Summary
We presenteren een protocol voor het immobiliseren van enkele macromoleculen in microfluïde apparaten en het kwantificeren van veranderingen in hun conformaties onder schuifstroom. Dit protocol is nuttig voor het karakteriseren van de biomechanische en functionele eigenschappen van biomoleculen zoals eiwitten en DNA in een stroomomgeving.
Abstract
Single-molecule gedrag onder mechanische verstoring is op grote schaal gekenmerkt om veel biologische processen te begrijpen. Methoden zoals atoomkrachtmicroscopie hebben echter een beperkte tijdelijke resolutie, terwijl Förster resonance energy transfer (FRET) alleen voegformaties kan voorkomen. Fluorescentie microscopie, aan de andere kant, maakt real-time in situ visualisatie van enkele moleculen in verschillende stroomomstandigheden. Ons protocol beschrijft de stappen om conformatieveranderingen van afzonderlijke biomoleculen onder verschillende schuifstromenomgevingen vast te leggen met behulp van fluorescentiemicroscopie. De schuifstroom wordt gemaakt in microfluïde kanalen en wordt aangestuurd door een spuitpomp. Als demonstraties van de methode, von Willebrand factor (VWF) en lambda DNA worden gelabeld met biotine en fluorophore en vervolgens geïmmobiliseerd op het kanaaloppervlak. Hun conformaties worden continu gecontroleerd onder variabele schuifstroom met behulp van totale interne reflectie (TIRF) en confocale fluorescentie microscopie. De omkeerbare ontrafelende dynamiek van VWF zijn nuttig om te begrijpen hoe de functie ervan is geregeld in menselijk bloed, terwijl de conformatie van lambda DNA inzichten biedt in de biofysica van macromoleculen. Het protocol kan ook op grote schaal worden toegepast om het gedrag van polymeren, met name biopolymeren, in verschillende stromingsomstandigheden te bestuderen en om de reologie van complexe vloeistoffen te onderzoeken.
Introduction
Mechanismen voor hoe biomoleculen reageren op omgevingsstimuli zijn op grote schaal bestudeerd. Vooral in een stromingsomgeving reguleren schuif- en verlengingskrachten de conformatieveranderingen en mogelijk de functie van biomoleculen. Typische voorbeelden zijn shear-geïnduceerde ontrafeling van lambda DNA en von Willebrand factor (VWF). Lambda DNA is gebruikt als een instrument om de conformatiedynamiek van individuele, flexibele polymeerketens en de reheologie van polymeeroplossingen1,2,3,4te begrijpen. VWF is een natuurlijke stroomsensor die bloedplaatjes op wondlocaties van bloedvaten samenvoegt met abnormale afschuifsnelheden en stromingspatronen. Het ontrafelen van VWF is essentieel bij het activeren van de binding van bloedplaatjes aan het A1-domein en collageenbinding aan het A3-domein. Bovendien maakt het uitvouwen van een hoge afschuifbare A2-domein het decolleté van VWF mogelijk, dat de moleculaire gewichtsverdeling in omloop5,6regelt. Zo kan directe visualisatie van hoe deze moleculen zich gedragen onder stroom ons fundamentele begrip van hun biomechanica en functie aanzienlijk verbeteren, wat op zijn beurt nieuwe diagnostische en therapeutische toepassingen mogelijk kan maken.
Typische methoden om single-molecule conformaties te karakteriseren zijn optische / magnetische pincet, atomaire kracht microscopie (AFM) en single-molecule Förster resonantie energieoverdracht (FRET)7. Single-molecule kracht spectroscopie is een krachtig instrument om de kracht en beweging geassocieerd met de conformatieveranderingen van biomoleculen te onderzoeken. Het ontbreekt echter aan de mogelijkheid om de algehele moleculaire conformaties in kaart te brengen8. AFM is in staat om te beeldvorming met een hoge ruimtelijke resolutie, maar is beperkt in temporele resolutie9,10. Bovendien kan contact tussen de tip en het monster de respons die door de stroom wordt veroorzaakt, verwarren. Andere methoden zoals FRET en nanoporie analytics bepalen single-molecule eiwit vouwen en ontvouwen staten op basis van de detectie van intramoleculaire afstand en uitgesloten volumes. Deze methoden staan echter nog in de kinderschoenen en beperkt in hun directe observatie van enkelmolecuulconformaties11,12,13,14.
Aan de andere kant heeft het direct observeren van macromoleculen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie onder fluorescentiemicroscopie ons begrip van de dynamiek van één molecuul in veel biologische processenverbeterd 15,16. Zo hebben Fu et al. onlangs voor het eerst gelijktijdige visualisatie van VWF-verlenging en bloedplaatjesreceptorbinding bereikt. In hun werk werden VWF-moleculen geïmmobiliseerd op het oppervlak van een microfluïdisch kanaal door middel van biotine-streptavidin interacties en afgebeeld onder totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie in verschillende schuifstroom omgevingen17. Door een soortgelijke methode toe te passen als Fu's, tonen we hier aan dat conformaties van VWF en lambda DNA direct kunnen worden waargenomen onder zowel TIRF als confocale fluorescentiemicroscopie. Zoals in figuur 1wordt weergegeven, worden microfluïde apparaten gebruikt om de schuifstroom te maken en te controleren en worden biomoleculen geïmmobiliseerd op het kanaaloppervlak. Bij toepassing van verschillende afschuifsnelheden worden conformaties van hetzelfde molecuul geregistreerd om de lengte te meten, ook weergegeven in figuur 1. De methode kan op grote schaal worden toegepast om ander polymeergedrag te onderzoeken onder complexe stromingsomgevingen voor zowel rheologische als biologische studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van VWF
- Reconstrueren menselijk plasma VWF om het voor te bereiden op de etikettering reacties. Voeg 100 μL gedeïoniseerd (DI) water toe aan 100 μg lyofieliseerde VWF om een VWF-voorraadoplossing van 1 mg/mL te creëren.
- Dialyze VWF stock oplossing om overtollige glycine te verwijderen, waardoor de biotine en fluorophore etikettering efficiëntie.
- Breng 50 μL VWF-voorraadoplossing over in een 0,1 mL dialyse-eenheid met een afsnijding van 10.000 moleculair gewicht en sluit af met een dop. Bewaar de resterende voorraadoplossing op -20 °C. VWF voorraad zal stabiel zijn voor maximaal 1 jaar op -20 °C.
- Voer dialyse uit in 500 mL van 1x steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (0,01 M dinatriumfosfaat, 0,0018 monokaliumfosfaat, 0,0027 M kaliumchloride, 0,137 M natriumchloride, pH 7,4 bij 25 °C) gedurende 1 uur bij 4 °C bij langzaam roeren. Herhaal dialyse gedurende een extra uur met behulp van 500 mL verse PBS.
- Start biotine etikettering reactie. Bereid een 2 mM oplossing van NHS-PEG4-biotine door het oplossen van de vaste stof in DI water vlak voor de reactie. Het toestaan van NHS-PEG4-biotine te blijven in het water voor langere tijd zal leiden tot de NHS-ester groep te hydrolyseren, waardoor afnemende etikettering efficiëntie.
- Voeg 2,5 μL van 2 mM NHS-PEG4-biotine toe aan de dialyse-eenheid met de VWF-voorraadoplossing. Dit zal resulteren in een 20-voudige molaire overmaat aan biotine in vergelijking met VWF monomeren. Primaire amines van VWF zal reageren met de NHS-ester groepen, waardoor covalently binding aan PEG4-biotine groepen via amide linkages.
- Plaats de dialyse-eenheid in een microcentrifugebuis van 1,5 mL. Sluit de dialyse-eenheid af met de bijbehorende dop. Zet de buisdialyseassemblage vast met Parafilm. Blijf rechtop staan en laat 40 min bij kamertemperatuur.
- Start fluorophore etikettering reactie. Bereid een 2,8 mM oplossing van Alexa 488 tetrafluorofenyl-ester (TFP-ester) tl-kleurstof (excitatiemax = 498 nm, emissiemax = 519 nm) door het oplossen van de fluorophore vaste stof in DI water. Doe dit vlak voor de reactie om te voorkomen dat de TFP-ester groep hydrolyzing.
- Voeg 2,9 μL van de 2,8 mM 488 fluorophore toe aan de dialyse-eenheid. Dit zal resulteren in een 34-voudige molaire overmaat van fluorophore in vergelijking met VWF monomeren. De resterende primaire amines van VWF zullen reageren met de TFP-estergroepen, waardoor covalently binding is aan fluorophores via amide-koppelingen.
- Voeg 2,0 μL natriumbicarbonaat (opgelost in DI-water) toe aan de dialyse-eenheid. Dit past de pH van de reactie dichter bij 8.0 aan, wat de efficiëntie van de TFP-ester en primaire aminereactie verhoogt.
- Zet de dialyse-eenheid in een microcentrifugebuis, net als in stap 1.3.2. Bewaar in het donker om fotobleken te voorkomen en laat 1 uur en 30 min bij kamertemperatuur.
- Plaats de dialyse-eenheid in 900 mL van 1x steriel PBS en dialyze 's nachts op 4 °C. Dit levert ongeveer 70 μL aan gelabelde VWF op bij een concentratie van 0,71 mg/mL of 2,84 μM (monomeerconcentratie).
- Breng het gelabelde VWF over in een microcentrifugebuis. Bedek de buis met aluminiumfolie en bescherm tegen licht. Bewaar bij 4 °C. Voor langdurige opslag voegt u natriumazide van antimicrobiële agent toe aan een eindconcentratie van 0,02% (w/v).
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
2. Voorbereiding van Lambda DNA
- Biotinylate lineair lambda DNA door het vullen van de samenhangende eindsites (cos sites) met biotine-14-dCTP nucleotiden volgens standaard protocollen, hier herhaald in stap 2.118. Vul de rest van de cos sites met dATP, dTTP en dGTP nucleotiden.
- Bereid 1 mM-oplossingen voor van dATP, dTTP, dGTP en biotin-14-dCTP in een 10x reactiebuffer (500 mM natriumchloride, 100 mM Tris hydrochloride, 100 mM magnesiumchloride, 10 mM dithithreitol, pH 7,9 bij 25 °C).
- Plaats 48 μL van 500 ng/μL lambda DNA in een PCR-buis en verwarm gedurende 5 min bij 65 °C. De cos sites van cirkelvormige lambda DNA zal scheiden onder warmte, lineariseren van het molecuul en het maken van single-stranded overhangen klaar voor biotinylation. Onmiddellijk daarna, plaats op ijs om te voorkomen dat cos sites opnieuw annealing.
- Voeg 5 μL van 1 mM dATP, dTTP en dGTP en 4 μL van 1 mM biotine-14-dCTP toe aan het lambda-DNA. Voeg ook 2,5 μL 5 U/μL Klenow Fragment (3'à5' exo-) toe om de DNA-synthese te katalyseren.
- Incubeer het reactiemengsel gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Voeg 1,2 μL edta van 0,5 M toe. Verwarm vervolgens het reactiemengsel gedurende 5 min bij 70 °C. Dit zal de Klenow Fragment en biotinylation reactie deactiveren.
- Verwijder overtollige nucleotiden uit lambda-DNA met behulp van een spinkolom die 10-70 μL kan bevatten en een 6.000 moleculaire gewichtscut-off heeft.
- Plaats de kolom in een microcentrifugebuis van 2 mL. Centrifugeer de kolom en buis op 1000 x g gedurende 2 min. Gooi de doorstroom weg die zich in de buis verzamelt.
- Vervang de kolombuffer door een 1x-oplossing van dezelfde reactiebuffer vanaf stap 2.1.1. Doe dit door 500 μL van 1x buffer aan de kolom toe te voegen. Centrifuge voor 1 min bij 1000 x g. Gooi flow-through weg. Herhaal deze nog 2 keer, zodat er in totaal 1500 μL aan de kolom is toegevoegd.
- Plaats de kolom in een microcentrifugebuis van 1,5 mL. Voeg de oplossing van stap 2.1.5 voorzichtig toe aan de bovenste laag van de kolom. Centrifuge voor 4 min bij 1000 x g.
- Verzamel de doorstroom (40-70 μL) uit de microcentrifugebuis en plaats in een PCR-buis. Dit bevat het gezuiverde, biotinylated lambda DNA.
- Label lambda DNA met fluorescerende YOYO-1 kleurstof (excitatiemax = 490 nm, emissiemax = 509 nm) volgens standaard protocollen, hier herhaald in stap 2.3.120.
- Bereid een oplossing van YOYO-1 kleurstof en lambda DNA met een kleurstof tot base pair molaire verhouding van 1:10. Stel dat er geen DNA verloren is gegaan in de zuiveringsstap om de basispairconcentratie van lambda-DNA te berekenen. Full-length lambda DNA heeft 48.502 basisparen.
OPMERKING: Als bijvoorbeeld 50 μL aan oplossing is teruggewonnen uit stap 2.2.4, voegt u 7,4 μL 500 μM YOYO-1 kleurstof toe. - Verwarm de oplossing gedurende 2 uur bij 50 °C in het donker om de reactie te voltooien.
- Bedek de buis met aluminiumfolie en bescherm tegen licht. Bewaar bij 4 °C. De oplossing is nu klaar om te worden geïnjecteerd in microfluïde apparaten.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
- Bereid een oplossing van YOYO-1 kleurstof en lambda DNA met een kleurstof tot base pair molaire verhouding van 1:10. Stel dat er geen DNA verloren is gegaan in de zuiveringsstap om de basispairconcentratie van lambda-DNA te berekenen. Full-length lambda DNA heeft 48.502 basisparen.
3. Het creëren van microfluïdekanaalmallen in siliciumwafer
- Gebruik fotolithografie om microfluïde kanalen met de juiste afmetingen(figuur 2)te creëren op een hoofdsiliciumwafer volgens standaardprotocollen19.
4. Bereiding van polydimethylsiloxane (PDMS) microfluïde inrichting
- Voeg 5 delen siliconen elastomer basis aan 1 deel uithardingsmiddel (door massa) in een weegboot. Roer de inhoud 1 min grondig om vooraf uitgeharde PDMS-oplossing te creëren.
- Doe de hoofdsiliciumwafer in een plastic petrischaaltje. Giet de PDMS-oplossing over de wafer om een laag van 5 mm te maken. Bedek de schotel en laat in een desiccator onder vacuüm voor 1 uur om luchtbellen te verwijderen.
- Incubate bedekt petrischaal bij 60 °C 's nachts om PDMS te genezen tot een flexibele vaste stof. Uitharding zal resulteren in microfluïde kanalen gegoten in de PDMS op de PDMS-wafer interface.
- Snijd rechthoeken van 20 x 10 mm in de PDMS, rond elk microfluïdisch kanaal, met behulp van een scheermes. Verwijder de rechthoekige PDMS-blokken met een pincet.
- Gebruik een 25 G stompe eindnaald met geslepen randen om aan het ene uiteinde van het kanaal een gat met een diameter van 0,5 mm te slaan, zodat het gat volledig door het PDMS-blok gaat(figuur 2). Gebruik een dunne naald te ponsen PDMS uit gat. Herhaal dit aan de andere kant van het kanaal. Dit zal leiden tot een inlaat en uitlaat voor stroom door het kanaal.
- Maak het oppervlak van het PDMS-blok schoon met vinyl cleanroomtape. Blaas samengeperst stikstofgas over een 1 1/2, 22 x 50 mm afdekbon om vuil te verwijderen.
- Plaats het PDMS-blok met de kanaalzijde omhoog en de coverslip in de kamer van een plasmabindmachine. Start de behandeling.
- Wanneer de behandeling is voltooid, plaatst u het PDMS-blok snel op een coverslip, zodat het kanaal in contact komt met de slip. Druk uitoefenen langs de randen van het blok. Plaats de coverslip-PDMS-assemblage gedurende 15 min op een kookplaat op 115 °C om de permanente binding te versterken.
- Steek de slang met een binnenste diameter van 10 cm lang in het uitlaatgat boven aan het PDMS-blok. Hierdoor kan vloeistof gemakkelijk uit het kanaal stromen. Het apparaat is nu voltooid.
5. Behandeling van het oppervlak van microfluïdenaar
- Inject <10 μL van 10 μg/mL biotinylated bovine serum albumine (BSA-biotin) opgelost in steriele 1x PBS in de inlaat van microfluïde-apparaat voor VWF experimenten. Inject <10 μL van 1 mg/mL BSA-biotine voor lambda DNA-experimenten. Houd na injectie een paar microliter BSA-biotine in de pipettip achter en laat de tip in de inlaat blijven zitten.
- Houd altijd een druppel DI water rond de tip. Dit voorkomt dat luchtbellen het kanaal binnenkomen. Breng deze techniek elke keer toe als er een nieuwe oplossing in het kanaal wordt geïnjecteerd.
- Laat BSA-biotine gedurende 2 uur in het apparaat uitbroeden. De BSA zal zich niet specifiek aan het coverslipoppervlak binden(figuur 3A).
- Verwijder de pipettip. Injecteer <10 μL casein blocking oplossing in het kanaal en laat het uitbroeden voor 30 min. De caseine blokkeert alle vrije sites, waardoor niet-specifieke binding van biomoleculen aan het oppervlak wordt verminderd (figuur 3B).
- Verwijder de tip en injecteer <10 μL van 10 μg/mL streptavidin opgelost in steriele 1x PBS in het kanaal voor VWF experimenten. Gebruik 100 μg/mL streptavidin voor lambda DNA experimenten. Incubeer voor 10 min. De streptavidin zal zich binden aan de biotinegroepen van de BSA-biotine (figuur 3C).
- Verwijder de tip en injecteer <10 μL van 1x wasmiddeloplossing (0,05% Tween 20 in PBS) in het kanaal om overtollige streptavidinweg e.a. weg te spoelen.
- Verwijder de tip en injecteer <10 μL van ofwel 28,4 nM VWF verdund in casein oplossing of lambda DNA uit stap 2.3.3. Incubeer VWF voor 3 min. Incubeer lambda DNA voor 45 min (figuur 3D).
- Verwijder de tip en injecteer <10 μL van 5 mM gratis biotine verdund in casein oplossing. Gratis biotine blokkeert overtollige streptavidin bindingsites op kanaaloppervlak(figuur 3E).
6. Visualiseren vwf en Lambda DNA onder fluorescentie microscopie
- Bereid 1 mL casein blokkeren oplossing met 2,2 mM protocatechuic zuur en 37 nM protocatechuate-3,4-dioxygenase (om fotobleken te minimaliseren). Laad in een spuit en veilig in een spuitpomp. Neem 30 cm lang, 0,25 mm binnendiameter slang en bevestig een uiteinde aan de spuitnaald. Stroom in de oplossing om luchtbellen te verwijderen. Bevestig het andere uiteinde van de buis aan de inlaat van het microfluïde apparaat. Het wordt aanbevolen om dit 3 minuten na stap 5.6 te doen.
- Selecteer de hoogste vergrotingsdoelstelling (d.w.z. 60-100X) van een totale interne reflectie (TIRF) of confocale fluorescentiemicroscoop. Voeg indien nodig een druppel onderdompelingsolie toe aan het doel. Plaats het microfluïde apparaat op het microscoopstadium, zodat de coverslip gelijk is met het doel.
- Start brightfield microscopie. Pas de focus zo aan dat alle functies, zoals puin en bellen, zichtbaar zijn. Pas vervolgens de fase in de X- en Y-richting aan totdat de rand van het microfluïde kanaal zichtbaar is en het frame doorsnijdt.
- Schakel over naar het 488-kanaal (FITC). Pas z-niveau en TIRF hoek indien nodig aan totdat individuele groene, bolvormige moleculen kunnen worden onderscheiden. Dit zijn OFWEL VWF of lambda DNA moleculen.
- Pas belichtingstijd en laserintensiteit aan om fluorescerende moleculen te visualiseren zonder ze te snel te photobleachen. Pas het contrast aan om moleculen ook duidelijker te visualiseren.
- Start stroom van de spuitpomp, zodat casein blokkeren oplossing stroomt in het kanaal en uit de uitlaat. Doe dit precies 5 minuten na stap 5.6. Stop en begin stroom om de veranderingen in de conformatie van moleculen te observeren. Bij het toepassen van de stroom, gebruik tarieven tussen 5.000 en 30.000 μL/h. Herhaal dit in verschillende gebieden van het microfluïde apparaat. Zet dit proces voort om moleculen te lokaliseren die zich kunnen uitstrekken en ontspannen op meerdere cycli van stoppen en starten.
- Merk op hoe lang het duurt voor moleculen om maximale uitbreiding te bereiken en volledig te ontspannen in bolletjes. Neem video's op van het continue gedrag van moleculen onder de schuifstroom, selecteer de beste belichtingstijd, belichtingsfrequentie en videoduur die het volledige bereik van extensieal gedrag vastleggen en fotobleken minimaliseren.
- Sla de video's op als . AVI-bestanden met een scalebar.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
7. Beeldanalyse van conformatieveranderingen
- Bereken de
wandafschuifsnelheid ( ) toegepast op macromoleculen met behulp van de stroomsnelheid (Q) en de hoogte (h) en breedte (w) van het rechthoekige microfluidic kanaal. Gebruik hiervoor de volgende vergelijking:
- Bepaal de lengte van een biomolecuul onder verschillende schuifsnelheden met behulp van een aangepaste MATLAB-code (zie Aanvullende bestanden). Maak een map met de titel video's analyse die de volgende MATLAB codes bevat: main.m, save_each_frame.m, get_length.m en get_length.fig. Maak een submap binnen video's analyse getiteld video's en voeg . AVI-bestanden die erin moeten worden geanalyseerd.
- Open main.m met MATLAB 2019a en voer de code uit. Typ de naam van het te analyseren videobestand in het opdrachtvenster onder Voer het gegevensbestand in om te analyseren:.
- Stel in de geopende grafische gebruikersinterface (GUI) drempelwaarde (tekst in het vak rechtsboven in het venster) in op 20 en klik op de knop Drempelinstellen om te bevestigen.
- Gebruik de gegevenscursor op de bovenste gereedschapsbalk van het venster om ergens op de schaalbalk één pixel te kiezen. Klik op Startpunt in de sectie Schaalbalk rechts in het venster. De (x,y) positie van de gekozen pixel verschijnt rechts van de knop. Klik op de knop Pixelgrootte (μm). De pixelgrootte hoeft slechts één keer in elke video te worden gemeten.
- Kies een pixel op het molecuul van belang. Klik op Startpunt in de VWF sectie. Nadat de positie van de gekozen pixel op het tekstvak rechts is weergegeven, klikt u op Links, Rechts einde en Stringlengte om de moleculaire lengte in de afbeelding te krijgen.
OPMERKING: Deze stap kan worden gebruikt om de conformatieveranderingen van een biomolecuul te analyseren, ondanks de code met een specifieke sectie met de naam VWF. - Controleer de linker- en rechterkant van het molecuul dubbel. Zoom in en gebruik de gegevenscursor om de pixelpositie van belang te controleren. Kies de pixel handmatig als einde en bereken de lengte (in pixels) indien nodig opnieuw.
- Noteer de pixelgrootte in μm- en tekenreekslengte in het pixelgetal in een Excel-blad en bereken de tekenreekslengte in μm.
- Herhaal de bovenstaande stappen voor elke afbeelding. Gebruik De knop Laatst, Volgende in de rechterbenedenhoek van de GUI om te schakelen tussen afbeeldingen in hetzelfde videobestand. Klik op Sluiten om het GUI-venster te sluiten.
wandafschuifsnelheid ( ) toegepast op macromoleculen met behulp van de stroomsnelheid (Q) en de hoogte (h) en breedte (w) van het rechthoekige microfluidic kanaal. Gebruik hiervoor de volgende vergelijking:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het observeren van het dynamische gedrag van biomoleculen zoals VWF en lambda DNA is sterk afhankelijk van het optimaliseren van hun binding aan het apparaatoppervlak. Het uitbroeden van oppervlaktebehandelingen voor de aanbevolen tijden in het microfluïde apparaat is cruciaal voor het verkrijgen van binding met een paar verankeringspunten, zodat moleculen zich vrij kunnen uitbreiden en ontspannen bij het veranderen van stroom. Als de eiwitten of DNA te sterk gebonden zijn met meerdere koppelingen, zullen ze zich uitstrekken tot beperkte lengtes of helemaal niet uitbreiden. Dit gebeurt met name bij VWF wanneer het langer dan 3 minuten lang zonder stroom op het apparaatoppervlak blijft voordat er gratis biotine wordt geblokkeerd. Hoe langer VWF aan de oppervlakte blijft stagneren, hoe meer VWF-biotinegroepen zich binden aan de oppervlaktestreptavidingroepen en hoe minder flexibiliteit het molecuul moet ontrafelen. Als moleculen te zwak gebonden zijn, aan de andere kant, zullen ze losraken bij stroom en verdwijnen uit het zicht. Dit kan optreden als VWF of lambda DNA wordt geïncubeerd voor te korte periodes, waardoor te weinig biotine-streptavidin interacties te vormen. Moleculen kunnen ook losbreken wanneer extreem hoge afschuifsnelheden (>200.000 s-1)worden toegepast, waardoor de interacties tussen biotine-streptavidin worden verzwakt.
Een ideaal molecuul bindt zich zodanig dat het kan ontrafelen en ontspannen op meerdere cycli van stoppen en beginnen de stroom. De flexibiliteit van een molecuul om bevleesdheid als deze te veranderen wordt vaak aangetoond door zijn vermogen om uit te breiden tot toenemende lengtes als hogere afschuifsnelheden worden toegepast binnen een bereik van toenemende stroom. Afbeeldingen van VWF verkregen met TIRF microscopie tonen deze relatie in Video 1. De uitbreiding versus de schuiffrequentiecurve van ditzelfde VWF-molecuul in figuur 4 legt precies het afschuifgedrag van een VWF-molecuul vast en is handig voor het karakteriseren van de biomechanische eigenschappen van het eiwit. Beelden van lambda DNA verkregen met confocale fluorescentie microscopie tonen op dezelfde manier verhoogde uitbreiding op hogere afschuifsnelheden en geleidelijke ontspanning over 2 min, zoals wordt vastgelegd in Video 2 en Video 3. De terugslagkenmerken van lambda-DNA na gestopte stroom zijn ook grafisch vertegenwoordigd in figuur 5.
Figuur 1: Schema's van single-molecule flow experiment in microfluidic kanaal onder fluorescentie microscopie. Het kanaaloppervlak is bekleed met BSA-biotine en geblokkeerd met caseine. Streptavidin is gebonden met biotine op het kanaaloppervlak en ook biotinylated VWF/lambda DNA om enkele moleculen op het oppervlak te immobiliseren. Naarmate de schuifsnelheid van A naar Ctoeneemt, wordt het molecuul uitgerekt van een gevouwen toestand naar een langwerpige toestand langs de stroomrichting van links naar rechts. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Microfluïde kanaalafmetingen. De vorm en structuur van het PDMS microfluidic apparaat worden samen met de kanaalafmetingen weergegeven. Het kanaal is 50 μm hoog en varieert van 0,1 tot 1,0 mm breed. Het versmallingsgebied in het midden van het kanaal is 0,7 mm lang. De inlaat en het stopcontact hebben een diameter van 0,5144 mm (25 G). De stroomrichting is van links naar rechts. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Oppervlaktebehandelingsstappen voor immobilisatie met één molecuul. Alle stappen vinden plaats bij kamertemperatuur. (A). BSA-biotine is gecoat op het oppervlak voor 2 uur . (B). Casein wordt geïnjecteerd in het kanaal voor 30 min om het oppervlak te blokkeren. (C). Streptavidin wordt geïncubeerd in het kanaal voor 10 min te binden met BSA-biotine. (D). Na het wegwassen van overtollige moleculen in de eerste stappen, fluorophore en biotine gelabeld VWF / lambda DNA wordt geïnjecteerd in het kanaal en geïmmobiliseerd door binding met streptavidin. (E). Vrije biotine wordt gestroomd in, het blokkeren van extra streptavidin bindende sites om de interferentie met het molecuul te minimaliseren tijdens conformatieveranderingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Extensioneel gedrag van VWF onder schuifstroom. Het molecuul omkeerbaar ontrafelt bij 7 verschillende afschuifsnelheden: 0 s-1, 33.333 s-1, 66.667 s-1, 100.000 s-1, 133.333 s-1, 166.667 s-1 en 200.000 s-1. Lengte van het uitgerekte molecuul stijgt van 0,52 μm bij nul afschuifsnelheid tot 3,44 μm bij 200.000 s-1 afschuifsnelheid. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Ontspanningsgedrag van lambda-DNA na afschuifstop. Flow met 33.000 s-1 en 66.667 s-1 afschuifsnelheden worden toegepast van 0 tot 30 s naar hetzelfde molecuul. Ontspanning wordt geregistreerd van 30 s tot 150 s. Bij 66.667 s-1 schuifsnelheid elongates het DNA-molecuul tot 15,00 μm en ontspant het terug naar 5,83 μm nadat de stroom gedurende 2 min is gestopt. Bij 33.333 s-1 schuifsnelheid strekt het molecuul zich slechts uit tot 8,75 μm en is het 3,33 μm lang na 2 minuten ontspanning. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video 1: Omkeerbare ontrafeling van VWF onder toenemende afschuifsnelheden met behulp van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie. Het molecuul in het midden van het uitzicht omkeerbaar ontrafelt naar verschillende lengte bij afschuifsnelheden 33.333 s-1, 66.667 s-1, 100.000 s-1 en 133.333 s-1. Een spuitpomp wordt gebruikt om de stroomsnelheid te regelen waaruit de afschuifsnelheden worden berekend. De stroomrichting is van links naar rechts. Beelden worden genomen met 15 s intervallen om volledige ontspanning en uitbreiding processen mogelijk te maken. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 2: Ontspanning van lambda DNA na 33.333 s-1 afschuifpercentage. Beelden worden genomen onder confocale fluorescentie microscopie. Lambda DNA worden uitgerekt onder 33.333 s-1 schuifstroom en ontspannen terug naar een gevouwen toestand nadat de stroom wordt gestopt bij 30 s. Duur van de ontspanning is 2 min. De richting van de stroom is van links naar rechts. Foto's worden genomen met 30 s intervallen tussen. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 3: Ontspanning van lambda DNA na 66.667 s-1 afschuifpercentage. Instellingen zijn identiek aan die in Video 2, behalve voor de initiële schuifsnelheid. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Aanvullende bestanden: MATLAB codes. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen van conformatieveranderingen met één molecuul met behulp van fluorescentiemicroscopie zoals beschreven in deze methode, is het van cruciaal belang om het molecuul voor de juiste hoeveelheid tijd uit te broeden, de niet-specifieke interacties met het oppervlak te minimaliseren en stel microscoopinstellingen vast die het bleken van foto's verminderen. Het vermogen van het molecuul om vrij te veranderen bevleesdheid is gerelateerd aan het aantal biotine-streptavidin interacties gevormd tussen het molecuul en het oppervlak. Zoals eerder vermeld, moet dit worden gecontroleerd door het molecuul zonder stroom te uitbroeden voor de juiste hoeveelheid tijd. Bovendien kan eiwit of DNA niet specifiek aan de coverslip binden als de coverslip niet effectief wordt geblokkeerd. Zonder de aanbevolen blokkeringsoplossing kunnen moleculen zich niet specifiek aan het glas hechten en niet reageren op een toegepaste stroomsnelheid. Het toepassen van het caseinblok tijdens een vroege oppervlaktebehandeling en het behouden van de aanwezigheid ervan tijdens de stroom is essentieel voor het verminderen van deze niet-specifieke interacties. Ten slotte vereist het vastleggen van het continue, dynamische gedrag van een enkel molecuul frequente fluoroffereopwinding tijdens het vastleggen van afbeeldingen. Dit kan leiden tot snelle fotobleken als laserintensiteit, belichtingstijd en belichtingsfrequentie te hoog zijn. Het is daarom noodzakelijk om deze instellingen samen te passen en te strategize hoe ze hun waarden kunnen verlagen zonder afbreuk te doen aan de tijd of beeldresolutie van de gegevens.
Als uitbreiding en ontspanning van het molecuul niet worden waargenomen, moeten extra stappen worden gevolgd. Incubeer het molecuul in het apparaat voor langere en kortere tijden dan wat wordt geadviseerd in het protocol. Voor elke keer dat wordt getest, variëren BSA-biotine en streptavidin concentraties door factoren van 10. Deze tests kunnen nodig zijn om het aantal biotine-streptavidin verankeringspunten gevormd tussen het molecuul en het oppervlak te optimaliseren. Als de biotinelabeldichtheid bijvoorbeeld zeer hoog is, als gevolg van afwijkingen van de aanbevolen concentraties of reagentia in het etiketteringsprotocol, kunnen kortere moleculaire incubatietijd en lagere BSA-biotine- en streptavidinconcentraties nodig zijn. Om het succes van het experiment verder te verbeteren, scant u het hele microfluïde apparaat op moleculen die reversibly ontrafelen. Het oppervlak kan niet uniform worden behandeld met streptavidin estreptavidin of casein blok, waardoor moleculen in bepaalde gebieden om grotere ontrafelende reacties dan anderen hebben.
Deze methode wordt beperkt door een gebrek aan informatie over de grootte en tethering punten van het molecuul, de moeilijkheid bij het produceren van 0 s-1 afschuifsnelheid en de optische resolutie van fluorescentie microscopen. Eerder werk heeft aangetoond een grote variatie in het ontrafelen gedrag van VWF, mogelijk verklaard door de brede verdeling in het aantal en de locatie van biotine-streptavidin tether punten en het molecuulgewicht van elke VWF molecuul18. Op dit moment kan de methode die we presenteren geen tetherpunten en moleculaire grootte definiëren. Echter, Browniaanse dynamiek simulaties van een grofkorrelige VWF model gepubliceerd door Wang et al. nemen deze variabelen en kan worden uitgevoerd naast experimentele bevindingen om een dergelijke variatie te verklaren18. Bovendien stopt de stroom niet onmiddellijk wanneer de spuitpomp wordt gestopt, waardoor de observatie van terugslagdynamiek wordt verwrongen. Dit is te wijten aan de vervorming en lichte verwijding van het PDMS-kanaal tijdens de beoogde stroomperiode. Wanneer de pomp wordt gestopt, blijft de vloeistof stromen totdat de PDMS volledig ontspannen is. Een verbeterd systeem moet gebruik maken van meer rigide PDMS of microkanalen vervaardigd in harde plastic materialen, waardoor vloeistof om een 0 s-1 afschuifsnelheid sneller te bereiken. Ten slotte kan men alleen moleculen oplossen waarvan de grootte in dezelfde orde van grootte is als de optische resolutie van de fluorescentiemicroscoop, die niet kleiner mag zijn dan een paar honderd nanometer. Zo is er een minimale grootte vereiste voor de moleculen die direct kunnen worden waargenomen met deze methode.
Het huidige protocol heeft voornamelijk betrekking op kwantificering van conformatieveranderingen van eiwit- en DNA-moleculen onder fysiologische stroom. De methode kan echter ook worden gebruikt om real-time interacties tussen biologische moleculen te visualiseren en de eiwit- en DNA-functie verder te karakteriseren. Bijvoorbeeld, Fu et al. hebben aangetoond dat aangebonden VWF kan activeren onder hoge schuifstroom en verder vangen van de bloedplaatjes hechting molecuul GPIbα onder verschillende stroomomstandigheden17. Deze bindende gebeurtenis wordt bewaard, zelfs wanneer VWF is gebonden aan het oppervlak door biotine-streptavidin koppelingen, waaruit de effectiviteit van dit protocol om fysiologisch relevante functies en mechanica te bestuderen17. Vergelijkbare mechanistische inzichten kunnen worden verkregen tijdens het bestuderen van de interacties tussen ontrafeld DNA en regulerende eiwitten instromingsomgevingen 21,22. Bovendien heeft onze methode vooral betrekking op het waarnemen van conformatieveranderingen in macromoleculen. Toch zou men het kunnen aanpassen met het oog op het bestuderen van kleinere moleculen die groot genoeg zijn om te worden opgelost onder fluorescentiemicroscopie. Bijvoorbeeld, door noncovalently of covalently hechten van een klein molecuul aan een veel groter, geïmmobiliseerd lambda DNA, kan men de afschuifgevoeligheid van het kleinere molecuul verhogen en gemakkelijker zijn gedrag waarnemen. Tot slot bieden andere single-molecule karakteriseringsmethoden, zoals AFM of optische pincet, gegevens met hoge resolutie over de structurele en functionele eigenschappen van macromoleculen; deze alternatieve methoden kunnen echter niet de dynamische, conformatieveranderingen van eiwitten en DNA waarnemen die plaatsvinden in een fysiologische stroomomgeving, zoals in dit protocol wordt gepresenteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een National Science Foundation subsidie DMS-1463234, National Institutes of Health subsidies HL082808 en AI133634, en Lehigh University interne financiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
References
- Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
- Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
- LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
- Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
- Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
- Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
- Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
- Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
- Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
- Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
- Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).
- Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
