Summary
Воспользовавшись интравитальной микроскопией, представленный здесь метод позволяет в режиме реального времени визуализировать пролитие кишечных эпителиальных клеток у живых животных. Поэтому местно окрашенные слизистые оболочки кишечника (акрифлавин и родаминБ-декстран) эстетизированных мышей изобразованы до одноклеточного разрешения с помощью конфокаленной микроскопии.
Abstract
Интравитальная микроскопия кишечника с помощью конфокальной визуализации позволяет в режиме реального времени осуществлять наблюдение за эпителиальным пролитием клеток и утечкой барьеров у живых животных. Таким образом, слизистая оболочка кишечника анестезированных мышей местно окрашены неспецифическим окрашивания (акрифлавин) и флуоресцентный трассировщик (родамин-B декстран), установленный на солевой раствор промыть пластины и непосредственно изображения с помощью конфокального микроскопа. Этот метод может дополнять другие неинвазивные методы для выявления утечки кишечной проницаемости, такие как трансмукозальный проход устно управляемых трассировщиков. Кроме того, представленный здесь подход позволяет осуществлять прямое наблюдение за событиями, которые проливают клетки в режиме реального времени. В сочетании с соответствующими флуоресцентными мышами-репортерами этот подход подходит для пролития света в клеточные и молекулярные механизмы, контролирующие экструзию кишечных эпителиальных клеток, а также на другие биологические процессы. В последние десятилетия, интересные исследования с использованием интравитальной микроскопии способствовали знания по эндотелиальной проницаемости, иммунной клетки кишечника самонаведения, иммунно-эпителиальной связи и вторжения светящихся компонентов, среди других. Вместе представленный здесь протокол не только поможет повысить понимание механизмов контроля экструзии эпителиальных клеток, но и может стать основой для развития других подходов, которые будут использоваться в качестве инструментов для визуализации других высокодинамитических клеточных процессов, даже в других тканях. Среди технических ограничений оптические свойства конкретной ткани, а также выбранная технология визуализации и конфигурация микроскопа, в свою очередь, определяют расстояние работы изображения и разрешение полученных изображений.
Introduction
Кишечник является высокоспециализированным органом с жестко регулируемой функцией, позволяющей конфликтующие процессы, а именно питание и защита от вредных светящихся веществ. Подкладка между человеческим телом и окружающей средой, кишечный эпителий действует как физический и иммунологический барьер и способствует поддержанию слизистой гомеостаза вкишечнике 1,2. Потеря эпителиальной целостности и повышенная проницаемость плотного соединения, как известно, связаны с воспалительными заболеваниями кишечника (IBD)3,,4,,5,,6. Эпителиальные изменения затем рассматриваются в качестве причин и вторичных усилителей для хронического воспаления кишечника в IBD. Таким образом, улучшение понимания ранних эпителиальных изменений в кишечнике пациентов IBD будет иметь огромное значение для разработки новых стратегий по восстановлению эпителиальной целостности для надежного прогнозирования и последующей профилактики рецидивов IBD.
Кишечный эпителий следует за сложным и жестко регулируемым процессом оборота. Из склепа дно, неизлечимо дифференцированных кишечных эпителиальных клеток (IECs), полученных из плюрипотентных стволовых клеток мигрируют вверх к кончику виллуса, где в возрасте / поврежденных клеток пролить в люмен7. Равновесие между делением и экструзией клеток позволяет поддерживать кишечные эпителиальные числа клеток, избегая образования зазоров и протечек, а также накопление эпителиальных клеток, потенциально ведущих к клеточным массам и опухолевомугенезу 8,,9,,10. Несмотря на ключевую роль эпителиального пролития клеток в физиологическом обновлении эпителия кишечника, знания о молекулярных механизмах, вождения экструзии клеток на кончике вилюля ограничены. Таким образом, необходимо продать фундаментальные исследования, обеспечивающие точное описание последовательности молекулярных событий, связанных с эпителиальным пролитием клеток.
Сложные взаимодействия между различными типами клеток в слизистой оболочке кишечника являются ключевыми для понимания молекулярных механизмов, регулирующих эпителиальный оборот и кишечный гомеостаз. Таким образом, исследования in vivo предлагают высокие преимущества перед подходами in vitro и ex vivo в этом контексте. Кроме того, методы визуализации в режиме реального времени позволяют описание последовательности событий, контролирующих конкретные явления. В этом контексте изучение высокодинаминых процессов требует использования оптимизированных методов высокого разрешения для прямого наблюдения за тканями. Интравитальные методы визуализации появляются в качестве уникальных подходящих инструментов для изучения эпителиальных клеток пролить в кишечнике.
Термин "интравитальная микроскопия" относится к экспериментальным подходам, воспользовавшись методами визуализации высокого разрешения (мультифотонная или конфокальная микроскопия) для непосредственной визуализации клеток и тканей в их родных окрестностях в пределах живогоживотного 11. Это позволяет в режиме реального времени приобретение информации in vivo до разрешения одной ячейки, и влечет за собой явные преимущества по сравнению со статичными или низкими методами разрешения. Интравитальная микроскопия предоставляет дополнительную информацию и преодолевает некоторые ограничения от классических и/или высококачественных методов, таких как артефакты из-за обработки тканей. В отличие от этого, основным ограничением интравитальной микроскопии является то, что ткань должна быть непосредственно подвержена микроскопу, который в большинстве случаев требует хирургического вмешательства. Хотя сложные подходы сохраняют жизнеспособность и минимизируют воздействие изображенной ткани (камеры кожи и окна длявизуализации) 12,,13,в большинстве случаев выполняется простой разрез кожи для экстернализации тканей (кожных лоскутов)14. В последнее десятилетие эти подходы стали ключевыми свидетельствами о высокодинамих процессах, которые ранее были непостижимыми. Переводно, в режиме реального времени изображения предоставили новые биологические идеи о стволовых клетках и лейкоцитовсамонаведения 15, а также распространениерака и образование метастазов 13,16. В клиническом контексте эндомикроскопия в настоящее время используется в качестве диагностическогоинструмента рака 17 и желудочно-кишечных заболеваний, таких как IBD18,19; в то время как конфокальная мозаичная микроскопия стала инструментом быстрой патологии во времяоперации 20. В совокупности интравитальная микроскопия в последнее время стала ценным и универсальным инструментом для биомедицинских исследований и будущего применения в клинике.
Интравитальная микроскопия здесь реализована для визуализации эпителиальной утечки кишечника в режиме реального времени и наблюдения за эпителиальными явлениями пролития клеток. Утечка кишечной проницаемости может быть идентифицирована другими неинвазивными методами in vivo, такими как количественная оценка перорального введения флуоресцентных трассировщиков всыворотке 21. Тем не менее, этот метод не позволяет прямого наблюдения пролить производительность, ни сегрегации между пара- и транс-клеточной проницаемости. Сочетание стандартных экспериментов трассировщика и интравитальной микроскопии представляет собой подходящий подход к: i) выявлению нарушений в проницаемости кишечника и ii) сегрегации между пара- и трансклеточной эпителиальной проницаемостью. Помимо пролития клеток, интравитальная микроскопия в сочетании с маркировкой флуоресценции in vivo позволяет изучать другие клеточные и молекулярные механизмы (например, жесткое перераспределение соединения во время пролития клеток с использованиемфлуоресцентных мышей-репортеров 22 или взаимодействия между IECs и другими клетками внутри слизистойоболочки кишечника 23).
Представленный здесь метод представляет собой адаптацию интравитальной микроскопии для наблюдения слизистой оболочки кишечника в режиме реального времени с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). Таким образом, мы используем условные нокаут мышей GGTase (Geranylgeranyltransferase) в кишечных эпителиальных клеток (IECs) в (Pggt1bi qIEC мышей), так как они страдают от тяжелой кишечной болезни и увеличение эпителиальной проницаемости24. Описана хирургическая подготовка мыши и окрашивание слизистой оболочки кишечника, а также соответствующие настройки, используемые для получения изображений и анализа после приобретения. Этот протокол мог бы позволить будущим исследованиям, способствующим современным знаниям о динамике и кинетике кишечного эпителиального пролития клеток. Кроме того, протокол может послужить основой для различных адаптаций для изучения других явлений, происходящих на поверхности слизистой оболочки кишечника, и даже в других тканях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол был одобрен соответствующими местными органами власти в Эрлангене (Regierung von Unterfranken, Вюрцбург, Германия). Мыши размещались в особых условиях, свободных от патогенов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибирование GGTase-опосредованного прениляции в IECs вызывает серьезное изменение кишечной проницаемости у мышей Pggt1bi'IEC 24. Таким образом, эта модель мыши была использована, чтобы продемонстрировать, как протокол может быть полезен для изучения дефектов кишечного барьера. Тем не менее, этот протокол может быть использован для изучения любой другой линии мыши.
1. Хирургическая подготовка и окрашивание слизистой оболочки кишечника
ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическая подготовка основана на ранее описанных протоколах25. Держите обезболивающее мышь под красной лампой во время хирургической подготовки, чтобы избежать падения температуры тела.
- Анестезия мыши путем внутриперитонеальной инъекции кетамина/ксилазина (96 мг/кг кетамина; и 12,8 мг/кг ксилазина). Проверить анестезию, проверяя на отсутствие рефлекса век.
- Нанесите крем для защиты глаз с помощью ватного тампона.
- Сделайте разрез (1 см) на левой брюшной области с помощью стандартных типсов и прямых тонких ножниц.
- Внешний сегмент кишечника (5-7 см, приблизительно).
- Откройте экстерьерный сегмент кишечника продольно путем электрокаутеризации на антаймсэнтерической стороне.
- Выставить слизистую оболочку и промыть в ближайшее время солевым раствором, чтобы удалить фекальное содержание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно, применять ксилазин непосредственно на кишечнике, чтобы избежать движения артефактов из-за перистализа. - Окрашивание поверхности слизистой оболочки кишечника акриффлавином и родамином-B декстраном (10 кДа).
- Нанесите раствор 1 мг/мл акрифлавина (100 л) на трубоубег капли за каплей на слизистую оболочку и инкубировать в течение 3 мин. Вымойте оставшееся решение с помощью PBS.
- Нанесите раствор 2 мг/мл родамина-декстрана (100 л) на трубоубег капли за каплей на слизистую оболочку и инкубировать в течение 3 мин. Вымойте оставшееся решение с помощью PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно, удалить кровь из препарата с использованием асептического хлопка.
- Поместите анестезированую мышь на крышку слайда, установленного в камере, промытой предварительно разогретый солевой раствор (37 градусов по Цельсию).
ПРИМЕЧАНИЕ: Открытый сегмент кишечника затем помещается светимой поверхности вниз, на крышке слайда. - Поместите препарат (анестезировалую мышь в камеру) на перевернутой стадии микроскопа.
- Обложка животное с изотермальной площадкой (приблизительно 37 градусов по Цельсию).
- Немедленно приступайте к интравитальной микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите хирургический препарат промыть предварительно разогретый солевой раствор, чтобы избежать обезвоживания тканей и клеточной смерти.
2. Интравитальная микроскопия
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаг 2.1 перед началом хирургического препарата, чтобы избежать длительного ожидания между анестезией, хирургией и приобретением изображений. При необходимости, дополнительные дозы анестезии могут быть даны хирургически подготовленных животных, чтобы держать их под наркозом для визуализации экспериментов.
- Настройка микроскопа CLSM.
- Запустите микроскоп CLSM, включив основание микроскопа и коробку сканера. Включите компьютер, нажав кнопку "Пуск".
- Запустите программное обеспечение для получения изображений (например, LAS X), дважды нажав на значок. Выберите соответствующую конфигурацию (Конфигурация: машина; Микроскоп: DMI6000) и нажмите OK.
- Определите соответствующую резолюцию. Перейти к конфигурации Оборудование (ru) Разрешение (ru) Глубина бита. Выберите 12.
- Перейти к приобретению меню. Выберите xyzt для режима получения изображения из выпадают меню. Выберите цель из меню высадки (20x или 40x).
- Разработка последовательной настройки приобретения. Нажмите на Seq. Добавьте вторую последовательность, нажав на кнопку добавления (яп. Выберите между кадрами.
- Настройка последовательности 1 (обнаружение акриффлавина; 416 нм возбуждения; 514 нм выбросов). Включите видимую лазерную коробку. Активируйте PMT1 (ON). Определите окно длины волны излучения (490-550 нм).
- Настройка последовательности 2 (обнаружение родаминБ-декстрана; 570 нм возбуждения; 590 нм, выброс). Включите видимую лазерную коробку. Активируйте PMT2 (ON). Определите окно длины волны излучения (550-760).
- Активируйте соответствующие лазеры (488 и 552). Перейти к конфигурации Лазеры. Активировать лазеры 488 и 552 нм (поверните ON).
- Отрегулируйте настройку с конкретными особенностями текущего эксперимента.
- Включите источник света (нажмите на него). Поместите препарат (анестезировал мышь в камеру) на стадии микроскопа и измените положение xy до тех пор, пока ось освещения не будет сосредоточена на подготовке тканей.
- Выберите поле интереса, используя стандартный источник света и окуляры.
- Выберите куб фильтра (I3). Открой затвор. Сосредоточьтесь на поверхности слизистой оболочки кишечника с помощью макро- и микроколеса. Поиск области, где несколько вилли можно визуализировать в поле зрения, изменив положение XY.
- Убедитесь, что окрашивание родамина-декстрана также видно в этой области. Изменение куба фильтра (N2.1). Проверьте изображение через окуляры.
- Начните приобретение изображений CLSM с программного обеспечения. Оптимизация настроек для двух последовательностей.
- Выберите последовательность 1. Отрегулируйте мощность лазера, получите и компенсируйте для последовательности 1.
- Выберите последовательность 2. Отрегулируйте мощность лазера, получите и компенсируйте для последовательности 2.
- Определите диапазон стеков z.
- Откройте меню высадки из стека. Сосредоточьтесь на поверхности слизистой оболочки с помощью управления z-оси. Пресс Начать.
- Сосредоточьтесь на нижнем пределе, где сигнал все еще обнаруживается. Пресс-энд.
- Определите количество стеков z (10). Избегайте промежуток времени более 2 минут в течение двух последовательных временных очков.
- Определите настройки времени. Перейти к меню времени. Нажмите Минимит. Выберите Приобретение до тех пор, пока не остановлено.
- Определите среднее значение строки. Выберите Seq 1. Выберите среднюю строку 2. Выберите Seq 2. Выберите среднюю строку 2.
- Приобретайте соответствующие изображения.
- Выберите формат (1024 x 1024) и скорость (400). Пресс-старт.
- Нажмите Остановить после желаемого времени приобретения изображения.
- Сохраните файл. Перейти к проекту. Нажмите правой кнопкой мыши на соответствующий файл. Пресс Сохранить как.
- Назовите файл соответствующим образом. Выберите адекватную папку. Пресс Сохранить.
- Усыпляйте животное (вывих шейки матки) и при необходимости собирайте ткани для скрытого анализа.
3. Анализ изображений: Определить скорость пролития клеток и кишечный эпителий
- Скорость пролития клеток
- Запуск программного обеспечения для приобретения изображений.
- Перейти к открытым проектам. Выберите соответствующий файл.
- Определите общее время приобретения изображения.
- Выберите последний полный стек z. Выберите последнюю позицию q из ранее выбранной точки времени. Прочитайте время в правом нижнем углу экрана (общее время получения изображения).
- Выберите виллус.
- Выберите соответствующее положение стека (поверхность виллуса, но достаточно глубоко, чтобы избежать вмешательства с уже пролитых клеток и других компонентов, присутствующих на люмен).
- Измерьте длину базальной мембраны. Выберите инструмент линейки. Разделите виллус на несколько линий, чтобы покрыть или нарисовать весь периметр виллуса. Добавьте различные значения (общая длина базальной мембраны). Удалите сегменты инструмента Ruler.
- Подсчитайте количество событий, происходящих в течение всего срока приобретения изображения.
- Разделите виллус на сегменты с адекватным размером. Проанализируйте последовательность событий/сегмента, сдвинув планку через различные точки времени. Аннотировать выявленные события пролития клеток.
- Рассчитайте количество событий пролития/времени/длины базальной мембраны, что указывает на скорость пролития клеток. Подсчитайте до 5 вилли/видео и, по крайней мере, два видео/мышь. Рассчитайте среднее количество этих 10 измерений.
- Утечки
- Выберите виллус.
- Выберите соответствующее положение стека (поверхность виллуса, но достаточно глубоко, чтобы избежать вмешательства с уже пролитых клеток и других компонентов, присутствующих на люмен). Подсчитайте общее количество эпителиальных клеток/виллусов.
- Подсчитайте количество точек утечки (параклеточное присутствие родамина декстрана. Это событие является преходятным, что может быть подтверждено путем проверки предыдущих и скрытых приобретенных фотографий).
- Рассчитайте количество утечек/общее количество эпителиальных клеток. Проанализируйте 10 различных villus/sample/video и рассчитайте среднее количество утечек и проницаемых ячеек/виллусов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, представленный здесь описывает интравитальной микроскопии на основе подхода к визуализации кишечной эпителиальной утечки и наблюдать производительность клеток пролить в кишечнике в режиме реального времени. Короче говоря, мышей анестезировали и подались на хирургическую подготовку, чтобы разоблачить поверхность слизистой оболочки тонкой кишки. IECs после этого запятнаны через местное применение acriflavine; в то время как светящийся родамин B-декстран используется в качестве трассировщиков для обнаружения трансмукозального прохода из люмена в субэпителиальное пространство. Таким образом, хирургическая подготовка и анестезированная мышь помещаются на слайд, установленный в чашке Петри и изображенный с течением времени с помощью CLSM(рисунок 1). Пост-приобретение анализ позволяет расчет эпителиальной скорости пролития клеток (количество событий пролития клеток / минут / длина базальной мембраны), а также процент временной утечки (параклеточная проницаемость) и "проницаемые клетки" (трансцеллюлярная проницаемость) в определенный момент времени.
Для того, чтобы вызвать изменения эпителиальной целостности, мы воспользовались ранее описанной IEC-специфической GGTase-недостаточной условной модели мыши(Pggt1bi'IEC мышей), генерируемых с помощью системы LoxP-Cre24. Как описано ранее, у мышей Pggt1bi'IEC (рисунок 2A)развилась тяжелая патология кишечника, о чем свидетельствует повышенный балл гистологических повреждений в тонкойкишке (рисунок 2B). Повышенная эпителиальная проницаемость кишечника может быть обнаружена с помощью трассировщика in vivo экспериментов с использованием устно управляемых FITC-декстран (4 kDa) (Рисунок 2C), а затем подтверждена с помощью интравитальной микроскопии (Рисунок 2D-2E). В то время как родамин декстран ограничивается светящимся отсеком у контрольных мышей, мы могли бы обнаружить трассировщик в подэпителиальной отсеке после отмены экспрессии GGTase в IECs у мышей Pggt1bi'IEC. Во время получения изображения, события пролития клеток могут быть определены как клетки, движущиеся из эпителиального монослоя в люмен, что приводит к временным зазорам в уплотнению эпителия, которые, наконец, закрыты контактом между соседними клетками, так называемый почтовый эффект(рисунок 3A). Мы могли бы четко наблюдать эти пробелы, что мы называем временной эпителиальной утечки как в управлении и Pggt1bi'IEC мышей, хотя частота этих явлений была выше в последнем (Рисунок 3B,3C). Интересно, что мы могли бы также определить другие клетки, где декстран может быть обнаружен внутриклеточно, так называемые "проницаемые клетки"; эти события происходили в основном у мышей Pggt1bi'IEC (рисунок 3B,3D). Вместе, воспользовавшись представленным здесь подходом к интравитальной микроскопии, мы смогли определить, что нарушение эпителиальной целостности у мышей Pggt1bi'I'ЕC приводит к изменению производительности клеток и увеличению пара- и трансклеточной эпителиальной проницаемости кишечника.
Рисунок 1: Схематическое описание представленного здесь подхода к интравитальной микроскопии. (A) Диаграмма потока. (B) Диаграмма. После хирургического вмешательства слизистая оболочка кишечника, окрашенная акриффлавином и роданом декстраном, устанавливается на крышку-слайд, встроенный в чашку Петри, чтобы перфузия с солевым раствором (люминесцентная поверхность вниз). Слизистая оболочка кишечника затем изображена с помощью микроскопа CLSM с течением времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Нарушение эпителиальной целостности у мышей Pggt1bi'IEC, что приводит к повышению проницаемости кишечника. (A) Западная помарка показывая тамоксифен-индуцированное отмененное выражение GGTase-1B внутри IECs в Pggt1bi'IEC против мышей управления. (B) Гистологический счет тонкой кишки от управления и Pggt1bi'IEC мышей. (C)Количественная оценка кишечной эпителиальной проницаемости in vivo, измеряемой трансмукозальным прохождением устно управляемого FITC-Dextran (4 kDa). (D)Диаграмма, описывающая направление приобретения изображения, от люмена вниз до оси виллусов. Представитель фотографии из z-стек. (E)Представитель фотографии интравитальной микроскопии с использованием местно применяется акрифлавин и родамин B-декстран из-под контроля и Pggt1bi'IC мышей, как описано в этой рукописи. Данные выражаются как среднее ± SEM. Неспареный т-тест. значение P ≤ 0,05; Значение P ≤ 0.0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Эпителиальная клетка пролить производительности и пара / транс-клеточной эпителиальной проницаемости с помощью интравитальной микроскопии. (A) Представительфотографии, показывающие ячейки пролить событие в режиме реального времени (белая стрелка). Ячейка сарая выдавливается из эпителиального монослоя в люмен. Соседние клетки уплотнять временную утечку (zip-эффект), чтобы избежать потери барьерной функции. (B)Репрезентативная фотография, показывающая утечку (белые стрелы) и проницаемые кишечные эпителиальные клетки (синие стрелки). (C-D) Количественная оценка временной утечки(C)и проницаемыхклеток (D) в управлении и Pggt1bi'I'C мышей. Данные выражаются как среднее ± SEM. Неспареный т-тест. значение P ≤ 0,05; Значение P ≤ 0.0001 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя технически сложной, интравитальной микроскопии на основе методологии представляет собой уникальный экспериментальный подход к визуализации высокодинаминого клеточного процесса в режиме реального времени, таких, как производительность клеток пролить. До сих пор нет альтернативного экспериментального подхода к визуализации экструзии клеток in vivo. Мы считаем, что этот протокол может способствовать описанию различных клеточных процессов, играющих роль в поддержании кишечного гомеостаза.
Воспользовавшись интравитальной микроскопией, представленный здесь метод позволяет в режиме реального времени визуализировать пролитие кишечных эпителиальных клеток у живых животных. Таким образом, местно окрашенных слизистой оболочки кишечника (акрифлавин и родамин B-декстран) анестезированных мышей изображен до одноклеточного разрешения с помощью конфокальные микроскопии. В сочетании со стандартными экспериментами трассировщика, он позволяет идентифицировать кишечные нарушения проницаемости in vivo и различие между пара- и транс-клеточной проницаемостью. В сочетании с репортером мышей, аналогичные протоколы, эксплуатируемые для мониторинга эпителиальных клеток пролить может показать жесткое перераспределение соединения, чтобы запечатать транзиторные утечки, оставленные экструдированы клетки (zip-какэффект) 22,26.
Помимо эпителиального пролития клеток, изменения в представленном здесь методе были адаптированы к анализу других высокодинамичных клеточных процессов, происходящих на поверхности слизистой оболочки кишечника. Например, внутривенное введение молекул трассировщика и окрашивание кровеносных сосудов анти-CD31 антителами предоставило возможность оценить эндотелианую целостностькишечника 27. Помимо эпителия, аналогичные подходы были использованы для исследования кишечника самонаведениясвойства иммунных клеток 28,29, а также взаимодействие между иммунными клетками и IECs в контексте кишечнойинфекции 23.
Несмотря на множество потенциальных применений описанного здесь протокола, существуют также некоторые ограничения на его использование. Легкое рассеяние внутри образца ухудшает приобретение изображений глубоко внутри ткани. В случае тонкой кишки, получение изображения ограничивается явлениями, происходящими на поверхности слизистой оболочки (наконечник виллуса). С другой стороны, структура и функция кишечника сама по себе ограничивает производительность интравитальной микроскопии. Несмотря на оптимальные оптические свойства органов, перистальтическое сокращение тканей, а также движение кишечных вилли, вызванное потоком, подразумевают частые изменения плоскости фокусировки во время получения изображения.
Потенциальные изменения в представленном протоколе могут преодолеть некоторые из этих ограничений. Использование альтернативных методов микроскопии, таких как однофотонная или многофотонная микроскопия, предполагает более высокую глубину пенетранса для визуализации фокусированных плоскостей, расположенных на глубине до 50-100 мкм ниже поверхности образца. Однако важно учитывать компромисс между разрешением изображения и временем приобретения, поскольку эти эксперименты направлены на наблюдение за быстрыми и динамичными процессами. С точки зрения конфигурации микроскопа и/или настроек использование длинных длин волн, а также выбор целей дальнего свободного рабочего расстояния с высокой численной диафрагмой влечет за собой оптимизированные настройки для интравитальной визуализации.
В совокупности оптимальный экспериментальный дизайн с учетом выбора соответствующих флуоресцентных красителей и техники микроскопии, а также конфигурации устройства визуализации следует рассматривать в качестве ключевых шагов для получения успешного результата этих экспериментов. В перспективе разработка инструментов прогнозирования/количественной оценки на основе изображений может облегчить интерпретацию полученных данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один.
Acknowledgments
Исследования, ведущие к этим результатам, получили финансирование от Программы «Действия людей» (Marie Curie Actions) в соответствии с грантовым соглашением REA No 302170 Седьмой рамочной программы Европейского союза (FP7/2007-2013); Междисциплинарный центр клинических исследований (ИЗКФ) Университета Эрлангена-Нюрнберга; Совместный исследовательский центр TRR241 и Группа клинических исследований KFO257 Немецкого исследовательского совета (DFG); и DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | - |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | - |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | - | - |
| LSM microscope SP8 | Leica | - | - |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | - |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | - |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
References
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation? Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics. Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).
- Kiesslich, R., et al. Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease. Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).
- Dourmashkin, R. R., et al. Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease. Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).
- Soderholm, J. D., et al. Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease. Gut. 50 (3), 307-313 (2002).
- Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface. American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
- Fan, Y., Bergmann, A. Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell! Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).
- Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways. Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research. Cytometry A. , (2019).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance. Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).
- Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases. Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).
- Kiesslich, R., et al. Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).
- Krishnamurthy, S., et al. Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Lopez-Posadas, R., et al. Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).
- Duckworth, C. A., Watson, A. J. Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium. Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Haep, L., et al. Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).
- Lopez-Posadas, R., et al. Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice. Gastroenterology. , (2019).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
