Summary
Presentato qui è un protocollo per la registrazione dei cicli di recupero della velocità muscolare (MVRC), un nuovo metodo di esame delle proprietà della membrana muscolare. Gli MVRC consentono la valutazione in vivo del potenziale della membrana muscolare e alterazioni della funzione del canale ionico muscolare in relazione alla patologia e consentono la dimostrazione della depolarizzazione muscolare nei muscoli neurogenici.
Abstract
Anche se gli studi convenzionali di conduzione nervosa (NCS) e l'elettromiografia (EMG) sono adatti per la diagnosi di disturbi neuromuscolari, forniscono informazioni limitate sulle proprietà della membrana della fibra muscolare e sui meccanismi della malattia sottostante. I cicli di recupero della velocità muscolare (MVRC) illustrano come la velocità di un potenziale di azione muscolare dipenda dal tempo dopo un potenziale di azione precedente. Gli MVRC sono strettamente correlati ai cambiamenti nel potenziale della membrana che seguono un potenziale d'azione, fornendo così informazioni sulle proprietà della membrana della fibra muscolare. Gli MVRC possono essere registrati in modo rapido e semplice mediante stimolazione diretta e registrazione da fasci multifibra in vivo. Gli MVRC sono stati utili nella comprensione dei meccanismi della malattia in diversi disturbi neuromuscolari. Studi condotti su pazienti con channelopatie hanno dimostrato i diversi effetti di specifiche mutazioni del canale ionico sull'eccitabilità muscolare. MVRC sono stati precedentemente testati in pazienti con muscoli neurogenici. In questo studio precedente, il periodo di rifrazione relativa muscolare (MRRP) è stato prolungato, e la supernormalità precoce (ESN) e la tardiva supernormalità (LSN) sono state ridotte nei pazienti rispetto ai controlli sani. In questo modo, gli MVRC possono fornire prove in vivo della depolarizzazione della membrana in fibre muscolari umane intatte che sono alla base della loro ridotta eccitabilità. Il protocollo qui presentato descrive come registrare mVRC e analizzare le registrazioni. Gli MVRC possono fungere da metodo veloce, semplice e utile per rivelare i meccanismi della malattia in un'ampia gamma di disturbi neuromuscolari.
Introduction
Gli studi di conduzione nervosa (NCS) e l'elettromiografia (EMG) sono i metodi elettrofisiologici convenzionali utilizzati per la diagnosi di disturbi neuromuscolari. NCS consente di rilevare la perdita assonale e la demielinazione nei nervi1, mentre EMG può distinguere se la miopatia o i cambiamenti neurogenici sono presenti nel muscolo a causa di danni ai nervi. Tuttavia, NCS o EMG forniscono informazioni limitate sulle proprietà della membrana della fibra muscolare e sui meccanismi della malattia sottostanti. Queste informazioni possono essere ottenute utilizzando elettrodi intracellulari in muscoli isolati dalle biopsiemuscolari 2,3,4. Tuttavia, è di importanza clinica utilizzare metodologie utilizzando registrazioni da muscoli intatti nei pazienti.
La velocità di un secondo potenziale di azione fibra muscolare cambia in funzione del ritardo dopo il primo5, e questa funzione di recupero della velocità (o ciclo di recupero) ha dimostrato di cambiare nei muscoli distrofici o denervati. La resa di tali registrazioni da fibre muscolari singole era, tuttavia, troppo bassa per essere utile come strumento clinico6. Tuttavia, in seguito, la commissione per la protezione dell'ambiente e la protezione dell'ambiente, non è stata in grado di ottenere tali registrazioni in vivo7. In questometodoviene utilizzata una sequenza di stimoli elettrici a impulsi accoppiati con intervalli interstimoli variabili (ISI).
I parametri MVRC valutati includono i seguenti: 1) periodo refrattario relativo muscolare (MRRP), che è la durata dopo un potenziale di azione muscolare fino a quando il prossimo potenziale di azione può essere suscitato; 2) supernormalità precoce (ESN); e 3) supernormalità tardiva (LSN). ESN e LSN sono i periodi dopo il periodo refrattario in cui i potenziali di azione vengono condotti lungo la membrana muscolare più velocemente del normale. L'accumulo depolarizzante postpotenziale e di potassio nei tubuli t del muscolo rispettivamente, sono ipotizzati come le principali cause per i due periodi di supernormalità.
L'ampia applicabilità degli MVRC ai disturbi muscolari è stata dimostrata nel rilevamento della depolarizzazione della membrana in ischemia7,10,12 e insufficienza renale13, oltre a fornire informazioni sulle anomalie della membrana muscolare nella miopatia della malattia critica14 e miosite corporea di inclusione15. Da allora sono stati introdotti i protocolli di simulazione intermittenti da 15 e 20 Hz. Gli MVRC, insieme a questi protocolli aggiuntivi, hanno dimostrato i diversi effetti sulla eccitabilità della membrana muscolare legati alle mutazioni di perdita di funzione o guadagno di funzione in vari canali ionici muscolari nelle channelopatie degli ioni muscolari ereditari (cioè, canale di sodio miotonia, paramiotonia congenita16, distrofia miaotonica17, Sindrome di Andersen-Tawil18, e miotonia congenita19,20).
In un recente studio, l'applicabilità degli MVRC ai muscoli neurogenici è stata dimostrata per la prima volta. Il termine "muscolo neurogenico" si riferisce ai cambiamenti secondari nei muscoli scheletrici che si sviluppano come denervazione e reinnervazione dopo qualsiasi lesione alle cellule del corno anteriore o agli assoni motori. La denervazione è caratterizzata in EMG come attività spontanea (ad esempio, fibrillazioni [fibs] e onde taglienti positive [psws]), mentre grandi potenzialità di unità motorie con durata prolungata e aumento dell'ampiezza presentano reinnervation21. I cambiamenti EMG sono evidenti nei muscoli denervati, ma i cambiamenti cellulari sottostanti nei potenziali della fibra muscolare sono stati dimostrati solo in studi sperimentali sul tessuto muscolare isolato2,3,4. Gli MVRC forniscono ulteriori informazioni sulle proprietà della membrana muscolare umana in vivo per quanto riguarda il processo di denervazione.
Questo documento descrive in dettaglio la metodologia degli MVRC. Riassume anche i cambiamenti nei muscoli neurogenici in un sottogruppo di pazienti da uno studio precedentemente riportato22 e soggetti di controllo sani che consente di determinare se il metodo è appropriato per uno studio pianificato.
Le registrazioni vengono eseguite utilizzando un protocollo di registrazione che fa parte di un programma software. Altre apparecchiature utilizzate è uno stimolatore di corrente a corrente costante lineare isolato, un eliminatore di rumore di 50 Hz, un amplificatore elettromiografico isolato e un convertitore analogico-digitale.
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Protocol
Tutti i soggetti devono fornire il consenso scritto prima dell'esame e il protocollo deve essere approvato dall'appropriato comitato di revisione etica locale. Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato Etico Scientifico Regionale e dall'Agenzia danese per la protezione dei dati.
1. Preparazione del soggetto
- Valutare le storie mediche dei soggetti per assicurarsi che non abbiano disturbi del sistema nervoso precedenti diversi dal gruppo di malattie che verrà studiato.
- Informare l'argomento in dettaglio sugli esami e richiedere il consenso scritto.
- Informare il soggetto circa l'inserimento di due aghi in un muscolo della gamba e che le fibre muscolari saranno stimolati con corrente debole.
- Spiega che la sensazione può sembrare leggermente sgradevole.
- Informare il soggetto che la stimolazione può essere disattivata immediatamente in qualsiasi momento durante la registrazione in caso di disagio.
- Pulire la parte inferiore della gamba del soggetto con l'alcol.
- Inserire l'elettrodo aghi monopolare stimolante (25 mm x 26 G) sopra il muscolo tibiale anteriore e l'elettrodo di superficie adesivo come l'anodo distale di 1 cm all'ago monopolare (Figura 1).
- Posizionare un elettrodo di terra distale per l'anodo.
- Inserire l'elettrodo dell'ago concentrico di registrazione (25 mm x 30 G) circa 2cm prossimale per l'elettrodo ago monopolare stimolante lungo le fibre muscolari (Figura 1).
- Collegare l'ago concentrico di registrazione e gli elettrodi a terra al preamplificatore.
- Chiedere al soggetto di rimanere in silenzio ed evitare il movimento durante l'esame.
- Azzerare l'uscita dello stimolatore e collegare gli elettrodi stimolanti allo stimolatore (Figura 1).
- Mantenere la temperatura della pelle tra i 32 e i 36 gradi centigradi utilizzando una lampada riscaldante.
2. Registrazione degli MVRC
- Avviare il software di registrazione semi-automatica utilizzando il protocollo di registrazione eccitabilità muscolare e accendere lo stimolatore. Le stimolazioni inizieranno a 2,5 mA con 1 Hz.
- Aumentare manualmente l'intensità dello stimolo premendo il tasto Inserisci fino a quando non viene registrata una risposta (max : 10 mA).
- Regolare gli aghi stimolanti e di registrazione, se necessario, fino a registrare una risposta accettabile con un'intensità di stimolo inferiore a 10 mA. La forma del potenziale di azione muscolare dovrebbe essere triphasica, se possibile, e stabile. Evitare grandi contrazioni di tutto il muscolo.
- Invertire il potenziale di azione muscolare premendo il tasto meno (-) se il potenziale appare capovolto.
NOTA: sullo schermo viene visualizzata una linea orizzontale magenta che indica la larghezza del potenziale di azione.
- Regolare la posizione e la lunghezza della linea magenta trascinando la linea con il mouse. La linea orizzontale verde rappresenta la linea di base.
- Fare clic su OK per avviare la registrazione degli MVRC.
- Selezionare una relazione di risposta di stimolo dalle opzioni principali.
- Aumentare l'intensità dello stimolo premendo il tasto Inserisci a un massimo di 10 mA o tollerabile.
- Fare clic su OK per iniziare a decrescente la curva di risposta allo stimolo.
- Fare clic su OK quando lo stimolo di test raggiunge lo zero.
- Impostare l'intensità dello stimolo su level per una latenza stabile.
- Fare clic su OK per tornare al menu principale.
- Selezionare l'opzione 1/2/5 stim di condizionamento per RC.
- Selezionare un protocollo dalle opzioni del ciclo di ripristino (ad esempio, avviare il ciclo di ripristino rapido [ignora ritardi alternativi]), che è l'impostazione predefinita.
NOTA: la registrazione continua automaticamente per 34 passaggi con intervalli interstimolati decrescenti (ISI). - Assicurarsi che il potenziale di azione muscolare è stabile durante la registrazione e che l'ago non si è mosso. La schermata passa automaticamente alle opzioni principali una volta completati i 34 passaggi.
- Fare clic su Termina registrazione . Chiudere il file OK, a meno che non venga eseguita una frequenza di ramp-up o registrazioni a 20 Hz.
- Terminare la registrazione e salvare i dati facendo clic sul pulsante Chiudi file e salva dati.
3. Analisi MVRC
- Avviare il programma software di analisi per eseguire l'analisi offline.
- Selezionare la registrazione che verrà analizzata e fare clic sul pulsante OK.
- Fare clic su Carica parametri dal menu File.
- Selezionare l'opzione MANAL99 per l'analisi. Se questo non è presente nella lista, fare clic su Sfoglia per trovare questo file. Fare clic su OK per continuare.
- Quando viene visualizzata una descrizione dell'analisi di eccitabilità muscolare MAnal9, fare clic su OK per continuare.
- Invertire il potenziale di azione muscolare digitando MM-1 se il potenziale appare capovolto.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse per rendere visibile la linea magenta. Impostare la finestra sulla base della risposta di picco e con una larghezza corrispondente approssimativamente alla larghezza del potenziale di azione a quell'altezza. Trascinare con il mouse per regolare la finestra. La finestra determina le latenze entro le quali vengono misurate l'altezza e la latenza, come indicato dalle linee blu pallido, mentre la linea verde indica la linea di base. Fare clic su OK per continuare.
- Fare clic su OK per rimisurare le latenze e i picchi. Questa operazione verrà eseguita automaticamente.
NOTA: Nel display delle latenze rimesmite, le latenze vengono misurate in ritardi più brevi rispetto a quelli originali. Questo perché le risposte agli stimoli di condizionamento da sole sono state sottratte dalle risposte al condizionamento più il test. Ciò garantisce che gli stimoli di condizionamento non interferiscano con le misurazioni della latenza. Come indicato nella casella di richiesta, i singoli punti non superati possono essere eliminati posizionando il cursore (linea rossa verticale) sul punto e premendo il tasto . Il punto non valido viene sostituito con la media dei valori su entrambi i lati nello stesso canale. Se non sono presenti punti non necessari, impostare DE (fine visualizzazione) su appena dopo l'ultima latenza richiesta. - Fare clic su OK per creare un file RMC.
- Ignorare la maggior parte delle opzioni visualizzate nel modulo "Crea RCC o RMC", poiché queste riguardano le misurazioni della fibra C anziché degli MVRC. Fare clic su Salva ed esci per continuare. Dopo aver salvato il file RMC, la casella di richiesta fornisce diverse opzioni
- Se sono stati registrati dati di rampa di frequenza e/o di stimolazione ripetitiva, seguire le istruzioni per analizzarli. In caso contrario, selezionare l'opzione Vai direttamente per creare un file MEM per creare un file MEM. Fare clic su OK per continuare.
- Fare clic su Salva ed esci per continuare.
- Fare clic su OK per aggiungere i dati RMC al file MEM.
- Fare clic su Aggiungi da file RMC di input per aggiungere questi dati al file MEM, quindi modificare la directory in modo da salvare il file MEM composito. Quindi, fare clic su Salva ed esci per salvarlo.
- Fare clic su OK per salvare il file Q-D rimisurato in modo da consentire la differenziazione dal file Q-D originale utilizzando un segno .
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Representative Results
I seguenti risultati sono stati ottenuti in un sottogruppo di pazienti da un recente studio22, in cui c'erano fibs/psws in tutti i siti che mostravano una prossucusia attività di denervazione. I risultati hanno mostrato che i cambiamenti nelle fibre muscolari dopo la denervazione sono stati valutati in vivo utilizzando la tecnica MVRC descritta in questo protocollo. Gli MVRC hanno mostrato cambiamenti coerenti con la depolarizzazione del potenziale della membrana a riposo nelle fibre muscolari neurogeniche.
Quattordici pazienti sono stati confrontati con 29 soggetti sani. I dati demografici dell'oggetto sono riportati nella tabella 1. Figura 2 illustra le registrazioni da un soggetto sano e paziente. La figura 3 e la tabella 2 illustrano il confronto tra gli MVRC dei pazienti e i soggetti sani. MRRP è stato prolungato e ESN e LSN sono stati ridotti nei pazienti rispetto ai controlli sani (Tabella 2, Figura 3).
Figura 1: Immagine della configurazione degli MVRC. (A) Stimolatore lineare di costante-corrente lineare isolato, (B) eliminatore del rumore di 50 Hz, (C) ha isolato l'amplificatore EMG e ( (D)il convertitore analogico-digitale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempi di registrazioni MVRC. Registrazioni dopo uno stimolo di condizionamento (rosso), due stimoli di condizionamento (verde) e cinque stimoli di condizionamento (blu) da un soggetto sano (A) e(B)paziente con radiculopathy L5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: MVRC con uno, due e cinque stimoli di condizionamento. (A) MVRC in 14 pazienti (linee grigie) rispetto al valore medio di 29 controlli sani (quadrati neri riempiti). La rappresentazione grafica della variazione percentuale della latenza viene tracciata rispetto agli ISI da 2 a 1.000 ms (scala logaritmica). (B,C): Uguale a (A), ma con due e cinque stimoli di condizionamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Controlli integri (n. 29) |
Pazienti (n. 14) |
|
| Età (anni) | 55,7 x 14,9 | 58,9 x 16,3 |
| Sesso (M/F) | 14/15 | 9/5 |
| Durata della malattia (mesi) | - | 3,4 x 2,7 |
| Punteggio MRC | - | 3.0 - 1.1 |
| Eziologia | - | Neuropatia peronale (9) Afflizione delle radici L5 |
Tabella 1: Caratteristiche demografiche e cliniche. I valori sono elencati come mezzi - deviazione standard. Questa tabella è stata modificata da Witt etal.
| Controlli sani (n. 29) |
Pazienti (n. 14) |
p-value per t-test | |
| MRRP (ms) | 3,5 x 0,4 | 7,6 x 3,1 | p - 6,8-8 |
| ESN (%) | 11,3 - 2,1 | 7,6 x 2,3 | p - 5,5-5 |
| ESN (ms) | 7,8 - 1,3 | 12,7 x 2,5 | p - 1,6-8 |
| 5ESN (%) | 13,7 x 2,5 | 1,0 - 0,6 | p - 9,3-10 |
| LSN (%) | 4.1 - 1,4 | 2.8 - 1,7 | p - 0,017 |
| XLSN (%) | 2,9 x 0,7 | 1,0 - 1,6 | p - 1,8-10 |
| 5XLSN (%) | 8,0 - 1,4 | 2,8 - 1,6 | p - 2,2-11 |
Tabella 2: Confronto dei parametri MVRC tra controlli sani e pazienti. MRRP - periodo di rifrazione relativo muscolare; ESN (%) : riduzione della latenza del potenziale di azione muscolare dopo uno stimolo di condizionamento come percentuale di stimolo non condizionato all'ISI di <15 ms. ESN (ms), ISI corrispondente all'ESN (%). 5ESN - picco di supernormalità precoce dopo cinque stimoli di condizionamento. LSN (%) - Riduzione della latenza del potenziale di azione muscolare dopo uno stimolo di condizionamento come percentuale di stimolo incondizionato all'ISI tra 100-150 ms. XLSN (%) - riduzione della latenza del potenziale di azione muscolare dopo due stimoli di condizionamento come percentuale di uno stimolo di condizionamento all'ISI tra 100-150 ms. 5XLSN (%) - riduzione della latenza del potenziale di azione muscolare dopo cinque stimoli di condizionamento come percentuale di uno stimolo di condizionamento a ISI tra 100-150 ms.
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Discussion
Gli MVRC, come programmato nel software di registrazione, sono una procedura altamente automatizzata, ma è necessaria attenzione per ottenere risultati affidabili. Nella fase di registrazione, durante la regolazione degli aghi, è importante evitare di stimolare la zona di fascia terminale o il nervo. Questo di solito porta a grandi contrazioni di tutto il muscolo, che aumenta il rischio di spostamento della stimolazione e/ o registrazione dell'ago durante la registrazione di MVRC. Fino ad oggi, il metodo è stato applicato a diversi muscoli che hanno meglio descritto zona di piastra finale; tuttavia, le piastre finali possono essere sparse (cioè nel muscolo tibiale anteriore). Pertanto, è necessaria una particolare attenzione.
Al fine di evitare la stimolazione della fascia o del nervo invece delle fibre muscolari, è necessario prestare attenzione quando si osserva il muscolo per contrazioni. L'ago monopolare stimolante deve essere spostato, così come l'ago concentrico di registrazione, per individuare un sito che non causa contrazioni. Inoltre, ai soggetti dovrebbe essere chiesto se provano dolore o meno. Le registrazioni MVRC non causano alcuna spiacevolezza, a meno che la zona di fascia o il nervo non sia stimolata al posto delle fibre muscolari.
Una limitazione del metodo MVRCs è l'esecuzione della registrazione in un solo sito e l'esame di poche fibre muscolari, che non rappresentano necessariamente l'intero muscolo. Questa limitazione è particolarmente importante nei disturbi in cui la patologia non è diffusa. Uno studio precedente ha trovato sorprendentemente alcuna differenza tra i pazienti con sclerosi laterale amiotrofica e controlli sani nonostante i muscoli denervati. Questo è stato probabilmente perché l'attività di denervazione non è stata registrata nel sito in cui sono stati registrati gli MVRC23. Inoltre non si può escludere che l'ago avrebbe potuto essere regolato in un luogo più sano con una risposta più ottimale.
Un'altra limitazione degli MVRC è che si può avere la tendenza a individuare le fibre muscolari sane mentre si regola l'ago di registrazione per ottenere una risposta stabile per le misurazioni. Un modo per superare questa limitazione può essere quello di fare le registrazioni da potenziali polifasici. Tuttavia, questo può rappresentare problemi per determinare una latenza accurata se ci sono picchi indifferenziati. Inoltre, anche se abbiamo intenzione di stimolare e registrare dallo stesso fascio di fibre muscolari, questi potrebbero non essere esattamente lo stesso. Il fascio stimolato può contenere diverse fibre durante l'esperimento in corso24.
Gli MVRC forniscono informazioni che non possono essere ottenute con i metodi elettrofisiologici convenzionali. Pertanto, non esiste un altro metodo nell'uso corrente che possa essere paragonato agli MVRC. Il precedente rapporto6, utilizzando elettrodi aghi a fibra singola per registrare in due siti dalla stessa fibra muscolare, era molto più difficile. Buone registrazioni sono state ottenute solo da 43 su 118 studi di fibra muscolare, e questo metodo non è stato adottato in laboratori di ricerca o cliniche. Un altro approccio simile ma non automatizzato utilizzato otto diversi ISI da 20 ms a 2 ms25. Gli autori hanno riferito che una registrazione ha preso 20-60 min, mentre questo metodo registra MVRC con 34 ISI in circa 10 min. L'analisi è anche veloce e altamente automatizzata.
In conclusione, MVRC è un metodo che può fornire informazioni inestimabili per comprendere i meccanismi sottostanti dei disturbi neuromuscolari. Per i pazienti in cui è stata identificata una mutazione in un gene del canale ionico, questo metodo fornisce anche dati sugli effetti di tali mutazioni specifiche sull'eccitabilità della proteina muscolare in vivo. Questo, insieme agli studi di espressione in vitro, consente una comprensione più accurata della fisiopatologia muscolare in questi pazienti. Questo metodo ha il potenziale per fornire informazioni sul ruolo di tali canali nella fisiologia muscolare normale, migliorando così la comprensione della malattia muscolare in generale. Sono necessari ulteriori studi con altri gruppi di pazienti e gruppi più grandi. Studi che registrano MVRC in muscoli diversi sono anche giustificati.
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Disclosures
H.B. riceve royalty da UCL per le vendite del suo software Qtrac utilizzato in questo studio. Gli altri autori non hanno potenziali conflitti di interesse. Tutti gli autori hanno approvato l'articolo finale.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto finanziariamente principalmente dalle due sovvenzioni della Lundbeck Foundation (numero di concessione R191-2015-931 e numero di sovvenzione R290-2018-751). Inoltre, lo studio è stato sostenuto finanziariamente dal Novo Nordisk Foundation Challenge Programme (numero di sovvenzione NNF14OC0011633) come parte del Consorzio Internazionale di Neuropatia Diabetica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 Hz Noise Eliminator | Digitimer Ltd | Humbug | |
| Analogue-to-Digital Converter | National Instruments | NI-6221 | |
| Analysing software program | Digitimer Ltd (copyright Institute of Neurology, University College, London) | QtracP, MANAL9 | |
| Disposable concentric needle electrode, 25 mm x 30G | Natus | Dantec DCN | |
| Disposable monopolar needle electrode, 25 mm x 26G | Natus | TECA elite | |
| Isolated EMG amplifier | Digitimer Ltd | D440 | |
| Isolated linear bipolar constant-current stimulator | Digitimer Ltd | DS5 | |
| Software and recording protocol | Digitimer Ltd (copyright Institute of Neurology, University College, London) | QtracW software, M3REC3 recording protocol written by Hugh Bostock, Istitute of Neurology, London, UK) |
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