Summary
ラットの上腸間膜動脈(SMA)における長期注入のためのアクセスは、SMAの近位枝のカンヌレーションから成る外科的処置である。カニューレは腹部の傷口から出て、皮下空間を通って肩甲骨の折り畳みに戻る。
Abstract
上腸間膜動脈は、大腿動脈または腋窩動脈の低侵襲放射線カテーテル法を介してヒトでカニューレ化することができる。SMAのカンヌレーションは、小さな解剖学的寸法のためにラットでより困難である。この研究の目的は、無制限の動物でSMA血管床への薬物の長期注入を行うためのラットにおけるSMAのカヌレーションのための外科的技術を記述することである。
SMA血栓症のリスクを回避するため、または直接アクセスからの出血を避けるために、SMAの近位枝が単離され、遠方に結紮され、大腸からSMAの起源に近い先端が進行する0.25mmのポリウレタン毛細管管でカニューレートされる。カニューレは、動物の首の後ろと人工弁を介して皮膚を通って皮下にトンネル状にトンネル化されます。カニューレの外部部分は、半硬質の支持システムに挿入され、ラットが自由に動くケージの外の連続注入ポンプに接続されます。
カニューレの正しい位置は、手術後の血管造影および検死所見によって実証された。SMA領域への生理食道注入の24時間後のカテーテルのステイシーは、ポンプの全排出および血液サンプリングまたは生理食前注入のための機能的カニューレの認識によってほとんどのラットで保証された。
Introduction
ラットのようにヒトの上腸間間膜動脈(SMA)は腹部大動脈に由来し、十二指腸から近位横結腸に動脈血を腸に供給する。SMAは、多数の枝を生み出します。
毛細血管灌流後、腸間膜循環は門脈を通して肝臓に排出され、そこで肝代謝を受けて全身循環に読み込まれる。SMAのカンヌレーションは、診断目的、治療塞栓化および薬物注入に対して、選択的または連続的な方法で、腸への影響を評価するか、または最も重要なのは、肝臓代謝および化学的クリアランスに有用である。ヒトでは、SMAの低侵襲放射線カテーテル化は、経大または半軸からの穿刺およびカヌル化のようないくつかの経皮的アプローチを用いて、血管内治療1 または選択的薬物注入2 のために行われる。
小さな腹部のカヌレーションの異なる技術の文献報告があります:上腸間膜静脈(SMV)3、下腸間膜動脈(IMA)4、腸間膜リンパ管5、肝動脈6 、またはラットの腸 灌流7のエクスビボの研究。静脈側と比較して、ラットにおけるSMAのカヌレーションは、血栓症および出血の同時リスクのためにはるかに厳しく、その高圧を提供した。特に、ラットが手術用ベッドの麻酔から目を覚ますと、手術後にケージに遊離動物が必要な場合に、カヌレーションが作動している場合に問題が発生する。
最近の論文では、麻酔下の動物における実験(血圧測定)の一環としてSMAカヌル化が記載されています8。しかし、無制限の動物における長期注入に対するSMAの外科的カヌレーションには何の技術も記載されていない。この原稿の目的は、少なくとも24時間(および以上)間膜床への薬物の選択的注入を可能にする近位枝を通してSMAの長期カヌル化のための外科的技術をステップごとに記述することである。安定した丈夫なカヌル化は、カテーテルが挿入された容器の恒久的な結紮および閉鎖を必要とするため、この技術は代わりにカテーテルをSMA9 に直接挿入することを避け、近位枝のカヌレーションを通して、できるだけ大腸からのSMAの非常に起源に近づく。近位注入は、注入された薬物が主な血管を通る血流を閉じることなく、可能な限り最も広い解剖学的ベッドに到達することを可能にする。
ラットSMAカンヌレーション技術は多くの用途を有する。腸間膜動脈区画で選択的に薬物を投与して、胃腸レベルで局所作用を得て、全身作用や肝薬物代謝を回避することが可能であろう。SMAカニューレ化ラットモデルは、より大きな動物モデルよりも利点があります:それはより安価であり、倫理的に受け入れられ、実行し、学ぶ方が簡単です。SMAカヌリン化手術は、マウスモデルに比べてラットモデルでも行いやすい。
Protocol
この原稿に記載されている研究は、地元の動物倫理委員会(ローマのサクロ・クオーレ大学)によって承認され、イタリア保健省に従って行われました。
1. SMAの近位枝に挿入するためのカニューレの調製
- 0.93mmの大きなカニューレを必要な長さ(約30cm)に切ります。
- 小さなカニューレ(0.4 mm O.D、0.25 mm I.D.)を約5cmの長さに切り、大きなカニューレに1cm挿入します。
- 2つのカニューレをシアノクリレート接着剤で一緒に固定し、内腔の閉塞を避けます。
- より大きなカニューレの自由な極度を、生理食音溶液で満たされた1 mLのシリンジに取り付けられたLuerスタブアダプタ(23 G)に接続します。
- SMAの枝にカテーテルを挿入できるように、小さなカニューレの自由な先端をハサミで研ぎ澄まします。
- 生理液で洗い流してカニューレの熟愛を確認します。
注意:カニューレの鋭い端は固定され、容器に沿って滑らないので動物の動きの間に動脈を損傷しない。
2. 手術のためのラットの準備
- ケタミン/キシラジン(100/10 mg/kg)で筋肉内麻酔を行います。
注:十分な麻酔深さは、足ピンチ反射の欠如または近い不在によって判断されます。 - 外科領域から毛皮を剃る:SMAカニューリンの枝のための腹部、およびカニューレ出口のための首の後ろ。
- 外科的な足のピンチ反射を使用して無菌の外科領域をきれいにしなさい。
注: すべての準備は無菌技術で行う必要があります。 - スクラブまたは溶液を円形運動で塗布し、続いて滅菌生理液または70%エタノールを3回加える。
- 動物を、4本の手足を固定して、動物を上の位置に置きます。
3. SMAの近位枝のカンヌレーション
- 切開前に足ピンチ反射をテストすることにより、適切な麻酔深さを確認します。
- 無菌の外科、耐水性のカーテンを適用する。
- メスの刃で、腹膜にすべての腹部面を通して、中胃領域の正中線にまっすぐ3cmの切開で腹壁を開きます。
- 手術ドレープの上に開腹切開の周りに、生理液を浸したガーゼを置く。縫合糸を使用して外科的切開を開いたままにします。
注:すべての綿棒および外科用器具は無菌でなければなりません。 - 綿棒を使用して小腸を識別し、露出します。腸間質を識別するために、その自然な性質に従ってください。腹腔内切りから腸間腸を抽出し、ガーゼの上に下向きに置きます(図1A)。
- 脈動を感じることによってSMAを識別する。
- 綿棒を使用して腸間脂肪の間を「道を作る」とSMAとその近位枝の2-3を明らかにする。
- SMAの近位枝を選択して、カニュールの外科的操作を可能にするのに十分大きい。この枝を(4-0シルク縫合糸で)その起源から下流に3〜4 cm結び、後で操作するのに十分な長さの縫合糸を維持するその拡張を可能にします。
- SMA のブランチの下に固定サポートを配置します。外科鉗子のハンドルはここで十分である。
- 小さなカニューレ(反対の四肢で大きなカニューレと連結)の端を鉗子を使用して支配的な手で保持し、縫合端をもう一方の手で引っ張って容器を緊張させ、カテーテルの侵入を容易にする(図1B)。
- 血管の平面から、血管の平面から血流と反対の方向に20°の角度でカニューレの先端を保持します。
- 先端を軽く押して動脈壁を貫通し、カニューレを挿入します。
注:カヌレーションは動脈を切断せずに行われます。カテーテルの先端は容器の壁を壊し、入り口を促進する。カニューレに戻って流れる血液は正しい挿入を確認する。 - SMAから原点に近い動脈枝に別の1cmのカニューレの挿入を続ける。
- 外科用結び目(4-0シルク)でカニューレを動脈に固定し、1 mLの無菌生理液を洗い流すか、血液サンプリングで正しく機能していることを確認します。
4. カニューレのトンネリングと輸液支援システムへの配置
- 動物の位置を変更する前に切開に無菌の外科用ドレープを置きます。
注:後ろから腹部へのトンネルは、尖った外科器具で皮下空間に圧力をかけることで作成されます。腹部および背中の切開部に無菌の外科用ドレープを使用する必要があります。 - 首の後部領域の1cmの切開を行い、球状弁を収容する。
- 腹腔切れから頸部に置かれた弁にカニューレを通して皮下組織を通す(図2A)。カテーテルプラグでカニューレの遠位を閉じて、空気の流入を避けます。
- 腹腔内の小腸を交換してください。腹壁を閉じ、連続した3-0シルク縫合糸で皮膚切開を閉じます。
- ステッチで首の皮膚にバルブを固定します。連続した3-0シルク縫合糸で皮膚切開を閉じます。
5. 術後管理
- ボタンバルブを保護するために、ジャケットでラットをドレスアップ。注入の間に鋼鉄棒でカニューレの露出部分を保護し、弁にそれをしっかり止める(図2B)。
注:手術は無菌技術で行われるため、抗生物質は示されていません。NSAIDは、疼痛制御のために術前投与する必要があります (5 mg/mL メロキシカム注射, 1 mg/kg 1 日 1 回最大 3 日間).操作後、ラットを注入時(24h)の代謝ケージで安定化させる。次に、注入系を分解するのに必要な時間のイオブルラン吸入でラットを再麻酔します。その後、12時間の明暗サイクルと食料と水への自由なアクセスと通常のケージにラットを収容することが可能です。 - 注入時の代謝ケージでラットを安定させる。ネズミは今目を覚まし、ケージの中で自由に動いて食べることができます。
- カニューレの遠位の端数を、50 mLの無菌生理食糸溶液で満たされたエラストマーポンプ(最大100 mL体積、5.0 mL/h流量)に接続します。24時間の注入を進めます(図2C)。
- 最初の日に、筋肉内抗生物質(最初の24時間のエンロフロキサシン10mg /kg)を投与し、経口投与(飲用水中500mLで500mgのエンロフロキサシン100mg)に渡す。目覚め時に筋肉内で鎮痛療法を分配する (ケトプロフェン 5.0 mg/kg) 次の日に経口 (パラセタモール 200 飲料水中 mg).
注:飲料水中に投与される希薄な経口療法は、耐え難い味を得る。体重測定と水分補給を監視します。 - 注入時間の終わりに(24時間)は、ラットからポンプ、ジャケット、スチールロッド、およびバルブを除去することによって、動物の外部注入システムを分解する。カニューレが首から出てくると閉じて切り取り、縫合糸を巻いた後に首の皮膚の下にこの四肢を残します。
注:この段階では、イオブルオレアン吸入によって数分間ラットを麻酔する必要があるかもしれません。 - 12時間の明暗サイクルと食料と水への無料アクセスを備えた通常のケージに、ラットを個別に収容します。
注:ベースラインポストオペ食品摂取量は約30g/日ベースラインの水の摂取量は約50ml/日である。平均体重は約 400 mg である必要があります。.
Representative Results
本研究では、15匹のラットに対して手順を行った。生理食動物の注入の24時間の終わりに、代謝ケージでは生理食いまたは失血の徴候は観察されておらず、腹部の傷はケージと同様にすべての動物できれいであった。
通常のケージでは、ラットは体重と水分/食物摂取量の毎日の監視と5日間観察されました。この間、総検査での動物の一般的な状態は、行動異常の徴候なしで良好であった。手術直後にすべてのラットが再び餌を与え始めた。1日平均の食料と水の摂取量は、 それぞれ図3A と 3B に示すように、3日後に通常まで徐々に増加した。 図3Cでは、体重増加が規則的であったことが分かり、観察期間の終わりまで徐々に増加する。腸の動きの変更は行われず、毎日の便と尿の出力は正常でした。
24時間後、生理液を50mL充填したポンプ2個(それぞれ40mLおよび20mL)に生理液残渣(それぞれ40mLおよび20mL)があり、他の全て(86.7%)は空であった。さらに、この注入期間の後、12カヌラ(80%)は、血液サンプリングおよび生理食合注入(5mL)の両方に対して依然として機能していたが、3カニューラはもはや特許ではなかった(これらの2は残渣を有するポンプに連結されたカニューラであった)(表1)。
壊死では、カニューラ(n=15)の100%がまだSMA枝に位置し、ラットは腸虚血の徴候を持っていなかった(図4B)または内腹部出血。3つの閉塞したカニューラは、SMA枝への挿入からそれぞれ0.5cm、1cmおよび1.5cmでキンクされた。この現象は、おそらくケージ内の動物の動きによるものです。
5匹のラットにおいて、処置後およびポンプ接続前の直後に、2mLのヨウ素化造影剤を腸間膜カニューレに注入し、画像増強剤を介して血管造影を得た(血管造影は術中に行われた)。各ラット(n=5)では、 図4Aに示すように、対照培地が腹部に広がることなく、腸間間膜動脈円とそのSMAとその主枝を見て、陽性であった。これはカニューレが十分に配置され、SMAの枝に固定されていることを確認した。
図1:実験写真 (A)ガーゼ上の自然な性質に続く小腸(すべての枝でSMAを視覚化することが可能です)。(B) カニューレを SMA ブランチに挿入するオペレータ。チューブの挿入を保証するために、容器の下に固体支持を持っている必要があります。遠位絹縫合糸は容器を閉じ、近位の縫合糸は枝の中のカテーテルを固定する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:輸液支援システム (A) 皮下にトンネルを掘ると、カニューレは白い弁を通って首の後部領域から現れる。(B)白い弁を安定させるためにジャケットを着たネズミ。鋼棒は注入の間カテーテルを保護する。(C)鋼棒を出るカニューレに接続されたエラストマーポンプで生理食動物の注入中に代謝ケージに収容されたラットの図示。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:5日間の観察期間におけるラットの食物摂取、水分摂取量および体重増加(n=15)の代表的データ。 1日平均食物(A)と水(B)の摂取量は徐々に増加し、3日後に生理的レベルで安定化する。平均体重増加(C)は、観察期間の終わりまで徐々に増加する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:(A)カニューレ(カニューレの十分に配置されたカニューレの証明)と(B)剖解剖中にまだ十分に位置づけられたカニューレを通してのコントラスト注入後の間隔膜動脈領域のコントラスト血管造影を撮影してください。
| エラストマーポンプ | カニューレ | |||
| 空 | 残留物付き | 特許 | 特許ではない | |
| n=15 | 13 | 2 | 12 | 3 |
| % | 86.7 | 13.3 | 80 | 20 |
表1:24時間の生理食糸後のエラストマーポンプ排出およびカニューレの敗血を起こす。 パテンシーは、注射器で血液を引き出し、カニューレに5mLの生理食音を注入することによって試験された。
Discussion
このラットSMA注入モデルの主な利点は、動物の大半で少なくとも24時間の安定性と耐久性です。抗凝固剤の注入は、この時間間隔を長くする可能性があります。このモデルは、小腸および結腸の近位部分を標的とする腸間膜領域における薬物の信頼できる注入を可能にする。
このテクニックを成功させるためには、いくつかのステップが重要です。非常に小さな容器でカヌリン化を達成するためには、少なくとも400グラムの重さのラットを選択することが重要です。性別と年齢は関係ありません。正しい手術器具とカニューレの種類を選択することも重要です。ここでは、より小さなポリウレタンカニューレ(0.4 mm O.D,0.25mm I.D.)を大きなカニューレ(0.93mm O.D,0.5mm I.D.)に1cm挿入し、小さな動脈と大きな注入系への両方の接続を可能にする機能的で有用なカテーテルを得る。
最初の外科的重要なステップは、周囲の脂肪組織からカヌル化のために同定されたSMAおよび分岐を洗浄することである(ステップ3.5)。これは、組織と動脈の間のカニューレの挿入を避けるのに役立ちます, これは、一般的な間違いです.しかし、この洗浄工程は、SMAの小枝が壊れやすく、損傷しやすいため困難である。枝が負傷した場合、合字による出血を止め、動物を無駄にしないように別の近位枝を選択することが可能である。
カニューレ内の気泡の形成を防ぎ、ガス塞栓を避けるために、カニューレは枝に挿入する前にチップまで生理液状で満たされなければなりません。カニューレを所定の位置に固定するには、外科用糸(4-0シルク)の適用は、カテーテルの周りの血管の上に、動脈に挿入点とカニューレ先端の間になければなりません。外科的結び目はカニューレを固定するのに十分タイトでなければならないが、それを閉塞させるにはあまりにもきつくない(ステップ3.12)。
正しいカニューレを確保する最善の方法は、カニューレを通って血流を見る(ステップ3.10)。トラブルシューティングの観点から、この問題が発生しない場合は、次の理由が考えられます。
カニューレは動脈に正しく挿入されなかった。
カニューレは動脈の内側にあるが、ノードが間違った位置に閉塞している;
カニューレは動脈の内側にあり、カニューレの気泡は流れを遅くしている。
カニューレ内に血栓が形成されている。
誤った挿入は、動脈と脂肪組織の間の空間におけるカニューレの位置に起因する可能性がある。この場合、再挿入が必要です。容器の上の結び目がカニューレを閉塞するとき、それを非常に注意深く解き、それを作り直すことができる。カテーテルの小さな気泡は、一般的にカヌレーションを損なわないし、生命を脅かすものではない。しかし、カニューレに大きな気泡がある場合は、注射器を使用してカニューレに引き戻すか、別の枝にカテーテルを再配置する必要があります。通常、血栓形成を回避し、運転中にたまに0.2 mLの生理液のボラスを注入することによってカニューレ特許を保持することが可能である。
この研究の限界は、より長い注入時間におけるカニューレの愛味の過小評価である:ここでは、代謝ケージに収容されたラットの間に24時間の注入が行われた。より長い注入期間を得るために、抗凝固療法を使用することが有用であり得るが、本研究では投与されない。しかし、注入の間、ラットは注入系を支える唯一のものであるので、代謝ケージに収容されなければならない。この場所は、より長い期間治療するとストレスを受ける可能性のある動物にとって不快です。さらに、注入には生理食合溶液のみを使用したので、特定の薬物投与に関する結果はない。この方法の1つの制限は、カテーテルに使用される上記の動脈枝(存在する場合)に注入することが不可能である。このため大オルタから最も近い枝をカニュールすることをお勧めします。
拘束されていない動物に対する他のラットSMA長期注入モデルは、文献に存在しない。何年も前に説明したIMAのカヌレーションモデルと比較して、ここで説明した技術は、SMA灌流領域における薬物注入を可能にし、結腸に限定されないので、より広い実験対象を有する。最近では、初めて、SMAの枝の選択的なカヌルが腸平滑筋10に及ぼす影響を研究するために動脈腸間膜領域に直接ボツリヌス毒素を注入するために使用されたが、他の多くの薬物は将来的にテストすることができる。例えば、抗凝固剤は、腸間膜血栓症、または腸内微生物叢action11 または炎症性腸疾患に対する薬物を有する薬物を研究するために注入することができる12。動脈内注入は、特に、血液が肝代謝を受ける門脈循環を通過する前に薬物効果が高く評価されるため、腸代謝研究に有用である。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らはCen.Ri.Sを認めたいと思っています。許可のためにローマのカトリカ・デル・サクロ・クオーレ大学の(セントロ・ディ・ライスチェ・スペリメンタリ)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crile-Wood Needle Holder | 2Biological Instruments | Tip Shape: Straight; Tip Width: 2 mm; Clamping Length: 14 mm; Lock: Yes; Scissors: No; Alloy / Material: Stainless Steel; Length: 15 cm; Serrated: Yes | |
| Extra Fine Graefe Forceps | 2Biological Instruments | Tip Width: 0.5 mm; Tip Dimensions: 0.5 x 0.5 mm; Alloy / Material: Stainless Steel; Length: 10 cm | |
| Luer Stub Adapter | BD Intramedic | 23 gauge for use with 427410 tubing | |
| Membrane valve | Biomed | Mod 617 | |
| Poliurethane Catheter | ENKI | external diameter: 0.4 mm, internal diameter: 0.25 mm | |
| Silastic Catheter Laboratory tubing | Healthcare industries | 508-002 | |
| Spring Scissors | 2Biological Instruments | Tip Shape: Angled; Tips: Sharp; Alloy / Material: Stainless Steel | |
| Student Surgical Scissors | 2Biological Instruments | Tip Shape: Straight; Alloy / Material: Student Stainless Steel; Serrated: No; Feature: Student Quality |
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