Summary
الاستفادة من المجهر داخل مدينة، طريقة المقدمة هنا تمكن التصور في الوقت الحقيقي من الظهارية الأمعاء سفك الخلايا في الحيوانات الحية. لذلك ، يتم تصوير الغشاء المخاطي المعوي الملون موضعيًا (acriflavine و rhodamineB-dextran) من الفئران المُضنِع إلى دقة خلية واحدة باستخدام المجهر confocal.
Abstract
يسمح المجهر الداخلي للأمعاء باستخدام التصوير confocal الملاحظة في الوقت الحقيقي من سفك الخلايا الظهارية وتسرب الحاجز في الحيوانات الحية. ولذلك ، فإن الغشاء المخاطي المعوي للفئران المُجَنَّبة مُلطّخة موضعيًا بصبغ غير محدد (acriflavine) وتتبع فلوري (رودامين - ب ديكستران) ، مثبتًا على لوحة مشطفة بالمحلول الملحي ومصوّرة مباشرة باستخدام مجهر confocal. يمكن لهذه التقنية أن تكمل تقنيات أخرى غير الغازية لتحديد تسرب نفاذية الأمعاء، مثل مرور transmucosal من المقتفيات تدار شفويا. بالإضافة إلى هذا، النهج المعروض هنا يسمح بالمراقبة المباشرة للأحداث تسليط الخلية في الوقت الحقيقي. في تركيبة مع الفئران مراسل الفلورسنت المناسبة، وهذا النهج هو مناسبة لتسليط الضوء على الآليات الخلوية والجزيئية التي تتحكم في قذف الخلايا الظهارية المعوية، وكذلك لعمليات بيولوجية أخرى. في العقود الماضية، ساهمت دراسات مثيرة للاهتمام باستخدام المجهر داخل الرحم في المعرفة حول نفاذية الأمعاء البطانية، واتصال الأمعاء في الخلايا المناعية، والتواصل بين المناعة والظهارية، وغزو المكونات اللماحية، من بين أمور أخرى. معا، فإن البروتوكول المقدم هنا ليس فقط تساعد على زيادة فهم آليات التحكم في قذف الخلايا الظهارية، ولكن يمكن أيضا أن يكون أساسا للتنمية من النهج الأخرى لاستخدامها كأدوات لتصور عملية أخرى الخلوية ديناميكية للغاية، حتى في الأنسجة الأخرى. ومن بين القيود التقنية، فإن الخصائص البصرية للأنسجة المحددة، فضلا عن تكنولوجيا التصوير المختارة وتكوين المجهر، من شأنها أن تحدد بدورها مسافة عمل التصوير، ودقة الصور المكتسبة.
Introduction
الأمعاء هي جهاز متخصص للغاية مع وظيفة منظمة بإحكام تمكين العمليات المتضاربة، وهي التغذية والحماية من المواد الإنارة الضارة. بطانة بين الجسم البشري والبيئة، وظهارة المعوية بمثابة حاجز المادية والمناعية ويساهم في الحفاظ على التوازن المخاطي في القناة الهضمية1،2. ومن المعروف جيدا فقدان النزاهة الظهارية وزيادة نفاذية تقاطع ضيق أن تكون مرتبطة مع مرض التهاب الأمعاء (IBD)3,4,5,6. ثم تعتبر التعديلات الظهارية كمسببات ومكبرات الصوت الثانوية لالتهاب الأمعاء المزمن في IBD. وهكذا، فإن تحسين فهم التعديلات الظهارية المبكرة في القناة الهضمية لمرضى IBD ستكون ذات قيمة هائلة لتطوير استراتيجيات جديدة لاستعادة السلامة الظهارية للتنبؤ الموثوق بها والوقاية اللاحقة من الانتكاسات IBD.
يتبع ظهارة الأمعاء عملية دوران معقدة ومنظمة بإحكام. من أسفل سرداب، الخلايا الظهارية المعوية المتمايزة بشكل نهائي (IECs) المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات تهاجر صعودا إلى طرف villus، حيث يتم إلقاء الخلايا القديمة / التالفة في تجويف7. يمكن التوازن بين الانقسام وبثق الخلية الحفاظ على أرقام الخلايا الظهارية المعوية ، وتجنب تشكيل الثغرات والتسرب ، وكذلك تراكم الخلايا الظهارية التي يحتمل أن تؤدي إلى كتل الخلايا و ورمريجنيس8،9،10. على الرغم من الدور الرئيسي للخلية الظهارية ذرف في التجديد الفسيولوجي للظهارة القناة الهضمية، والمعرفة حول الآليات الجزيئية التي تقود قذف الخلايا في طرف villus محدودة. وهكذا، هناك حاجة للبحوث الأساسية التي توفر وصفا دقيقا لسلسلة من الأحداث الجزيئية التي تنطوي عليها الخلايا الظهارية ذرف.
التفاعلات المعقدة بين أنواع الخلايا المختلفة داخل الغشاء المخاطي المعوي هي المفتاح لفهم الآليات الجزيئية التي تنظم دوران الظهارية والأمعاء. وهكذا، في الدراسات الحية تقدم مزايا عالية على الأساليب في المختبر و السابقين في هذا السياق. وعلاوة على ذلك، تسمح تقنيات التصوير في الوقت الحقيقي بوصف تسلسل الأحداث التي تتحكم في ظواهر معينة. وفي هذا السياق، تتطلب دراسة العمليات ذات الحيوية العالية استخدام تقنيات عالية الدقة الأمثل للمراقبة المباشرة للأنسجة. تقنيات التصوير داخل الأتصال تظهر كأدوات فريدة مناسبة لدراسة الخلايا الظهارية التي تسيل في الأمعاء.
يشير مصطلح المجهر داخلة في المنشآت إلى الأساليب التجريبية التي تستفيد من تقنيات التصوير عالية الدقة (المجهر متعدد الصور أو المجهر) لتصور الخلايا والأنسجة مباشرة في محيطها الأصلي داخل حي11. فإنه يتيح الحصول في الوقت الحقيقي من المعلومات في الجسم الحي تصل إلى قرار خلية واحدة، وينطوي على مزايا واضحة على أساليب ثابتة أو منخفضة القرار. يوفر المجهر داخل الواجهة معلومات تكميلية ويتغلب على بعض القيود من التقنيات الكلاسيكية و/أو الراقية، مثل القطع الأثرية الناتجة عن معالجة الأنسجة. في المقابل ، فإن القيد الرئيسي للمجهر داخل الرحم هو أن الأنسجة يجب أن تتعرض مباشرة للمجهر ، والتي تتطلب في معظم الحالات الجراحة. على الرغم من أن النهج المتطورة الحفاظ على حيوية وتقليل تأثير الأنسجة المصورة (غرف الجلد والنوافذ التصوير)12،13، في معظم الحالات يتم تنفيذ شق بسيط الجلد لال خارجية من الأنسجة (الجلد اللوحات)14. وفي العقد الماضي، أسهمت هذه النهج بأدلة رئيسية عن عمليات شديدة الدينامية كانت في السابق غير قابلة للإثبات. ترجمة, التصوير في الوقت الحقيقي قدمت رؤى بيولوجية جديدة على الخلايا الجذعية و الكريات البيض توجيه15, فضلا عن نشر السرطان وتشكيل الانبثاث13,16. في السياق السريري, يتم حاليا استغلال التنظير الداخلي كأداة تشخيصية للسرطان17 وأمراض الجهاز الهضمي, مثل IBD18,19; في حين أصبح الفسيفساء المجهرية confocal أداة علم الأمراض السريعة أثناء الجراحة20. معًا، ظهر الفحص المجهري داخل الرحم مؤخرًا كأداة قيمة ومتعددة الاستخدامات للبحث الطبي الحيوي والتطبيق المستقبلي في العيادة.
يتم هنا تنفيذ المجهر داخل الرحم للتصور في الوقت الحقيقي من تسرب الظهارية المعوية ومراقبة الخلايا الظهارية ذرف الأحداث. يمكن التعرف على تسرب نفاذية الأمعاء من قبل تقنيات أخرى في الجسم الحي غير الباضع، مثل القياس الكمي للإدارة شفويا من التتبع الفلورسنت في المصل21. ومع ذلك، فإن هذه التقنية لا تسمح بالمراقبة المباشرة لأداء السفك ولا الفصل بين نفاذية شبه الخلوية. يمثل الجمع بين تجارب التتبع القياسية والمجهرية داخل الرحم منهجًا مناسبًا لما يلي: 1) تحديد الاضطرابات في نفاذية الأمعاء، و ii) الفصل بين نفاذية الظهارية شبه الخلوية. بالإضافة إلى سفك الخلايا، المجهر داخل الرحم في تركيبة مع في وضع العلامات الفلورية في الجسم الحي تمكن دراسة الآليات الخلوية والجزيئية الأخرى (على سبيل المثال، ضيق تقاطع إعادة توزيع أثناء سفك الخلية باستخدام الفئران مراسل الفلورسنت22 أو التفاعلات بين IECs والخلايا الأخرى داخل الغشاء المخاطي المعوي23).
الطريقة المعروضة هنا تمثل تكييف المجهر داخلة لتمكن من المراقبة في الوقت الحقيقي من الغشاء المخاطي المعوي، وذلك باستخدام المجهر الليزر confocal (CLSM). ولذلك، فإننا نستخدم الفئران خروج المغلوب المشروط من GGTase (Geranylgeranyltransferase) في الخلايا الظهارية المعوية (IECs) في (Pggt1biΔIEC الفئران)، لأنها تعاني من مرض الأمعاء الحاد وزيادة نفاذيةالظهارية 24. يتم وصف الإعداد الجراحي للفأر وتلطيخ الغشاء المخاطي المعوي ، وكذلك الإعدادات المناسبة المستخدمة في الحصول على الصور وتحليل ما بعد الاستحواذ. يمكن أن يمكّن هذا البروتوكول الدراسات المستقبلية التي تساهم في المعرفة الحالية حول ديناميات وحركيات الخلايا الظهارية المعوية التي تسفك. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون البروتوكول بمثابة أساس للتكيفات المختلفة لدراسة الظواهر الأخرى التي تحدث على سطح الغشاء المخاطي في الأمعاء، وحتى في الأنسجة الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت السلطات المحلية المختصة في إرلانجن على البروتوكول التالي (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Germany). تم إيواء الفئران في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض.
ملاحظة: تثبيط قبلة GGTase بوساطة داخل IECs يسبب تغيير شديد في نفاذية الأمعاء في Pggt1bط ΔIEC الفئران24. لذلك، تم استخدام هذا النموذج الماوس لشرح كيف يمكن أن يكون البروتوكول مفيدا لدراسة عيوب الحاجز المعوي. ومع ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة أي خط الماوس الأخرى.
1. إعداد الجراحية والفأر الأمعاء تلطيخ الغشاء المخاطي
ملاحظة: يستند الإعداد الجراحي على البروتوكولات25الموصوفة سابقاً. الحفاظ على الماوس تخدير تحت مصباح أحمر أثناء التحضير الجراحي، لتجنب انخفاض في درجة حرارة الجسم.
- تخدير الماوس بالحقن داخل الصفتون من الكيتامين/إكسيلازين (96 ملغم/كغم كغم من الكيتامين؛ و12.8 ملغم/كغم إكسيلازين). تحقق من التخدير عن طريق التحقق من عدم وجود رد فعل الجفن.
- تطبيق كريم حماية العين باستخدام برعم القطن.
- إجراء شق (1 سم) على منطقة البطن الأيسر باستخدام ملقط القياسية ومقص غرامة مستقيمة.
- اسطح جزء من الأمعاء (5-7 سم، تقريبا).
- فتح الجزء الخارجي الأمعاء طوليا عن طريق الكهرباء في الجانب antimesenteric.
- فضح الغشاء المخاطي وشطف قريبا مع محلول ملحي لإزالة محتوى البراز.
ملاحظة: اختياريا، تطبيق xylazin مباشرة على القناة الهضمية لتجنب التحف الحركة بسبب الsis. - وصمة عار سطح الغشاء المخاطي المعوي مع acriflavine والرودامين-B ديكستران (10 كيلو Da).
- تطبيق 1 ملغ / مل acriflavine الحل (100 ميكرولتر) عن طريق قطرة الأنابيب عن طريق قطرة على الغشاء المخاطي واحتضان لمدة 3 دقائق. اغسل الحل المتبقي مع برنامج تلفزيوني.
- تطبيق 2 ملغ / مل رودامين ديكستران حل (100 ميكرولتر) عن طريق قطرة الأنابيب عن طريق قطرة على الغشاء المخاطي واحتضان لمدة 3 دقائق. اغسل الحل المتبقي مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: اختياريا، إزالة الدم من إعداد باستخدام القطن العقيم.
- ضع الماوس المُغدَّر على شريحة غلاف مثبتة في غرفة مشطفة بمحلول ملحي مُدفأ مسبقًا (37 درجة مئوية).
ملاحظة: ثم يتم وضع الجزء المعوي المفتوح سطح الإنارة إلى أسفل، على شريحة الغلاف. - وضع إعداد (الماوس تخدير في الغرفة) على مرحلة المجهر المقلوب.
- تغطية الحيوان مع وسادة متساوي الحرارة (حوالي 37 درجة مئوية).
- انتقل على الفور إلى المجهر داخل الرحم.
ملاحظة: حافظ على شطف الإعداد الجراحي بمحلول ملحي مسبق الدفء لتجنب جفاف الأنسجة وموت الخلايا.
2. المجهر intravital
ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوة 2.1 قبل البدء في التحضير الجراحي، لتجنب فترات الانتظار الطويلة بين التخدير والجراحة واكتساب الصورة. إذا لزم الأمر، يمكن إعطاء جرعات إضافية من التخدير للحيوانات المعدة جراحيا لإبقائها تحت التخدير لتجارب التصوير.
- إعداد مجهر CLSM.
- ابدأ مجهر CLSM عن طريق تشغيل قاعدة المجهر وصندوق الماسحة الضوئية. قم بتشغيل الكمبيوتر عن طريق الضغط على الزر ابدأ.
- إطلاق برنامج الحصول على الصور (مثل، رقم 1) بالنقر المزدوج على الرمز. حدد التكوين المناسب (التكوين: الجهاز; المجهر: DMI6000) وانقر فوق موافق.
- تعريف الدقة المناسبة. الانتقال إلى التكوين | الأجهزة | القرار | عمق بت. حدد 12.
- انتقل إلى قائمة الاكتساب. حدد xyzt لوضع الحصول على الصور من القائمة المنسدلة. اختر الهدف من قائمة الإنزال (20x أو 40x).
- تصميم إعداد الامتلاك التسلسلي. انقر على SEQ. إضافة تسلسل ثاني، بالنقر على زر الإضافة (+). حدد بين الإطارات.
- تكوين التسلسل 1 (الكشف عن acriflavine؛ 416 nm الإثارة؛ انبعاث 514 نانومتر). قم بتشغيل مربع الليزر المرئي. تنشيط PMT1 (تشغيل). تحديد نافذة الطول الموجي للانبعاثات (490-550 نانومتر).
- تكوين التسلسل 2 (الكشف عن رودامينب-ديكستران؛ 570 نانومتر الإثارة؛ 590 نانومتر، الانبعاثات). قم بتشغيل مربع الليزر المرئي. تنشيط PMT2 (تشغيل). تحديد نافذة الطول الموجي للانبعاثات (550-760).
- قم بتنشيط أشعة الليزر المقابلة (488 و552). الانتقال إلى التكوين | الليزر . تنشيط 488 و 552 نانومتر الليزر (تشغيل).
- اضبط الإعداد إلى الميزات المحددة للتجربة الحالية.
- تشغيل مصدر الضوء (ضغط الطاقة). ضع الإعداد (الماوس المُهدَّد في الغرفة) على مرحلة المجهر وغيّر موضع س ص حتى يركز محور الإضاءة على إعداد الأنسجة.
- حدد مجال الاهتمام باستخدام مصدر الضوء القياسي واللعينات.
- حدد مكعب التصفية (I3). افتح الغالق. التركيز على سطح الغشاء المخاطي المعوي باستخدام العجلة الكلية والصغرى. البحث عن منطقة حيث يمكن تصور عدة شيشة داخل مجال الرؤية عن طريق تغيير موقف XY.
- تحقق من أن تلطيخ رودامين ديكستران مرئي أيضا في تلك المنطقة. تغيير مكعب التصفية (N2.1). تحقق من الصورة من خلال العدسة.
- بدء الحصول على صورة CLSM من البرنامج. تحسين الإعدادات للتسلسلين.
- حدد التسلسل 1. ضبط قوة الليزر، وكسب وأزاحة للتسلسل 1.
- حدد التسلسل 2. ضبط قوة الليزر، وكسب وموازنة للتسلسل 2.
- تعريف نطاق مكدس z.
- افتح قائمة إسقاط مكدس Z. التركيز على سطح الغشاء المخاطي باستخدام التحكم في محور ع. اضغط على ابدأ.
- التركيز على الحد السفلي حيث إشارة لا يزال يمكن الكشف عنها. اضغط على النهاية.
- تحديد عدد مكدسات z (10). تجنب هفوات الوقت أطول من 2 دقيقة لنقاط زمنية متتالية.
- تحديد إعدادات الوقت. انتقل إلى قائمة الوقت. انقر فوق تصغير. حدد الحصول حتى يتم إيقاف .
- تحديد متوسط البند. اختر SEQ 1. حدد متوسط البند 2. حدد Seq 2. حدد متوسط البند 2.
- الحصول على الصور المقابلة.
- حدد تنسيق (1024 × 1024) وسرعة (400). اضغط على ابدأ.
- اضغط على إيقاف بعد وقت الحصول على الصورة المرغوبة.
- حفظ الملف. انتقل إلى المشروع. انقر بزر الماوس الأيمن على الملف المقابل. اضغط على حفظ باسم.
- اسم الملف بشكل مناسب. حدد المجلد المناسب. اضغط على حفظ.
- القتل الرحيم الحيوان (خلع عنق الرحم) وجمع الأنسجة لتحليلها خفية، إذا لزم الأمر.
3. تحليل الصور: تحديد معدل سفك الخلايا وظهارة الأمعاء
- معدل سفك الخلايا
- إطلاق برنامج الحصول على الصور.
- انتقل إلى فتح المشاريع. حدد الملف المناسب.
- تحديد الوقت الإجمالي للحصول على الصورة.
- حدد آخر مكدس z كاملة. حدد الموضع Z الأخير من نقطة الوقت المحددة مسبقًا. قراءة الوقت في الزاوية السفلية اليمنى من الشاشة (الوقت الإجمالي للحصول على صورة).
- حدد villus.
- حدد موضع مكدس Z المناسب (سطح villus، ولكن عميق بما يكفي لتجنب التداخل مع الخلايا السقيفة بالفعل والمكونات الأخرى الموجودة في التجويف).
- قياس طول الغشاء القاعدي. حدد أداة المسطرة. تقسيم villus في عدة خطوط لتغطية أو رسم محيط villus كله. إضافة قيم مختلفة (الطول الإجمالي للغشاء القاعدي). حذف مقاطع أداة المسطرة.
- حساب عدد الأحداث التي تحدث خلال مدة الحصول على الصورة بالكامل.
- تقسيم villus إلى شرائح مع حجم مناسب. تحليل تسلسل الأحداث / الجزء عن طريق تحريك شريط من خلال نقاط زمنية مختلفة. إضافة تعليق توضيحي للأحداث التي تم تحديدها في الخلية.
- حساب عدد من الأحداث ذرف / الوقت / طول الغشاء القاعدي، مما يدل على معدل سفك الخلايا. عد ما يصل إلى 5 قنينة / فيديو ، وعلى الأقل اثنين من أشرطة الفيديو / الماوس. حساب متوسط هذه القياسات 10.
- التسرب
- حدد villus.
- حدد موضع مكدس Z المناسب (سطح villus، ولكن عميق بما يكفي لتجنب التداخل مع الخلايا السقيفة بالفعل والمكونات الأخرى الموجودة في التجويف). عدد العدد الإجمالي للخلايا الظهارية/villus.
- عد عدد نقاط التسرب (تواجد شبه خلوي للرودامين ديكستران. هذا الحدث هو عابر، والتي يمكن تأكيدها عن طريق التحقق من الصور المكتسبة السابقة والخفية).
- حساب عدد التسرب/العدد الإجمالي للخلايا الظهارية. تحليل 10 مختلف villus / عينة / فيديو وحساب متوسط عدد من تسرب والخلايا نفاذية / villus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف البروتوكول المعروض هنا نهجًا قائمًا على المجهر الداخلي لتصور تسرب الظهارة المعوية ومراقبة أداء سفك الخلايا في الأمعاء في الوقت الفعلي. باختصار ، يتم تخدير الفئران وتقديمها إلى التحضير الجراحي من أجل الكشف عن سطح الأمعاء الدقيقة المخاطية. ثم تلطخ IECs عن طريق تطبيق موضعي من acriflavine; بينما يستخدم اللمّبات اللمّة اللمّة (اللمّة) (اللمّة) إلى الفضاء دون الظهارية كمتتبعات. وهكذا، يتم وضع الإعداد الجراحي والفأرة المُقنَّة على شريحة مثبتة في طبق بيتري وتُصوَّر بمرور الوقت باستخدام CLSM (الشكل 1). يسمح تحليل ما بعد الاكتساب بحساب معدل سفك الخلايا الظهارية (عدد أحداث سفك الخلايا /الدقيقة/ طول الغشاء القاعدي) وكذلك النسبة المئوية للتسرب العابر (نفاذية شبه الخلايا) و "الخلايا نفاذية" (نفاذية عبر الخلايا) في نقطة زمنية محددة.
من أجل الحث على تعديلات على سلامة الظهارية، ونحن الاستفادة من وصفها سابقا GGTase-قاصر GGTase نموذج الماوس المشروطة(Pggt1biΔIEC الفئران)، ولدت عن طريق نظام LoxP-Cre24. كما هو موضح من قبل ، Pggt1biΔIEC الفئران (الشكل 2ألف) وضعت أمراض الأمعاء الحاد كما يتضح من زيادة درجة الضرر النسيجي في الأمعاء الدقيقة (الشكل 2B). زيادة نفاذية الظهارية المعوية يمكن الكشف عن طريق التتبع في التجارب vivo باستخدام إدارة شفويا FITC-dextran (4 كيلو ادا) (الشكل 2C)، ثم أكد عن طريق المجهر intravital (الشكل 2D-2E). في حين يقتصر دكستران رودامين إلى المقصورة الإنارة في الفئران التحكم، يمكننا الكشف عن التتبع داخل المقصورة تحت الظهارية عند إلغاء التعبير GGTase داخل IECs في الفئران IIEC Pggt1b.iΔIEC أثناء الحصول على الصورة، يمكن تحديد أحداث سفك الخلايا كخليات تتحرك من أحادية الظهارة إلى التجويف، مما يؤدي إلى ثغرات مؤقتة في ختم الظهارة، والتي يتم إغلاقها في النهاية عن طريق الاتصال بين الخلايا المجاورة، ما يسمى تأثير الرمز البريدي(الشكل 3A). يمكننا أن نلاحظ بوضوح هذه الثغرات، ما نسميه تسرب الظهارة المؤقتة سواء في السيطرة و Pggt1biΔIEC الفئران، على الرغم من أن وتيرة هذه الظاهرة كان أعلى في هذا الأخير(الشكل 3B, 3C). ومن المثير للاهتمام, يمكننا أيضا تحديد الخلايا الأخرى حيث يمكن الكشف عن دكستران داخل الخلايا, ما يسمى "الخلايا نفاذية"; وقعت هذه الأحداث أساسا في Pggt1biΔIEC الفئران (الشكل 3B, 3D). معا، والاستفادة من النهج هنا قدم المجهر intravital، يمكننا تحديد أن ضعف سلامة الظهارية في Pggt1bط ΔIEC الفئران يؤدي إلى خلية ذرف التعديلات الأداء وزيادة شبه- وعبر الخلوية النفاذية الظهارية في القناة الهضمية.
الشكل 1: الوصف التخطيطي لنهج المجهر داخل الرحم المعروض هنا. (A) مخطط تدفق. (B) مخطط. بعد التحضير الجراحي ، يتم تركيب الغشاء المخاطي المعوي الملطخة موضعًا بمحلول acriflavine و rhodamine dextran على شريحة تغطية مدمجة على طبق بيتري للسماح بال perfusion مع محلول ملحي (سطح لامع لأسفل). ثم يتم تصوير الغشاء المخاطي المعوي باستخدام مجهر CLSM بمرور الوقت. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ضعف المرونة الظهارية في فئران Pggt1biΔIEC مما يؤدي إلى زيادة نفاذية الأمعاء. (A) لطخة الغربية تظهر تاموكسيفين الناجمة عن GGTase-1B التعبير داخل IECs في Pggt1biΔIEC مقابل السيطرة الفئران. (ب) نقاط الأمعاء الفاضلة من السيطرة و Pggt1biΔIEC الفئران. (C) القياس الكمي للنفاذية الظهارية المعوية في الجسم الحي تقاس بمرور transmucosal من FITC-Dextran المدارة شفويا (4 كيلو Da). (D) مخطط يصف اتجاه الحصول على الصورة، من التجويف إلى الأسفل إلى محور villus. صور تمثيلية من مكدس z. (E) صور تمثيلية للمجهر داخلة في الـمُستَبِر باستخدام acriflavine وتطبيق الريودامين B-dextran من التحكم وماوس Pggt1biΔIEC، كما هو موضح في هذه المخطوطة. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SEM. اختبار t غير المقترن. * قيمة P ≤ 0.05؛ قيمة P ≤ 0.0001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الخلايا الظهارية ذرف الأداء والنفاذية الظهارية شبه الخلوية / عبر الخلوية باستخدام المجهر داخل الرحم. (أ) ممثل الصور التي تظهر خلية ذرف الحدث في الوقت الحقيقي (السهم الأبيض). يتم مقذوف خلية السقيفة من أحادية الظهارة إلى التجويف. الخلايا المجاورة ختم تسرب مؤقت (الرمز البريدي تأثير) لتجنب فقدان وظيفة الحاجز. (B) صورة تمثيلية تظهر التسرب (السهام البيضاء) وخلايا الظهارية المعوية نفاذية (السهام الزرقاء). (C-D) القياس الكمي للتسرب المؤقت (C) وخلايا نفاذية (D) في السيطرة و Pggt1biΔIEC الفئران. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SEM. اختبار t غير المقترن. * قيمة P ≤ 0.05؛ قيمة P ≤ 0.0001 . الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن تحديا من الناحية الفنية، منهجية تستند إلى المجهر intravital يمثل نهجا تجريبيا فريدة من نوعها لتصور دينامية عالية عملية الخلوية في الوقت الحقيقي، مثل سفك الخلية الأداء. حتى الآن، لا يوجد نهج تجريبي بديل لتصور البثق الخلية في الجسم الحي. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول يمكن أن تسهم في وصف العمليات الخلوية المتنوعة التي تلعب دورا في الحفاظ على التوازن المعوي.
الاستفادة من المجهر داخل مدينة، طريقة المقدمة هنا تمكن التصور في الوقت الحقيقي من الظهارية الأمعاء سفك الخلايا في الحيوانات الحية. لذلك ، يتم تصوير الغشاء المخاطي المعوي الملون موضعيًا (acriflavine و rhodamine B-dextran) من الفئران المُجَنَّة حتى دقة الخلية الواحدة باستخدام المجهر confocal. في تركيبة مع تجارب التتبع القياسية، فإنه يسمح بتحديد الاضطرابات نفاذية الأمعاء في الجسم الحي والتمييز بين نفاذية شبه وعبر الخلوية. في تركيبة مع الفئران مراسل، بروتوكولات مماثلة استغلت لمراقبة ذرف الخلية الظهارية يمكن أن تظهر إعادة توزيع تقاطع ضيق لختم تسرب العابرة التي خلفتها الخلايا مقذوف (تأثير الرمز البريدي مثل)22،26.
إلى جانب سفك الخلايا الظهارية، تم تكييف التعديلات على الطريقة المعروضة هنا لتحليل العمليات الخلوية الأخرى ذات الحيوية العالية التي تحدث على سطح الغشاء المخاطي المعوي. على سبيل المثال، إعطاء الوريد من الجزيئات التتبع والأوعية الدموية تلطيخ مع الأجسام المضادة لـ CD31 وفرت الفرصة لتقييم سلامة البطانية في القناة الهضمية27. وراء ظهارة، وقد استخدمت نهج مماثلة للتحقيق في خصائص توجيه الأمعاء من الخلايا المناعية28,29, وكذلك التفاعل بين الخلايا المناعية و IECs في سياق العدوى المعوية23.
وعلى الرغم من كثرة التطبيقات المحتملة للبروتوكول الموصوف هنا، توجد أيضا بعض القيود على استخدامه. يُضعف التشتت الضوئي داخل العينة عملية الحصول على التصوير في عمق الأنسجة. في حالة الأمعاء الدقيقة ، يقتصر الحصول على الصورة على الظواهر التي تحدث على سطح الغشاء المخاطي (طرف villus). من ناحية أخرى ، فإن بنية ووظيفة القناة الهضمية نفسها يحد من أداء المجهر داخل الرحم. على الرغم من الخصائص البصرية للأعضاء المثلى، انكماش الأنسجة الرادلية وكذلك حركة التدفق الناجمة عن الزغب المعوي يعني تعديلات متكررة على مستوى التركيز أثناء الحصول على الصورة.
وقد تتغلب التعديلات المحتملة على البروتوكول المعروض هنا على بعض هذه القيود. استخدام تقنيات المجهر البديلة، مثل المجهر الفوتون أو متعدد الصور، يعني عمقًا أعلى من أجل تصور المستويات البؤرية الموجودة حتى 50-100 ميكرومتر تحت سطح العينة. ومع ذلك ، من المهم النظر في حل وسط بين دقة الصورة ووقت الاقتناء ، لأن هذه التجارب تهدف إلى مراقبة العمليات السريعة والديناميكية. من حيث تكوين المجهر و / أو الإعدادات ، واستخدام أطوال موجية أطول وكذلك اختيار أهداف مسافة العمل الحرة الطويلة مع الفتحة العددية العالية تنطوي على إعدادات محسنة للتصوير داخل الرحم.
وينبغي أن يعتبر التصميم التجريبي الأمثل معاً مع الأخذ في الاعتبار اختيار الأصباغ الفلورية المناسبة وتقنية المجهر، فضلاً عن تكوين جهاز التصوير، بمثابة خطوات رئيسية من أجل الحصول على نتيجة ناجحة من هذه التجارب. ومن شأن وضع أدوات للتنبؤ/القياس الكمي القائمة على الصور، كمنظور مستقبلي، أن ييسر تفسير البيانات المكتسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
وقد تلقى البحث الذي أدى إلى هذه النتائج تمويلاً من برنامج الأشخاص (Marie Curie Actions) بموجب اتفاقية منحة REA رقم 302170 من البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7/2007-2013)؛ مركز البحوث السريرية المتعدد التخصصات (IZKF) التابع لجامعة إرلانغن - نورمبرغ؛ مركز البحوث التعاونية TRR241 ومجموعة البحوث السريرية KFO257 من مجلس البحوث الألماني (DFG)؛ وDFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | - |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | - |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | - | - |
| LSM microscope SP8 | Leica | - | - |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | - |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | - |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
References
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation? Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics. Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).
- Kiesslich, R., et al. Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease. Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).
- Dourmashkin, R. R., et al. Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease. Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).
- Soderholm, J. D., et al. Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease. Gut. 50 (3), 307-313 (2002).
- Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface. American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
- Fan, Y., Bergmann, A. Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell! Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).
- Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways. Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research. Cytometry A. , (2019).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance. Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).
- Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases. Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).
- Kiesslich, R., et al. Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).
- Krishnamurthy, S., et al. Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Lopez-Posadas, R., et al. Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).
- Duckworth, C. A., Watson, A. J. Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium. Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Haep, L., et al. Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).
- Lopez-Posadas, R., et al. Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice. Gastroenterology. , (2019).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
