Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Floresan Mikroskopi ile Kesme Akışı Altında Tek Moleküllü Konformasyonel Değişikliklerin Karakterizasyonu

Published: January 25, 2020 doi: 10.3791/60784
Automatic Translation
1, *2, *3, 3, 1,2, 1,4
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University
* These authors contributed equally

Summary

Tek makromoleküllerin mikroakışkan cihazlarda immobilize edilebisi ve konformasyonlarındaki değişiklikleri kesme akışı altında ölçen bir protokol sayılmısAk. Bu protokol, bir akış ortamında proteinler ve DNA gibi biyomoleküllerin biyomekanik ve fonksiyonel özelliklerini karakterize etmek için yararlıdır.

Abstract

Mekanik tedirginlik altında tek moleküllü davranış birçok biyolojik süreçleri anlamak için yaygın olarak karakterize edilmiştir. Ancak, atomik kuvvet mikroskobu gibi yöntemler insidansı sınırlı zamansal çözünürlüğe sahipken, Förster rezonans enerji transferi (FRET) sadece konformasyonların çıkarılsın. Floresan mikroskopi, diğer taraftan, çeşitli akış koşullarında tek moleküllerin yerinde görselleştirme gerçek zamanlı sağlar. Protokolümüz, floresan mikroskobu kullanarak farklı kesme akış ortamları altında tek biyomoleküllerin konformasyonel değişikliklerini yakalama adımlarını açıklamaktadır. Kesme akışı mikroakışkan kanallar içinde oluşturulur ve bir şırınga pompası tarafından kontrol edilir. Yöntemin gösterimleri olarak von Willebrand faktörü (VWF) ve lambda DNA'sı biotin ve florofor ile etiketlenir ve kanal yüzeyinde hareketsiz hale getirilmiştir. Konformasyonları toplam iç yansıma (TIRF) ve konfokal floresan mikroskopisi kullanılarak değişken kesme akışı altında sürekli olarak izlenir. VWF'nin geri dönüşümlü çözülme dinamikleri, işlevinin insan kanında nasıl düzenlendiğini anlamak için yararlıdır, lambda DNA'sının konformasyonu ise makromoleküllerin biyofiziği hakkında öngörüler sunar. Protokol aynı zamanda polimerlerin, özellikle de biyopolimerlerin, değişen akış koşullarındaki davranışlarını incelemek ve karmaşık sıvıların reolojisini araştırmak için de yaygın olarak uygulanabilir.

Introduction

Biyomoleküllerin çevresel uyaranlara nasıl tepki verecek mekanizmaları geniş ölçüde incelenmiştir. Özellikle bir akış ortamında, kesme ve uzama kuvvetleri konformasyonel değişiklikleri ve potansiyel olarak biyomoleküllerin işlevini düzenler. Tipik örnekler lambda DNA ve von Willebrand faktörü (VWF) kesme kaynaklı çözülme içerir. Lambda DNA bireysel, esnek polimer zincirleri ve polimer çözeltileri1,2,3,4reolojikonformasyon dinamikleri anlamak için bir araç olarak kullanılmıştır. VWF anormal kesme hızları ve akış desenleri ile kan damarlarının yara sitelerinde trombositler toplar doğal bir akış sensörüdür. VWF'nin çözülmesi, trombositlerin A1 etki alanına ve kollajenin A3 etki alanına bağlanmasını aktive etmek için gereklidir. Buna ek olarak, yüksek makas kaynaklı A2 etki alanı açılmak VWF dekolte sağlar, hangi dolaşımda moleküler ağırlık dağılımı nı düzenleyen5,6. Böylece, bu moleküllerin akış altında nasıl hareket ettiklerine doğrudan görselleştirme, biyomekanik ve işlevleri ne kadar temel anlayışlarımızı geliştirebilir, bu da yeni tanı ve tedavi uygulamaları sağlayabilir.

Tek moleküllü konformasyonları karakterize eden tipik metodolojiler arasında optik/manyetik cımbız, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (FRET)7sayılabilir. Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi biyomoleküllerin konformasyonel değişiklikleri ile ilişkili kuvvet ve hareketi araştırmak için güçlü bir araçtır. Ancak, genel moleküler konformasyonlar8harita yeteneği yoksun. AFM yüksek uzamsal çözünürlükile görüntüleme yeteneğine sahiptir ancak zamansal çözünürlük9sınırlıdır ,10. Buna ek olarak, uç ve örnek arasındaki temas akış tarafından indüklenen yanıt ı bozabilir. FRET ve nanopore analitiği gibi diğer yöntemler, moleküler mesafe ve dışlanmış hacimlerin tespitine dayalı olarak tek moleküllü protein katlama ve açılma durumlarını belirler. Ancak, bu yöntemler hala emekleme döneminde ve tek moleküllü konformasyonlar onların doğrudan gözlem sınırlıdır11,12,13,14.

Öte yandan, floresan mikroskopisi altında yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüğe sahip makromoleküllerin doğrudan gözlemlenmesi, birçok biyolojik süreçte tek moleküllü dinamikleri anlamamızı geliştirmiştir15,16. Örneğin, Fu ve ark. son zamanlarda ilk kez VWF uzama ve trombosit reseptör bağlama eşzamanlı görselleştirme elde etti. Çalışmalarında, VWF molekülleri biotin-streptavidin etkileşimleri yoluyla bir mikroakışkan kanalın yüzeyinde immobilize edildi ve değişen kesme akış ortamlarında toplam iç yansıma floresansı (TIRF) mikroskopi altında görüntülendi17. Fu's gibi benzer bir yöntem uygulayarak, burada VWF ve lambda DNA konformasyonları doğrudan TIRF ve konfokal floresan mikroskopi altında görülebilir göstermektedir. Şekil 1'degösterildiği gibi, mikroakışkan cihazlar kesme akışını oluşturmak ve kontrol etmek için kullanılır ve biyomoleküller kanal yüzeyinde hareketsiz hale getirilmiştir. Değişen kesme hızlarının uygulanması üzerine, aynı molekülün konformasyonları, Şekil 1'dede gösterilen uzatma uzunluğunu ölçmek için kaydedilir. Yöntem, hem reolojik hem de biyolojik çalışmalar için karmaşık akış ortamları altında diğer polimer davranışlarını araştırmak için yaygın olarak uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. VWF Hazırlama

  1. Etiketleme reaksiyonları için hazırlamak için insan plazmavwf yeniden. 1 mg/mL VWF stok çözeltisi oluşturmak için 100 μL deiyonize (DI) suyu 100 μg lyophilized VWF ekleyin.
  2. Aşırı glisini gidermek için VWF stok çözeltisini diyalize çevirin, bu nedenle biyotin ve florofor etiketleme verimliliğini artırın.
    1. VWF stok çözeltisinin 50 μL'sini 10.000 moleküler ağırlık kesme ve kapaklı mühürleme ile 0,1 mL diyaliz ünitesine aktarın. Kalan stok çözeltisini -20 °C'de saklayın. VWF stoku -20 °C'de 1 yıla kadar stabil olacaktır.
    2. Diyalizi 500 mL 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS) (0,01 M disodyum fosfat, 0,0018 monopotasyum fosfat, 0,0027 M potasyum klorür, 0,137 M sodyum klorür, pH 7,4 at 25 °C) 4 °C'de 1 saat yavaş karıştırarak çalıştırın. 500 mL taze PBS kullanarak diyalizi bir saat daha tekrarlayın.
  3. Biotin etiketleme reaksiyonuna başlayın. Reaksiyondan hemen önce DI suyundaki katı eriterek 2 mM'lik NHS-PEG4-biotin çözeltisi hazırlayın. NHS-PEG4-biotin'in uzun süre suda kalmasına izin vermek, NHS-ester grubunun hidrolize etmesine neden olur ve böylece etiketleme verimliliğini azaltır.
    1. VWF stok çözeltisini içeren diyaliz ünitesine 2,5 mM NHS-PEG4-biotin ekleyin. Bu VWF monomerler ile karşılaştırıldığında biotin 20 kat molar fazlalığı neden olacaktır. VWF'nin birincil aminleri NHS-ester gruplarıile reaksiyona girecek ve bu nedenle anamid bağlantıları yoluyla PEG4-biotin gruplarına kovalent olarak bağlanır.
    2. Diyaliz ünitesini 1,5 mL mikrosantrifüj tüpün içine yerleştirin. Diyaliz ünitesini ilgili kapağı ile kapatın. Tüp diyaliz tertibatını Parafilm ile sabitle. Dik tutun ve 40 dakika oda sıcaklığında bırakın.
  4. Florofor etiketleme reaksiyonu başlatın. Alexa 488 tetraflorofenil ester (TFP-ester) floresan boya (uyarmamax = 498 nm, emisyonmax = 519 nm) 2.8 mM çözeltisi hazırlayın DI suda florofor katı eriterek. TFP-ester grubunun hidrolize etmesini önlemek için reaksiyondan hemen önce bunu yapın.
    1. Diyaliz ünitesine 2,8 mM 488 florofor 2,9 μL ekleyin. Bu vwf monomerler ile karşılaştırıldığında florofor 34 kat molar aşırı neden olacaktır. VWF kalan birincil aminler TFP-ester grupları ile reaksiyona girecek, bu nedenle kovalent amid bağlantıları yoluyla floroforlar için bağlayıcı.
    2. Diyaliz ünitesine 2,0 μL 1 M sodyum bikarbonat (DI suda çözünmüş) ekleyin. Bu, reaksiyonun pH'ını 8.0'a yakın ayarlar, bu da TFP-ester ve primer amin reaksiyonunun verimliliğini artırır.
    3. 1.3.2 adımda olduğu gibi diyaliz ünitesini mikrosantrifüj tüpünde sabitle. Fotobeyaztma önlemek için karanlıkta saklayın ve 1 saat ve 30 dakika oda sıcaklığında bırakın.
  5. Diyaliz ünitesini 900 mL 1x steril PBS'ye yerleştirin ve gece boyunca 4 °C'de diyalize sürün. Bu, 0,71 mg/mL veya 2,84 μM (monomer konsantrasyonu) konsantrasyonunda yaklaşık 70 μL etiketli VWF sağlayacaktır.
  6. VWF etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Boruyu alüminyum folyo ile kaplayın ve ışıktan koruyun. 4 °C'de saklayın. Uzun süreli depolama için, %0,02 (w/v) son konsantrasyonuna anti-mikrobiyal ajan sodyum azit ekleyin.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

2. Lambda DNA'sının Hazırlanması

  1. Biyotinylate lineer lambda DNA uyumlu uç siteleri doldurarak (cos sites) biotin-14-dCTP nükleotitler standart protokollere göre, burada adım 2.118tekrarlanır . Cos sitelerinin geri kalanını dATP, dTTP ve dGTP nükleotidleri ile doldurun.
    1. 10x reaksiyon tamponunda (500 mM sodyum klorür, 100 mM Tris hidroklorür, 100 mM magnezyum klorür, 10 mM dithiothreitol, pH 7.9 25 °C) dATP, dTTP, dGTP ve biotin-14-dCTP 1 mM çözeltisi hazırlayın.
    2. 48 μL 500 ng/μL lambda DNA'sını bir PCR tüpüne yerleştirin ve 65 °C'de 5 dakika ısılayın. Dairesel lambda DNA'sının cos bölgeleri ısı altında ayrılacak, molekülü doğrusallaştıracak ve tek iplikçikli çıkıntıları biyotinylasyona hazır hale getirecek. Hemen sonra, yeniden annealing cos siteleri önlemek için buz üzerine yerleştirin.
    3. Lambda DNA'sına 1 mM dATP, dTTP ve dGTP'nin 5 μL'sini ve 1 mM biotin-14-dCTP'nin 4 μL'sini ekleyin. Ayrıca DNA sentezini katalize etmek için 5 U/μL Klenow Fragment (3'à5' exo-) 2,5 μL ekleyin.
    4. Reaksiyon karışımını 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    5. 0,5 M EDTA 1,2 μL ekleyin. Daha sonra reaksiyon karışımını 70 °C'de 5 dk ısıtın. Bu Klenow Parçası ve biyotinylation reaksiyon devre dışı bırakacaktır.
  2. 10-70 μL tutabilen ve 6.000 moleküler ağırlık kesme ye sahip bir spin sütunu kullanarak lambda DNA'sından fazla nükleotitleri çıkarın.
    1. Kolon2 mL mikrosantrifüj tüp içine yerleştirin. 2 dk. 1000 x g'daki kolon ve tüpü santrifüj edin.
    2. Sütun arabelleği adım 2.1.1 aynı reaksiyon arabellek 1x çözüm ile değiştirin. Bunu, sütuna 500 μL 1x arabellek ekleyerek yapın. 1000 x gde 1 dakika santrifüj . Akıştan kurtulun. Bu 2 kez daha tekrarlayın, böylece sütuna toplam 1500 μL eklendi.
    3. Kolonu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe yerleştirin. 2.1.5 adımından sütunun üst katmanına çözümü dikkatlice ekleyin. 1000 x g4 dk için santrifüj .
    4. Mikrocentrifuge tüpünden akış (40-70 μL) toplayın ve pcr tüpüne yerleştirin. Bu saflaştırılmış, biyotinylated lambda DNA içerir.
  3. Etiket lambda DNA floresan YOYO-1 boya ile (uyarmamax = 490 nm, emisyonmax = 509 nm) standart protokollere göre, burada adım 2.3.120tekrarlanır .
    1. YOYO-1 boya ve lambda DNA'sının 1:10'luk temel çifti molar oranına boya ile çözeltihazırlayın. Lambda DNA'sının baz çifti konsantrasyonunun hesaplanması için arınma adımında DNA kaybolmadığını varsayalım. Tam uzunlukta lambda DNA 48.502 baz çifti vardır.
      NOT: Örneğin, adım 2.2.4'ten 50 μL çözelti kurtarıldıysa, 500 μM YOYO-1 boyanın 7,4 μL'sini ekleyin.
    2. Reaksiyonu tamamlamak için çözeltiyi karanlıkta 50 °C'de 2 saat ısıtın.
    3. Boruyu alüminyum folyo ile kaplayın ve ışıktan koruyun. 4 °C'de saklayın. Çözüm artık mikroakışkan cihazlara enjekte edilmeye hazırdır.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

3. Silikon gofret mikroakışkan kanal kalıpları oluşturma

  1. Standartprotokolleregöre ana silikon gofret üzerinde uygun boyutlarda mikroakışkan kanallar oluşturmak için fotolitografiyi kullanın (Şekil 2).

4. Polidimethylsiloxane (PDMS) mikroakışkan cihazın hazırlanması

  1. Bir tartma teknede 1 parça kür ajan (kütle ye göre) için 5 parça silikon elastomer tabanı ekleyin. Önceden tedavi edilmiş PDMS çözümü oluşturmak için içindekileri 1 dakika boyunca iyice karıştırın.
  2. Plastik bir Petri kabına ana silikon gofret yerleştirin. 5 mm'lik bir katman oluşturmak için PDMS çözümünü gofretin üzerine dökün. Çanak kapağı ve hava kabarcıkları kaldırmak için 1 saat vakum altında bir kurutucu bırakın.
  3. İnkübasyon, PDMS'yi esnek bir katıya dönüştürmek için bir gecede 60 °C'de Petri kabını kapladı. Kürleme, PDMS-gofret arabiriminde PDMS'ye kalıplanmış mikroakışkan kanallara neden olur.
  4. Bir jilet kullanarak, her mikroakışkan kanalın etrafında, PDMS içine 20 x 10 mm dikdörtgenler kesin. Dikdörtgen PDMS bloklarını cımbızla kaldırın.
  5. Kanalın bir ucunda0,5 mm çapında bir delik delmek için keskinleştirilmiş kenarları olan 25 G künt uç iğnesi kullanın, deliğin PDMS bloğundan tamamen geçtiğinden emin olun(Şekil 2). DELikten PDMS dışarı yumruk için ince bir iğne kullanın. Bunu kanalın diğer ucunda tekrarlayın. Bu kanal üzerinden akış için bir giriş ve çıkış yaratacaktır.
  6. PDMS bloğunun yüzeyini vinil temiz oda bandı ile temizleyin. Enkaz kaldırmak için bir No 1 1/2, 22 x 50 mm coverslip üzerinde sıkıştırılmış azot gazı darbe.
  7. PDMS bloğunu kanal tarafı yukarı ve kapak kapağını plazma yapıştırma makinesinin odasına yerleştirin. Tedaviye başla.
  8. Tedavi tamamlandığında, PDMS bloğunu hızlı bir şekilde bir kapak kaymasına yerleştirin, böylece kanal kaymayla temas halindedir. Bloğun kenarlarıboyunca basınç uygulayın. Coverslip-PDMS tertibatını 115 °C'de 15 dk sıcak bir tabağa yerleştirin ve kalıcı bağı güçlendirin.
  9. PDMS bloğunun üst kısmındaki çıkış deliğine 10 cm uzunluğunda, 0,25 mm iç çaplı boru yerleştirin. Bu, sıvının kanaldan kolayca akmasını sağlar. Cihaz artık tamamlandı.

5. Mikroakışkan cihazın yüzeyinin tedavisi

  1. Enjekte <10 μL 10 μg/mL biyotinylated sığır serum albumin (BSA-biotin) VWF deneyleri için mikroakışkan cihaz girişine steril 1x PBS içinde çözünmüş. Lambda DNA deneyleri için 1 mg/mL BSA-biotin injeks <10 μL. Enjeksiyondan sonra pipet ucunda birkaç mikrolitre BSA-biotin tutun ve ucun girişte gömülü kalmasını bekleyin.
    1. Her zaman ucu etrafında DI su damlacıkları tutun. Bu, hava kabarcıklarının kanala girmesini önler. Kanala her yeni bir çözüm enjekte edişişsinde bu tekniği uygulayın.
    2. BSA-biotin'in cihazda 2 saat kuluçkaya yatmasını bekleyin. BSA özellikle kapak yüzeyine bağlanır (Şekil 3A).
  2. Pipet ucunu çıkarın. Kanala <10 μL kazein engelleme çözeltisi enjekte edin ve 30 dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin. Kazein herhangi bir serbest alanı bloke eder ve biyomoleküllerin yüzeye spesifik olmayan bağlanmasını azaltır (Şekil 3B).
  3. VWF deneyleri için kanala steril 1x PBS'de çözünmüş 10 μg/mL streptavidinin ucunu çıkarın ve enjekte edin.lt;10 μL. Lambda DNA deneyleri için 100 μg/mL streptavidin kullanın. 10 dakika kuluçka. Streptavidin BSA-biotin biyotin gruplarına bağlanır (Şekil 3C).
  4. Fazla streptavidini temizlemek için ucunu çıkarın ve 1x deterjan çözeltisinin <10 μL'sini (%0,05 PBS'de %0,05 Ara 20) kanala enjekte edin.
  5. Kazein çözeltisinde seyreltilmiş 28,4 nM VWF'nin veya lambda DNA'sının 2.3.3 adımdan ucunu çıkarın ve enjekte edin.lt;10 μL. 3 dk. Incubate lambda DNA için 3 dk. 45 dk (Şekil 3D) için TÜPLÜ VWF .
  6. Kazein çözeltisinde seyreltilmiş 5 mM içermeyen biotinin ucunu çıkarın ve 10 μL enjekte edin. Serbest biotin kanal yüzeyinde aşırı streptavidin bağlayıcı siteleri engelleyecektir (Şekil 3E).

6. VWF ve Lambda DNA'sını floresan mikroskopi altında görselleştirme

  1. 2,2 mM protocatechuic asit ve 37 nM protocatechuate-3,4-dioxygenase (fotobeyazrlamayı en aza indirmek için) ile 1 mL kazein engelleme çözeltisi hazırlayın. Bir şırınga içine yük ve bir şırınga pompası güvenli. 30 cm uzunluğunda, 0,25 mm iç çaplı boru alın ve bir ucunu şırınga iğnesine takın. Hava kabarcıkları kaldırmak için çözelti akışı. Tüpün diğer ucunu mikroakışkan cihazın girişine takın. Bu adım 5.6 sonra 3 dakika bunu yapmak için tavsiye edilir.
  2. Toplam iç yansımanın (TIRF) veya konfokal floresan mikroskobunun en yüksek büyütme hedefini (örn. 60-100X) seçin. Gerekirse amacına bir damla daldırma yağı ekleyin. Mikroakışkan cihazı mikroskop aşamasına yerleştirin, böylece kapak kayması hedefe doğru sifonu çeksin.
  3. Brightfield mikroskobu başla. Odak noktasını, enkaz ve kabarcıklar gibi tüm özelliklerin görünür olması için ayarlayın. Daha sonra mikroakışkan kanalın kenarı görünene ve çerçeveyi ikiye bölene kadar X ve Y yönünde sahneyi ayarlayın.
  4. 488 kanala (FITC) geçin. Bireysel yeşil, küresel moleküller ayırt edilebilir kadar gerektiği gibi Z seviyesi ve TIRF açısı ayarlayın. Bunlar ya VWF ya da lambda DNA molekülleridir.
  5. Floresan molekülleri çok hızlı bir şekilde fotobeyazlama yapmadan görselleştirmek için pozlama süresini ve lazer yoğunluğunu ayarlayın. Molekülleri daha net görselleştirmek için kontrastı ayarlayın.
  6. Şırınga pompasından akış başlatın, böylece kazein engelleme çözeltisi kanala ve prizin dışına akar. Bunu adım 5.6'dan tam olarak 5 dakika sonra yapın. Moleküllerin konformasyonundaki değişiklikleri gözlemlemek için akışı durdurun ve başlatın. Akış uygulanırken, 5.000 ile 30.000 μL/sa arasındaki kullanım oranları. Durdurma ve başlangıç akışı birden fazla döngü üzerinde genişletmek ve dinlenmek molekülleri bulmak için bu süreci devam edin.
  7. Moleküllerin maksimum uzantıya ulaşmasının ve globüllerin içine tamamen gevşemenin ne kadar sürdüğünü unutmayın. Kesme akışı altındaki moleküllerin sürekli davranışlarının videolarını kaydedin, en iyi pozlama süresini, pozlama sıklığını ve tüm uzantılarını yakalayacak ve fotobeyaztlatma işlemini en aza indirecek video süresini seçin.
  8. Videoları ' olarak kaydet. Bir ölçek çubuğu ile AVI dosyaları.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

7. Konformasyonel değişikliklerin görüntü analizi

  1. Dikdörtgen mikroakışkan kanalınSymbol 1akış hızı (Q) ve yüksekliği(h)ve genişlik(w)kullanılarak makromoleküllere uygulanan duvar kesme hızını hesaplayın. Bunu yapmak için aşağıdaki denklemi kullanın:
    Equation 1
  2. Özelleştirilmiş bir MATLAB kodu kullanarak çeşitli kesme oranları altında herhangi bir biyomolekülün uzunluğunu belirleyin (Bkz. Ek Dosyalar). Aşağıdaki MATLAB kodlarını içeren video analizi başlıklı bir klasör oluşturun: main.m, save_each_frame.m, get_length.m ve get_length.fig. Video analizi başlıklı videolar içinde bir alt klasör oluşturun ve ekleyin. AVI dosyaları içine analiz edilecek.
  3. MATLAB 2019a kullanarak main.m'yi açın ve kodu çalıştırın. Komut penceresinde çözümlenecek video dosyasının adını yazın Lütfen analiz etmek için veri dosyasını girdin:.
  4. Açılan grafik kullanıcı arabiriminde (GUI), eşiği (pencerenin sağ üst kısmındaki kutudaki metin) 20'ye ayarlayın ve onaylamak için Ayarla eşiğini tıklatın.
  5. Ölçek çubuğunda herhangi bir yerde bir piksel seçmek için pencerenin üst araç çubuğunda veri imleci kullanın. Pencerenin sağındaki Ölçek çubuğu bölümünde Başlangıç noktasını tıklatın. Seçilen pikselin (x,y) konumu düğmenin sağında görünür. Piksel boyutu (μm) düğmesine tıklayın. Piksel boyutu her videoda yalnızca bir kez ölçülebilir.
  6. İlgi molekülündeki herhangi bir pikseli seçin. VWF bölümündeki Başlangıç noktasına tıklayın. Seçilen pikselin konumu sağdaki metin kutusunda göründükten sonra, görüntüdeki moleküler uzunluğu elde etmek için Sol uç, Sağ uç ve String uzunluğunu tıklatın.
    NOT: Bu adım, kodun VWFadlı belirli bir bölümü olmasına rağmen, herhangi bir biyomolekülün konformasyonel değişikliklerini analiz etmek için kullanılabilir.
  7. Molekülün sol ve sağ ucunu iki kez kontrol edin. Yakınlaştırın ve ilgi alanının piksel konumunu kontrol etmek için veri imlecini kullanın. Pikseli el ile son olarak seçin ve gerektiğinde uzunluğu (piksel olarak) yeniden hesaplayın.
  8. Piksel boyutunu μm ve dize uzunluğu yla piksel sayısı olarak bir Excel sayfasına kaydedin ve dize uzunluğunu μm olarak hesaplayın.
  9. Her görüntü için yukarıdaki adımları tekrarlayın. Gui'nin sağ alt köşesindeki Son, Sonraki düğmesini kullanarak aynı video dosyasındaki görüntüler arasında geçiş yapın. GUI penceresini kapatmak için Kapat'ı tıklatın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

VWF ve lambda DNA gibi biyomoleküllerin dinamik davranışlarını gözlemlemek cihaz yüzeyine bağlanmalarını optimize etmeye son derece bağlıdır. Mikroakışkan cihazda önerilen süreler için yüzey tedavileri inkübasyon birkaç ankraj noktaları ile bağlayıcı elde etmek için çok önemlidir, böylece moleküller serbestçe genişletmek ve akış değişen üzerine dinlenmek. Proteinler veya DNA birden fazla bağlantı ile çok güçlü bir şekilde bağlı ise, ya sınırlı uzunluklara kadar uzatır ya da hiç uzatmak değil. Bu, özellikle VWF ile cihaz yüzeyinde serbest biotin engellemeden önce 3 dakikadan fazla akış olmadan kaldığında oluşur. Uzun VWF yüzeyde durgun kalır, daha VWF biotin grupları yüzeystreptavidin gruplarına bağlı ve molekül ün çözmek için daha az esneklik vardır. Moleküller çok zayıf bağlanırsa, diğer taraftan, akış üzerine ayrılacaktır ve gözden kaybolur. VWF veya lambda DNA'sı çok kısa süreler için kuluçkaya yatırılırsa bu durum çok az biotin-streptavidin etkileşiminin oluşmasına neden olabilir. Moleküller de son derece yüksek kesme oranları (>200.000 s-1)uygulandığında, biotin-streptavidin etkileşimleri zayıflatma serbest kırabilir.

İdeal bir molekül, birden fazla durma ve başlangıç akışı döngüsü nde çözülüp rahatlayabildiği ölçüde bağlanır. Bir molekülün bu gibi konformasyonu değiştirme esnekliği, daha yüksek kesme hızları artan akış aralığında uygulandığı için uzunlukları artırma yeteneği yle sık sık ortaya konmuştur. TIRF mikroskobu ile elde edilen VWF görüntüleri Video 1'debu ilişkiyi göstermektedir. Şekil 4'teki aynı VWF molekülünün uzatma ve kesme hızı eğrisi, bir VWF molekülünün yama kaynaklı davranışını tam olarak yakalar ve proteinin biyomekanik özelliklerini karakterize etmek için yararlıdır. Confocal floresan mikroskopi ile elde edilen lambda DNA görüntüleri benzer şekilde video 2 ve Video 3yakalanır gibi, daha yüksek kesme oranları ve 2 dakika üzerinde kademeli gevşeme üzerine artan uzantısı göstermektedir. Lambda DNA'sının durmuş akıştan sonraki recoiling özellikleri de Grafiksel olarak Şekil 5'tetemsil edilmektedir.

Figure 1
Şekil 1: Floresan mikroskopi altında mikroakışkan kanalda tek moleküllü akış deneyşetiği. Kanal yüzeyi BSA-biotin ile kaplanır ve kazein ile bloke edilir. Streptavidin kanal yüzeyinde biotin ile bağlanır ve aynı zamanda biyotinylated VWF / lambda DNA yüzeyinde tek molekülleri hareketsizleştirmek için. Kesme hızı A'dan C'yearttıkça, molekül katlanmış bir durumdan soldan sağa doğru akış yönü boyunca uzatılmış bir duruma doğru gerilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Mikroakışkan kanal boyutları. PDMS mikroakışkan cihazın şekli ve yapısı kanal boyutları ile birlikte gösterilir. Kanal 50 μm yüksekliğindedir ve genişliği 0,1 ile 1,0 mm arasında değişmektedir. Kanalın ortasındaki daralan bölge 0.7 mm uzunluğundadır. Giriş ve çıkış 0,5144 mm (25 G) çapındadır. Akış yönü soldan sağa doğru. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Tek moleküllü immobilizasyon için yüzey işleme adımları. Tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleşir. (A). BSA-biotin yüzeyde 2 saat (B)kaplanır. Kazein yüzeyi engellemek için 30 dakika kanaliçine enjekte edilir. (C). Streptavidin BSA-biotin ile bağlamak için 10 dakika boyunca kanalda kuluçkaya yatırılır. (D). Eski basamaklarda fazla molekülleryıkandıktan sonra, VWF/lambda etiketli florofor ve biotin DNA kanala enjekte edilir ve streptavidin ile bağlanarak immobilize edilir. (E). Serbest biotin akar, konformasyonel değişiklikler sırasında molekül ile girişimen en aza indirmek için ekstra streptavidin bağlama siteleri engelleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: VWF'nin kesme akışı altında uzantılı davranışı. Molekül 7 farklı kesme oranlarında geri döner: 0 s-1, 33,333 s-1, 66,667 s-1, 100,000 s-1, 133,333 s-1, 166,667 s-1 ve 200,000 s-1. Gerilmiş molekülün uzunluğu sıfır kesme hızında 0,52 μm'den 200.000 s-1 kesme hızında 3,44 m'ye yükselir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Lambda DNA'sının kesme akışı durduktan sonra gevşeme davranışı. 33.000 s-1 ve 66.667 s-1 kesme oranları ile akış 0'dan 30'a kadar aynı moleküle uygulanır. Gevşeme 30 s ile 150 s arasında kaydedilir. 66.667 s-1 kesme hızında, DNA molekülü 15.00 μm'ye kadar uzalar ve akış 2 dakika süreyle durdurulduktan sonra 5.83 μm'ye geri döner. 33.333 s-1 kesme hızında molekül sadece 8.75 μm'ye kadar uzanır ve 2 dk gevşemeden sonra 3.33 μm uzunluğundadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1
Video 1: Toplam iç yansıma floresansı (TIRF) mikroskopisi kullanılarak VWF'nin artan kesme hızları altında ters çözülmesi. Görünümün ortasındaki molekül, 33.333 s-1, 66.667 s-1, 100.000 s-1 ve 133.333 s-1'defarklı uzunluğa döner. Bir şırınga pompası kesme hızları hesaplanır akış hızını kontrol etmek için kullanılır. Akış yönü soldan sağa doğru. Görüntüler tam gevşeme ve uzatma işlemleri sağlamak için 15 s aralıklarla alınır. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Video 2
Video 2: Lambda DNA'sının 33.333 s-1 kesme hızından sonra gevşemesi. Görüntüler konfokal floresan mikroskopi altında alınır. Lambda DNA 33.333 s-1 kesme akışı altında gerilir ve akış 30 s. 30 s. Gevşeme süresi 2 dk. Akış yönü soldan sağa kesildikten sonra katlanmış bir duruma geri rahat. Görüntüler arasında 30 s aralıklarla alınır. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Video 3
Video 3: Lambda DNA'sının 66.667 s-1 kesme hızından sonra gevşemesi. Ayarlar, ilk kesme hızı dışında Video 2'dekilerle aynıdır. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Ek Dosyalar: MATLAB kodları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yöntemde açıklandığı gibi floresan mikroskobu kullanılarak tek moleküllü konformasyonel değişikliklerin yüksek kaliteli veri elde etmek için, molekülü uygun süre için kuluçkaya yatırmak, yüzeyle nonspesifik etkileşimlerini en aza indirmek çok önemlidir. ve fotobeyaztlamayı azaltan mikroskop ayarlarını kurun. Molekülün konformasyonu serbestçe değiştirebilme yeteneği, molekül ile yüzey arasında oluşan biyotin-streptavidin etkileşimlerinin sayısı ile ilgilidir. Daha önce de belirtildiği gibi, bu zaman uygun miktarda akış olmadan molekül kuluçka ile kontrol edilmelidir. Ayrıca, kapak kayması etkin bir şekilde engellenmezse protein veya DNA özellikle kapak kaymasına bağlanabilir. Önerilen engelleme çözeltisi olmadan, moleküller cama özel olarak bağlanabilir ve uygulanan herhangi bir akış hızına yanıt vermeyebilir. Kazein bloğunun erken yüzey işleme sırasında uygulanması ve akış sırasında varlığının korunması bu nonspesifik etkileşimleri azaltmak için gereklidir. Son olarak, tek bir molekülün sürekli, dinamik davranış yakalama görüntü yakalama sırasında sık florofor heyecan gerektirir. Lazer yoğunluğu, maruz kalma süresi ve maruz kalma sıklığı çok yüksekse bu hızlı fotobeyazrlama neden olabilir. Bu nedenle, bu ayarları birlikte ayarlamak ve verilerin zaman veya görüntü çözünürlüğünden ödün vermeden değerlerini nasıl azaltacaklarını stratejilemek gerekir.

Molekülün uzantısı ve gevşemesi gözlenmezise, ek adımlar izlenmelidir. Molekülü protokolde tavsiye edilenden daha uzun ve daha kısa süreler için cihazda kuluçkaya yatırın. Test edilen her zaman için, BSA-biotin ve streptavidin konsantrasyonları 10 faktörlere göre değişir. Bu testler molekül ve yüzey arasında oluşan biotin-streptavidin ankraj noktalarının sayısını optimize etmek için gerekli olabilir. Örneğin, biyotin etiketleme yoğunluğu çok yüksekse, etiketleme protokolünde önerilen konsantrasyonlardan veya reaktiflerden sapmalar nedeniyle, daha kısa moleküler kuluçka süresi ve daha düşük BSA-biotin ve streptavidin konsantrasyonları gerekebilir. Deneyin başarısını daha da artırmak için, geri döndürülen moleküller için tüm mikroakışkan cihazı tarar. Yüzey streptavidin veya kazein bloğu ile düzgün bir şekilde tedavi edilemeyebilir ve bazı bölgelerdeki moleküllerin diğerlerinden daha fazla çözülme yanıtına sahip olmasını sağlayabilir.

Bu yöntem, molekülün boyutu ve tethering noktaları hakkında bilgi eksikliği, 0 s-1 kesme hızı ve floresan mikroskopların optik çözünürlüğü ile sınırlıdır. Önceki çalışma VWF çözme davranışı büyük bir varyasyon göstermiştir, potansiyel sayı ve biotin-streptavidin tether noktaları nın konumu geniş dağılımı ve her VWF molekülün moleküler ağırlığı ile açıklanan18. Şu anda, sunduğumuz yöntem tether noktaları ve moleküler boyutu tanımlayamazsınız. Ancak, Wang ve ark. tarafından yayınlanan kaba taneli VWF modelinin Brownian dinamikleri simülasyonları bu değişkenleri birleştirir ve bu varyasyonu açıklamak için deneysel bulgularla birlikte çalıştırılabilir18. Ayrıca, şırınga pompası durdurulduğunda akış anında durmaz, recoiling dinamikleri gözlem kafa karıştırıcı. Bunun nedeni, amaçlanan akış döneminde PDMS kanalının deformasyonu ve hafif genişlemesidir. Pompa durdurulduğunda, PDMS tamamen gevşeyene kadar sıvı akmaya devam ekadar devam edin. Geliştirilmiş bir sistem, sıvının0-1 kesme oranına daha hızlı ulaşmasını sağlayan sert plastik malzemelerde imal edilen daha sert PDMS veya mikrokanallar kullanmalıdır. Son olarak, sadece boyutu floresan mikroskobunun optik çözünürlüğü ile aynı büyüklükte olan molekülleri çözebiliriz, ki bu birkaç yüz nanometreden daha küçük olmayabilir. Bu nedenle, doğrudan bu yöntem ile gözlemlenebilir moleküller için minimum boyut gereksinimi vardır.

Mevcut protokol esas olarak fizyolojik akış altında protein ve DNA moleküllerinin konformasyonel değişikliklerinin nicelikselleştirilmesi ile ilgilidir. Ancak, yöntem aynı zamanda biyolojik moleküller arasındaki gerçek zamanlı etkileşimleri görselleştirmek ve daha fazla protein ve DNA fonksiyonu karakterize etmek için kullanılabilir. Örneğin, Fu ve ark. bağlı VWF yüksek kesme akışı altında etkinleştirmek ve daha fazla değişen akış koşulları altında trombosit yapışma molekülü GPIbα yakalamak göstermiştir17. Bu bağlama olayı, VWF biotin-streptavidin bağlantıları ile yüzeye bağlı olsa bile korunur, fizyolojik olarak ilgili fonksiyonları ve mekanik 17 çalışma için bu protokolün etkinliğini gösteren17. Benzer mekanistik anlayışlar akış ortamlarında çözülmüş DNA ve düzenleyici proteinler arasındaki etkileşimleri incelerken elde edilebilir21,22. Ayrıca, yöntemimiz çoğunlukla makromoleküllerdeki konformasyonel değişiklikleri gözlemlemekle ilgilidir. Yine de, floresan mikroskopisi altında çözülecek kadar büyük küçük molekülleri incelemek amacıyla adapte edilebilir. Örneğin, küçük bir molekülü çok daha büyük, hareketsiz lambda DNA'sına nonkovalent veya kovalent olarak bağlayarak, küçük molekülün kesme-duyarlılığını artırabilir ve davranışını daha kolay gözlemleyebilir. Sonuç olarak, AFM veya optik cımbız gibi diğer tek moleküllü karakterizasyon yöntemleri, makromoleküllerin yapısal ve işlevsel özellikleri hakkında yüksek çözünürlüklü veriler sağlar; ancak bu alternatif yöntemler, bu protokolde sunulduğu gibi, fizyolojik akış ortamında meydana gelen proteinlerin ve DNA'nın dinamik, konformasyonel değişimlerini gözlemleyemez.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.

Acknowledgments

Bu çalışma kısmen Ulusal Bilim Vakfı hibe DMS-1463234, Ulusal Sağlık Enstitüleri HL082808 ve AI133634 hibe ve Lehigh Üniversitesi iç finansman tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Labeling Kit Invitrogen A30006
Bio-Spin P-6 Gel Columns Bio-Rad 7326221
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Use as free biotin in Step 5.6
Biotin-14-dCTP AAT Bioquest 17019
BSA-Biotin Sigma-Aldrich A8549
Coverslips VWR 48393-195 No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP Set Invitrogen 10297018
Float Buoys for Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69588
Klenow Fragment (3'→5' exo-) New England BioLabs M0212S Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2
Lambda DNA New England BioLabs N3011S
Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69570 10K MWCO, 0.1 mL volume
NEBuffer 4 New England BioLabs B7004S
NHS-PEG4-Biotin Thermo Scientific 21330
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase Sigma-Aldrich P8279
Protocatechuic acid Santa Cruz Biotechnology sc-205818
Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication The Dow Chemical Company 4019862
Streptavidin Sigma-Aldrich 85878
The Blocking Solution CANDOR Bioscience 110 050 Use as casein blocking solution throughout protocol
Vinyl Cleanroom Tape Fisher Scientific 19-120-3217
von Willebrand Factor, Human Plasma Millipore Sigma 681300
YOYO-1 Dye AAT Bioquest 17580
0.25 mm Inner Diameter Tubing Cole-Parmer EW-06419-00
25 Gauge Needle Thomas Scientific JG2505X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
  2. Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
  3. LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
  4. Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
  5. Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
  6. Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
  7. Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
  8. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  9. Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
  10. Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
  11. Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
  12. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  13. Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
  14. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
  15. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  16. Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
  17. Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
  18. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
  19. Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).
  20. Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
  21. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  22. Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).

Tags

Biyomühendislik Sayı 155 von Willebrand faktörü lambda DNA mikroakışkanlar kesme akışı TIRF konfokal floresan mikroskopi
Floresan Mikroskopi ile Kesme Akışı Altında Tek Moleküllü Konformasyonel Değişikliklerin Karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pisapati, A. V., Wang, Y., Blauch,… More

Pisapati, A. V., Wang, Y., Blauch, M. E., Wittenberg, N. J., Cheng, X., Zhang, X. F. Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60784, doi:10.3791/60784 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter