Summary
利用病毒内显微镜,这里介绍的方法使活体动物的肠道上皮细胞脱落的实时可视化。因此,麻醉小鼠的局部染色肠道粘膜(acriflavine 和 rhodamineB-dextran)使用共和显微镜被成像为单细胞分辨率。
Abstract
使用共体成像对肠道进行病毒内显微镜,可以实时观察活体动物的上皮细胞脱落和屏障泄漏。因此,麻醉小鼠的肠道粘膜被局部染色,并染色有非特异性染色(acriflavine)和荧光示踪剂(rhodamine-B dextran),安装在盐水溶液冲洗板上,并使用共和显微镜直接成像。该技术可以补充其他非侵入性技术,以识别肠道渗透性泄漏,如口头管理的示踪剂的跨粘膜通道。除此之外,这里介绍的方法允许实时直接观察细胞脱落事件。与适当的荧光记者小鼠结合,这种方法适用于将光分入控制肠道上皮细胞挤出的细胞和分子机制,以及其他生物过程。过去几十年,使用病毒内显微镜进行有趣的研究有助于了解内皮渗透性、免疫细胞肠道定位、免疫上皮通信和灯具成分的入侵等。这里提出的协议不仅有助于增进对控制上皮细胞挤出的机制的理解,而且可以作为其他方法的发展的基础,这些方法可以用作工具,以可视化其他高动态细胞过程,即使在其他组织中。在技术限制中,特定组织的光学特性以及选定的成像技术和显微镜配置反过来将决定成像工作距离和采集图像的分辨率。
Introduction
肠道是一个高度专业化的器官,具有严格调节的功能,能够产生冲突过程,即营养和防止有害发光物质。在人体与环境之间,肠道上皮作为物理和免疫屏障,有助于维持肠道1,2的粘膜平衡。上皮完整性的丧失和紧密结渗透性增加是众所周知的与炎症性肠病(IBD)3,4,5,6。3,4,5,6然后,上皮改变被认为是IBD慢性肠道炎症的原因和辅助放大器。因此,更好地了解IBD患者肠道的早期上皮变化,对于制定恢复上皮完整性的新战略,以便进行可靠的预测和随后预防IBD复发,将具有巨大的价值。
肠道上皮遵循一个复杂和严格监管的周转过程。从墓穴底部,从多能干细胞中提取的端点分化肠道上皮细胞(IECs)向上迁移至维卢斯尖端,在那里老化/受损的细胞被流变到流明7。分裂和细胞挤出之间的平衡能够维持肠道上皮细胞数,避免形成间隙和泄漏,以及上皮细胞的积累,可能导致细胞质量和肿瘤发生,8,9,10。,10尽管上皮细胞脱落在肠道上皮的生理更新中起着关键作用,但有关分子机制推动细胞在维卢斯尖端挤出的知识是有限的。因此,有必要进行基础研究,对上皮细胞脱落所涉及的分子事件序列进行精确描述。
肠道粘膜内不同细胞类型之间的复杂相互作用是了解调节上皮周转和肠道平衡的分子机制的关键。因此,在这种情况下,体内研究比体外和体外方法具有很高的优势。此外,实时成像技术允许描述控制特定现象的事件序列。在这方面,研究高动态过程需要使用优化的高分辨率技术直接观察组织。体内成像技术似乎作为独特的适当工具,用于研究上皮细胞在肠道脱落。
术语"病毒内显微镜"是指利用高分辨率成像技术(多光子或共生显微镜)直接可视化活体动物11内其原生环境内的细胞和组织的实验方法。它支持实时获取体内信息,高达单细胞分辨率,并且与静态或低分辨率方法相比具有明显的优势。内维图显微镜提供补充信息,并克服经典和/或高端技术的一些限制,如组织加工造成的伪影。相比之下,病毒内显微镜的主要局限性是,组织应直接暴露在显微镜下,在大多数情况下,这需要手术。虽然复杂的方法保持活力,并尽量减少图像组织(皮肤折叠室和成像窗口)的影响12,13,,13在大多数情况下,一个简单的皮肤切口执行组织外化(皮肤皮瓣)14。在过去十年中,这些方法为高度动态的过程提供了关键证据,这些进程以前是难以理解的。翻译上,实时成像提供了新的生物学见解干细胞和白细胞,以及癌症传播和转移形成13,16。13,16在临床背景下,内皮镜目前被利用作为癌症17和胃肠道疾病的诊断工具,如IBD18,19;,19而共体马赛克显微镜成为手术20期间的快速病理工具。一起,病毒内显微镜最近已成为生物医学研究和未来在临床应用的宝贵和通用的工具。
内维他微显微镜是在这里实现的肠道上皮泄漏的实时可视化和上皮细胞脱落事件的观察。肠道渗透性泄漏可以通过其他体内非侵入性技术进行识别,例如在血清21中对荧光示踪剂进行口头注射。然而,这种技术不允许直接观察脱落性能,也不允许分离准细胞和跨细胞渗透性。标准示踪剂实验和病毒内显微镜的结合代表了一种合适的方法:i) 识别肠道渗透性中的干扰,ii) 分离准细胞和跨细胞上皮渗透性。除了细胞脱落,体内显微镜与体内荧光标签相结合,使研究其他细胞和分子机制(例如,使用荧光报告小鼠22或在肠道粘膜23 内的其他细胞在细胞脱落过程中紧密结再分配或国际细胞与肠道粘膜23内的其他细胞之间的相互作用)。
此处介绍的方法表示对病毒内显微镜的适应,以便使用共和激光扫描显微镜 (CLSM) 实时观察肠道粘膜。因此,我们使用有条件的敲除小鼠GGTase(Geranylgeranyl转移酶)在肠道上皮细胞(IECs)在(Pggt1bi+IEC 小鼠),因为他们患有严重的肠道疾病和增加上皮渗透性24。介绍了小鼠的手术准备和肠道粘膜的染色,以及用于成像采集和采集后分析的适当设置。该协议可以使未来的研究有助于目前关于肠道上皮细胞脱落动力学和动力学的知识。此外,该协议可以作为各种适应的基础,以研究发生在肠道粘膜表面,甚至在其他组织的其他现象。
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Protocol
以下议定书已获埃尔兰根(德国维尔茨堡雷吉隆·冯·翁特弗兰肯)相关地方当局批准。老鼠被安置在特定的无病原体条件下。
注:在IECs内抑制GGTase-中压的预膜抑制会导致 Pggt1bi+IEC 小鼠24肠道渗透性严重改变。因此,此鼠标模型用于演示该协议如何可用于研究肠道屏障缺陷。但是,此协议可用于研究任何其他鼠标行。
1. 手术准备和小鼠肠道粘膜染色
注:手术准备基于前面描述的协议25。在手术准备期间,将麻醉小鼠放在红灯下,以避免体温下降。
- 麻醉小鼠通过氯胺酮/西拉津注射(96毫克/千克氯胺酮;和12.8毫克/千克西拉津)。通过检查缺乏眼睑反射来验证麻醉。
- 使用棉芽涂抹护眼霜。
- 使用标准钳和直细剪刀在左腹区域进行切口(1 厘米)。
- 外化肠道的一段(5-7厘米,约)。
- 通过直肠侧电烧,纵向打开外化肠道部分。
- 暴露粘膜,并很快用盐水溶液冲洗,以去除粪便含量。
注:可选地,直接在肠道上涂抹 xylazin,以避免因近位而导致的运动伪影。 - 用阿克里弗拉文和罗丹-B dextran(10kDa)染色肠道粘膜的表面。
- 通过滴在粘膜上滴滴移液和孵育3分钟,应用1mg/mL阿克里弗拉文溶液(100μL)。用 PBS 洗掉剩余的溶液。
- 将 2 mg/mL 罗丹胺-二十兰溶液(100 μL)涂抹,通过滴在粘膜上滴移液并孵育3分钟。用 PBS 洗掉剩余的溶液。
注:可选,使用无菌棉从制剂中去除血液。
- 将麻醉小鼠 supine 放在安装在用预热盐水溶液 (37 °C) 冲洗的室内盖幻灯片上。
注:打开的肠道部分随后将发光表面向下放置,放在盖幻灯片上。 - 将制备(麻醉小鼠在腔室中)放在倒置显微镜阶段。
- 用等温垫盖住动物(约37°C)。
- 立即进行病毒内显微镜检查。
注:保持手术准备用预热盐水溶液冲洗,以避免组织脱水和细胞死亡。
2. 病毒内显微镜
注:在开始手术准备之前执行步骤2.1,以避免麻醉、手术和图像采集之间的长时间等待。如有必要,可向手术准备的动物提供额外剂量的麻醉剂,以使它们接受麻醉,进行成像实验。
- 设置 CLSM 显微镜。
- 打开显微镜底座和扫描仪盒,启动 CLSM 显微镜。按"开始"按钮 打开 计算机。
- 通过双击图标启动图像采集软件(例如 LAS X)。选择适当的配置(配置:机器;显微镜:DMI6000)并单击"确定"。
- 定义适当的分辨率。转到 配置 |硬件 |分辨率 |位深度。选择 12。
- 转到"获取 " 菜单。从下拉菜单中选择图像采集模式的 xyzt。 从放置菜单(20 倍或 40 倍)中选择目标。
- 设计顺序采集设置。单击 Seq。通过单击添加按钮 (+), 添加第 二个序列。在 帧之间选择。
- 配置序列 1(检测火种;416 nm 激发;514 nm 发射)。打开可见的激光盒。激活 PMT1 (打开)。定义发射波长窗口(490-550 nm)。
- 配置序列 2(检测罗达明B-dextran;570 nm激发;590 nm,发射)。打开可见的激光盒。激活 PMT2 (打开)。定义发射波长窗口 (550-760)。
- 激活相应的激光(488 和 552)。转到 配置 |激光。激活 488 和 552 nm 激光器(打开)。
- 根据当前实验的特定功能调整设置。
- 打开光源(按电源)。将制备(在腔室中的麻醉小鼠)放在显微镜舞台上,并更改 xy 位置,直到照明轴聚焦在组织准备上。
- 使用标准光源和目镜选择感兴趣的领域。
- 选择筛选器立方体 (I3)。打开快门。使用微轮和微轮,聚焦肠道粘膜的表面。搜索一个区域,通过更改 XY 位置,可以在视野中可视化多个 villi。
- 验证罗丹胺-德xtran染色是否也可见于该区域。更改滤波数据集 (N2.1)。通过目镜检查图像。
- 从软件开始获取 CLSM 映像。优化两个序列的设置。
- 选择序列 1。调整序列 1 的激光功率、增益和偏移。
- 选择序列 2。调整序列 2 的激光功率、增益和偏移。
- 定义 z 堆栈范围。
- 打开 Z 堆栈放置菜单。使用 z 轴控制,聚焦粘膜表面。按"开始"。
- 关注信号仍可检测到的底部限制。按"结束"。
- 定义 z 堆栈数 (10)。避免连续两个时间点的时间推移时间超过 2 分钟。
- 定义时间设置。转到 时间菜单 。单击 "最小化"。选择 "获取"直到停止。
- 定义线平均值。选择"Seq 1"。选择行平均值 2。选择"Seq 2"。选择行平均值 2。
- 获取相应的图像。
- 选择格式 (1024 x 1024) 和速度 (400)。按"开始"。
- 按 所需 图像采集时间后停止。
- 保存文件。转到项目。右键单击相应的文件。按"另存为"。
- 适当地命名文件。选择适当的文件夹。按"保存"。
- 如果需要,对动物(宫颈脱位)进行安乐死,并收集组织进行别有用心的分析。
3. 图像分析:确定细胞脱落率和肠道上皮
- 细胞脱落率
- 启动图像采集软件。
- 转到"打开"项目。选择适当的文件。
- 定义图像采集的总时间。
- 选择最后一个完整的 z 堆栈。从以前选择的时间点中选择最后一个 Z 位置。读取屏幕右下角的时间(图像采集的总时间)。
- 选择一个维卢斯。
- 选择适当的 Z 堆栈位置(villus 的表面,但足够深,以避免对流明上已经脱落的细胞和其他组件的干扰)。
- 测量基底膜的长度。选择标尺工具。将维卢斯分成几条线,以覆盖或绘制整个维卢斯周长。添加不同的值(基底膜的总长度)。删除标尺工具的段。
- 计算整个图像采集期间发生的事件数。
- 将 villus 分成足够大小的段。通过滑过不同的时间点来分析事件/分段的顺序。注释标识的单元格脱落事件。
- 计算下层膜的脱落事件/时间/长度数,表示细胞脱落率。最多数 5 个 villi/视频,以及至少两个视频/鼠标。计算这 10 个测量值的平均值。
- 泄漏
- 选择一个维卢斯。
- 选择适当的 Z 堆栈位置(villus 的表面,但足够深,以避免对流明上已经脱落的细胞和其他组件的干扰)。计算上皮细胞/肿瘤的总数。
- 计算泄漏点的数量(罗达明葡萄糖的帕拉细胞存在。此事件是短暂的,可以通过检查以前和别有用心的图片来确认)。
- 计算上皮细胞的泄漏数/总数。分析10种不同的villus/样本/视频,并计算泄漏和渗透细胞/维卢斯的平均数量。
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Representative Results
此处介绍的协议描述了一种基于病毒内显微镜的方法,用于可视化肠道上皮泄漏并实时观察肠道中的细胞脱落性能。简单地说,小鼠麻醉和提交手术准备,以暴露小肠粘膜的表面。然后,通过局部应用 acriflavine 来染色 IECs;而发光的罗达明B-dextran被用作示踪剂,以检测从流明到亚上皮空间的透气通道。因此,手术准备和麻醉小鼠被放置在安装在培养皿中的幻灯片上,并随着时间的推移使用CLSM进行成像(图1)。采集后分析允许计算上皮细胞脱落率(细胞脱落事件数/分钟/基底膜长度)以及临时泄漏(准细胞渗透性)和"可渗透细胞"(透细胞渗透性)在确定的时间点。
为了诱导上皮完整性的改变,我们利用了之前描述的特定于IEC的GGTase缺陷条件小鼠模型(Pggt1bi+IEC小鼠),通过LoxP-Cre系统24生成。如前所述,Pggt1bi+IEC小鼠(图2A)A发展为严重的肠道病理学,如小肠组织损伤评分增加(图2B所示)。通过使用口头管理的 FITC-dextran (4 kDa) (图2C)在体内的示踪器检测出肠道上皮渗透性增强,然后通过体内显微镜(图 2D-2E)确认肠道上皮渗透性增强。Figure 2虽然罗达胺葡萄糖被限制在对照小鼠的发光室,但我们可以在Pggt1bi+IEC小鼠的IECs中废除GGTase表达时,检测下皮室内的示踪。在图像采集过程中,细胞脱落事件可以识别为细胞从上皮单层进入流明,导致上皮密封的暂时间隙,最终由相邻细胞之间的接触闭合,即所谓的拉链效应(图3A)。我们可以清楚地观察到这些差距,我们称之为控制鼠和Pggt1bi+IEC小鼠的临时上皮泄漏,尽管这种现象在后者中的频率更高(图3B,3C)。有趣的是,我们还可以识别其他细胞,其中可检测到细胞内,所谓的"渗透细胞";这些事件主要发生在Pggt1bi+IEC小鼠(图3B,3D)。B,3D总之,利用这里介绍的病毒内显微镜方法,我们可以确定Pggt1bi+IEC小鼠的上皮完整性受损会导致细胞脱落性能的改变,并增加肠道的准细胞和跨细胞上皮渗透性。
图1:此处介绍的图解描述中介绍了病毒内显微镜方法。 (A) 流程图. (B) 图. 手术后,肠道粘膜上沾有阿克里夫和罗达明葡萄糖的盖板,嵌入在培养皿上,允许用盐水溶液灌注(发光表面向下)。然后使用 CLSM 显微镜对肠道粘膜进行成像。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 2:Pggt1bi+IEC 小鼠上皮完整性受损,导致肠道渗透性增强。 (A) 西方印迹显示塔莫西芬诱导的废除GGTase-1B表达在 IECs在PGgt1bi+IEC 与对照小鼠。(B) 小肠从对照组和 Pggt1bi+IEC小鼠的组理得分 。(C) 通过口头管理的 FITC-Dextran (4 kDa) 的转粘膜通道测量体内肠道上皮渗透性的定量。(D) 描述图像采集方向的图,从流明向下到维卢斯轴。来自 z 堆栈的代表性图片。(E) 代表图片内病毒显微镜使用顶部应用阿克里弗拉文和罗丹B-dextran从 控制和Pggt1bi+IEC小鼠 ,如本手稿所述。数据表示为平均± SEM. 非配对 t 检验。* P 值≤ 0.05;P 值≤ 0.0001。请单击此处查看此图的较大版本。
图3:使用病毒内显微镜,显亲细胞脱落性能和半/跨细胞上皮渗透性。(A) 显示实时单元格脱落事件的代表性图片(白色箭头)。棚体从上皮单层挤压到流明。相邻细胞密封临时泄漏(拉链效应),以避免屏障功能损失。(B) 显示泄漏(白色箭头)和可渗透肠道上皮细胞(蓝色箭头)的代表性图片。(C-D)定量对照和Pggt1bi+IEC小鼠的临时泄漏 (C) 和渗透细胞 ( D.D数据表示为平均± SEM. 非配对 t 检验。* P 值≤ 0.05;P 值 ≤ 0.0001 .请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
虽然技术上具有挑战性,但基于病毒内显微镜的方法代表了一种独特的实验方法,可以实时可视化高动态细胞过程,例如细胞脱落性能。到目前为止,还没有其他的实验方法来可视化体内的细胞挤出。我们相信,该协议有助于描述不同的细胞过程在维持肠道平衡方面发挥作用。
利用病毒内显微镜,这里介绍的方法使活体动物的肠道上皮细胞脱落的实时可视化。因此,麻醉小鼠的局部染色肠道粘膜(阿克里弗拉文和罗丹B-dextran)使用共和显微镜将图像成像为单细胞分辨率。结合标准示踪剂实验,可以识别体内肠道渗透性扰动,并区分准细胞渗透性和跨细胞渗透性。与记者小鼠结合,利用类似的协议来监测上皮细胞脱落,可以显示紧密的结再分配,以密封挤出细胞留下的暂时性泄漏(拉链状效应)22,,26。
除了上皮细胞脱落外,本文介绍的方法的修改已适应对肠道粘膜表面发生的其他高动态细胞过程的分析。例如,静脉注射示踪剂分子和血管染色与抗CD31抗体提供了机会,以评估内皮完整性在肠道27。除了上皮,类似的方法已经被用来研究免疫细胞28,29的29肠道宿主特性,以及免疫细胞和EECs在肠道感染23的背景下相互作用。
尽管此处描述的协议存在大量潜在应用,但其使用也存在一些限制。试样内的光散射会损害组织深处成像的获取。在小肠的情况下,图像采集仅限于发生在粘膜表面(villus 尖端)的现象。另一方面,肠道本身的结构和功能限制了病毒内显微镜的性能。尽管具有最佳的器官光学特性,但蠕动组织收缩以及肠道病毒的流动运动意味着在图像采集过程中对焦点平面的频繁修改。
对此处提出的协议进行潜在修改可能会克服其中一些限制。使用替代显微镜技术(如单光子或多光子显微镜)意味着更高的切光深度,以便可视化样品表面以下 50-100 μm 的对焦平面。然而,考虑图像分辨率和采集时间之间的妥协非常重要,因为这些实验旨在观察快速和动态的过程。在显微镜配置和/或设置方面,使用更长的波长以及选择具有高数值孔的长自由工作距离目标需要优化对病毒内成像的设置。
综合考虑选择适当的荧光染料和显微镜技术以及成像装置的配置,应共同考虑最佳实验设计,以便从这些实验中获得成功的结果。作为未来的观点,开发基于图像的预测/量化工具可能有助于解释获得的数据。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
导致这些结果的研究得到了《人民方案》(玛丽居里行动)根据欧洲联盟第七框架方案第302170号《REA赠款协定》(FP7/2007-2013)提供的资金;埃尔兰根-纽伦堡大学跨学科临床研究中心( IZKF);合作研究中心TRR241和德国研究理事会(DFG)的临床研究组KFO257;和 Dfg 。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | - |
Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | - |
Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
LAS X | Leica | - | - |
LSM microscope SP8 | Leica | - | - |
PBS | Biochrom | L182 | |
Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | - |
Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | - |
Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
Xylazin | Bayer | 1320422 |
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