Summary
Apresentamos um protocolo para imobilizar macromoléculas únicas em dispositivos microfluidos e quantificar mudanças em suas conformações fluxo de cisalhamento. Este protocolo é útil para caracterizar as propriedades biomecânicas e funcionais de biomoléculas, como proteínas e DNA, em um ambiente de fluxo.
Abstract
O comportamento de uma única molécula perturbação mecânica tem sido amplamente caracterizado para entender muitos processos biológicos. No entanto, métodos como microscopia da força atômica têm resolução temporal limitada, enquanto a transferência de energia de ressonância förster (FRET) só permite que conformações sejam inferidas. A microscopia de fluorescência, por outro lado, permite a visualização em tempo real de moléculas únicas em várias condições de fluxo. Nosso protocolo descreve as etapas para capturar alterações conformacionais de biomoléculas únicas em diferentes ambientes de fluxo de cisalhamento usando microscopia de fluorescência. O fluxo de cisalhamento é criado dentro de canais microfluidos e controlado por uma bomba de seringa. Como demonstrações do método, o fator von Willebrand (VWF) e o DNA lambda são rotulados com biotina e fluoroforo e depois imobilizados na superfície do canal. Suas conformações são continuamente monitoradas fluxo de cisalhamento variável utilizando reflexão interna total (TIRF) e microscopia de fluorescência confocal. A dinâmica reversível de desvendar a VWF é útil para entender como sua função é regulada no sangue humano, enquanto a conformação do DNA lambda oferece insights sobre a biofísica das macromoléculas. O protocolo também pode ser amplamente aplicado para estudar o comportamento dos polímeros, especialmente biopolímeros, em condições variadas de fluxo e investigar a reologia de fluidos complexos.
Introduction
Mecanismos de como as biomoléculas respondem a estímulos ambientais têm sido amplamente estudados. Em um ambiente de fluxo em particular, as forças de cisalhamento e alongamento regulam as mudanças conformacionais e potencialmente a função das biomoléculas. Exemplos típicos incluem desvendamento induzido por cisalhamento do DNA lambda e do fator von Willebrand (VWF). O DNA lambda tem sido usado como ferramenta para entender a dinâmica conformação de cadeias de polímeros individuais e flexíveis e a reologia das soluções de polímeros1,2,3,4. VWF é um sensor de fluxo natural que agrega plaquetas em locais de feridas de vasos sanguíneos com taxas de cisalhamento anormal e padrões de fluxo. O desvendamento da VWF é essencial para ativar a vinculação de plaquetas ao domínio A1 e ligação de colágeno ao domínio A3. Além disso, o desdobramento do domínio A2 induzido por cisalhamento permite o decote da VWF, que regula sua distribuição de peso molecular na circulação5,6. Assim, a visualização direta de como essas moléculas se comportam o fluxo pode melhorar muito nossa compreensão fundamental de sua biomecânica e função, que por sua vez podem permitir novas aplicações diagnósticas e terapêuticas.
Metodologias típicas para caracterizar conformações de moléculaúnica incluem pinças ópticas/magnéticas, microscopia de força atômica (AFM) e transferência de energia de ressonância Förster de molécula única (FRET)7. A espectroscopia de força de molécula única é uma poderosa ferramenta para investigar a força e o movimento associados às mudanças conformacionais de biomoléculas. No entanto, não tem a capacidade de mapear conformações moleculares globais8. A AFM é capaz de imagens com alta resolução espacial, mas é limitada na resolução temporal9,10. Além disso, o contato entre a ponta e a amostra pode confundir a resposta induzida pelo fluxo. Outros métodos como a ANÁLISE frete e nanopore determinam o dobrável e desdobramento de proteínas de molécula única com base na detecção de distância molecular e volumes excluídos. No entanto, esses métodos ainda estão em sua infância e limitados em sua observação direta de conformações unimoléculas11,12,13,14.
Por outro lado, observar diretamente macromoléculas com alta resolução temporal e espacial microscopia de fluorescência melhorou nossa compreensão da dinâmica de moléculaúnica em muitos processos biológicos15,16. Por exemplo, Fu et al. recentemente alcançaram visualização simultânea de alongamento VWF e ligação receptor a plaqueta pela primeira vez. Em seu trabalho, as moléculas vwf foram imobilizadas na superfície de um canal microfluido através de interações biotina-streptavidin e imagens reflexão interna total fluorescência (TIRF) microscopia em diferentes ambientes de fluxo de cisalhamento17. Aplicando um método semelhante ao de Fu, demonstramos aqui que conformações de DNA VWF e lambda podem ser observadas diretamente microscopia de fluorescência TIRF e confocal. Como mostrado na Figura 1,dispositivos microfluidos são usados para criar e controlar o fluxo de cisalhamento, e as biomoléculas são imobilizadas na superfície do canal. Após a aplicação de diferentes taxas de cisalhamento, conformações da mesma molécula são registradas para medir o comprimento extensão, também mostrado na Figura 1. O método poderia ser amplamente aplicado para explorar outros comportamentos de polímeros em ambientes de fluxo complexos para estudos reológicos e biológicos.
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Protocol
1. Preparando VWF
- Reconstituir o VWF de plasma humano para prepará-lo para as reações de rotulagem. Adicione 100 μL de água desionizada (DI) a 100 μg de VWF liofilizado para criar uma solução de estoque VWF de 1 mg/mL.
- Dilatar a solução de estoque da VWF para remover o excesso de glicina, aumentando assim a eficiência de rotulagem de biotina e fluorofóforo.
- Transfira 50 μL da solução de estoque da VWF para uma unidade de diálise de 0,1 mL com um corte de peso molecular de 10.000 e vedação com uma tampa. Armazene a solução de estoque restante a -20 °C. As ações da VWF ficarão estáveis por até 1 ano a -20 °C.
- Executar diálise em 500 mL de 1x fosfato estéril tampão de fosfato (PBS) (0,01 M fosfato de sódio, 0,0018 fosfato monopotássio, 0,0027 M cloreto de potássio, 0,137 M cloreto de sódio, pH 7.4 a 25 °C) por 1h a 4 °C com agitação lenta. Repita a diálise por mais uma hora usando 500 mL de PBS fresco.
- Comece a reação de rotulagem de biotina. Prepare uma solução de 2mM de NHS-PEG 4-biotin dissolvendo o sólido na água DI imediatamente antes da reação. Permitir que o NHS-PEG4-biotina permaneça na água por tempo prolongado fará com que o grupo NHS-ester hidresse, diminuindo assim a eficiência da rotulagem.
- Adicione 2,5 μL de 2 mM NHS-PEG4-biotina à unidade de diálise contendo a solução de estoque vwf. Isso resultará em um excesso molar de 20 vezes de biotina em comparação com os monomers vwf. As aminas primárias da VWF reagirão com os grupos NHS-ester, vinculando-se covalentemente aos grupos PEG4-biotinaatravés de ligações de amido.
- Coloque a unidade de diálise dentro de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Selar a unidade de diálise com sua tampa correspondente. Proteja a montagem de diálise com parafilm. Mantenha-se ereto e deixe à temperatura ambiente por 40 min.
- Comece a reação de rotulagem fluoroforre. Prepare uma solução de 2,8 mM de Alexa 488 tetrafluorofife-ester (TFP-ester) corante fluorescente(extremidade máxima de excitação = 498 nm,emissão máxima = 519 nm) dissolvendo o flúor sólido di em água DI. Faça isso imediatamente antes da reação para evitar que o grupo TFP-ester hidrrate.
- Adicione 2,9 μL do fluoroforó de 2,8 mM 488 à unidade de diálise. Isso resultará em um excesso molar de 34 vezes de fluoroforre em comparação com os monomers da VWF. As aminas primárias remanescentes da VWF reagirão com os grupos TFP-ester, ligando covalentemente aos fluoroforreios através de ligações de amido.
- Adicione 2,0 μL de 1 M de bicarbonato de sódio (dissolvido em água DI) à unidade de diálise. Isso ajusta o pH da reação mais perto de 8,0, o que aumenta a eficiência do TFP-ester e da reação primária de amina.
- Proteja a unidade de diálise em um tubo de microcentrífuga, assim como na etapa 1.3.2. Guarde no escuro para evitar fotobranqueamento e deixe à temperatura ambiente por 1h e 30 min.
- Coloque a unidade de diálise em 900 mL de PBS estéreis de 1x e divagação durante a noite a 4 °C. Isso renderá aproximadamente 70 μL de VWF rotulado em uma concentração de 0,71 mg/mL ou 2,84 μM (concentração monomer).
- Transferência rotulada VWF em um tubo de microcentrífuga. Cubra o tubo com papel alumínio e proteja da luz. Loja a 4°C. Para armazenamento a longo prazo, adicione azida de sódio antimicrobiano ao azida de sódio antimicrobiana a uma concentração final de 0,02% (w/v).
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Preparando DNA lambda
- Biotinylate DNA linear lambda preenchendo seus locais finais coesos (cos sites) com nucleotídeos biotina-14-dCTP de acordo com protocolos padrão, repetidos aqui na etapa2.118. Preencha o restante dos sites cos com nucleotídeos dATP, dTTP e dGTP.
- Prepare 1 mM soluções de dATP, dTTP, dGTP e biotina-14-dCTP em um tampão de reação de 10x (cloreto de sódio de 500 mM, hidrocloreto tris de 100 mM, cloreto de magnésio de 100 mM, 10 m dithiothreitol, pH 7,9 a 25 °C).
- Coloque 48 μL de DNA lambda de 500 ng/μL em um tubo PCR e aqueça por 5 min a 65 °C. Os cos locais de DNA de lambda circular se separarão o calor, linearizando a molécula e deixando as saliências de uma única cadeia prontas para a biotinylation. Imediatamente depois, coloque no gelo para evitar que os locais cos reanam.
- Adicione 5 μL de 1 mM dATP, dTTP e dGTP e 4 μL de 1 mM biotina-14-dCTP ao DNA lambda. Adicione também 2,5 μL de 5 U/μL Klenow Fragment (3'à5' exo-) para catalisar a síntese de DNA.
- Incubar a mistura de reação por 1 h a 37 °C.
- Adicione 1,2 μL de 0,5 M EDTA. Em seguida, aqueça a mistura de reação por 5 min a 70 °C. Isso desativará o Fragmento klenow e a reação de biotinylation.
- Remova o excesso de nucleotídeos do DNA lambda usando uma coluna de spin que pode conter 10-70 μL e tem um corte de peso molecular de 6.000.
- Coloque a coluna dentro de um tubo de microcentrífuga de 2 mL. Centrífuga a coluna e o tubo a 1000 x g por 2 min. Descarte o fluxo-through que coleta no tubo.
- Substitua o buffer da coluna por uma solução de 1x do mesmo buffer de reação da etapa 2.1.1. Faça isso adicionando 500 μL de 1x tampão à coluna. Centrífuga por 1 min a 1000 x g. Descarte o fluxo. Repita essas duas vezes mais para que um total de 1500 μL tenha sido adicionado à coluna.
- Coloque a coluna em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione cuidadosamente a solução da etapa 2.1.5 à camada superior da coluna. Centrífuga por 4 min a 1000 x g.
- Colete o fluxo -through (40-70 μL) do tubo de microcentrífuga e coloque em um tubo PCR. Isso contém o DNA de lambda purificado e biotinylado.
- Rotular dNA lambda com corante YOYO-1 fluorescente(extremidade máxima = 490 nm,emissão máxima = 509 nm) de acordo com protocolos padrão, repetido aqui na etapa 2.3.120.
- Prepare uma solução de YOYO-1 dye e DNA lambda com um corante para a razão molar par base de 1:10. Suponha que nenhum DNA tenha sido perdido na etapa de purificação para calcular a concentração de DNA do par base de DNA lambda. O DNA lambda de comprimento completo tem 48.502 pares de base.
NOTA: Por exemplo, se 50 μL de solução foi recuperado da etapa 2.2.4, adicione 7,4 μL de 500 μM YOYO-1 tinante. - Aqueça a solução por 2h a 50 °C no escuro para completar a reação.
- Cubra o tubo com papel alumínio e proteja da luz. Loja a 4°C. A solução está pronta para ser injetada em dispositivos microfluidos.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
- Prepare uma solução de YOYO-1 dye e DNA lambda com um corante para a razão molar par base de 1:10. Suponha que nenhum DNA tenha sido perdido na etapa de purificação para calcular a concentração de DNA do par base de DNA lambda. O DNA lambda de comprimento completo tem 48.502 pares de base.
3. Criar moldes de canais microfluidos em wafer de silício
- Use a fotolitografia para criar canais microfluidos com dimensões apropriadas (Figura 2) em um wafer de silício mestre de acordo com os protocolos padrão19.
4. Preparação do dispositivo microfluido de polimetilexino (PDMS)
- Adicione 5 partes base de elastômero de silicone a 1 peça agente de cura (por massa) em um barco de pesagem. Mexa o conteúdo completamente por 1 min para criar solução PDMS pré-curada.
- Coloque o mestre do wafer de silício em uma placa de Petri de plástico. Despeje a solução PDMS sobre o wafer para criar uma camada de 5 mm. Cubra o prato e deixe em um dessecador vácuo por 1h para remover bolhas de ar.
- Incubar placa de Petri coberta a 60 °C durante a noite para curar PDMS em um sólido flexível. A cura resultará em canais microfluidos moldados no PDMS na interface PDMS-wafer.
- Corte retângulos de 20 x 10 mm no PDMS, em torno de cada canal microfluido, usando uma navalha. Remova os blocos PDMS retangulares com pinças.
- Use uma agulha final de 25 G com bordas afiadas para furar 0,5 mm de diâmetro em uma extremidade do canal, certificando-se de que o buraco passe completamente pelo bloco PDMS(Figura 2). Use uma agulha fina para socar PDMS do buraco. Repita isso do outro lado do canal. Isso criará uma entrada e saída para o fluxo através do canal.
- Limpe a superfície do bloco PDMS com fita de limpeza de vinil. Soprar gás nitrogênio comprimido sobre um deslizamento de cobertura nº 1 1/2, 22 x 50 mm para remover detritos.
- Coloque o bloco PDMS com o lado do canal para cima e o deslizamento de cobertura na câmara de uma máquina de ligação de plasma. Comece o tratamento.
- Quando o tratamento estiver completo, coloque rapidamente o bloco PDMS em um deslizamento de cobertura para que o canal esteja em contato com o deslizamento. Aplique pressão ao longo das bordas do bloco. Coloque o conjunto coverslip-PDMS em uma placa quente a 115 °C por 15 min para reforçar o vínculo permanente.
- Insira tubos de diâmetro interno de 10 cm de comprimento e 0,25 mm no orifício de saída na parte superior do bloco PDMS. Isso permite que o fluido flua facilmente para fora do canal. O dispositivo está completo.
5. Tratando superfície de dispositivo microfluido
- Injetar <10 μL de 10 μg/mL biotinylated trico soro albumin (BSA-biotin) dissolvido em PBS estéreis 1x na entrada de dispositivo microfluido para experimentos VWF. Injetar <10 μL de 1 mg/mL BSA-biotina para experimentos de DNA lambda. Retenha alguns microlitros de BSA-biotina na ponta da pipeta após a injeção e deixe que a ponta permaneça embutida na entrada.
- Mantenha sempre uma gota de água DI ao redor da ponta. Isso impedirá que bolhas de ar entrem no canal. Aplique essa técnica toda vez que uma nova solução é injetada no canal.
- Permita que a BSA-biotina incubar no dispositivo por 2 h. A BSA se ligará especificamente à superfície do deslizamento de cobertura(Figura 3A).
- Remova a ponta da pipeta. Injetar <10 μL de solução de bloqueio de caseína no canal e permitir que ela incuba por 30 min. A caseína bloqueará quaisquer locais livres, reduzindo a ligação não específica de biomoléculas à superfície (Figura 3B).
- Remova a ponta e injete <10 μL de 10 μg/mL streptavidin dissolvido em PBS 1x estéreis no canal para experimentos VWF. Use 100 μg/mL streptavidin para experimentos de DNA lambda. Incubar por 10 min. A streptavidin se ligará aos grupos de biotina da BSA-biotina (Figura 3C).
- Remova a ponta e injete <10 μL de solução de detergente 1x (0,05% Tween 20 em PBS) no canal para lavar o excesso de streptavidin.
- Remova a ponta e injete <10 μL de 28,4 nM VWF diluído na solução de casein ou DNA lambda a partir da etapa 2.3.3. Incubar VWF por 3 min. Incubate lambda DNA por 45 min (Figura 3D).
- Remova a ponta e injete <10 μL de 5 mM de biotina livre diluída na solução de casein. A biotina gratuita bloqueará o excesso de locais de ligação streptavidin na superfície do canal(Figura 3E).
6. Visualização de DNA VWF e Lambda microscopia de fluorescência
- Prepare 1 mL de solução de bloqueio de caseína com 2,2 mM de ácido protocatecônico e protocatechuana toda-3,4 dioxygenase (para minimizar o fotobranquelo). Carregue em uma seringa e segure em uma bomba de seringa. Leve 30 cm de comprimento, tubo de diâmetro interno de 0,25 mm e conecte uma extremidade à agulha de seringa. Flua na solução para remover bolhas de ar. Conecte a outra extremidade do tubo à entrada do dispositivo microfluido. Recomenda-se fazer isso 3 minutos após a etapa 5.6.
- Selecione o maior objetivo de ampliação (ou seja, 60-100X) de uma reflexão interna total (TIRF) ou microscópio de fluorescência confocal. Adicione uma gota de óleo de imersão em seu objetivo, se necessário. Coloque o dispositivo microfluido no palco do microscópio para que o deslizamento de cobertura esteja alinhado com o objetivo.
- Comece microscopia de campo brilhante. Ajuste o foco para que quaisquer características, como detritos e bolhas, sejam visíveis. Em seguida, ajuste o estágio na direção X e Y até que a borda do canal microfluido seja visível e bissecta a moldura.
- Mude para o canal 488 (FITC). Ajuste o ângulo z-nível e TIRF conforme necessário até que moléculas verdes e globulares individuais possam ser distinguidas. Estas são moléculas de DNA VWF ou lambda.
- Ajuste o tempo de exposição e a intensidade do laser para visualizar moléculas fluorescentes sem fotobranque-las muito rapidamente. Ajuste o contraste para também visualizar moléculas com mais clareza.
- Inicie o fluxo da bomba de seringa para que a solução de bloqueio de casein flua para dentro do canal e para fora da tomada. Faça exatamente 5 minutos após o passo 5.6. Pare e inicie o fluxo para observar as mudanças na conformação de moléculas. Ao aplicar o fluxo, as taxas de uso entre 5.000 e 30.000 μL/h. Repita isso em várias áreas do dispositivo microfluido. Continue esse processo para localizar moléculas que podem se estender e relaxar em vários ciclos de parada e início do fluxo.
- Observe quanto tempo leva para as moléculas atingirem a extensão máxima e relaxarem completamente em glóbulos. Grave vídeos do comportamento contínuo das moléculas fluxo de cisalhamento, selecionando o melhor tempo de exposição, frequência de exposição e duração do vídeo que capturará toda a gama de comportamento extensivo e minimizará o fotobranqueamento.
- Salve os vídeos como . Arquivos AVI com uma barra de escala.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
7. Análise de imagem de alterações conformacionais
- Calcule a taxa
de cisalhamento da parede aplicada às macromoléculas usando a taxa de fluxo(Q)e a altura(h) e largura(w)do canal microfluido retangular. Use a seguinte equação para fazê-lo:
- Determine o comprimento de qualquer biomolécula várias taxas de cisalhamento usando um código MATLAB personalizado (ver Arquivos Suplementares). Crie uma análise de vídeos intitulada pasta que inclua os seguintes códigos MATLAB: main.m, save_each_frame.m, get_length.m e get_length.fig. Crie uma subpasta dentro de vídeos de análise de vídeos intitulado vídeos e adicione . Arquivos AVI a serem analisados nele.
- Abra o main.m usando o MATLAB 2019a e execute o código. Digite o nome do arquivo de vídeo a ser analisado na janela de comando em por favor insira o arquivo de dados para analisar:.
- Na interface gráfica aberta do usuário (GUI), definir o limiar (texto na caixa no canto superior direito da janela) para 20 e clicar no botão de limiar set para confirmar.
- Use o cursor de dados na barra de ferramentas superior da janela para escolher um pixel em qualquer lugar na barra de escala. Clique no ponto de partida na seção de barras de escala à direita da janela. A posição (x,y) do pixel escolhido aparecerá à direita do botão. Clique no botão tamanho Pixel (μm). O tamanho do pixel precisa ser medido apenas uma vez em cada vídeo.
- Escolha qualquer pixel na molécula de interesse. Clique no ponto de partida na seção VWF. Após a posição do pixel escolhido aparecer na caixa de texto à direita, clique na extremidade esquerda, extremidade direita e comprimento de string para obter o comprimento molecular na imagem.
NOTA: Esta etapa pode ser usada para analisar as alterações conformaçãois de qualquer biomolécula, apesar do código ter uma seção específica chamada VWF. - Verifique duas vezes a extremidade esquerda e direita da molécula. Amplie e use o cursor de dados para verificar a posição de interesse do pixel. Escolha manualmente o pixel como uma extremidade e recalcule o comprimento (em pixels) quando necessário.
- Grave o tamanho do pixel em μm e comprimento de corda em número de pixel em uma folha excel e calcule o comprimento da corda em μm.
- Repita os passos acima para cada imagem. Use por último, botão Next no canto inferior direito da GUI para alternar entre imagens no mesmo arquivo de vídeo. Clique em Fechar a janela gui.
de cisalhamento da parede aplicada às macromoléculas usando a taxa de fluxo(Q)e a altura(h) e largura(w)do canal microfluido retangular. Use a seguinte equação para fazê-lo:
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Representative Results
Observar o comportamento dinâmico de biomoléculas como VWF e DNA lambda é altamente dependente da otimização de sua ligação com a superfície do dispositivo. A incubação de tratamentos superficiais para os tempos recomendados no dispositivo microfluido é crucial para obter a ligação com alguns pontos de ancoragem, para que as moléculas possam se estender livremente e relaxar ao mudar o fluxo. Se as proteínas ou DNA estiverem muito fortemente ligados a várias ligações, elas se estenderão a comprimentos limitados ou não se estenderão. Isso ocorre particularmente com a VWF quando permanece sem fluxo na superfície do dispositivo por mais de 3 min antes do bloqueio gratuito de biotina. Quanto mais tempo a VWF permanece estagnada na superfície, mais grupos de biotina da VWF se ligam aos grupos de streptavidina superficial e menos flexibilidade a molécula tem que desvendar. Se as moléculas estiverem ligadas muito fracamente, por outro lado, elas se desprenderão ao fluir e desaparecerão da vista. Isso pode ocorrer se o DNA VWF ou lambda for incubado por períodos muito curtos, causando poucas interações biotina-streptavidin a forma. Moléculas também podem se libertar quando taxas de cisalhamento extremamente altas (>200.000 s-1) são aplicadas, enfraquecendo as interações biotina-streptavidina.
Uma molécula ideal se liga a tal ponto que pode desvendar e relaxar em vários ciclos de parada e início do fluxo. A flexibilidade de uma molécula para mudar a conformação como esta é frequentemente demonstrada por sua capacidade de estender-se a comprimentos crescentes à medida que taxas de cisalhamento mais altas são aplicadas dentro de uma gama de fluxo crescente. Imagens da VWF obtidas com microscopia TIRF demonstram essa relação no Vídeo 1. A curva de extensão versus taxa de cisalhamento desta mesma molécula VWF na Figura 4 captura precisamente o comportamento induzido por cisalhamento de uma molécula VWF e é útil para caracterizar as propriedades biomecânicas da proteína. Imagens de DNA lambda obtidas com microscopia de fluorescência confocal mostram igualmente maior extensão sobre taxas de cisalhamento mais altas e relaxamento gradual ao longo de 2 min, como é capturado no Vídeo 2 e Vídeo 3. As características de recuo do DNA lambda após o fluxo interrompido também são graficamente representadas na Figura 5.
Figura 1: Esquemas de fluxo de moléculaúnica experimentam em canal microfluido microscopia de fluorescência. A superfície do canal é revestida com bsa-biotina e bloqueada com caseína. A streptavidina é ligada com biotina na superfície do canal e também biotinylated DNA VWF/lambda para imobilizar moléculas únicas na superfície. À medida que a taxa de cisalhamento aumenta de A para C,a molécula é estendida de um estado dobrado para um estado alongado ao longo da direção de fluxo da esquerda para a direita. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Dimensões microfluidas do canal. A forma e a estrutura do dispositivo microfluido PDMS são mostrados juntamente com as dimensões do canal. O canal tem 50 μm de altura e varia de 0,1 a 1,0 mm de largura. A região de estreitamento no meio do canal tem 0,7 mm de comprimento. A entrada e a tomada têm 0,5144 mm de diâmetro. A direção de fluxo é da esquerda para a direita. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Etapas de tratamento superficial para imobilização de molécula única. Todos os passos ocorrem em temperatura ambiente. (A). BSA-biotina é revestido na superfície por 2 h. (B). Casein é injetado no canal por 30 min para bloquear a superfície. (C). Streptavidin está incubado no canal por 10 min para se ligar com BSA-biotina. (D). Depois de lavar moléculas em excesso nos degraus anteriores, fluorofóbico e biotina rotulado sapateado VWF/lambda DNA é injetado no canal e imobilizado através da ligação com streptavidin. (E). A biotina livre é fluida, bloqueando locais extras de ligação de streptavidin para minimizar sua interferência com a molécula durante as alterações conformacionais. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Comportamento extensivo da VWF fluxo de cisalhamento. A molécula se desenrola reversivelmente a 7 diferentes taxas de cisalhamento: 0 s-1, 33.333 s-1, 66.667 s-1, 100.000 s-1, 133.333 s-1, 166.667 s-1 e 200.000 s-1. O comprimento da molécula esticada aumenta de 0,52 μm a taxa de cisalhamento zero para 3,44 μm a 200.000 s-1 taxa de cisalhamento. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 5: Comportamento de relaxamento do DNA lambda após paradas de fluxo de cisalhamento. O fluxo com 33.000 s-1 e 66.667 s-1 taxas de cisalhamento são aplicados de 0 a 30 s para a mesma molécula. O relaxamento é registrado de 30 a 150 s. Com 66.667 s-1 taxa de cisalhamento, a molécula de DNA se alonga a 15,00 μm e relaxa de volta para 5,83 μm depois que o fluxo foi interrompido por 2 min. Com 33.333 s-1 taxa de cisalhamento, a molécula se estende apenas a 8,75 μm e tem 3,33 μm de comprimento após 2 minutos de relaxamento. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Vídeo 1: Desvendamento reversível da VWF taxas crescentes de cisalhamento usando microscopia total de fluorescência de reflexo interno (TIRF). A molécula no meio da vista se desenrola reversivelmente a diferentes comprimentos a taxas de cisalhamento 33.333 s-1, 66.667 s-1,100.000 s-1 e 133.333 s-1. Uma bomba de seringa é usada para controlar a vazão a partir da qual as taxas de cisalhamento são calculadas. A direção de fluxo é da esquerda para a direita. As imagens são tiradas com intervalos de 15 s para permitir processos completos de relaxamento e extensão. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito de baixar.)
Vídeo 2: Relaxamento do DNA lambda após 33.333 s-1 taxa de cisalhamento. As imagens são tiradas microscopia de fluorescência confocal. O DNA lambda está esticado o fluxo de cisalhamento de 33.333 s-1 e relaxado de volta para um estado dobrado depois que o fluxo é interrompido em 30 s. A duração do relaxamento é de 2 min. A direção de fluxo é da esquerda para a direita. As imagens são tiradas com intervalos de 30 s no meio. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito de baixar.)
Vídeo 3: Relaxamento do DNA lambda após 66.667 s-1 taxa de cisalhamento. As configurações são idênticas às do Video 2, exceto pela taxa inicial de cisalhamento. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito de baixar.)
Arquivos Suplementares: códigos MATLAB. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Para obter dados de alta qualidade de alterações conformais de molécula única usando microscopia de fluorescência como descrito neste método, é fundamental incubar a molécula pela quantidade adequada de tempo, minimizar suas interações inespecíficas com a superfície e estabelecer configurações de microscópio que reduzem o fotobranqueamento. A capacidade da molécula de mudar livremente a conformação está relacionada ao número de interações biotina-streptavidin formada entre a molécula e a superfície. Como mencionado anteriormente, isso deve ser controlado incubando a molécula sem fluxo para a quantidade de tempo apropriada. Além disso, a proteína ou o DNA podem se ligar inespecificamente ao deslizamento de cobertura se o deslizamento de cobertura não for bloqueado efetivamente. Sem a solução de bloqueio recomendada, as moléculas podem se conectar ao vidro sem especificamente e não responder a qualquer taxa de fluxo aplicada. Aplicar o bloqueio de casein durante o tratamento da superfície precoce e manter sua presença durante o fluxo é essencial para reduzir essas interações inespecíficas. Finalmente, capturar o comportamento contínuo e dinâmico de uma única molécula requer excitação fluoroforre frequente durante a captura de imagem. Isso pode causar fotobranqueamento rápido se a intensidade do laser, o tempo de exposição e a frequência de exposição forem muito altos. Por isso, é necessário ajustar essas configurações em conjunto e estratégias de como reduzir seus valores sem comprometer o tempo ou resolução de imagem dos dados.
Se a extensão e relaxamento da molécula não forem observadas, medidas adicionais devem ser seguidas. Incubar a molécula no dispositivo por tempos mais longos e curtos do que o que é aconselhado no protocolo. Para cada vez que é testado, varie as concentrações de biotina e streptavidin bsa por fatores de 10. Esses testes podem ser necessários para otimizar o número de pontos de ancoragem biotina-streptavidin formados entre a molécula e a superfície. Por exemplo, se a densidade de rotulagem de biotina for muito alta, devido a desvios das concentrações recomendadas ou reagentes no protocolo de rotulagem, menor tempo de incubação molecular e concentrações de biotina e streptavidin inferior podem ser necessárias. Para melhorar ainda mais o sucesso do experimento, escaneie todo o dispositivo microfluido para moléculas que se desenrolam reversivelmente. A superfície não pode ser tratada uniformemente com streptavidin ou bloco de caseína, fazendo com que moléculas em determinadas áreas tenham respostas maiores desvendadas do que outras.
Este método é limitado pela falta de informações sobre o tamanho e os pontos de amarração da molécula, a dificuldade em produzir 0 s-1 taxa de cisalhamento e a resolução óptica de microscópios de fluorescência. Trabalhos anteriores mostraram uma grande variação no comportamento desvendado da VWF, potencialmente explicado pela ampla distribuição no número e localização de pontos de corda biotina-streptavidin e o peso molecular de cada molécula VWF18. No momento, o método que apresentamos não pode definir pontos de corda e tamanho molecular. No entanto, simulações dinâmicas brownianas de um modelo VWF de grãos grossos publicados por Wang et al. incorporam essas variáveis e podem ser executadas juntamente com descobertas experimentais para explicar tal variação18. Além disso, o fluxo não para instantaneamente quando a bomba de seringa é interrompida, confundindo a observação da dinâmica de recuo. Isso se deve à deformação e leve dilatação do canal PDMS durante o período de fluxo pretendido. Quando a bomba é parada, o fluido continua a fluir até que o PDMS esteja totalmente relaxado. Um sistema melhorado deve usar PDMS mais rígido ou microcanais fabricados em materiais plásticos duros, permitindo que o fluido atinja uma taxa de cisalhamento 0 s-1 mais rapidamente. Finalmente, só se pode resolver moléculas cujo tamanho está na mesma ordem de magnitude que a resolução óptica do microscópio de fluorescência, que pode não ser menor do que algumas centenas de nanômetros. Assim, há um requisito de tamanho mínimo para as moléculas que podem ser diretamente observados com este método.
O protocolo atual diz respeito principalmente à quantificação das alterações conformacionais de proteínas e moléculas de DNA fluxo fisiológico. No entanto, o método também pode ser usado para visualizar interações em tempo real entre moléculas biológicas e caracterizar ainda mais a função proteína e DNA. Por exemplo, Fu et al. mostraram que o VWF amarrado pode ativar alto fluxo de cisalhamento e capturar ainda mais a molécula de adesão de plaquetas GPIbα condições de fluxo variadas17. Este evento vinculante é preservado mesmo quando a VWF é vinculada à superfície por ligações biotina-streptavidin, demonstrando a eficácia deste protocolo para estudar funções fisiologicamente relevantes e mecânica17. Insights mecanicistas semelhantes poderiam ser obtidos enquanto estudavam as interações entre DNA desvendado e proteínas regulatórias em ambientes de fluxo21,22. Além disso, nosso método diz respeito principalmente à observação de alterações conformacionais em macromoléculas. No entanto, pode-se adaptá-lo com o propósito de estudar moléculas menores que são grandes o suficiente para serem resolvidas microscopia de fluorescência. Por exemplo, ao anexar não valenteou ou covalentemente uma pequena molécula a um DNA de lambda muito maior e imobilizado, pode-se aumentar a sensibilidade de cisalhamento da molécula menor e observar mais facilmente seu comportamento. Em conclusão, outros métodos de caracterização de moléculaúnica, como AFM ou pinças ópticas, fornecem dados de alta resolução sobre as propriedades estruturais e funcionais das macromoléculas; no entanto, esses métodos alternativos não podem observar as mudanças dinâmicas e conformais de proteínas e DNA que ocorrem em um ambiente de fluxo fisiológico, como é apresentado neste protocolo.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte por uma Fundação Nacional de Ciência sacada dMS-1463234, Institutos Nacionais de Saúde concede HL082808 e AI133634, e financiamento interno da Universidade Lehigh.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
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