Summary
ここで提示するプロトコルは、皮質腎臓抽出物調製および全タンパク質正常化を利用して、哺乳動物腎臓における血管内皮成長因子と黄体形成ホルモンとの相関関係を実証するためのプロトコルである。
Abstract
血管内皮増殖因子(VEGF)は、腎臓の血管新生および血管透過性を制御するのに役立つ。糖尿病性腎症などの腎疾患は、腎臓におけるVEGF調節不全と関連している。腎臓の生理学的条件下でVEGFを支配する因子はよく理解されていません。前血管新生ホルモンである黄体形成ホルモン(LH)は、生殖器官の生理学的VEGF発現を調節するのに役立ちます。LH受容体が腎臓に見つかっていることを考えると、私たちは、ジーチック研究所で、LHも腎臓のVEGF発現を調節するのに役立つと仮定しています。証拠を提供するために、我々はLHレベルが哺乳動物腎臓のVEGFレベルを予測できることを示すことを目的とした。腎臓を含むほとんどのVEGF関連の調査は、モデルとして低次哺乳動物(すなわち、げっ歯類とウサギ)を使用しています。この研究を人体に翻訳するために、高次哺乳動物(ウシとブタモデル)におけるVEGFとLHの関係を調べることにした。このプロトコルは、腎皮質からの総タンパク質リサートを使用します。この方法の成功の鍵は、死後すぐに食肉処理場の動物からの腎臓の調達だけでなく、総タンパク質による検体レベル(腎臓抽出物中)の正常化が含まれます。この研究は、ウシとブタの両方の腎臓におけるLHとVEGFの間の有意な線形関係を示すに成功した。結果は2つの異なる種で再現可能である。この研究は、牛や豚からの腎臓抽出物の使用が、特にVEGFと他のアナライトとの相関関係を調べるために、腎生理学の研究のための優れた、経済的、豊富な資源であることを支持する証拠を提供する。
Introduction
血管内皮増殖因子A(VEGF-A)は、腎臓および他の器官1、2における血管新生および血管透過性を調節するのに役立つ(以下、VEGF−AはVEGFと呼ばれる)。腎臓のVEGFレベルは、厳格な恒静制御下にある。腎VEGFレベルが上昇または抑制されると、腎臓が機能不全を起こす可能性があります。例えば、出生後3週間以内に、VEGFに対するポドサイト特異的ヘテロ接合性を有するマウスは、子宮内皮症および無血球体(すなわち、ヒト子癇前症に見られる腎病変)を発症し、そして最終段階の腎不全は生後3ヶ月までにこれらのヘテロジゴスで起こる。ポドサイト特異的ホモ接合性ノックアウトは、生後1日以内に水腫および腎不全で死亡する3,4.
一方、腎VEGFの過剰発現は、タンパク尿および糸球体肥大3、4を引き起こす。例えば、VEGFを過剰発現するトランスジェニックウサギは、腎症の初期段階で糸球体濾過率の増加を伴う進行性タンパク尿を示し、続いて後の段階3で糸球体濾過率の低下を示す。糖尿病成人における末期腎疾患の主な原因である糖尿病性腎症は、VEGF調節不全2、5に強く関連している。病理学的条件下でVEGF発現を誘導する際の低酸素症の役割に多大な注意が払われている5.しかしながら、生理学的条件下でVEGFを支配する因子(腎臓および他の器官の両方)は、よく理解されていない2、6。生理学的および病理学的VEGF調節に関与するこれらの因子(酸素を除く)を同定することは重要な取り組みである。
前血管新生ホルモンである黄体形成ホルモン(LH)は、卵巣および精巣7、8などの生殖器官における生理学的VEGF発現を調節するのに役立つ。以前の研究は、LHはまた、目6、9、10などの非生殖器官のVEGFを調節するのに役立つという証拠を提供しています。LH受容体は、腎臓11、12の髄質および皮質に見られる。なお、腎尿細管上皮細胞は、LH受容体と同様に、VEGF11、12、13、14を発現する。これら2つの観察を一緒に取り、我々はLHが腎臓13、14のVEGF発現を調節するのにも役立つと仮定した。このLH/VEGF関係の証拠を提供するために、提示されたプロトコルは、LHレベルが腎臓のVEGFレベルを予測できることを示すことを目的としています。腎臓に関する多くの以前のVEGF関連の調査は、低次哺乳動物モデル(すなわち、げっ歯類およびウサギ)2を使用している。この研究を人体に翻訳するために、この研究は、高次哺乳動物(ここでは、ウシとブタモデル)におけるVEGFとLHの関係を調べる。この目的を遂行するために、ウシおよびブタ腎臓の皮質領域から総タンパク質リサートを調製した。
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Protocol
この研究には生きた動物や実験動物は使われなかった。
1. 組織の取り扱い
- アバトワールからの殺処分直後にウシとブタの全腎臓を調達する。実験室への氷の上の輸送。
- 実験室に到着すると、50 mLの氷冷リン酸緩衝生理食塩酸(PBS)で腎臓をすすすします。血液を完全に除去するには、この手順 2x を繰り返します。
- さらに抽出するまで、腎臓を氷の上に置く(または冷蔵する)。
2. 腎臓の解剖
- 無菌のはさみ、鉗子、ナイフ、ペトリ皿を使用して腎臓を解剖し、必要な組織部分を切除します。
- 腎解剖の前にRIPAリシスバッファーを準備します。5 mM NaCl、0.5 M EDTA、1 M トリス(pH = 8.0)、NP-40(ID + GEPAL CA-630)、10%デオキシコール酸ナトリウム、および10%SDSを二重蒸留水に溶解し、十分に混合します。使用しないときはRIPAリシス緩衝液を冷蔵する。
- 腎臓をゆっくりと半分に切り(矢状面)、腎臓の中央の皮質領域(湿った重量で80〜100mgの重量)から組織(50-70 mm2)を切った。
- 組織ブロックをナイフで細かく刻み、均質化プロセスを支援します。
- 組織をミンチした後、1mLの氷冷1x RIPAリシス抽出バッファーを用いてマイクロフュージチューブに移す。さらに抽出するまでチューブを氷の中に置きます。
3. 組織均質化
- マイクロフュージチューブに、組織上清の収集のための特定のサンプルの詳細をラベル付けします。
- 滅菌プローブでハンドヘルドホモジナイザーを使用し、組織の塊が見えなくなるまで、寒い条件(アイスバケツ上のサンプル)で1〜2分間組織を均質化します。
- 冷蔵遠心分離機中の遠心分離のために組織抽出物を直ちに被験者し、4°Cで5分間9,600 x gである。
- 遠心分離機からチューブを取り出し、アイスバケツの上に置きます。
- 新しいラベル付きマイクロフュージチューブに上清を収集し、氷の上に保存します。ペレットを捨てます。
- LHおよびVEGF-A酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)および総タンパク質分析のための上清の別々のアリコートをそれぞれ調製し、凍結融解サイクルを回避します。
4. 牛と豚 LH ELISA アッセイ
- 市販の黄体形成ホルモン(LH)ELISAキットに含まれるすべてのELISAアッセイ成分を2~8°Cで保管してください(材料表を参照)。これには、抗体、HRP-コンジュゲート、アッセイプレート(96ウェル)、キャリブレータ、洗浄緩衝液(20x濃縮物)、基板A、基板B、および停止溶液が含まれる。製造元の指示に従ってすべての試薬を準備します。
- アッセイを開始する前に、すべての試薬とアッセイプレートを室温(RT)に持ち込みます。アッセイ、シール、未使用の井戸の使用に必要な数の井戸を使用し、使用するまで4°Cに保ちます。
- 洗浄バッファー(20x濃縮物の15 mL)を二重蒸留水で300mLに希釈する
- 解決策なしで空白の井戸を設定します。
- 各ウェルに50μLの標準またはサンプルを加え(n =2)、さらに50μLのホースラディッシュペルオキシダーゼ(hrp)コンジュゲートを各ウェルに加えます。直ちに各ウェルにさらに50μLの抗体溶液を加えます。プレートを密封し、よく混ぜ、37°Cで1時間インキュベートします。
- 1x洗浄バッファー(200°L/ウェル)で井戸を洗浄し、4xを繰り返します。
- 基板Aの50μLと基板Bの50°Lをそれぞれウェルに加え、側面のプレートを軽くタップしてよく混ぜます。プレートを密封し、暗闇の中で37°Cで15分間インキュベートします。
- 各ウェルに50μLのストップ溶液を加え、プレートを軽くタップし、450nm波長に設定された分光光度計を使用してプレートを読み取ります。
- ウシとブタのLHレベルを総タンパク質に正規化します(セクション6を参照)。
5. 牛と豚 VEGF-A ELISA アッセイ
- 市販の血管内皮成長因子-A ELISAキットに含まれるすべてのELISAアッセイ成分を2〜8°Cで保管してください(材料表を参照)。これには、抗体、HRP-コンジュゲート、アッセイプレート(96ウェル)、キャリブレータ、洗浄緩衝液(20x濃縮物)、基板A、基板B、および停止溶液が含まれる。製造元の指示に従ってすべての試薬を準備します。
- アッセイを開始する前に、すべての試薬とアッセイプレートをRTに持ち込み、アッセイに必要な数の井戸を使用し、シールし、使用するまで未使用のウェルを4°Cに保ちます。
- 洗浄バッファー(20x濃縮物の15 mL)を二重蒸留水で300mLに希釈する
- 各ウェルに標準またはサンプルの100 μLを追加します(n = 2)。プレートを密封し、よく混ぜ、37°Cで2時間インキュベートします。
- 各ウェルの液体を取り出し、検出試薬Aの100°Lを各ウェルに加え、プレートを密封し、37°Cで1時間インキュベートします。
- 1x洗浄バッファー(400°L/ウェル)で井戸を洗浄し、4xを繰り返します。
- 検出試薬Bを100μLずつよく加え、側面のプレートを軽くタップしてよく混ぜます。プレートを密封し、37°Cで1時間プレートをインキュベートします。
- 1x洗浄バッファー(400°L/ウェル)で井戸を洗浄し、4xを繰り返します。
- 90μLの基板溶液を各ウェルに加え、プレートを軽くタップし、37°Cで1時間インキュベートします。
- 各ウェルに50μLのストップ溶液を加え、プレートを軽くタップし、450nm波長に設定された分光光度計を使用してプレートを読み取ります。
- ウシとブタVEGF-Aレベルを総タンパク質に正規化する(セクション6)。
6. 総タンパク質推定
- メーカーの推奨事項に従って、市販のキット(材料表を参照)を使用して、標準ウシ血清アルブミン(BSA)アッセイによるウシおよびブタ腎臓抽出物の総タンパク質を推定します。
7. 統計分析
- 各検検の平均、中央値、標準偏差を計算します。
- コルモゴロフ・スミルノフ検定を利用した通常のサンプル分布の発散をテストし、使用時にパラメトリックと.ノンパラメトリック統計検定。データが正規分布している場合は、パラメトリック検定を使用して統計的検定を実行します。
- 適切な状況 (正規データ分布など) では、回帰モデルを使用して LH と VEGF-A の間の線形関係を調べます。
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Representative Results
動物の種類および性別によるLHおよびVEGFの平均および中央値レベルを表1に示す。コルモゴロフ・スミルノフ法線検定によるデータの正規性を検証した後、線形回帰モデルを利用してLHとVEGFの関係を調べた。LHは、牛と豚の腎臓の両方でVEGFの強力かつ有意な予測変数であることが判明しました(ウシ腎臓モデル:n =7、R2 =0.86、p = 0.002;豚腎臓モデル:n = 7;R2 = 0.66、p = 0.025)。
LH/VEGF線形関係を図1(ウシ回帰モデル)と図2(豚回帰モデル)に示す。牛の線形方程式は次のとおりです: VEGF レベル = 2.156 x LH レベル + 68.75.ブタ線形方程式は次のとおりです: VEGF レベル = 196.7 x LH レベル + 47.94.
| サンプルの種類 | 男性 | 女性 | すべての |
| 牛腎臓 | n = 4 | n = 3 | n = 7 |
| LH (mIU/mg 総タンパク質) | 平均: 27.47 (SD 13.3) | 平均: 19.5 (SD 2.1) | 平均: 24.06 (SD 10.8) |
| 中央値: 25.7 | 中央値: 19.9 | 中央値: 19.9 | |
| VEGF (pg/mg 総タンパク質) | 平均: 126.2 (SD 25.8) | 平均: 106.0 (SD 14.5) | 平均: 120.6 (SD 25.1) |
| 中央値: 131.6 | 中央値: 103.5 | 中央値: 110.8 | |
| 豚腎臓 | n = 4 | n = 3 | n = 7 |
| LH (mIU/mg 総タンパク質) | 平均: 13.2 (SD 3.6) | 平均: 12.3 (SD 5.5) | 平均: 12.8 (SD 4.5) |
| 中央値: 13.6 | 中央値: 10.3 | 中央値: 11.2 | |
| VEGF (pg/mg 総タンパク質) | 平均: 2987.2 (SD 772.5) | 平均: 2354.1 (SD 932.4) | 平均: 2715.9 (SD 901.0) |
| 中央値: 3324.67 | 中央値: 2377.3 | 中央値: 3226.4 |
表1:動物の種類および性別別のLHおよびVEGFレベルの平均および中央値。
図1:成人ウシ腎臓におけるLH/VEGF線形関係(n=7)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:成人豚腎におけるLH/VEGF線形関係(n=7)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
動物の死の直後にアバトワールから腎臓を調達することは、この方法論の成功の鍵です。これは、人間の死体の代わりに牛や豚からの臓器を利用する主な利点です。通常、死亡時からヒトの死体器官が調達されるまで、少なくとも12〜24時間の遅延がある。身体器官の化学組成は2時間後の死後15、16内で有意に変化するので、ヒト死体腎におけるVEGF研究は実際の状況を反映しない可能性がある。このプロトコルは、抽出後の氷上の動物器官の即時調達と配置の重要性を大きく強調しているが、他の研究者もこのステップを優先するかどうかは分かっていない。例えば、最近の研究の方法論セクション(抗生物質残基の検出のためにウシおよびブタ腎臓を利用する)は、動物の死と臓器17の調達/冷凍との間の時間遅延を指定しなかった。
本研究では、市販の種特異的ELISを用いて目的の測定値(VEGFおよびLH)を測定する。ELISAは非常に敏感で、アッセイを簡単に実行でき、堅牢な結果を生み出します。プロトコルの重要なステップは、総タンパク質による(ELISA測定)検体レベルの正規化です。皮質腎臓抽出物は、非常に異種の生物学的物質です。この点に照らして、動物間で検光レベルを比較できるように補正因子が不可欠です。このように、全タンパク質によって正規化が行われ、我々および他の人が同様に9、19、20の方法で他の異種生体物質(すなわち、尿、乾燥した血液斑、および静脈液)を正常に正規化したからである。
以前の研究は、ブドウ液中のLHとVEGFの間の相関関係(ウシとブタの目から)は、総タンパク質6によって正常化した後にのみ現れることを示した。重要なことに、この正規化ステップは、特にELISAアッセイを含むもので、公開されたVEGF研究で頻繁に省略される。代わりに、VEGFレベルは、多くの場合、1ミリリットル当たりのピコグラムなどの単位で表されます(そして、総タンパク質のミリグラム当たりのピコグラムとしてではありません)。例えば、9つの異なるELISA試験における静脈VEGF測定値(vitreous VEGFレビュー記事に含まれていた)は、任意の補正方法21、22によって正規化されなかった。ELISA研究におけるVEGF正規化のこの欠如は、VEGFがまだ有効なバイオマーカー21、22として検証されていない理由を部分的に説明するかもしれない。
代表的なデータの限られたサンプルサイズ(ウシ、n =7;ブタ、n =7)にもかかわらず、このプロトコルは、ウシとブタ腎臓の両方でLHとVEGFの間の強く、有意な線形関係を示しています。とはいえ、性別に合わせて調整された多変量解析を行うのに十分な大きさのサンプルサイズはありませんでした。このような分析を実行できるように、より大きなサンプルサイズでこの研究を繰り返す予定です。それにもかかわらず、提示された結果は、哺乳動物腎臓におけるLHとVEGFとの潜在的な関連性を支持する。
この研究は、腎臓におけるVEGFの恒静調節の理解をさらに助けると期待される。この方法論の質と知見の堅牢性の両方が、2つの異なる種における結果の再現性によって示される。肉の生産のために運命づけられた動物は健康であるため、食肉処理場の動物からの腎臓抽出物の使用は、主に生理学を研究するためのものです。しかし、彼らの器官は、彼らの使用の主な制限である病理学を研究するのにあまり役に立ちません。全体として、牛や豚からの腎抽出物の使用は、正常な成人腎臓の研究のための優れた、経済的、豊富なリソースです。最後に、このプロトコルは、特にVEGFと他の分析物との相関関係を調べる場合に、正規化のために総タンパク質を利用する有効性を実証する。
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Disclosures
ジエットチック研究所(ZRI)は民間(営利目的)の研究機関であり、タミー・モフサス博士(ZRIの創設者兼ディレクター)は、眼疾患の治療にゴナドトロピン拮抗薬を使用するための保留中の特許出願と検証済みの特許を持っていますそして糖尿病。ZRIの従業員(生化学者)であること以外に、A.ムトゥサミー博士は報告する他の財政的な矛盾はありません。A. アリバラガン(ZRIのサマーインターン、ミシガン大学の学部生)は、報告する他の財政的な矛盾はありません。
Acknowledgments
著者らは、牛と豚の腎臓を提供したショルのスローターハウス(ブリスフィールド、MI)に感謝します。この研究には助成金は使われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
References
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