Summary
マイクロ流体デバイス内の単一の高分子を固定化し、せん断流下での立体構造の変化を定量化するプロトコルを提示する。このプロトコルは、流れ環境におけるタンパク質やDNAなどの生体分子の生体力学的および機能的特性を特徴付けするのに役立ちます。
Abstract
機械的摂動下における単一分子挙動は、多くの生物学的プロセスを理解することが広く特徴付けられている。しかし、原子間力顕微鏡法は時間分解能が限られているのに対し、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は立体構造の推測しか認めることができない。一方、蛍光顕微鏡法は、様々な流れ条件下での単一分子のリアルタイム可視化を可能にする。我々のプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いて異なる剪断流環境下で単一の生体分子の立体構造変化を捉えるステップを記述する。剪断流はマイクロ流体チャネルの内部に作成され、シリンジポンプによって制御される。この方法のデモンストレーションとして、フォン・ヴィルブランド因子(VWF)とラムダDNAをビオチンとフルオロフォアで標識し、チャネル表面に固定化する。それらの立体構造は、全内部反射(TIRF)および共焦点蛍光顕微鏡を用いて可変剪断流下で連続的にモニタリングされる。VWFの可逆的な解明ダイナミクスは、その機能がヒト血液中でどのように調節されているかを理解するのに役立ちますが、ラムダDNAの立体構造は高分子の生物物理学に関する洞察を提供します。プロトコルはまた、様々な流れの条件でポリマー、特に生体高分子の挙動を研究し、複雑な流体の流動を調査するために広く適用することができる。
Introduction
生体分子が環境刺激にどう反応するかのメカニズムが広く研究されている。特に流れ環境では、せん断と伸びの力が、立体構造の変化を調節し、生体分子の機能を制御する可能性があります。代表的な例としては、ラムダDNAおよびフォン・ヴィルブランド因子(VWF)の剪断誘発解明が挙げられる。ラムダDNAは、個々の、柔軟なポリマー鎖の構造ダイナミクスとポリマー溶液1、2、3、4の流動を理解するためのツールとして使用されている。VWFは異常な剪断速度および流れのパターンの血管の傷ついた場所で血小板を凝集する自然な流れセンサーである。VWFの解明は、A1ドメインへの血小板の結合とA3ドメインへのコラーゲン結合を活性化するために不可欠である。さらに、高剪断誘導A2ドメイン展開は、循環中の分子量分布を調節するVWFの切断を可能にする5、6。したがって、これらの分子が流動下でどのように振る舞うかを直接視覚化することで、バイオメカニクスと機能に関する基本的な理解が大幅に高まり、新しい診断および治療用途が可能になります。
単一分子の立体構造を特徴付ける一般的な方法論には、光/磁気ピンセット、原子間力顕微鏡(AFM)および単分子フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)7が含まれる。単一分子力分光法は生体分子の立体構造変化に伴う力と運動を調べる強力なツールです。しかし、それは全体的な分子構造8をマッピングする能力を欠いている。AFMは、高い空間分解能でイメージングが可能であるが、時間分解能9、10に制限されている。また、先端と試料との接触は、流れによって誘導される応答を混乱させる可能性がある。FRETやナノポア分析のような他の方法は、分子内距離と除外された体積の検出に基づいて、単一分子タンパク質の折りたたみおよび展開状態を決定します。しかし、これらの方法は、まだ初期段階にあり、単一分子立体構造11、12、13、14の直接観察において制限されている。
一方、蛍光顕微鏡下で高い時間的および空間的分解能を有する高い時間的および空間的な高分子を直接観察することは、多くの生物学的プロセスにおける単一分子ダイナミクスの理解を改善した15,16。例えば、Fuら最近、初めてVWF伸長と血小板受容体結合の同時可視化を達成した。その研究では、VWF分子をビオチン-ストレプトアビジン相互作用を介して微小流体チャネルの表面に固定化し、様々な剪断流環境で全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡下で画像化した17。Fuと同様の方法を用いて、ここでは、VWFとラムダDNAの立体構造をTIRFと共焦点蛍光顕微鏡の両方で直接観察できることを実証します。図1に示すように、マイクロ流体デバイスを使用してせん断流を作成および制御し、生体分子をチャネル表面に固定化します。せん断速度の変化を適用すると、同じ分子の立体構造が記録され、伸長長を測定し、図1にも示される。この方法は、レオロジー研究と生物学的研究の両方のために複雑な流れの環境下で他のポリマー挙動を探求するために広く適用することができる。
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Protocol
1. VWF の準備
- ヒトプラズマVWFを再構成し、標識反応のためにそれを調製する。100 μLの脱イオン(DI)水を100μgの凍結乾燥VWFに加え、1mg/mL VWFストック溶液を作成します。
- ダイアレーズVWFストック溶液は、過剰グリシンを除去するために、ビオチンおよびフルオロフォア標識効率を高める。
- VWFストック液50μLを0.1mL透析ユニットに移し、10,000個の分子量カットオフを行い、キャップで密閉します。残りのストック液を-20 °Cに保存します。VWFの在庫は-20 °Cで最大1年間安定します。
- 1x滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の500mLで透析を実行し(0.01Mリン酸二ナトリウム、リン酸一酸化カリウム、0.0027M塩化カリウム、0.137M塩化ナトリウム、25°CでpH 7.4 at 25°C)を1時間遅く攪拌します。500 mLの新鮮なPBSを使用して、さらに1時間透析を繰り返します。
- ビオチン標識反応を開始します。反応の直前にDI水に固体を溶解することにより、NHS-PEG4-ビオチンの2mM溶液を調製する。NHS-PEG4-ビオチンが長期間水中にとどまることを可能にすると、NHSエステル群は加水分解し、それによって標識効率が低下する。
- VWFストック溶液を含む透析ユニットに2mM NHS-PEG4-ビオチンの2.5 μLを加えます。これにより、VWFモノマーと比較して20倍のモル超過のビオチンが得られます。VWFの一次アミンはNHSエステル基と反応し、それによってアミド結合を介してPEG4-ビオチン基に共有結合する。
- 透析ユニットを1.5mLマイクロ遠心チューブの内側に入れてください。透析ユニットを対応するキャップで密封します。パラフィルムでチューブ透析アセンブリを固定します。直立して、室温で40分間放置します。
- 蛍光素標識反応を開始します。アレクサ488テトラフルオロフェニルエステル(TFPエステル)蛍光色素(励起最高度=498nm、発光最大=519nm)の2.8mM溶液をDI水中にフルオロフォア固体を溶解して調製する。反応の直前にこれを行い、TFP-エステル基が加水分解するのを防ぎます。
- 透析装置に2.8 mM 488フルオロフォアの2.9μLを加えます。これにより、VWFモノマーと比較して34倍のモル超過の蛍光色素が得られます。VWFの残りの一次アミンはTFPエステル基と反応し、それによってアミド結合を介して蛍光体に共有結合する。
- 透析ユニットに1M重炭酸ナトリウム(DI水に溶解)の2.0μLを加えます。これは、8.0に近い反応のpHを調整します, これは、TFPエステルと一次アミン反応の効率を増加させます.
- 透析ユニットは、ステップ 1.3.2 と同様にマイクロ遠心チューブに固定します。暗い所に保管して、光の漂白を防ぎ、室温で1時間30分放置します。
- 透析ユニットを1x滅菌PBSの900mLに入れ、4°Cで一晩透析します。これは、0.71 mg/mLまたは2.84 μM(モノマー濃度)の濃度で標識されたVWFの約70 μLを生成します。
- 標識されたVWFをマイクロ遠心管に移す。チューブをアルミ箔で覆い、光から保護します。4°Cで保管してください。長期保存の場合、0.02%(w/v)の最終濃度に抗菌剤アジドナトリウムを加えます。
注: ここでプロトコルを一時停止できます。
2. ラムダDNAの準備
- ビオチエン酸リニアラムダDNAは、その凝集末端部位(cos部位)を標準プロトコルに従ってビオチン-14-dCTPヌクレオチドで充填することにより、ここでステップ2.118で繰り返される。残りのcos部位にdATP、dTTPおよびdGTPヌクレオチドを記入する。
- dATP、dTTP、dGTPおよびビオチン-14-dCTPの1mM溶液を10x反応バッファー(500mM塩化ナトリウム、100mMトリス塩酸塩、100mM塩化マグネシウム、10mMジチオトレイトール、25°CでpH 7.9)で調製する。
- 48 μL の 500 ng/μL ラムダ DNA を PCR チューブに入れ、65 °C で 5 分間加熱します。円形ラムダDNAのcos部位は熱の下で分離し、分子を直線化し、ビオチン化の準備ができている一本鎖の突出を作る。直後に氷の上に置き、コスサイトが再アニールするのを防ぎます。
- ラムダDNAに1mM dATP、dTTPおよびdGTPの5μLおよび1mMビオチン-14-dCTPの4 μLを加える。また、DNA合成を触媒するために、5 U/μLクレノウフラグメント(3'à5'exo-)の2.5μLを加えます。
- 37°Cで1時間反応混合物をインキュベートする。
- 0.5 M EDTA の 1.2 μL を追加します。次いで、70°Cで5分間反応混合物を加熱する。これはクレノウフラグメントとビオチン化反応を非アクティブ化します。
- ラムダDNAから過剰なヌクレオチドを除去するには、10~70μLを保持でき、分子量6,000個のカットオフを有するスピンカラムを使用します。
- 柱を2mLマイクロ遠心チューブの内側に置きます。柱とチューブを1000 x gで2分間遠心分離します。
- ステップ 2.1.1 から同じ反応バッファーの 1x 溶液でカラムバッファーを交換します。これを行うには、500 μL の 1x バッファーをカラムに追加します。1000 x gで1分間の遠心分離機。フロースルーを破棄します。合計 1500 μL がカラムに追加されるように、さらに 2 回繰り返します。
- 柱を1.5mLマイクロ遠心チューブに入れる。ステップ 2.1.5 のソリューションを列の最上層に慎重に追加します。1000 x gで4分間の遠心分離機。
- マイクロ遠心チューブからフロースルー(40~70 μL)を集め、PCRチューブに入れます。これには、精製されたビオチン化ラムダDNAが含まれています。
- 標識ラムダDNAを蛍光YOYO-1色素(励起最大=490nm、発光最大=509nm)を標準プロトコルに従って、ここで繰り返すステップ2.3.120。
- YOYO-1色素とラムダDNAの溶液を、塩基対モル比1:10の色素と共に調製する。ラムダDNAの塩基対濃度を計算する精製工程でDNAが失われなかったと仮定します。完全長ラムダDNAは48,502塩基対を有する。
注:例えば、ステップ2.2.4から50μLの溶液を回収した場合、500μM YOYO-1色素の7.4μLを加えます。 - 溶液を暗闇の中で50°Cで2時間加熱して反応を完了させる。
- チューブをアルミ箔で覆い、光から保護します。4°Cで保管してください。このソリューションは、マイクロ流体デバイスに注入する準備が整いました。
注: ここでプロトコルを一時停止できます。
- YOYO-1色素とラムダDNAの溶液を、塩基対モル比1:10の色素と共に調製する。ラムダDNAの塩基対濃度を計算する精製工程でDNAが失われなかったと仮定します。完全長ラムダDNAは48,502塩基対を有する。
3. シリコンウェーハでのマイクロ流体チャネル金型の作成
- フォトリソグラフィを使用して、標準プロトコル19に従ってマスター シリコン ウェーハ上に適切な寸法 (図 2)を持つマイクロ流体チャネルを作成します。
4. ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体装置の製造
- 5部シリコーンエラストマーベースを1部硬化剤(質量)に加えます。内容物を1分間十分かき混ぜ、硬化PDMS溶液を作成します。
- プラスチック製のペトリ皿にマスターシリコンウエハを入れます。5 mmの層を作成するために、ウェーハの上にPDMS溶液を注ぎます。皿を覆い、空気泡を取り除くために1時間真空の下でデシケーターに残します。
- インキュベートは、PDMSを柔軟な固体に治すために一晩60°Cでペトリ皿を覆った。硬化は、PDMS-ウェハー界面で PDMS に成形されたマイクロ流体チャネルになります。
- カミソリを使用して、各マイクロ流体チャネルの周りにPDMSに20 x 10 mmの長方形をカットします。ピンセットを使用して、長方形の PDMS ブロックを取り外します。
- エッジを鋭くした25Gの鈍い端針を使用して、チャネルの一端に直径0.5mmの穴を開け、穴がPDMSブロックを完全に通過することを確認します(図2)。薄い針を使ってPDMSを穴から抜き出します。チャネルの反対側でこれを繰り返します。これにより、チャネルを流れる流入口と出口が作成されます。
- PDMSブロックの表面をビニールクリーンルームテープでクリーニングします。圧縮窒素ガスを1号機1/2号、22 x 50mmカバースリップで吹き飛ばして、デブリを除去します。
- PDMS ブロックをチャネル側を上に、カバースリップをプラズマボンディングマシンのチャンバーに入れます。治療を開始します。
- 治療が完了したら、チャネルがスリップに接触するように、PDMSブロックをカバースリップに素早く置きます。ブロックのエッジに沿って圧力を適用します。カバースリップPDMSアセンブリを115°Cのホットプレートに15分間置き、永久結合を補強します。
- PDMSブロック上部の出口穴に、長さ10cm、内径0.25mmのチューブを挿入します。これにより、流体がチャネルから簡単に流出できます。これでデバイスが完成しました。
5. マイクロ流体デバイスの表面の処理
- VWF実験用マイクロ流体装置の入口に、10 μg/mL ビオチン化ウシ血清アルブミン(BSA-ビオチン)を無菌1x PBSに溶解した10μg/mLの<10 μLを注入する。ラムダDNA実験のために1mg/mL BSA-ビオチンの<10 μLを注入する。注射後のピペットチップにBSA-ビオチンの数マイクロリットルを差し控え、チップが入り口に埋め込まれたままにします。
- 常に先端の周りにDI水の液滴を保ちます。これにより、気泡がチャネルに入るのを防ぎます。新しいソリューションがチャネルに注入されるたびにこの手法を適用します。
- BSA-ビオチンが2時間デバイス内でインキュベートできるようにします。BSAはカバースリップ面に特異的に結合しない(図3A)。
- ピペットの先端を取り外します。チャネルに<10 μLのカゼイン遮断溶液を注入し、30分間インキュベートします。カゼインは自由な部位を遮断し、生体分子の表面への非特異的結合を減少させる(図3B)。
- 先端を取り外し、滅菌1x PBSに溶解した10μg/mLストレプトアビジンの<10 μLをVWF実験用のチャネルに注入します。ラムダDNA実験には100 μg/mLストレプトアビジンを使用します。10分間インキュベートします。ストレプトアビジンはBSA-ビオチンのビオチン基に結合します(図3C)。
- 先端を取り出し、1x洗剤溶液の<10 μL(PBSで0.05%Tween 20)をチャネルに注入して、余分なストレプトアビジンを洗い流します。
- チップを取り出し、ステップ2.3.3から、カゼイン溶液またはラムダDNAで希釈した28.4 nM VWFの<10 μLを注入します。VWFを3分間インキュベートします。
- 先端を取り出し、カゼイン溶液で希釈した5mMフリービオチンの<10 μLを注入します。遊離ビオチンはチャネル表面上の過剰なストレプトアビジン結合部位を遮断します(図3E)。
6. 蛍光顕微鏡によるVWFとラムダDNAの可視化
- 2.2 mMプロトカテクチン酸と37 nMプロトカテキエート-3,4-ジオキシゲナーゼ(光滅を最小限に抑えるため)を用いてカゼインブロッキング溶液の1 mLを調製する。シリンジに積み込み、シリンジポンプで固定します。長さ30cm、内径0.25mmのチューブを取り、シリンジ針に一端を取り付けます。気泡を除去する溶液中の流れ。マイクロ流体デバイスの入口にチューブのもう一方の端を取り付けます。ステップ 5.6 の 3 分後に行うことをお勧めします。
- 全内部反射(TIRF)または共焦点蛍光顕微鏡の最も高い倍率目標(すなわち、60-100X)を選択してください。必要に応じて、その目的に浸漬油のドロップを追加します。マイクロ流体デバイスを顕微鏡のステージに置き、カバースリップが目的と一緒に洗い流されるようにします。
- 明視野顕微鏡を開始します。デブリや気泡などのフィーチャが表示されるように、フォーカスを調整します。次に、マイクロ流体チャネルのエッジが可視になり、フレームを二分化するまで、ステージを X 方向と Y 方向に調整します。
- 488 チャンネル(FITC)に切り替えます。個々の緑、球状分子が区別できるまで、必要に応じてZレベルおよびTIRF角度を調整します。これらは、VWFまたはラムダDNA分子のいずれかである。
- 露光時間とレーザー強度を調整して、蛍光分子をあまりにも早く光色化することなく可視化します。また、より明確に分子を視覚化するためにコントラストを調整します。
- シリンジポンプから流れを開始し、カゼインブロッキング溶液がチャネルに流れ込み、出口から出るようにします。ステップ 5.6 のちょうど 5 分後にこの操作を行います。分子の立体構造の変化を観察するために流れを停止し開始する。流れを適用する場合、5,000~30,000 μL/hの間の速度を使用します。このプロセスを続行して、流れを停止および開始する複数のサイクルで伸び、リラックスできる分子を見つけます。
- 分子が最大伸長に達し、完全に球状にリラックスするのにかかる時間に注意してください。せん断流下の分子の連続挙動のビデオを録画し、最高の露出時間、露出頻度、ビデオの持続時間を選択し、拡張行動の全範囲をキャプチャし、フォトブリーチを最小限に抑えます。
- ビデオを として保存します。スケールバーを持つAVIファイル。
注: ここでプロトコルを一時停止できます。
7. 立体構造変化の画像解析
- 長方形のマイクロ流体流路の
流量 ( Q ) と高さ (h) と幅 (w) を使用して、高さ(Q)に適用される壁せん断速度 ( ) を計算します。次の式を使用してこれを行います。
- カスタマイズされた MATLAB コードを使用して、さまざまなせん断速度での生体分子の長さを決定します (補足ファイルを参照)。次の MATLAB コードを含むビデオ分析というタイトルのフォルダーを作成します: main.m, save_each_frame.m, get_length.mとget_length.fig.ビデオ分析のタイトル付きビデオ内にサブフォルダを作成し、追加します。それに解析されるAVIファイル。
- MATLAB 2019a を使用してmain.mを開き、コードを実行します。コマンド ウィンドウの [分析するデータ ファイルを入力してください] の下に、分析するビデオ ファイルの名前を入力します。
- 開いているグラフィカルユーザーインタフェース(GUI)で、しきい値(ウィンドウ右上のボックス内のテキスト)を20に設定し、[しきい値の設定]ボタンをクリックして確認します。
- ウィンドウの上部のツールバーにあるデータカーソルを使用して、スケールバー上の任意の場所で 1 ピクセルを選択します。ウィンドウの右側にある[縮尺] セクションで [開始点] をクリックします。選択したピクセルの(x,y)位置がボタンの右側に表示されます。ピクセルサイズ(μm)ボタンをクリックします。ピクセル サイズは、各ビデオで 1 回だけ測定する必要があります。
- 目的の分子上の任意のピクセルを選択します。VWFセクションの開始ポイントをクリックします。選択したピクセルの位置が右側のテキストボックスに表示されたら、画像の分子長さを取得するために、左端、右端、文字列の長さをクリックします。
注: このステップは、コードがVWFという特定のセクションを持っているにもかかわらず、生体分子の立体構造の変化を分析するために使用できます。 - 分子の左端と右端を再確認します。データ カーソルを拡大して使用して、目的のピクセル位置を確認します。手動でピクセルを終わりとして選択し、必要に応じて長さ (ピクセル単位) を再計算します。
- ピクセルサイズをμm単位、文字列長をピクセル数でExcelシートに記録し、文字列の長さをμmで計算します。
- すべての画像について上記の手順を繰り返します。GUI の右下隅にあるLastボタン、次へボタンを使用して、同じビデオ ファイル内の画像を切り替えます。[閉じる]をクリックして GUI ウィンドウを閉じます。
流量 ( Q ) と高さ (h) と幅 (w) を使用して、高さ(Q)に適用される壁せん断速度 ( ) を計算します。次の式を使用してこれを行います。
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Representative Results
VWFやラムダDNAなどの生体分子の動的挙動を観察することは、デバイス表面への結合を最適化することに大きく依存しています。マイクロ流体デバイスの推奨時間に対する表面処理のインキュベートは、いくつかのアンカレッジポイントとの結合を得るために重要であり、分子が流れの変化に伴って自由に伸びてリラックスできるようにします。タンパク質またはDNAが複数のリンケージと強く結合しすぎると、限られた長さにまで伸びるか、まったく伸びないかのどちらかになります。これは、特にVWFがフリービオチンブロッキングの前に3分以上デバイス表面に流れずに残っている場合に発生します。VWFが表面に停滞している時間が長ければ長いほど、VWFビオチン群が表面ストレプトアビジン群に結合し、分子が解明する柔軟性が低くなります。分子が弱く結合しすぎると、流れに際して切り離され、視界から消えます。これは、VWFまたはラムダDNAがあまりにも短い期間インキュベートされ、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用が形成されない場合に発生する可能性があります。分子は、非常に高いせん断速度(>200,000 s-1)が適用されると、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用を弱める場合にも、自由に破壊される可能性があります。
理想的な分子は、流れを停止および開始する複数のサイクルで解きほぐしリラックスできる程度に結合します。このような立体構造を変化させる分子の柔軟性は、多くの場合、より高い剪断速度が流れの範囲内で適用されるため、長さを増加させるために拡張する能力によって実証される。TIRF顕微鏡で得られたVWFの画像は、ビデオ1でこの関係を示しています。図4のこの同じVWF分子の伸長対せん断速度曲線は、VWF分子の剪断誘導挙動を正確に捉え、タンパク質の生体力学的特性を特徴付けするのに有用である。共焦点蛍光顕微鏡で得られたラムダDNAの画像は、同様に、ビデオ2およびビデオ3に取り込まれるように、より高い剪断速度および緩やかな緩和に対する伸展の増加を2分にわたって示す。停止流れの後のラムダDNAの反動特性も図5に図示して表している。
図1:蛍光顕微鏡下のマイクロ流体チャネルにおける単分子流動実験の概略図チャネル表面はBSA-ビオチンで被覆され、カゼインでブロックされる。ストレプトアビジンは、チャネル表面上のビオチンと結合し、また表面上の単一分子を固定化するVWF/ラムダDNAをビオチン化します。せん断速度がAからCに増加すると、分子は折り畳まれた状態から左から右への流れ方向に沿って細長い状態に引き伸ばされます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マイクロ流体チャネル寸法PDMSマイクロ流体デバイスの形状および構造は、チャネル寸法とともに示される。チャネルは高さが50 μmで、幅が0.1~1.0mmです。チャネルの中央の狭い領域は、長さが 0.7 mm です。入口および出口は直径0.5144 mm (25 G)である。流れ方向は左から右です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:単一分子固定化のための表面処理工程すべてのステップは室温で発生します。(A).BSA-ビオチンは、2時間(B)の表面にコーティングされています。カゼインは、表面をブロックするために30分間チャネルに注入される。(C).ストレプトアビジンは、BSA-ビオチンと結合するために10分間チャネルでインキュベートされる。(D).前者の工程で過剰な分子を洗い流した後、フルオロフォアおよびビオチン標識VWF/ラムダDNAをチャネルに注入し、ストレプトアビジンとの結合を通じて固定化する。(E)遊離ビオチンが流入し、余分なストレプトアビジン結合部位をブロックして、立体構造変化時の分子との干渉を最小限に抑える。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:剪断流下のVWFの拡張挙動分子は7つの異なるせん断速度で可逆的に解明する:0 s-1、 33,333 s-1、66,667 s-1、100,000 s -1、133,333 s-1、166,667 s -1 および 200,000 s-1 。伸ばされた分子の長さは、0せん断速度で0.52μmから200,000 s-1せん断速度で3.44μmに増加します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:せん断流停止後のラムダDNAの緩和挙動33,000 s-1および 66,667 s-1せん断速度を持つ流れは同じ分子に 0 から 30 s まで適用されます。リラクゼーションは30sから150sまで記録される。66,667 s-1のせん断速度では、DNA分子は15.00μmまで伸び、流れが2分間停止した後、5.83μmまで緩和します。33,333 s-1せん断速度では、分子は8.75μmまでしか伸びず、2分のリラクゼーション後の長さは3.33μmです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:全内反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた剪断速度の増加下におけるVWFの可逆的解明。ビューの真ん中にある分子は、せん断速度33,333 s -1、66,667 s-1、100,000s-1、133,333 s-1で異なる長さに可逆的に解き明かす。シリンジポンプは、せん断速度の計算に使用される流量を制御するために使用されます。流れ方向は左から右です。画像は、完全な緩和と拡張プロセスを可能にするために15s間隔で撮影されます。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
ビデオ2:33,333s-1せん断速度後のラムダDNAの緩和。画像は共焦点蛍光顕微鏡で撮影されます。ラムダDNAは33,333s-1せん断流下で引き伸ばされ、流れが30sで停止した後に折り畳まれた状態に戻ります。画像は、間に30sの間隔で撮影されます。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
ビデオ3:66,667s-1せん断速度後のラムダDNAの緩和。設定は、最初のせん断速度を除き、ビデオ2のものと同じです。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
補足ファイル: MATLAB コード。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この方法で説明したように蛍光顕微鏡を用いて単分子の立体構造変化の高品質なデータを得るためには、適切な時間のために分子をインキュベートし、表面との非特異的相互作用を最小限に抑えることが重要であるそして、フォトブリーチを減らす顕微鏡の設定を確立します。この分子が自由に立体構造を変化させる能力は、分子と表面の間に形成されるビオチン-ストレプトアビジン相互作用の数に関連している。前述のように、これは適切な時間の流れなしに分子をインキュベートすることによって制御されなければならない。さらに、タンパク質またはDNAは、カバースリップが効果的に遮断されない場合、カバースリップに非特異的に結合する可能性がある。推奨ブロッキング溶液がなければ、分子はガラスに非特異的に付着し、適用される流量に反応しない可能性があります。早期表面処理時にカゼインブロックを適用し、流れの間にその存在を維持することは、これらの非特異的相互作用を低減するために不可欠である。最後に、単一分子の連続的で動的な挙動を捕捉するには、画像キャプチャ中に頻繁に蛍光素素興奮が必要です。レーザー強度、露光時間、露光周波数が高すぎると、急速な光の色素化が発生する可能性があります。したがって、これらの設定を並行して調整し、データの時間や画像の解像度を損なうことなく値を小さくする方法を戦略化する必要があります。
分子の伸展および弛緩が観察されない場合は、追加のステップに従う必要があります。プロトコルで推奨されているものよりも長く、短い時間のためにデバイス内の分子をインキュベートします。試験される時間ごとに、BSA-ビオチンおよびストレプトアビジン濃度を10の因子によって変化させます。これらの試験は、分子と表面の間に形成されるビオチン-ストレプトアビジンの位置の数を最適化するために必要な場合があります。例えば、ビオチン標識密度が非常に高い場合、標識プロトコルにおける推奨濃度または試薬からの逸脱に起因して、より短い分子インキュベーション時間および低いBSA-ビオチンおよびストレプトアビジン濃度が必要とされ得る。実験の成功をさらに改善するために、マイクロ流体デバイス全体をスキャンして、可逆的に解き明かす分子を探します。表面はストレプトアビジンまたはカゼインブロックで均一に処理されない可能性があり、特定の領域の分子は他の領域よりも大きな解明応答を有する。
この方法は、分子の大きさとテザリングポイントに関する情報の欠如、0s-1せん断速度の生成困難、蛍光顕微鏡の光学分解能によって制限される。これまでの研究では、VWFの解明挙動に大きなばらつきが示されており、ビオチン・ストレプトアビジン・テザー点の数と位置、および各VWF分子18の分子量の広い分布によって説明される可能性がある。現時点では、私たちが提示する方法は、テザーポイントと分子サイズを定義することはできません。しかし、Wangらによって公開された粗粒のVWFモデルのブラウンダイナミクスシミュレーションは、これらの変数を組み込み、そのような変動18を説明するために実験結果と一緒に実行することができる。さらに、シリンジポンプが停止すると流れが瞬時に止まらず、反動ダイナミクスの観察を混乱させる。これは、意図された流れの期間中のPDMSチャネルの変形およびわずかな拡張に起因する。ポンプが停止すると、PDMSが完全に緩和されるまで流体が流れ続けます。改良されたシステムは、硬質プラスチック材料で製造されたより硬いPDMSまたはマイクロチャネルを使用し、流体がより迅速に0s-1せん断速度に達することを可能にするべきである。最後に、数百ナノメートル以上の大きさの分子のサイズが蛍光顕微鏡の光学分解能と同じ程度の大きさである。したがって、この方法で直接観察できる分子には最小サイズ要件があります。
現在のプロトコルは、主に生理学的流れの下でタンパク質とDNA分子の立体構造変化の定量化に関するものです。しかし、この方法は、生体分子間のリアルタイム相互作用を可視化し、タンパク質とDNA機能をさらに特徴付けるためにも使用できます。例えば、Fuらは、つながれたVWFが高剪断流下で活性化し、更に様々な流量条件下で血小板接着分子GPIbαを捕捉できることを示している17。この結合事象は、VWFがビオチン-ストレプトアビジン結合によって表面に結合している場合でも保存され、生理学的に関連する機能および力学を研究するこのプロトコルの有効性を実証する17。流れ環境21,22で解きほぐされたDNAと調節タンパク質の相互作用を研究しながら、同様の機械論的洞察を得ることができた。また、我々の方法は、主に高分子の立体構造変化を観察することに関するものである。それにもかかわらず、蛍光顕微鏡で解決できるほど大きい小さな分子を研究する目的でそれを適応させることができます。例えば、より大きな固定化されたラムダDNAに低分子を非共有結合または共有結合して結合させることで、小さな分子のせん断感度を高め、その挙動をより容易に観察することができます。結論として、AFMや光学ピンセットのような他の単一分子特性評価法は、高分子の構造的および機能的特性に関する高解像度データを提供する。しかし、これらの代替方法は、このプロトコルに示すように、生理的な流れの環境で起こるタンパク質およびDNAの動的、立体構造変化を観察することができない。
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Disclosures
著者らは競合する利益を宣言していない。
Acknowledgments
この研究は、国立科学財団助成金DMS-1463234、国立衛生研究所助成金HL082808とAI133634、リーハイ大学の内部資金によって部分的にサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
References
- Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
- Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
- LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
- Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
- Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
- Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
- Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
- Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
- Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
- Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
- Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).
- Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
