Summary
Presentato qui è un protocollo per l'utilizzo di una preparazione di estratto di rene corticale e la normalizzazione totale delle proteine per dimostrare la correlazione tra fattore di crescita endoteliale vascolare e ormone luteinizzante nel rene dei mammiferi.
Abstract
Fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) aiuta a controllare l'angiogenesi e la permeabilità vascolare nel rene. Disturbi renali, come la nefropatia diabetica, sono associati con la disregolazione VEGF nel rene. I fattori che governano il VEGF in condizioni fisiologiche nel rene non sono ben compresi. L'ormone luteinizzante (LH), un ormone pro-angiogenico, aiuta a regolare l'espressione fisiologica VEGF negli organi riproduttivi. Dato che i recettori LH si trovano nel rene, noi, presso l'Istituto di ricerca di zietchick, abbiamo ipotizzato qui che LH aiuta anche a regolare l'espressione VEGF nel rene pure. Per fornire prove, abbiamo cercato di dimostrare che i livelli di LH sono in grado di prevedere i livelli di VEGF nel rene dei mammiferi. La maggior parte delle indagini relative al VEGF che coinvolgono il rene hanno utilizzato come modelli mammiferi di ordine inferiore (ad esempio, roditori e conigli). Per tradurre questo lavoro nel corpo umano, si è deciso di esaminare la relazione tra VEGF e LH nei mammiferi di ordine superiore (ad esempio, modelli bovini e suini). Questo protocollo utilizza la proteina totale lisato dalla corteccia renale. Le chiavi del successo di questo metodo includono l'approvvigionamento di reni da animali da macello subito dopo la morte, nonché la normalizzazione dei livelli di analita (nell'estratto renale) per proteina totale. Questo studio dimostra con successo una relazione lineare significativa tra LH e VEGF nei reni bovini e porcili. I risultati sono riproducibili in due specie diverse. Lo studio fornisce prove a sostegno che l'uso di estratti renali da mucche e maiali sono una risorsa eccellente, economica e abbondante per lo studio della fisiologia renale, in particolare per esaminare la correlazione tra VEGF e altri analiti.
Introduction
Fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGF-A), aiuta a regolare l'angiogenesi e la permeabilità vascolare nel rene e in altri organi1,2 (qui di seguito, VEGF-A sarà indicato come VEGF). I livelli di VEGF nel rene sono sotto stretto controllo omeostatico. Quando i livelli di VEGF renale sono elevati o depressi, il rene può non funzionare correttamente. Ad esempio, entro 3 settimane dalla nascita, i topi con eterozigosità specifica podocite per il VEGF sviluppano endoteliosi e glomeruli senza sangue (cioè lesioni renali osservate nella preeclampsia umana), e il rene di insufficienza allo stadio finale si verifica in queste eterozigoti entro i 3 mesi di età. Knockout omozigotici specifici per podociti muoiono per idropi e insufficienza renale entro 1 giorno dalla nascita3,4.
D'altra parte, la sovraespressione del VEGF renale provoca proteinuria e ipertrofia glomerare3,4. Ad esempio, i conigli transgenici che sovraesprimono il VEGF presentano proteinuria progressiva con tassi di filtrazione glomerale aumentati nelle prime fasi della nefropatia, seguiti da tassi di filtrazione glomerale in diminuzione nelle fasi successive3. La nefropatia diabetica, una delle principali cause di malattia renale allo stadio finale negli adulti diabetici, è fortemente associata alla disregolazione VEGF2,5. È stata prestata molta attenzione al ruolo dell'ipossia nell'indurre l'espressione del VEGF in condizioni patologiche5. Tuttavia, i fattori che regolano il VEGF in condizioni fisiologiche (sia nel rene che in altri organi) non sono ben compresi2,6. Identificare questi fattori (ad eccezione dell'ossigeno) che sono coinvolti nella regolazione del VEGF fisiologico e patologico è un'impresa importante.
Ormone luteinizzante (LH), un ormone pro-angiogenico, aiuta a regolare l'espressione fisiologica VEGF in organi riproduttivi come l'ovaio e il testire7,8. Studi precedenti hanno fornito prove che LH aiuta anche a regolare il VEGF negli organi non riproduttivi, come gli occhi6,9,10. I recettori LH si trovano nella medulla e nella corteccia delrene 11,12. Da notare, le cellule epiteliali tubolari renali, così come il recettore LH, esprimono VEGF11,12,13,14. Prendendo insieme queste due osservazioni, abbiamo ipotizzato che LH aiuta anche a regolare l'espressione VEGF nel rene13,14. Per fornire la prova di questa relazione LH/VEGF, il protocollo presentato mira a dimostrare che i livelli di LH sono in grado di prevedere i livelli di VEGF nel rene. Molte precedenti indagini relative al VEGF che hanno coinvolto il rene hanno utilizzato modelli di mammiferi di ordine inferiore (ad esempio, roditori e conigli)2. Per tradurre questo lavoro nel corpo umano, lo studio esamina la relazione tra VEGF e LH nei mammiferi di ordine superiore (qui, modelli bovini e porcino). Per raggiungere questo obiettivo, il lisato proteico totale è stato preparato dalla regione della corteccia dei reni bovini e porcili.
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Protocol
Per questo studio non sono stati utilizzati animali vivi o sperimentali.
1. Manipolazione dei tessuti
- Procurarsi reni interi bovini e porcini subito dopo la macellazione da un mattatoio. Trasporto su ghiaccio al laboratorio.
- All'arrivo in laboratorio, risciacquare i reni con 50 mL di fosfato freddo ghiaccio tamponato salina (PBS). Ripetere questo passaggio 2x per rimuovere completamente il sangue.
- Conservare i reni sul ghiaccio (o refrigerati) fino a un'ulteriore estrazione.
2. Dissezione dei reni
- Utilizzare forbici sterili, pinze, un coltello e piatti Petri per sezionare i reni e accisa la porzione di tessuto richiesta.
- Preparare il buffer di lisi RIPA prima della dissezione renale. Sciogliere 5 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 M Tris (pH - 8,0), NP-40 (ID - GEPAL CA-630), 10% deossicolato di sodio e 10% SDS in acqua a doppio distillato, quindi mescolare accuratamente. Conservare il buffer di lisi RIPA quando non è in uso.
- Tagliare delicatamente il rene a metà (piano sagittale) e tagliare un pezzo di tessuto (50-70 mm2) dalla regione della corteccia al centro del rene (che pesa 80-100 mg dal peso bagnato).
- Mitare il blocco di tessuto in piccoli pezzi con un coltello per assistere il processo di omogeneizzazione.
- Dopo aver maciampato i tessuti, trasferirli in un tubo di microfuge con 1 mL di 11 tampone di estrazione lisi RIPA a freddo ghiaccio. Mettere i tubi nel ghiaccio fino a un'ulteriore estrazione.
3. Omogeneizzazione dei tessuti
- Etichettare i tubi di microfuge con dettagli campione specifici per la raccolta dei supernatali dei tessuti.
- Utilizzando un omogeneizzatore portatile con una sonda sterile, quindi omogeneizzare i tessuti per 1-2 min in condizioni di freddo (campioni su secchio di ghiaccio) fino a quando non sono visibili pezzi di tessuti.
- Sottoporre immediatamente l'estrazione del tessuto per la centrifugazione nella centrifuga refrigerata a 9.600 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
- Rimuovere i tubi dalla centrifuga e metterli sul secchio di ghiaccio.
- Raccogliere il supernatante in un nuovo tubo di microfuge etichettato e conservare sul ghiaccio. Scartare il pellet.
- Preparare aliquote separate dei supernatanti per i saggi immunosorbenti collegati agli enzimi LH e VEGF-A (ELISA) e l'analisi totale delle proteine, rispettivamente, per evitare cicli di congelamento-scongelamento.
4. Bovino e Porcine LH ELISA Assay
- Conservare tutti i componenti di test ELISA inclusi nel kit ELISA (indice uluttivo) disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali)a 2-8 gradi centigradi. Questo include l'anticorpo, HRP-coniugato, piastra di analisi (96 bene), calibratori, buffer di lavaggio (20x concentrato), substrato A, substrato B, e soluzione di arresto. Preparare tutti i reagenti come raccomandato dalle istruzioni del produttore.
- Prima di iniziare il test, portare tutti i reagenti e la piastra di saggio a temperatura ambiente (RT). Utilizzare il numero richiesto di pozze per il saggio, sigillare e mantenere i pozzi inutilizzati a 4 gradi centigradi fino all'uso.
- Diluire il buffer di lavaggio (15 mL di 20x concentrato) a 300 mL con acqua a doppia distillazione
- Impostare i pozzi vuoti senza alcuna soluzione.
- Aggiungete 50 l di standard o di campione in ogni pozzetto (n ) quindi aggiungete altri 50 di rafano perossidasi (hrp) - coniugato ad ogni pozzo. Aggiungere immediatamente altri 50 gradi di soluzione anticorpale ad ogni pozzo. Sigillare la piastra, mescolare bene e incubare per 1 h a 37 gradi centigradi.
- Lavare i pozzi con 1x tampone di lavaggio (200 gradi centigradi) e ripetere 4x.
- Aggiungete 50 - L di substrato A e 50 luna di substrato B ad ogni pozzo, e mescolate bene toccando delicatamente la piastra sul lato. Sigillare la piastra e incubare per 15 min a 37 gradi centigradi al buio per 15 min.
- Aggiungere 50 -L di soluzione di arresto ad ogni pozzo, toccare delicatamente la piastra e leggere la piastra utilizzando lo spettrofotometro impostato su una lunghezza d'onda di 450 nm.
- Normalizzare i livelli di LH bovini e porci (centrano i livelli di Bovini e Porcine alle proteine totali" (cfr. sezione 6).
5. Saggio di eLISA di bovini e porcini
- Conservare tutti i componenti di analisi ELISA inclusi nei kit ENDOthelial Growth Factor-A ELISA disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali)a 2-8 gradi centigradi. Questo include l'anticorpo, HRP-coniugato, piastra di analisi (96 bene), calibratori, buffer di lavaggio (20x concentrato), substrato A, substrato B, e soluzione di arresto. Preparare tutti i reagenti come raccomandato dalle istruzioni del produttore.
- Prima di iniziare il test, portare tutti i reagenti e la piastra di prova in RT. Utilizzare il numero richiesto di pozzi per il saggio, sigillare e mantenere i pozzi inutilizzati a 4 gradi centigradi fino all'uso.
- Diluire il buffer di lavaggio (15 mL di 20x concentrato) a 300 mL con acqua a doppia distillazione
- Aggiungete 100 l dello standard o del campione ad ogni pozzetto (n ) . Sigillare la piastra, mescolare bene e incubare per 2 h a 37 gradi centigradi.
- Rimuovere il liquido in ogni pozzo e aggiungere 100 l di raccordo A ad ogni pozzo, sigillare la piastra e incubare per 1 h a 37 gradi centigradi.
- Lavare i pozzi con 1x tampone di lavaggio (400 gradi centigradi) e ripetere 4x.
- Aggiungete 100 l di reagente B di rilevamento ad ogni pozzo e mescolate bene toccando delicatamente la piastra sul lato. Sigillare la piastra e incubare la piastra per 1 h a 37 gradi centigradi.
- Lavare i pozzi con 1x tampone di lavaggio (400 gradi centigradi) e ripetere 4x.
- Aggiungete 90 l di soluzione di substrato ad ogni pozzo, toccheggiate delicatamente la piastra e incubate per 1 h a 37 gradi centigradi.
- Aggiungere 50 -L di soluzione di arresto ad ogni pozzo, toccare delicatamente la piastra e leggere la piastra utilizzando lo spettrofotometro impostato su una lunghezza d'onda di 450 nm.
- Normalizzare i livelli di bacchetta bovina e porcina-A in totale (sezione 6).
6. Stima totale delle proteine
- Stimare la proteina totale degli estratti renali bovini e porcina con l'essenza standard di siero bovino albumina (BSA) utilizzando un kit commerciale (vedi Tabella dei materiali)secondo le raccomandazioni del produttore.
7. Analisi statistica
- Calcolare la media, la mediana e la deviazione standard di ogni analita.
- Testare la divergenza della distribuzione del campione dal normale utilizzo di Kolmogorov-Smirnov Test per decidere, al momento dell'uso, tra parametrico e. test statistici non parametrici. Se i dati sono normalmente distribuiti, eseguire test statistici tramite test parametrici.
- In circostanze appropriate (ad esempio la distribuzione normale dei dati), utilizzare modelli di regressione per esaminare la relazione lineare tra LH e VEGF-A.
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Representative Results
I livelli medi e medici di LH e VEGF per tipo di animale e per sesso sono indicati nella Tabella 1. Dopo aver verificato la normalità dei dati da parte di Kolmogorov-Smirnov Test della normalità, sono stati utilizzati modelli di regressione lineare per esaminare la relazione tra LH e VEGF. LH è risultato essere un forte e significativo predittore di VEGF sia nei reni bovini che su gola (modello renale bovino: n : 7, R2 , 0,86, p - 0,002; modello renale porcine: n - 7; R2 - 0,66, p - 0,025).
La relazione lineare LH/VEGF è illustrata nella Figura 1 (modello di regressione bovina) e nella Figura 2 (modello di regressione dei suini). L'equazione lineare bovina è la seguente: livello VEGF : 2.156 x Livello LH - 68,75. L'equazione lineare del porcina è la seguente: livello VEGF : 196,7 x livelli LH - 47,94.
| Tipo di campione | Maschi | Femmine | Tutti |
| Reni bovini | n - 4 | n - 3 | n - 7 |
| LH (proteina totale mIU/mg) | Media: 27,47 (SD 13.3) | Media: 19,5 (SD 2.1) | Media: 24.06 (SD 10.8) |
| Mediana: 25.7 | Mediana: 19.9 | Mediana: 19.9 | |
| VEGF (proteina totale pg/mg) | Media: 126,2 (SD 25,8) | Media: 106,0 (SD 14,5) | Media: 120,6 (SD 25.1) |
| Mediana: 131.6 | Mediana: 103.5 | Mediana: 110.8 | |
| Reni di porcina | n - 4 | n - 3 | n - 7 |
| LH (proteina totale mIU/mg) | Media: 13,2 (SD 3.6) | Media: 12,3 (SD 5.5) | Media: 12,8 (SD 4.5) |
| Mediana: 13.6 | Mediana: 10.3 | Mediana: 11.2 | |
| VEGF (proteina totale pg/mg) | Media: 2987,2 (SD 772,5) | Media: 2354.1 (SD 932.4) | Media: 2715,9 (SD 901.0) |
| Mediana: 3324.67 | Mediana: 2377.3 | Mediana: 3226.4 |
Tabella 1: Livelli medi e mediani di LH e VEGF per tipo di animale e sesso.
Figura 1: Relazione lineare LH/VEGF nei reni bovini adulti (n : 7). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Relazione lineare LH/VEGF nei reni di porcina adulti (n . 7). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Procurarsi i reni dal mattatoio subito dopo la morte animale è la chiave del successo in questa metodologia. Questo è il vantaggio principale dell'utilizzo di organi da mucche e maiali invece di cadaveri umani. Di solito c'è almeno un ritardo di 12-24 ore dal momento della morte fino a quando gli organi cadaveri umani sono procurati. Poiché la composizione chimica degli organi corporei cambia in modo significativo entro 2 h dopo la morte15,16, gli studi VEGF nei reni cadaveri umani potrebbero non riflettere circostanze reali. Anche se il protocollo sottolinea notevolmente l'importanza dell'approvvigionamento immediato e del posizionamento di organi animali sul ghiaccio dopo l'estrazione, non è noto se anche altri ricercatori abbiano dato priorità a questo passaggio. Ad esempio, la sezione metodologica di un recente studio (utilizzando reni bovini e di suini per il rilevamento di residui antibiotici) non ha specificato il ritardo tra la morte animale e l'approvvigionamento/refrigerazione degli organi17.
Questo studio misura gli analiti di interesse (VEGF e LH) con ELISA disponibili in commercio, specifici per specie. Gli ELASA sono altamente sensibili, semplici da eseguire saggi e producono risultati solidi18. Un passo critico nel protocollo è la normalizzazione dei livelli di analisi (misurati da ELISA) in base alla proteina totale. L'estratto di rene corticale è una sostanza biologica altamente eterogenea. Alla luce di ciò, un fattore di correzione è essenziale in modo che i livelli di analita possano essere confrontati tra gli animali. Così, normalizzato dalla proteina totale è stato eseguito, dal momento che noi e altri abbiamo normalizzato con successo altre sostanze biologiche eterogenee (cioè urina, macchie di sangue essiccato, e fluido vitreo) nello stesso modo9,19,20.
Uno studio precedente ha mostrato che la correlazione tra LH e VEGF nel liquido vitreo (da occhi bovini e porcina) si manifesta solo dopo la normalizzazione da parte della proteina totale6. È importante sottolineare che questa fase di normalizzazione è spesso omessa negli studi VEGF pubblicati, in particolare in quelli che coinvolgono i saggi ELISA. Invece, i livelli di VEGF sono spesso espressi in unità come picogramma per millilitore (e non come picogramma per milligrammo di proteine totali). Ad esempio, nessuna delle misure VEGF vitree in nove diversi studi ELISA (che sono stati inclusi in un vitreo articolo di revisione VEGF) sono stati normalizzati con qualsiasi metodo di correzione21,22. Questa mancanza di normalizzazione VEGF negli studi ELISA può parzialmente spiegare perché veGF non è ancora stato verificato come un biomarcatore valido21,22.
Nonostante la dimensione limitata del campione dei dati rappresentativi (bovine, n - 7; porcine, n - 7), questo protocollo dimostra una forte e significativa relazione lineare tra LH e VEGF sia nei reni bovini che in quelli di porcina. Detto questo, non c'era una dimensione del campione abbastanza grande per eseguire analisi multivariate adeguate per genere. Abbiamo in programma di ripetere questo studio con campioni di dimensioni maggiori in modo da poter eseguire tali analisi. Tuttavia, i risultati presentati supportano la potenziale associazione tra LH e VEGF nel rene dei mammiferi.
Si prevede che questo lavoro contribuirà a migliorare la comprensione della regolazione omeostatica del VEGF nel rene. Sia la qualità di questa metodologia che la robustezza dei risultati sono illustrate dalla riproducibilità dei risultati in due specie diverse. Poiché gli animali destinati alla produzione di carne sono sani, l'uso di estratti renali provenienti da animali da macello è principalmente per studiare fisiologia; tuttavia, i loro organi sono meno utili per studiare la patologia, che è la principale limitazione del loro uso. Tutto sommato, l'uso di estratti renali da mucche e maiali sono una risorsa eccellente, economica e abbondante per lo studio dei normali reni adulti. Infine, il protocollo dimostra l'efficacia dell'utilizzo della proteina totale per la normalizzazione, in particolare quando si esaminano le correlazioni tra VEGF e altri analiti.
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Disclosures
Tammy Movsas (fondatore e direttore della società DI ricerca) ha una domanda di brevetto in sospeso e brevetti convalidati per l'uso di antagonisti della gonadotropina nel trattamento delle malattie oculari e il diabete. Oltre ad essere un dipendente (biochimico) presso la società, il Dr. A. Muthusamy non ha altri conflitti finanziari da segnalare. A. Arivalagan (stagista estivo presso la studentessa universitaria dell'Università del Michigan) non ha altri conflitti finanziari da segnalare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Scholl's Slaughterhouse (Blissfield, MI) per aver fornito i reni bovini e porcinici. Per questo studio non è stato utilizzato alcun finanziamento per sovvenzioni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
References
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