Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

צרקוספורין-פוטוזרז [4 + 1]-ו [4 + 2]-אוספים שנתיים של האזובחות בתנאים מתונים

Published: July 17, 2020 doi: 10.3791/60786
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2, 1
1Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, 2School of Pharmaceutical Science, Jiangnan University
* These authors contributed equally

Summary

מסלולים חדשים לסינתזה של בחנקן המכיל הטרופיברוקלס ניצול cercoספורין כמו פוטוזרז מתכת חינם פותחו.

Abstract

ההתעניינות בחנקן המכיל הטרופיברוקלס התרחבה במהירות בקהילה הסינתטית מאחר והם מוטיבים חשובים לתרופות חדשות. באופן מסורתי, הם היו מסונתז באמצעות תגובות תרמיות התגובה התרמית, ואילו היום, photoזרז היא המועדפת בשל התנאים קל ויעיל. עם התמקדות זו, שיטת פוטוקטליטי חדשה לסינתזה של הפשפשים המכילים בחנקן הוא הרצוי מאוד. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול לביוסינתזה של cercoספורין, אשר יכול לתפקד כפוטוזרז מתכת חינם. לאחר מכן אנו מדגימים את הפרוטוקולים של cercoספורין-פוטוזרז לסינתזה של הפשפשים המכילים חנקן 1, 2, 3-תיאדיבילס באמצעות שנתיות של אזוביון עם KSCN, וסינתזה של 1, 4, 5, 6-טטרהידרופידלזרינס [4 + 2] דרך ציקלודימרזציה של אזוביון בתנאים מתונים, בהתאמה. כתוצאה מכך, קיים גשר חדש בין שיטת התסיסה האורגנית לבין הסינתזה באופן מתון, חסכוני, ידידותי לסביבה ומלא קיימא.

Introduction

הפשפשים המכילים חנקן משכו הרבה תשומת לב מאז הם לא רק שלדים חשובים עבור מגוון רחב של מוצרים טבעיים עם פעילות ביולוגית, אלא גם מקדם סינתטי עבור מולקולות התרופות האגרוכימיה וסמים1,2. בין השונים N-הפשפשים, 1, 2, 3-thiadiazoles3,4 ו-1, 4, 5, 6-טטרהידרופילוס5,6 הם המולקולות החשובות ביותר, אשר מנוצלים כמו intermediates רב-תכליתי בכימיה סינתטי (איור 1). מאז השינוי של הקבוצות התפקודית שלהם תמיד מעורר פעילויות תרופתי ייחודי, מאמצים נרחבים הוקדשה לפיתוח אסטרטגיות אפקטיביות לסינתזה של הפשפשים המכילים החנקן והם היו בעיקר מסונתז באמצעות התגובות התרמי הציקלותוספת7,8,9,10. כיום, כדי לענות על הדרישות של פיתוח בר קיימא כימיה ירוקה, פוטוזרז יש חשיבות גדולה ויתרונות11,12,13,14, אשר כולל את האפקטיביות15,16,17,18,19 והימנעות של ריאגנטים stoichiometric עבור ההפעלה20,21. Intermediates ארבע יחידות רב עוצמה ורב תכליתי, אזובאלקיני (1, 2-diaza-1, 3-diaza)22,23,24,25,26,27,28,29, 20, 24, 20, 22, מועסקים כמסמנים מבוססי מתכת Ru (bpy)3Cl2-תגובות פוטוגניזזציה עם יעילות גבוהה עבור הללציה של הלוגארו הידראזיןו-"קקרבונ יתר על כן, זה נעשה גם בשימוש מתכת חינם אאוזין Y מערכת פוטוזרז, אבל מתן את המוצר הרצוי רק 7% תשואה. מאז פוטוזרזים מתכת חינם להראות יתרון גדול על מעבר מתכת מבוססי פוטוזרזים, לגבי הגורם הסביבתי, כמו גם את המחירים הזולים18,19, חשוב מאוד לפתח מערכות פוטוקטליטיים מתכת חינם חדש לסינתזה של N-הטרופיברוקלס.

Cercoספורין31,32,33,34,35, hypocrellin36,37,38,39,40, elsinochrome41 ו-phלייכרום42,43 (איור 2) שייכות לפיגמנטים בטבע והמיוצרים על ידי הפטריות האנפיזיטיות, אשר נחקרו באופן נרחב לגבי המאפיינים שלהם פוטופיסיים ופוטוביולוגי, ויישם טיפול פוטודינמי ואבחון פוטופיזיקלי, בשל ספיגת חזקה שלהם באזור UV-vis ומאפיינים ייחודיים של פוטוסנסיטיזציה36,44,45,46,47. על הקרנה, pqps אלה ניתן לבקש המדינה נרגש ולאחר מכן ליצור מינים פעילים באמצעות העברת אנרגיה (EnT) ו-העברת אלקטרון (ET),5435,38,44,48,49,50,51,52, 53, 54. כך, אנו מנחזה כי pqps טבעי אלה עשוי להיות מנוצל כמו "מתכת חופשית" פוטוזרזים לכונן תגובות אורגניות, אשר לעתים נדירות נחקרו55,56,57,58,59.

בזאת, אנו מדווחים על הפרוטוקול לביוסינתזה של cercoספורין מתסיסה נוזלית ולאחר מכן להחיל אותו כמו פוטוזרז מתכת חינם עבור תגובת השנתי [4 + 1] התגובה השנתית של אזוביון ו KSCN, כמו גם את הציקלודימרזציה של אזובאלקיני, המספקים 1, 2, 3-thiadiazoles ו-1, 4, 5, 6-טטרהידרופידלרינות עם יעילות גבוהה בתנאים מתונים, בהתאמה (איור 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: α-Halo-N-acyl-הידרשים הוכנו על פי הליך שפורסם60. כל ממיסים וריאגנטים כימי אחרים הושגו ממקורות מסחריים ללא טיהור נוסף. לראשונה תיארנו את הסינתזה של α-Halo-N-acyl-הידרטאזורי ו ביוסינתזה של cercoספורין כמו פוטוזרז מתכת חינם. לאחר מכן, הודמנו את הפרוטוקולים של התגובות cercoספורין-פוטוזרז לסינתזה של 1, 2, 3-thiadiazoles ו 1, 4, 5, 6-הטפרופיריזמרינס.

התראה: יש לנהל את כל המניפולציה בזהירות עם כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי מגן. מומלץ מאוד לקרוא בעיון את MSDS עבור כל כימיה ו ממס המשמשים את התגובות האלה תהליך הטיהור. כימיקלים יכולים להיות שקלו על המאזניים על הספסל. כל התגובות האורגניות צריכות להיות מוגדרות בתוך מכסה המנוע ותהליך הטיהור צריך להתבצע גם במנוע.

1. הכנת α-הילה-N-acyl-הידראזורי

  1. שוקלים 10 mmol של קטון ו 10 mmol של בנזואיל הידראזין לבקבוקון.
  2. הוסף 20 מ ל של CH3או לבקבוקון.
  3. לצייד את הבקבוקון עם פקק גומי ובר ערבוב.
  4. הכנס 0.25 mL של HCl לאט לתוך התערובת.
  5. מודאת הבקבוקון באוויר. בטמפרטורת החדר במשך 4 שעות
  6. לאסוף את הזרז לאחר התגובה על ידי סינון ולשטוף עם אצטון.
  7. יבש את המוצר על ידי ואקום ולזהות על ידי NMR.

2. הכנת צרקוספורין

  1. לטעון 3 L לנער בקבוקון עם 1 L של S-7 בינוני.
  2. הפקת מאמץ של cercoספורין-לייצר זן56 לתוך הבקבוקון לנער.
  3. תרבות התערובת בתנאים קלים ב 135 r/min, 25 ° צ' במשך שבועיים.
  4. הנושא את ציר התסיסה לסינון ואקום באמצעות משאבת ואקום כדי להשיג את הסופרנטאנט ואת הגלולה.
  5. לאסוף את הגלולה ויבש אותו במייבש הקפאה.
  6. לחלץ את הגלולה ואת סופרנטאנט בנפרד עם 3 x 50 מ ל dichloromethane.
  7. לשלב את השלבים האורגניים ולשטוף עם מים 2-3 פעמים.
  8. רכזו את השלב האורגני תחת ואקום.
  9. לפזר מחדש את השאריות עם מתנול אנליטי, ולסנן באמצעות קרום מיקרוסינון אורגני 0.18 יקרומטר.
  10. לטהר את cercoספורין עם עמודת Sephadex-20 ולהזדהות על ידי מאבחן.

3. הכנת 1, 2, 3-תיאדיטילס

  1. שוקלים את ה- α-Halo-N-הידראל (0.2 mmol, 1.0 eq), 1 מ ג cercoספורין (0.002 mmol, 0.01 equiv.), 27 מ"ג של tbuok (1.2 equiv) ו-39 mg של kscn (2 Equiv) לתוך 10 מ"ל אמבטיה schlenk מצויד בפקק גומי בר ערבוב.
  2. לטהר את צינור שלנק עם O2 שלוש פעמים.
  3. הכנס את CH3CN (2 מ ל) לצינור השילנק.
  4. הנושא את צינור השילנק לנורית כחולה בגובה 5 ואט מלמטה במשך 16 שעות.
  5. לשטוף עם 4 x 15 מ ל של תמיסת הנאגל רווי ולשלב את השלב מימית.
  6. לחלץ מחדש את השלב מימית עם 4 x 15 מ ל של אצטט אתיל.
  7. לשלב את השלב האורגני יבש עם Na הידרוous2כל כך4.
  8. הסר את הממס עם מאייד ואקום.
  9. לטהר את המוצר 3 על ידי העמודה סיליקה ג'ל כרומטוגרפיה (הללויה, נפט: אתיל אצטט = 10:1) ולזהות על ידי NMR.

4. הכנה של 1, 4, 5, 6-טטרהידרופידאזין

  1. שקול את ההילה α-הילה-N-הידרליזון (0.5 mmol), 2.7 mg של cercoספורין (0.01 equiv), ו 195 mg של Cs2CO3 (1.2 equiv) לתוך 10 מ ל האמבטיה schlenk מצויד בפקק גומי בר ערבוב.
  2. לטהר את צינור שלנק עם N2 שלוש פעמים.
  3. הכנס את CH3CN/H2O (10:1, 2 מ ל) לשפופרת של שלנק.
  4. הנושא את צינור השילנק לנורית כחולה בגובה 5 ואט מלמטה במשך 16 שעות.
  5. לשטוף עם 4 x 15 מ ל של תמיסת הנאגל רווי ולשלב את השלב מימית.
  6. לחלץ מחדש את השלב מימית עם 4 x 15 מ ל של אצטט אתיל.
  7. לשלב את השלב האורגני יבש עם Na הידרוous2כל כך4.
  8. הסר את הממס עם מאייד ואקום.
  9. לטהר את המוצר 4 על ידי כרומטוגרפיה העמודה סיליקה ג'ל (הללויה, נפט: אתיל אצטט = 10:1) ולזהות על ידי nmr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סינתזה של α-הילה-N-acyl-הידראזורי: הם מסונתז לפי פרוטוקול 1.

סינתזה של cercoספורין: זה היה מסונתז ומטוהר על פי פרוטוקול 2. מיכל בן H NMR (400 מגה-הרץ, CDCl3): δ ppm 14.82 (s, 2H, arh), 7.06 (s, 2h, arh), 5.57 (של, 2, 2H, CH2), 4.20 (של, 6H, 2h3), 3.62-3.57 (m, 2h, ch2), 3.42-3.37 (m, 2h, ch 2), 2.93-2.88 (m, 2H, ch2), 0.63 (ד, 6h, J = 8 הרץ, 2h3) (איור 4). מיכל בן 13 C NMR (101 מגה-הרץ, CDCl3): δ ppm 207.0, 181.8, 167.4, 163.4, 152.8, 135.4, 130.6, 127.9, 112.9, 109.3, 108.2, 92.6, 68.1, 61.2, 42.2, 19.3. HRMS (ESI-Q-תוף) מדויק calcd המסה עבור C29H25O10 [M-H]- 533.1448, נמצא 533.1468.

סינתזה של 4-פניקסיל-1, 2, 3-thiadiazole (3a): זה היה מסונתז ומטוהר באמצעות פרוטוקול 3 עם 88% תשואה. מיכל בן H NMR (400 מגה-הרץ, CDCl3): δ ppm 8.66 (s, 1h), 8.07-8.05 (m, 2h), 7.55-7.44 (m, 3h) (איור 5). מיכל בן 13 C NMR (100 מגה-הרץ, CDCl3): δ ppm 162.9, 130.8, 129.9, 129.4, 129.2, 127.4 (איור 6). HRMS (ESI-Q-תוף) בדיוק calcd המסה עבור C8H7N2S [M + H]+ 162.0330, נמצאו 163.0349.

סינתזה של 4-(4-Fluorophenyl)-1, 2, 3-thiadiazole (3b): זה היה מסונתז ומטוהר באמצעות פרוטוקול 3 עם 72% תשואה. מיכל בן H NMR (400 מגה-הרץ, CDCl3): δ ppm 8.60 (s, 1h), 8.09-8.02 (m, 2h), 7.19-7.19 (m, 2h). מיכל בן 13 C NMR (100 מגה-הרץ, CDCl3): δ ppm 164.3-161.9 (d, JC-f = 240 Hz), 161.3, 133.6, 129.8 (d, j-f = 9.0 hz), 127.8 (ד , גc- f = 3.0 הרץ), 116.7 (ד, ג ג-נ = 22.0 hz). HRMS (ESI-Q-תוף) מדויק calcd עבור C8H6FN2S [M + H]+ 181.0196, נמצאו 181.0191.

סינתזה של 4-(4-כלוראופנקסיל)-1, 2, 3-thiadiazole (3c): זה היה מסונתז ומטוהר באמצעות פרוטוקול 3 עם 87% תשואה. מיכל בן H NMR (400 מגה-הרץ, CDCl3): δ ppm 8.65 (s, 1h), 8.00 (d, j = 8 הרץ, 2h), 7.50 (d, j = 8 hz, 2h). מיכל בן 13 C NMR (100 מגה-הרץ, CDCl3): δ ppm 162.6, 135.5, 132.4, 129.4, 128.9, 128.7. HRMS (ESI-Q-תוף) בדיוק calcd המסה עבור C8H6cln2S [M + H]+ 196.9940, נמצאו 196.9940.

סינתזה של 4-(4-ברומרופאנאיל)-1, 2, 3-thiadiazole (3d): זה היה מסונתז ומטוהר באמצעות פרוטוקול 3 עם 78% תשואה. מיכל בן H NMR (400 מגה-הרץ, CDCl3): δ ppm 8.66 (s, 1h), 7.94 (ד, j = 8 hz, 2h), 7.65 (d, j = 8 hz, 2h). מיכל בן 13 C NMR (100 מגה-הרץ, CDCl3): δ ppm 161.2, 134.3, 132.7, 130.4, 129.6, 119.1. HRMS (ESI-Q-תוף) מדויק calcd עבור C8H6brn2S [M + H]+ 240.9435, נמצאו 240.9429.

סינתזה של (3, 6-Diphenyl-5, 6-דיהידרוטסטוסטרון-1 (4H)-yl) (פניאיל) מתיונין (4h): זה היה מסונתז ומטוהר באמצעות פרוטוקול 4 עם 80% תשואה. מיכל בן H NMR (400 מגה-הרץ, CDCl3): δ ppm 7.84-7.82 (ז, 2h), 7.60-7.58 (m, 2h), 7.49-7.44 (m, 3h), 7.33-7:30 (מ, 5h), 7.26-7.24 (m, 1h), 7.18 (ד, J = 8 Hz, 2h), 6.09 (s, 1h), 2.71-2.67 (m, 1h), 2.43-2.16 (m, 3H) (איור 7).

סינתזה של (3, 6-Bis (4-fluorophenyl)-5, 6-דיהידרוטסטוסטרון-1 (4H)-yl) (פנקסיל) מתיונין (4h): זה היה מסונתז ומטוהר באמצעות פרוטוקול 4 עם 72% תשואה. מיכל בן H NMR (400 מגה-הרץ, CDCl3): δ ppm 7.80-7.78 (ז, 2h), 7.57-7.55 (m, 2h), 7.52-7.43 (m, 3h), 7.16-7.12 (m, 2h), 7.03-6.97 (m, 4h), 6.05 (s, 1h), 2.69-2.65 (m, 1h), 2.40-2.25 (m, 2h), 2.18-2.13 (m, 1h). מיכל בן 13 C nmr (100 מגה-הרץ, cdcl3): δ ppm 170.2, 163.4 (d, 1jc-f = 248.1 hz), 162.0 (ד, 1jC-F c-f = 244.1 hz), 146.0, 135.5 (ד, 4Jc-f = 3.1 hz), 135.1, 133.2 (ד, 4jc-f = 3.2 hz), 130.4, 129.9, 127.5, 127.2 (d, 3jc-f = 8.2 hz), 127.1 (ד, 3jc-f = 8.0 hz), 115.7 (ד, 2j cC-F -f = 21.5 hz), 115.4 (ד, 2j c-f = 21.6 hz), 50.9, 24.0, 18.7. מיכל בן 19 F NMR (376 מגה-הרץ, CDCl3) (ppm)-111.7,-115.5. HRMS (ESI-Q-תוף) מדויק calcd המסה עבור C23H19F2N2O [M + H]+ 377.1465, נמצאו 377.1482.

סינתזה של (3, 6-Bis (4-כלורנול)-5, 6-דיהידרוטסטוסטרון-1 (4H)-yl) (פנקסיל) מתיונין (4h): זה היה מסונתז ומטוהר באמצעות פרוטוקול 4 עם 70% תשואה. מיכל בן H NMR (400 מגה-הרץ, CDCl3): δ ppm 7.78 (d, J = 4 Hz, 2h), 7.50-7.43 (m, 5h), 7:30-7.26 (m, 5h), 7.10 (d, J = 8 Hz, 2h), 6.03 (s, 1h), 2.68-2.63 (m, 1h), 2.39-2.26 (m, 2h), 2.20-2.11 (m, 1h). מיכל בן 13 C NMR (100 מגה-הרץ, CDCl3): δ ppm 170.2, 145.8, 138.3, 135.4, 135.3, 134.9, 133.2, 130.5, 129.9, 129.0, 128.6, 127.5, 126.9, 126.6, 51.2, 29.7, 19.8, 18.6. HRMS (ESI-Q-תוף) מדויק calcd המסה עבור C23H19Cl2N2O [M + H]+ 409.0874, נמצאו 409.0864.

סינתזה של (3, 6-Bis (4-ברומנול)-5, 6-דיהידרוטסטוסטרון-1 (4H)-yl) (פניל) מתיונין (4h): זה היה מסונתז ומטוהר באמצעות פרוטוקול 4 עם 82% תשואה. מיכל בן H NMR (400 מגה-הרץ, CDCl3): δ ppm 7.78 (d, j = 8 Hz, 2h), 7.52-7.40 (m, 9h), 7.04 (ד, J = 8 Hz, 2h), 6.01 (s, 1h), 2.67-2.62 (m, 1h), 2.39-2.25 (m, 2h), 2.20-2.11 (m, 1h). מיכל בן 13 C NMR (100 מגה-הרץ, CDCl3): δ ppm 170.2, 145.9, 138.9, 135.8, 134.8, 132.0, 131.6, 130.5, 129.9, 127.5, 127.2, 126.9, 119.6, 121.2, 51.3, 29.7, 19.8, 18.5. HRMS (ESI-Q-תוף) מדויק calcd המסה עבור C23H19Br2N2O [M + H]+ 498.9845, נמצאו 498.9799.

תוצאות מייצגים אלה מדגימים כיצד 4-aryl-1, 2, 3-thiadiazoles ו 1, 4, 5, 6-הטטרהידרופילוס יכול להיות נוח מסונתז על ידי cercoספורין-התגובה photocatalytic מ α-הילה-N-acyl-הידרזון (איור 8).

4-aryl-1, 2, 3-thiadiazoles הושגו עם התנאים האלה: 1 (0.2 ממול), KSCN (0.4 ממול), tbuok (0.24 ממול), CH3CN (2.0 mL), cercoספורין (1 מול%), 5 W כחול LED, 16 h, בטמפרטורת החדר מתחת O2 אווירה (איור 3 ואיור 8 הנוהל היה מתאים מצעים הנושאת הן אלקטרון-תרומת וקבוצות לקבל אלקטרון על הטבעת פניל, מתן את המוצרים הרצויים עם בינוני כדי תשואות טובות.

1, 4, 5, 6-הטטרההידרופידיזינים הושגו עם תנאים אלה: 1 (0.5 mmol), Cs2CO3 (1.2 equiv) ו cercoספורין (1 מול%) בתערובת של MeCN ו-H2O (10:1) תחת N2 אווירה (איור 3 ואיור 8). המוצרים הרצויים הושגו טוב לתשואות מצוינות.

Figure 1
איור 1: מולקולות ביואקטיביות עם מוטיבים של N-הטרוסוציקלס. מותאם בהיתר מ ג'אנג Y., סאו Y, Lu L. S., ג'אנג S. W., באו W. H, הואנג ס. פ., ראו י. י. הפרביונואיד-מזרז [4 + 1]-ו [4 + 2]-האוספים השנתיים של האזוברות: פוטוקטליטי גישה ל-1, 2, 3-Thiadiazole/1, 4, 5, 6-הטהידרופירודהנגזרים, כתב העת של כימיה אורגנית. 84 (12), 7711-7721, (2019). זכויות יוצרים (2019) האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: פיגמנטים מייצגים בטבע. מותאם בהיתר מ ג'אנג Y., סאו Y, Lu L. S., ג'אנג S. W., באו W. H, הואנג ס. פ., ראו י. י. הפרביונואיד-מזרז [4 + 1]-ו [4 + 2]-האוספים השנתיים של האזוברות: פוטוקטליטי גישה ל-1, 2, 3-Thiadiazole/1, 4, 5, 6-הטהידרופירודהנגזרים, כתב העת של כימיה אורגנית. 84 (12), 7711-7721, (2019). זכויות יוצרים (2019) האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: סריקוספורין-סינתזה של 1, 2, 3-תיאדיטילס ו-1, 4, 5, 6-טטרהיהידרופידלרינס. מותאם בהיתר מ ג'אנג Y., סאו Y, Lu L. S., ג'אנג S. W., באו W. H, הואנג ס. פ., ראו י. י. הפרביונואיד-מזרז [4 + 1]-ו [4 + 2]-האוספים השנתיים של האזוברות: פוטוקטליטי גישה ל-1, 2, 3-Thiadiazole/1, 4, 5, 6-הטהידרופירודהנגזרים, כתב העת של כימיה אורגנית. 84 (12), 7711-7721, (2019). זכויות יוצרים (2019) האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: 1H-nmr ספקטרום של cercoספורין (400 MHz, cdcl3). הודפסה מודפס בהיתר מ-ג'אנג-י., סאו-,, לו ל. ס., ג'אנג ס. וו, באו ו. ח., הואנג ס. פ., ראו י. י. הפרביונואיד-מזרז [4 + 1]-ו [4 + 2]-האוספים השנתיים של האזוברות: פוטוקטליטי גישה ל-1, 2, 3-Thiadiazole/1, 4, 5, 6-הטהידרופירודהנגזרים, כתב העת של כימיה אורגנית. 84 (12), 7711-7721, (2019). זכויות יוצרים (2019) האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: נציג 1H-nmr ספקטרום של 3a (400 MHz, cdcl3). הודפסה מודפס בהיתר מ-ג'אנג-י., סאו-,, לו ל. ס., ג'אנג ס. וו, באו ו. ח., הואנג ס. פ., ראו י. י. הפרביונואיד-מזרז [4 + 1]-ו [4 + 2]-האוספים השנתיים של האזוברות: פוטוקטליטי גישה ל-1, 2, 3-Thiadiazole/1, 4, 5, 6-הטהידרופירודהנגזרים, כתב העת של כימיה אורגנית. 84 (12), 7711-7721, (2019). זכויות יוצרים (2019) האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: מייצג 13C-nmr ספקטרום של 3a (400 MHz, cdcl3). הודפסה מודפס בהיתר מ-ג'אנג-י., סאו-,, לו ל. ס., ג'אנג ס. וו, באו ו. ח., הואנג ס. פ., ראו י. י. הפרביונואיד-מזרז [4 + 1]-ו [4 + 2]-האוספים השנתיים של האזוברות: פוטוקטליטי גישה ל-1, 2, 3-Thiadiazole/1, 4, 5, 6-הטהידרופירודהנגזרים, כתב העת של כימיה אורגנית. 84 (12), 7711-7721, (2019). זכויות יוצרים (2019) האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: נציג 1H-nmr ספקטרום של 4a (400 MHz, cdcl3). הודפסה מודפס בהיתר מ-ג'אנג-י., סאו-,, לו ל. ס., ג'אנג ס. וו, באו ו. ח., הואנג ס. פ., ראו י. י. הפרביונואיד-מזרז [4 + 1]-ו [4 + 2]-האוספים השנתיים של האזוברות: פוטוקטליטי גישה ל-1, 2, 3-Thiadiazole/1, 4, 5, 6-הטהידרופירודהנגזרים, כתב העת של כימיה אורגנית. 84 (12), 7711-7721, (2019). זכויות יוצרים (2019) האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: שקקובורין-סינתזה של 4-aryl-1, 2, 3-תיאדיטילס ו 1, 4, 5, 6-טטרהיהידרופייזרינס. מותאם בהיתר מ ג'אנג Y., סאו Y, Lu L. S., ג'אנג S. W., באו W. H, הואנג ס. פ., ראו י. י. הפרביונואיד-מזרז [4 + 1]-ו [4 + 2]-האוספים השנתיים של האזוברות: פוטוקטליטי גישה ל-1, 2, 3-Thiadiazole/1, 4, 5, 6-הטהידרופירודהנגזרים, כתב העת של כימיה אורגנית. 84 (12), 7711-7721, (2019). זכויות יוצרים (2019) האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חנקן מכיל מוטיבים המכילים תרופות חדשות רבות והיו מסונתז באופן מסורתי דרך תגובות תרמו-ציקלוקליות. בשל עניין רב, שיטת פוטוקטליטית חדשה לסינתזה של תרכובות אלה היא רצויה מאוד. כדי לנצל את התכונות פוטוסנסיטיזציה מעולה של cercoספורין, הגשתי cercoספורין כמו פוטוזרז מתכת חינם בשתי קטגוריות של תגובות שנתיות לסנתז חנקן המכיל הפשפשים.

ראשית, אנו דיווחו על פרוטוקול של cercoספורין-פוטוזרז [4 + 1] שנתיות של אזוביון עם KSCN תחת תנאים סטנדרטיים: α-halo-N-acyl-הידרזון 1 (0.2 mmol), tbuok (1.2 equiv), kscn 2 (2 equiv), cercoספורין (0.01 equiv), יבש CH3CN (2 מ ל), ואת התערובות שנוצרו היו חשופים 5 W כחול LED עבור 16 h תחת האטמוספירה O2 . ה-KSCN מתפקד כיחידה מיואופלפילית הנמצאת כאן. Cercoספורין, בובוק, אורכחול O2 היו כל הדרישות המוקדמות לתגובה זו. CH3 CN סיפק את התשואה הטובה ביותר של המוצר ו 0.01 equiv. של cercoספורין היה היחס האופטימלי.

שנית, אנו דיווחו על פרוטוקול של cercoספורין-פוטוזרז [4 + 2] שנתיות של אזוביון בתנאים סטנדרטיים: α-הילה-N-acyl-הידרזון 1 (0.5 Mmol), Cs2CO3 (1.2 equiv), CERCOספורין (0.01 Equiv) (CH3CN/H2O = 10:1) 2 מ ל, והתערובות הנובעות היו חשופים 5 ואט כחול LED 16 H תחת אווירה N2 . ניסויי הבקרה נעשו עבור התגובה [4 + 2] כפי שהיה עבור התגובה [4 + 1]. בפרוטוקול זה, תוספת של מים ו-Cs2CO3 היה קריטי לעיבוי עצמי של α-הילה-N-acyl-הידרזון. היחס בין המים לבין Cs23 היה גם קריטי כדי לספק את התשואה הטובה ביותר עבור המוצר.

לסיכום, אנו דיווחו על פרוטוקול יוסינטזה עבור cercoספורין ולאחר מכן ליישם אותו כמו פוטוזרז מתכת חינם לסינתזה של N-הפשפשים 4-aryl-1, 2, 3-תיאדילילס ו-1, 4, 5, 6-טטרהיהידרופיזלזאס בתנאים מתונים, באמצעות [4 + 1] שנתיות של אזוביון עם kscn ו-[4 + 2] שנתיות של אזוביון, בהתאמה. התגובות הללו עשה שימוש חסכוני 5 W LED והוא יכול להיות מעובד בקלות, אשר סיפקה יישום חדש סינתזה. והכי חשוב, בנינו גשר בין הביוסינתזה והסינתזה האורגנית לעיצוב של N-הטרוסוציקלס בצורה קלה, חסכונית, ידידותית לסביבה ומבחינה מעשית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים על מפתח לאומי R & D תוכנית של סין (2018YFA0901700), מדעי הטבע הקרן של מחוז ג'יאנגסו (מענקים לא. BK20160167), התוכנית אלף כשרונות (צעירים מקצוענים), קרנות המחקר הבסיסי של האוניברסיטאות המרכזיות (JUSRP51712B), התוכנית הלאומית למשמעת ממדרגה ראשונה של התעשייה הקלה טכנולוגיה והנדסה (LITE2018-14) ו פוסט דוקטורט במחוז ג'יאנגסו (2018K153C) עבור תמיכה במימון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4'-Dibromoacetophenone ENERGY D0500850050
2'-bromo-4-chloroacetophenone ENERGY A0500400050
2-Bromo-4'-fluoroacetophenone ENERGY A050037-5g
2-Bromoacetophenone ENERGY A0500870050
4-Bromobenzhydrazide ENERGY B0103390010
4-Chlorobenzhydrazide ENERGY D0511130050
4-Fluorobenzhydrazide ENERGY B010461-5g
5 W blue LED PHILIPS 29237328756
Benzoyl hydrazine ENERGY D0500610250
CH2Cl2 SINOPHARM 80047360
CH3CN SINOPHARM S3485101
CH3OH SINOPHARM 100141190
Cs2CO3 ENERGY E060058-25g
Ethyl acetate SINOPHARM 40065986
freeze dryer LABCONCO 7934074
HPLC Agilent 1260 Infinity II
KSCN ENERGY E0104021000
Na2SO4 SINOPHARM 51024461
organic microfiltration membrane SINOPHARM 92412511
S-7 medium Gluose 1g; Fructose 3g; Sucrose 6g; Sodium acetate 1g; Soytone 1g; Phenylalanine 5mg; Sodium benzoate 100mg; 1M KH2P04 buffer ph6.8; Biotin 1mg; Ca(NO3)2 6.5mg; Pyridoxal 1mg; Calcium pantothenate 1mg; Thiamine 1mg; MnCl2 5mg; FeCl3 2mg; Cu(NO3)2 1mg; MgSO4 3.6mg; ZnSO4 2.5mg
Schlenk tub Synthware F891910
sephadex LH-20 column GE 17009001
shaker Lab Tools BSH00847
silica gel ENERGY E011242-1kg
tBuOK ENERGY E0610551000
vacuum bump Greatwall SHB-III
vacuum evaporator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Majumdar, K. C., Chattopadhyay, S. K. Heterocycles in Natural Product Synthesis. ed, , 1st ed, Wiley-VCH. (2011).
  2. Taylor, R. D., MacCoss, M., Lawson, A. D. Rings in drugs. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (14), 5845-5859 (2014).
  3. Bakulev, V. A., Dehaen, W. The Chemistry of 1,2,3-Thiadiazoles. , John Wiley & Sons. (2004).
  4. Dong, W. L., Liu, Z. X., Liu, X. H., Li, Z. M., Zhao, W. G. Synthesis and antiviral activity of new acrylamide derivatives containing 1,2,3-thiadiazole as inhibitors of hepatitis B virus replication. European Journal of Medicinal Chemistry. 45 (5), 1919-1926 (2010).
  5. Combs, D. W., Reese, K., Phillips, A. Nonsteroidal Progesterone-Receptor Ligands. 1. 3-Aryl-1-Benzoyl-1,4,5,6-Tetrahydropyridazines. Journal of Medicinal Chemistry. 38 (25), 4878-4879 (1995).
  6. Combs, D. W., et al. Nonsteroidal Progesterone-Receptor Ligands. 2. High-Affinity Ligands with Selectivity for Bone Cell Progesterone Receptors. Journal of Medicinal Chemistry. 38 (25), 4880-4884 (1995).
  7. Xu, S. L., Chen, R. S., Qin, Z. F., Wu, G. P., He, Z. J. Divergent Amine-Catalyzed [4+2] Annulation of Morita-Baylis-Hillman Allylic Acetates with Electron-Deficient Alkenes. Organic Letters. 14 (4), 996-999 (2012).
  8. Ishikawa, T., Kimura, M., Kumoi, T., Iida, H. Coupled Flavin-Iodine Redox Organocatalysts: Aerobic Oxidative Transformation from N-Tosylhydrazones to 1,2,3-Thiadiazoles. ACS Catalysis. 7 (8), 4986-4989 (2017).
  9. Chen, J. F., Jiang, Y., Yu, J. T., Cheng, J. TBAI-Catalyzed Reaction between N-Tosylhydrazones and Sulfur: A Procedure toward 1,2,3-Thiadiazole. Journal of Organic Chemistry. 81 (1), 271-275 (2016).
  10. Liu, B. B., Bai, H. W., Liu, H., Wang, S. Y., Ji, S. J. Cascade Trisulfur Radical Anion (S3(*-)) Addition/Electron Detosylation Process for the Synthesis of 1,2,3-Thiadiazoles and Isothiazoles. Journal of Organic Chemistry. 83 (17), 10281-10288 (2018).
  11. Staveness, D., Bosque, I., Stephenson, C. R. J. Free Radical Chemistry Enabled by Visible Light-Induced Electron Transfer. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2295-2306 (2016).
  12. Corrigan, N., Shanmugam, S., Xu, J. T., Boyer, C. Photocatalysis in organic and polymer synthesis. Chemical Society Reviews. 45 (22), 6165-6212 (2016).
  13. Shaw, M. H., Twilton, J., MacMillan, D. W. C. Photoredox Catalysis in Organic Chemistry. Journal of Organic Chemistry. 81 (16), 6898-6926 (2016).
  14. Marzo, L., Pagire, S. K., Reiser, O., Konig, B. Visible-Light Photocatalysis: Does It Make a Difference in Organic Synthesis? Angewandte Chemie-International Edition. 57 (32), 10034-10072 (2018).
  15. Prier, C. K., Rankic, D. A., MacMillan, D. W. C. Visible Light Photoredox Catalysis with Transition Metal Complexes: Applications in Organic Synthesis. Chemical Reviews. 113 (7), 5322-5363 (2013).
  16. Reckenthaler, M., Griesbeck, A. G. Photoredox Catalysis for Organic Syntheses. Advanced Synthesis & Catalysis. 355 (14-15), 2727-2744 (2013).
  17. Nicewicz, D. A., Nguyen, T. M. Recent Applications of Organic Dyes as Photoredox Catalysts in Organic Synthesis. ACS Catalysis. 4 (1), 355-360 (2014).
  18. Pitre, S. P., McTiernan, C. D., Scaiano, J. C. Understanding the Kinetics and Spectroscopy of Photoredox Catalysis and Transition-Metal-Free Alternatives. Accounts of Chemical Research. 49 (6), 1320-1330 (2016).
  19. Romero, N. A., Nicewicz, D. A. Organic Photoredox Catalysis. Chemical Reviews. 116 (17), 10075-10166 (2016).
  20. Albini, A., Fagnoni, M. Photochemically-Generated Intermediates in Synthesis. , John Wiley & Sons. (2013).
  21. Chen, J. R., Hu, X. Q., Lu, L. Q., Xiao, W. J. Exploration of Visible-Light Photocatalysis in Heterocycle Synthesis and Functionalization: Reaction Design and Beyond. Accounts of Chemical Research. 49 (9), 1911-1923 (2016).
  22. Attanasi, O. A., et al. Cultivating the Passion to Build Heterocycles from 1,2-Diaza-1,3-dienes: the Force of Imagination. European Journal of Organic Chemistry. 19, 3109-3127 (2009).
  23. Attanasi, O. A., Filippone, P. Working twenty years on conjugated azo-alkenes (and environs) to find new entries in organic synthesis. Synlett. 10, 1128-1140 (1997).
  24. Deng, Y., Pei, C., Arman, H., Dong, K., Xu, X., Doyle, M. P. Syntheses of Tetrahydropyridazine and Tetrahydro-1,2-diazepine Scaffolds through Cycloaddition Reactions of Azoalkenes with Enol Diazoacetates. Organic Letters. 18 (22), 5884-5887 (2016).
  25. Guo, C., Sahoo, B., Daniliuc, C. G., Glorius, F. N-heterocyclic carbene catalyzed switchable reactions of enals with azoalkenes: formal [4+3] and [4+1] annulations for the synthesis of 1,2-diazepines and pyrazoles. Journal of American Chemistry Society. 136 (50), 17402-17405 (2014).
  26. Attanasi, O. A., et al. Interceptive [4+1] annulation of in situ generated 1,2-diaza-1,3-dienes with diazo esters: direct access to substituted mono-, bi-, and tricyclic 4,5-dihydropyrazoles. Journal of Organic Chemistry. 79 (17), 8331-8338 (2014).
  27. Li, J., Huang, R., Xing, Y. K., Qiu, G., Tao, H. Y., Wang, C. J. Catalytic Asymmetric Cascade Vinylogous Mukaiyama 1,6-Michael/Michael Addition of 2-Silyloxyfurans with Azoalkenes: Direct Approach to Fused Butyrolactones. Journal of the American Chemical Society. 137 (32), 10124-10127 (2015).
  28. Huang, R., Chang, X., Li, J., Wang, C. J. Cu(I)-Catalyzed Asymmetric Multicomponent Cascade Inverse Electron-Demand Aza-Diels-Alder/Nucleophilic Addition/Ring-Opening Reaction Involving 2-Methoxyfurans as Efficient Dienophiles. Journal of the American Chemical Society. 138 (12), 3998-4001 (2016).
  29. Tong, M. C., et al. Catalytic asymmetric synthesis of [2,3]-fused indoline heterocycles through inverse-electron-demand aza-Diels-Alder reaction of indoles with azoalkenes. Angew Chemistry International Edition English. 53 (18), 4680-4684 (2014).
  30. Yu, J. M., Lu, G. P., Cai, C. Photocatalytic radical cyclization of alpha-halo hydrazones with beta-ketocarbonyls: facile access to substituted dihydropyrazoles. Chemistry Communication (Camb.). 53 (38), 5342-5345 (2017).
  31. Kuyama, S., Tamura, T. Cercosporin. A pigment of Cercosporina kikuchii Matsumoto et Tomoyasu. I. Cultivation of fungus, isolation and purification of pigment. Journal of the American Chemical Society. 79 (21), 5725-5726 (1957).
  32. Kuyama, S., Tamura, T. Cercosporin. A pigment of Cercosporina kikuchii Matsumoto et Tomoyasu. II. Physical and chemical properties of cercosporin and its derivatives. Journal of the American Chemical Society. 79 (21), 5726-5729 (1957).
  33. Daub, M. E. Resistance of fungi to the photosensitizing toxin, cercosporin. Phytopathology. 77 (11), 1515-1520 (1987).
  34. Jalal, M. A. F., Hossain, M. B., Robeson, D. J., Vanderhelm, D. Cercospora-Beticola Phytotoxins - Cebetins That Are Photoactive, Mg2+-Binding, Chlorinated Anthraquinone Xanthone Conjugates. Journal of the American Chemical Society. 114 (15), 5967-5971 (1992).
  35. Daub, M. E., Ehrenshaft, M. The photoactivated Cercospora toxin cercosporin: Contributions to plant disease and fundamental biology. Annual Review of Phytopathology. 38 (1), 461-490 (2000).
  36. Diwu, Z. J., Lown, J. W. Photosensitization with Anticancer Agents. 14. Perylenequinonoid Pigments as New Potential Photodynamic Therapeutic Agents - Formation of Tautomeric Semiquinone Radicals. Journal of Photochemistry and Photobiology A-Chemistry. 69 (2), 191-199 (1992).
  37. Hu, Y. Z., An, J. Y., Jiang, L. J., Chen, D. W. Spectroscopic Study on the Photoreduction of Hypocrellin-a - Generation of Semiquinone Radical-Anion and Hydroquinone. Journal of Photochemistry and Photobiology A-Chemistry. 89 (1), 45-51 (1995).
  38. Hu, Y. Z., Jiang, L. J., Chiang, L. C. Characteristics of the reaction between semiquinone radical anion of hypocrellin A and oxygen in aprotic media. Journal of Photochemistry and Photobiology A-Chemistry. 94 (1), 37-41 (1996).
  39. Zhang, M. H., et al. Study of electron transfer interaction between hypocrellin and N,N-diethylaniline by UV-visible, fluorescence, electron spin resonance spectra and time-resolved transient absorption spectra. Journal of Photochemistry and Photobiology A-Chemistry. 96 (1-3), 57-63 (1996).
  40. He, Y. Y., An, J. Y., Jiang, L. J. pH Effect on the spectroscopic behavior and photoinduced generation of semiquinone anion radical of hypocrellin B. Dyes and Pigments. 41 (1-2), 79-87 (1999).
  41. Li, C., et al. Photophysical and photosensitive properties of Elsinochrome A. Chinese Science Bulletin. 51 (9), 1050-1054 (2006).
  42. So, K. K., et al. Improved production of phleichrome from the phytopathogenic fungus Cladosporium phlei using synthetic inducers and photodynamic ROS production by phleichrome. Journal of Bioscience and Bioengineering. 119 (3), 289-296 (2015).
  43. Hudson, J. B., Imperial, V., Haugland, R. P., Diwu, Z. Antiviral activities of photoactive perylenequinones. Photochemistry and Photobiology. 65 (2), 352-354 (1997).
  44. Diwu, Z. J., Lown, J. W. Photosensitization by Anticancer Agents. 12. Perylene Quinonoid Pigments, a Novel Type of Singlet Oxygen Sensitizer. Journal of Photochemistry and Photobiology A-Chemistry. 64 (3), 273-287 (1992).
  45. Diwu, Z. J., Zimmermann, J., Meyer, T., Lown, J. W. Design, Synthesis and Investigation of Mechanisms of Action of Novel Protein-Kinase-C Inhibitors - Perylenequinonoid Pigments. Biochemical Pharmacology. 47 (2), 373-385 (1994).
  46. Guedes, R. C., Eriksson, L. A. Photophysics, photochemistry, and reactivity: Molecular aspects of perylenequinone reactions. Photochemical & Photobiological Sciences. 6 (10), 1089-1096 (2007).
  47. Mulrooney, C. A., O'Brien, E. M., Morgan, B. J., Kozlowski, M. C. Perylenequinones: Isolation, Synthesis, and Biological Activity. European Journal of Organic Chemistry. (21), 3887-3904 (2012).
  48. Daub, M. E., Hangarter, R. P. Light-induced production of singlet oxygen and superoxide by the fungal toxin, cercosporin. Plant Physiololgy. 73 (3), 855-857 (1983).
  49. Daub, M. E., Leisman, G. B., Clark, R. A., Bowden, E. F. Reductive Detoxification as a Mechanism of Fungal Resistance to Singlet Oxygen-Generating Photosensitizers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (20), 9588-9592 (1992).
  50. Leisman, G. B., Daub, M. E. Singlet Oxygen Yields, Optical-Properties, and Phototoxicity of Reduced Derivatives of the Photosensitizer Cercosporin. Photochemistry Photobiology. 55 (3), 373-379 (1992).
  51. Bilski, P., Li, M. Y., Ehrenshaft, M., Daub, M. E., Chignell, C. F. Vitamin B6 (pyridoxine) and its derivatives are efficient singlet oxygen quenchers and potential fungal antioxidants. Photochemistry Photobiology. 71 (2), 129-134 (2000).
  52. Xing, M. Z., Zhang, X. Z., Sun, Z. L., Zhang, H. Y. Perylenequinones act as broad-spectrum fungicides by generating reactive oxygen species both in the dark and in the light. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (26), 7722-7724 (2003).
  53. Weng, M., Zhang, M. H., Shen, T. Electron transfer interaction between hypocrellin A and biological substrates and quantitative analysis of superoxide anion radicals. Journal of the Chemical Society-Perkin Transactions. 2 (11), 2393-2397 (1997).
  54. Daub, M. E., Li, M., Bilski, P., Chignell, C. F. Dihydrocercosporin singlet oxygen production and subcellular localization: A possible defense against cercosporin phototoxicity in Cercospora. Photochemistry and Photobiology. 71 (2), 135-140 (2000).
  55. Zhang, S. W., et al. Perylenequinonoid-catalyzed photoredox activation for the direct arylation of (het)arenes with sunlight. Organic & Biomolecular Chemistry. 17 (17), 4364-4369 (2019).
  56. Zhang, Y., et al. Perylenequinonoid-Catalyzed [4+1]-and [4+2]-Annulations of Azoalkenes: Photocatalytic Access to 1, 2, 3-Thiadiazole/1, 4, 5, 6-Tetrahydropyridazine Derivatives. Journal of Organic Chemistry. 84 (12), 7711-7721 (2019).
  57. Li, J., et al. Cercosporin-Bioinspired Selective Photooxidation Reactions under Mild Conditions. Green Chemistry. 21 (22), 6073-6081 (2019).
  58. Tang, Z., et al. Cercosporin-bioinspired photoreductive activation of aryl halides under mild conditions. Journal of Catalysis. 380, 1-8 (2019).
  59. Li, J., Bao, W., Zhang, Y., Rao, Y. Cercosporin-photocatalyzed sp3 (C-H) Activation for the Synthesis of Pyrrolo[3,4-c]quinolones. Organic & Biomolecular Chemistry. 17 (40), 8958-8962 (2019).
  60. Wang, F., Chen, C., Deng, G., Xi, C. J. Concise Approach to Benzisothiazol-3(2H)-one via Copper-Catalyzed Tandem Reaction of o-Bromobenzamide and Potassium Thiocyanate in Water. Journal of Organic Chemistry. 77 (8), 4148-4151 (2012).

Tags

כימיה סוגיה 161 Perylenequinonoid Cercoספורין פוטוזרז 1 2 3-Thiadiazole 1 4 5 6-הידרוהידרופירודאזין הטרונוקלס
צרקוספורין-פוטוזרז [4 + 1]-ו [4 + 2]-אוספים שנתיים של האזובחות בתנאים מתונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Icyishaka, P., Li, C., Lu, L., Bao,… More

Icyishaka, P., Li, C., Lu, L., Bao, W., Li, J., Zhang, Y., Rao, Y. Cercosporin-Photocatalyzed [4+1]- and [4+2]-Annulations of Azoalkenes Under Mild Conditions. J. Vis. Exp. (161), e60786, doi:10.3791/60786 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter