Y., Blauch,… More

Pisapati, A. V., Wang, Y., Blauch, M. E., Wittenberg, N. J., Cheng, X., Zhang, X. F. Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60784, doi:10.3791/60784 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter