Summary
इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी का लाभ उठाते हुए, यहां प्रस्तुत विधि जीवित जानवरों में आंतों के एपिथेलियल सेल शेडिंग के वास्तविक समय के दृश्य को सक्षम बनाती है। इसलिए, एनेस्थेटाइज्ड चूहों के सामयिक रूप से दाग वाली आंतों म्यूकोसा (एक्क्रिमेन और रोडामाइन-डेक्सट्रान) को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन तक इमेज किया जाता है।
Abstract
कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके आंत की इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी एपिथेलियल सेल शेडिंग और जीवित जानवरों में बाधा रिसाव के वास्तविक समय अवलोकन की अनुमति देती है। इसलिए, एनेस्थेटाइज्ड चूहों की आंतों के म्यूकोसा को एक खारा समाधान-कुल्ला प्लेट पर चढ़कर और सीधे कॉन्फोसल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक फ्लोरोसेंट ट्रेसर (रोडामाइन-बी डेक्सट्रॉन) के साथ सामयिक रूप से दाग दिया जाता है। यह तकनीक अन्य गैर-आक्रामक तकनीकों को पूरक कर सकती है ताकि आंतों की पारिम्यता के रिसाव की पहचान की जा सके, जैसे मौखिक रूप से प्रशासित ट्रेसर्स का ट्रांसमुकोसल मार्ग। इसके अलावा, यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण वास्तविक समय पर सेल शेडिंग घटनाओं के प्रत्यक्ष अवलोकन की अनुमति देता है। उपयुक्त फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहों के संयोजन में, यह दृष्टिकोण आंतों के एपिथेलियल सेल एक्सट्रूज़न के साथ-साथ अन्य जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने वाले सेलुलर और आणविक तंत्र में प्रकाश बहाने के लिए उपयुक्त है। पिछले दशकों में, इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके दिलचस्प अध्ययनों ने एंडोथेलियल पारगम्यता, प्रतिरक्षा कोशिका आंत होमिंग, प्रतिरक्षा-एपीथेलियल संचार और चमकदार घटकों के आक्रमण पर ज्ञान में योगदान दिया है। एक साथ, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल न केवल एपिथेलियल सेल एक्सट्रूज़न को नियंत्रित करने वाले तंत्र की समझ को बढ़ाने में मदद करेगा, बल्कि अन्य ऊतकों में भी अन्य अत्यधिक गतिशील सेलुलर प्रक्रिया की कल्पना करने के लिए उपकरणों के रूप में उपयोग किए जाने वाले अन्य दृष्टिकोणों के विकास का आधार हो सकता है। तकनीकी सीमाओं में, विशिष्ट ऊतक के ऑप्टिकल गुण, साथ ही चयनित इमेजिंग तकनीक और माइक्रोस्कोप विन्यास, बदले में इमेजिंग कामकाजी दूरी और अधिग्रहीत छवियों के संकल्प का निर्धारण करेगा।
Introduction
आंत एक अत्यधिक विशेष अंग है जिसमें एक कसकर विनियमित कार्य होता है जो परस्पर विरोधी प्रक्रियाओं को सक्षम करता है, अर्थात् हानिकारक चमकदार पदार्थों के खिलाफ पोषण और सुरक्षा। मानव शरीर और पर्यावरण के बीच अस्तर, आंतों का एपिथेलियम एक भौतिक और प्रतिरक्षा बाधा के रूप में कार्य करता है और आंत1,,2में म्यूकोसल होमोस्टेसिस के रखरखाव में योगदान देता है। एपिथेलियल अखंडता और बढ़ी हुई तंग जंक्शन पारमेबिलिटी का नुकसान भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) 3 , 4,5, 6 से जुड़ा होने के लिए अच्छीतरह,से जाना,जाताहै।5 एपिथेलियल परिवर्तन को तब आईबीडी में पुरानी आंतों की सूजन के कारण और माध्यमिक एम्पलीफायर के रूप में माना जाता है। इस प्रकार, आईबीडी रोगियों के पेट में प्रारंभिक एपिथेलियल परिवर्तनों की बेहतर समझ विश्वसनीय भविष्यवाणी और बाद में आईबीडी रिलेप्स की रोकथाम के लिए एपिथेलियल अखंडता को बहाल करने के लिए नई रणनीतियों के विकास के लिए बहुत मूल्य होगी।
आंतों के एपिथेलियम एक जटिल और कसकर विनियमित कारोबार प्रक्रिया का पालन करता है। तहखाना नीचे से, पूर्णपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त मरणासन्न विभेदित आंतों के एपिथेलियल कोशिकाएं (आईईसी) ऊपर की ओर विल्लस टिप पर स्थानांतरित हो जाती हैं, जहां वृद्ध/क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को ल्यूमेन 7 में बहायाजाताहै । विभाजन और कोशिका निष्कासन के बीच संतुलन आंतों के एपिथेलियल सेल संख्याओं के रखरखाव, अंतराल और रिसाव के गठन से बचने के साथ-साथ एपिथेलियल कोशिकाओं के संचय को संभावित रूप से सेल जनता और ट्यूमरजनन8,,9,,10तक ले जाने में सक्षम बनाता है। आंत एपिथेलियम के शारीरिक नवीकरण में एपिथेलियल सेल शेडिंग की महत्वपूर्ण भूमिका के बावजूद, मॉलस टिप पर कोशिकाओं के निष्कासन को चलाने वाले आणविक तंत्र के बारे में ज्ञान सीमित है। इस प्रकार, एपिथेलियल सेल शेडिंग में शामिल आणविक घटनाओं के अनुक्रम का सटीक विवरण प्रदान करने वाले बुनियादी अनुसंधान की आवश्यकता है।
आंतों म्यूकोसा के भीतर विभिन्न सेल प्रकारों के बीच जटिल बातचीत एपिथेलियल टर्नओवर और आंतों के होमोस्टेसिस को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, वीवो अध्ययन में इस संदर्भ में इन विट्रो और पूर्व वीवो दृष्टिकोणों पर उच्च लाभ प्रदान करते हैं। इसके अलावा, वास्तविक समय इमेजिंग तकनीक विशिष्ट घटनाओं को नियंत्रित करने वाली घटनाओं के अनुक्रम के विवरण की अनुमति देती है। इस संदर्भ में, अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन ऊतक के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए अनुकूलित उच्च संकल्प तकनीकों के उपयोग की मांग करता है। इंट्राविटल इमेजिंग तकनीक आंत में एपिथेलियल सेल शेडिंग के अध्ययन के लिए अद्वितीय उपयुक्त उपकरण के रूप में दिखाई देती है।
"इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी" शब्द एक जीवित जानवर11के भीतर अपने मूल वातावरण में कोशिकाओं और ऊतकों की कल्पना करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीकों (मल्टीफोटोन या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी) का लाभ उठाने के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों को संदर्भित करता है। यह वीवो जानकारी में एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन तक वास्तविक समय अधिग्रहण को सक्षम बनाता है, और स्थिर या कम रिज़ॉल्यूशन विधियों पर स्पष्ट लाभ पर जोर देता है। इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी पूरक जानकारी प्रदान करता है और शास्त्रीय और/या उच्च अंत तकनीकों से कुछ सीमाओं को दूर करता है, जैसे ऊतक प्रसंस्करण के कारण कलाकृतियों । इसके विपरीत, इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी की मुख्य सीमा यह है कि ऊतक को सीधे माइक्रोस्कोप से अवगत कराया जाना चाहिए, जिसमें ज्यादातर मामलों में सर्जरी की आवश्यकता होती है। यद्यपि परिष्कृत दृष्टिकोण जीवन शक्ति को बनाए रखते हैं और चित्रित ऊतक (स्किनफोल्ड चैम्बर्स और इमेजिंग खिड़कियां)12, 13,13के प्रभाव को कम करते हैं, लेकिन ज्यादातर मामलों में ऊतक (त्वचा फ्लैप)14के बाह्यीकरण के लिए एक साधारण त्वचा चीरा किया जाता है। पिछले दशक में, इन दृष्टिकोणों ने अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं के बारे में महत्वपूर्ण सबूत दिए हैं, जो पहले गूढ़ थे । अनुवादात्मक रूप से, वास्तविक समय इमेजिंग ने स्टेम सेल और ल्यूकोसाइट्सहोमिंग 15पर नई जैविक अंतर्दृष्टि प्रदान की, साथ ही कैंसर प्रसार और मेटास्टेसिसगठन 13,,16। नैदानिक संदर्भ में, एंडोमिक्रोस्कोपी को वर्तमान में कैंसर 17 और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल रोगों जैसे आईबीडी,18, 19के नैदानिक उपकरण के रूप में शोषण कियाजाताहै।17 जबकि कॉन्फोकल मोज़ेकिंग माइक्रोस्कोपी सर्जरी20दौरान एक रैपिड पैथोलॉजी टूल बन गया . साथ में, इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी हाल ही में क्लिनिक में जैव चिकित्सा अनुसंधान और भविष्य के आवेदन के लिए एक मूल्यवान और बहुमुखी उपकरण के रूप में उभरा है।
इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी यहां आंतों के एपिथेलियल रिसाव और एपिथेलियल सेल शेडिंग घटनाओं के अवलोकन के वास्तविक समय के दृश्य के लिए लागू किया गया है। आंतों की पारिम्यता के रिसाव की पहचान वीवो नॉनइनवेसिव तकनीकों में अन्य द्वारा की जा सकती है, जैसे सीरम21में फ्लोरोसेंट ट्रेसर्स के मौखिक प्रशासन का मात्राकरण। हालांकि, यह तकनीक प्रदर्शन को बहाने के प्रत्यक्ष अवलोकन की अनुमति नहीं देती है और न ही पैरा-और ट्रांस-सेलुलर पारमेबिलिटी के बीच अलगाव। मानक ट्रेसर प्रयोगों और इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी का संयोजन एक उपयुक्त दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है: i) आंतों की पारगम्यता में गड़बड़ी की पहचान करें, और ii) पैरा-और ट्रांस-सेलुलर एपिथेलियल पारगम्यता के बीच अलग होते हैं। सेल शेडिंग के अलावा, वीवो फ्लोरेसेंस लेबलिंग में संयोजन में इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी अन्य सेलुलर और आणविक तंत्र (उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहों 22 या आंतों के म्यूकोसा23 के भीतर आईईसी और अन्य कोशिकाओं के बीच बातचीत का उपयोग करके सेल शेडिंग केदौरानतंग जंक्शन पुनर्वितरण) के अध्ययन में सक्षम बनाता है।
यहां प्रस्तुत विधि कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएएम) का उपयोग करके आंतों के म्यूकोसा के वास्तविक समय अवलोकन को सक्षम करने के लिए इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी के अनुकूलन का प्रतिनिधित्व करती है। इसलिए, हम(Pggt1biCIEC चूहों) में आंतों की एपिथेलियल कोशिकाओं (आईईसी) में GGTase (Geranylgeranyltransferase) के सशर्त नॉक आउट चूहों का उपयोग करते हैं, क्योंकि वे एक गंभीर आंतों की बीमारी से पीड़ित हैं और एपिथेलियल पारमेबिलिटी24में वृद्धि हुई है। माउस की सर्जिकल तैयारी और आंतों के म्यूकोसा का धुंधला, साथ ही इमेजिंग अधिग्रहण और अधिग्रहण के बाद विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली उचित सेटिंग्स का वर्णन किया गया है। यह प्रोटोकॉल भविष्य के अध्ययनों को आंतों के एपिथेलियल सेल शेडिंग की गतिशीलता और काइनेटिक्स के बारे में वर्तमान ज्ञान में योगदान देने में सक्षम बना सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल आंतों के म्यूकोसा की सतह पर होने वाली अन्य घटनाओं का अध्ययन करने के लिए विभिन्न अनुकूलनों के लिए एक आधार के रूप में काम कर सकता है, और यहां तक कि अन्य ऊतकों पर भी।
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Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल को एर्लैंगन (रेजियरुंग वॉन अनटरफ्रेन्केन, वुर्ज़बर्ग, जर्मनी) में संबंधित स्थानीय अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया है। चूहों को विशिष्ट रोगजनक मुक्त परिस्थितियों में रखे गए थे।
नोट: आईईसी के भीतर GGTase-मध्यस्थता prenylation के अवरोध Pggt1bi A.IEC चूहों24में आंतों की पारगम्यता का एक गंभीर परिवर्तन का कारण बनता है । इसलिए, इस माउस मॉडल का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया गया था कि प्रोटोकॉल आंतों के बाधा दोषों का अध्ययन करने के लिए कैसे उपयोगी हो सकता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी अन्य माउस लाइन के अध्ययन के लिए किया जा सकता है।
1. सर्जिकल तैयारी और माउस आंतों म्यूकोसा धुंधला
नोट: शल्य चिकित्सा की तैयारी पहले वर्णित प्रोटोकॉल25पर आधारित है । शरीर के तापमान में गिरावट से बचने के लिए, शल्य चिकित्सा तैयारी के दौरान एक लाल दीपक के नीचे एनेस्थेटाइज्ड माउस रखें।
- केटामाइन/जाइलाजिन (९६ मिलीग्राम/किलो केटामाइन; और १२.८ मिलीग्राम/किलो जाइलाजिन) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा एनेस्थेटाइज माउस । पलक पलटा न हो इसके लिए जांच कर संज्ञाहरण का सत्यापन करें।
- कॉटन कली का इस्तेमाल करते हुए आई प्रोटेक्शन क्रीम लगाएं।
- मानक संदंश और सीधे ठीक कैंची का उपयोग कर बाएं वेंट्रल क्षेत्र पर एक चीरा (1 सेमी) बनाओ।
- आंत के एक खंड (5-7 सेमी, लगभग) को बाहरी बनाएं।
- बाहरी आंतों के खंड को एंटाइमेंटेरिक साइड में इलेक्ट्रोकेटराइजेशन द्वारा देशांतर से खोलें।
- म्यूकोसा का पर्दाफाश करें और मल सामग्री को हटाने के लिए खारे समाधान के साथ शीघ्र ही कुल्ला करें।
नोट: वैकल्पिक रूप से, पेरिस्टलसिस के कारण गति कलाकृतियों से बचने के लिए सीधे पेट पर जाइलाजिन लागू करें। - एक्रिफ्लामिन और रोडामाइन-बी डेक्सट्रान (10 केडीए) के साथ आंतों के म्यूकोसा की सतह को दाग दें।
- म्यूकोसा पर ड्रॉप करके ड्रॉप करके 1 मिलीग्राम/एमएल एक्क्राइन सॉल्यूशन (100 माइक्रोन) लगाएं और 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पीबीएस के साथ शेष समाधान को धो लें।
- म्यूकोसा पर ड्रॉप करके ड्रॉप को पिपिंग करके 2 मिलीग्राम/एमएल रोडामाइन-डेक्सट्रान सॉल्यूशन (100 माइक्रोन) लगाएं और 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पीबीएस के साथ शेष समाधान को धो लें।
नोट: वैकल्पिक रूप से, एसेप्टिक कपास का उपयोग करके तैयारी से रक्त निकालें।
- एनेस्थेटाइज्ड माउस रीढ़ को एक कवर स्लाइड पर रखें जो पूर्व-गर्म खारा समाधान (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ कुल्ला किए गए कक्ष में रखा गया है।
नोट: खोला आंतों खंड तो कवर स्लाइड पर, चमकदार सतह नीचे रखा जाता है । - उलटा माइक्रोस्कोप चरण पर तैयारी (कक्ष में एनेस्थेटाइज्ड माउस) रखें।
- जानवर को एक आइसोथर्मल पैड (लगभग 37 डिग्री सेल्सियस) से कवर करें।
- इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
नोट: ऊतक और सेल मृत्यु के निर्जलीकरण से बचने के लिए पूर्व-गर्म नमकीन समाधान के साथ शल्य चिकित्सा तैयारी को धोया रखें।
2. इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी
नोट: संज्ञाहरण, सर्जरी और छवि अधिग्रहण के बीच लंबे समय तक इंतजार करने से बचने के लिए, शल्य चिकित्सा तैयारी शुरू करने से पहले चरण 2.1 प्रदर्शन करें। यदि आवश्यक हो, तो इमेजिंग प्रयोगों के लिए संज्ञाहरण के तहत रखने के लिए शल्य चिकित्सा से तैयार जानवरों को एनेस्थेटिक्स की अतिरिक्त खुराक दी जा सकती है।
- सीएलएसएम माइक्रोस्कोप स्थापित करें।
- माइक्रोस्कोप बेस और स्कैनर बॉक्स को चालू करके सीएलएसएम माइक्रोस्कोप शुरू करें। स्टार्ट बटन दबाकर कंप्यूटर चालू करें।
- आइकन पर डबल क्लिक करके इमेज एक्विजिशन सॉफ्टवेयर (जैसे, लास एक्स) लॉन्च करें। उपयुक्त विन्यास का चयन करें (विन्यास: मशीन; माइक्रोस्कोप: DMI6000) और ठीक क्लिककरें ।
- उचित संकल्प को परिभाषित करें। विन्यास पर जाएं । हार्डवेयर । संकल्प । थोड़ी गहराई। 12 का चयन करें।
- अधिग्रहण मेनू पर जाएं। ड्रॉप-डाउन मेनू से छवि अधिग्रहण मोड के लिए xyzt का चयन करें। ड्रॉप-ऑफ मेनू (20x या 40x) से उद्देश्य का चयन करें।
- अनुक्रमिक अधिग्रहण सेटिंग डिजाइन करें। Seqपर क्लिक करें । ऐड बटन (+) पर क्लिक करके दूसरा सीक्वेंस डालें। फ्रेम के बीचचुनें ।
- कॉन्फिग्योर सीक्वेंस 1 (एक्रिफ्लेवाइन का पता लगाना; 416 एनएम एक्सिटेशन; 514 एनएम उत्सर्जन)। दिखाई लेजर बॉक्स चालू करें। पीएमटी1 (ऑन) को सक्रिय करें। उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य खिड़की (490-550 एनएम) को परिभाषित करें।
- कॉन्फिगर सीक्वेंस 2 (रोडामाइनबी-डेक्सट्रान का पता लगाना; 570 एनएम एक्सटिटेशन; 590 एनएम, उत्सर्जन)। दिखाई लेजर बॉक्स चालू करें। पीएमटी2 (ऑन) को सक्रिय करें। उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य खिड़की (550-760) को परिभाषित करें।
- संबंधित लेजर (488 और 552) को सक्रिय करें। विन्यास पर जाएं । लेजर। सक्रिय 488 और 552 एनएम लेजर (चाल चालू)..
- सेटिंग को वर्तमान प्रयोग की विशिष्ट विशेषताओं में समायोजित करें।
- प्रकाश स्रोत (प्रेस पावर) चालू करें। तैयारी (कक्ष में एनेस्थेटाइज्ड माउस) को माइक्रोस्कोप चरण पर रखें और जब तक रोशनी की धुरी ऊतक की तैयारी पर केंद्रित न हो जाए तब तक जाय की स्थिति बदलें।
- मानक प्रकाश स्रोत और आंखों के टुकड़े का उपयोग करके ब्याज के क्षेत्र का चयन करें।
- फिल्टर घन (I3) का चयन करें। शटर खोलें। मैक्रो-और माइक्रो-व्हील का उपयोग करके आंतों के म्यूकोसा की सतह पर ध्यान केंद्रित करें। एक ऐसे क्षेत्र की खोज करें जहां XY स्थिति को बदलकर देखने के क्षेत्र के भीतर कई विली की कल्पना की जा सकती है।
- सत्यापित करें कि उस क्षेत्र में रोडामाइन-डेक्सट्रान धुंधला भी दिखाई दे रहा है। फिल्टर घन (N2.1) बदलें। आईपीस के माध्यम से छवि की जांच करें।
- सॉफ्टवेयर से सीएलएसएम इमेज एक्विजिशन शुरू करें। दो दृश्यों के लिए सेटिंग्स का अनुकूलन करें।
- अनुक्रम 1 का चयन करें। अनुक्रम 1 के लिए लेजर शक्ति, लाभ और ऑफसेट समायोजित करें।
- अनुक्रम 2 का चयन करें। अनुक्रम 2 के लिए लेजर शक्ति, लाभ और ऑफसेट समायोजित करें।
- जेड स्टैक रेंज को परिभाषित करें।
- जेड-स्टैक ड्रॉप-ऑफ मेनू खोलें। जेड-एक्सिस नियंत्रण का उपयोग करके म्यूकोसा की सतह पर ध्यान केंद्रित करें। प्रेस शुरू।
- नीचे की सीमा पर ध्यान केंद्रित करें जहां सिग्नल अभी भी पता लगाने योग्य है। प्रेस एंड।
- जेड स्टैक (10) की संख्या को परिभाषित करें। लगातार दो बार अंक के लिए 2 मिनट से अधिक समय चूक से बचें।
- टाइम सेटिंग्स को परिभाषित करें। टाइम मेन्यू पर जाएं। क्लिक करें कम से कमकरें । बंद होने तक अधिग्रहणका चयन करें ।
- लाइन औसत को परिभाषित करें। Seq 1 का चयन करें। लाइन औसत 2 का चयन करें। Seq 2 का चयन करें। लाइन औसत 2 का चयन करें।
- इसी छवियों को प्राप्त करें।
- प्रारूप (1024 x 1024) और स्पीड (400) चुनें। प्रेस स्टार्ट।
- वांछित छवि अधिग्रहण समय के बाद प्रेस बंद करो।
- फाइल को सेव करें। परियोजनाके लिए जाओ । संबंधित फ़ाइल पर सही क्लिक करें। प्रेस के रूप में बचाओ।
- फाइल का नाम उचित रूप से दें। पर्याप्त फ़ोल्डर का चयन करें। प्रेस बचाओ।
- पशु (गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था) को इच्छामृत्यु दें और यदि आवश्यक हो तो गलत विश्लेषण के लिए ऊतकों को इकट्ठा करें।
3. छवि विश्लेषण: सेल शेडिंग दर और आंतों के एपिथेलियम का निर्धारण करें
- सेल शेडिंग दर
- छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर लॉन्च करें।
- ओपन प्रोजेक्ट्स पर जाएं। उपयुक्त फ़ाइल का चयन करें।
- छवि अधिग्रहण के कुल समय को परिभाषित करें।
- पिछले पूरा जेड ढेर का चयन करें। पहले से चयनित टाइम पॉइंट से अंतिम जेड स्थिति का चयन करें। स्क्रीन के दाहिने नीचे के कोने (छवि अधिग्रहण का कुल समय) पर समय पढ़ें।
- एक विल्लस का चयन करें।
- उपयुक्त जेड स्टैक स्थिति (विल्लस की सतह) का चयन करें, लेकिन पहले से ही शेड कोशिकाओं और ल्यूमेन में मौजूद अन्य घटकों के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए पर्याप्त गहरी है)।
- बेसल झिल्ली की लंबाई मापें। शासक उपकरण का चयन करें। पूरे विल्लस परिधि को कवर या आकर्षित करने के लिए कई लाइनों में विल्लस को विभाजित करें। विभिन्न मूल्यों (बेसल झिल्ली की कुल लंबाई) जोड़ें। शासक उपकरण के खंडों को हटा दें।
- छवि अधिग्रहण की पूरी अवधि के दौरान होने वाली घटनाओं की संख्या की गणना करें।
- विल्लस को पर्याप्त आकार के साथ खंडों में विभाजित करें। विभिन्न समय बिंदुओं के माध्यम से बार फिसलने से घटनाओं/खंड के अनुक्रम का विश्लेषण करें । पहचाने गए सेल शेडिंग की घटनाओं को एनोटेट करें।
- बेसल झिल्ली की बहा घटनाओं/समय/लंबाई की संख्या की गणना करें, जो सेल शेडिंग दर को इंगित करता है । 5 विली/वीडियो तक गिनें, और कम से दो वीडियो/माउस । इन 10 मापों के मतलब की गणना करें।
- रिसाव
- एक विल्लस का चयन करें।
- उपयुक्त जेड स्टैक स्थिति (विल्लस की सतह) का चयन करें, लेकिन पहले से ही शेड कोशिकाओं और ल्यूमेन में मौजूद अन्य घटकों के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए पर्याप्त गहरी है)। एपिथेलियल कोशिकाओं/विल्लस की कुल संख्या की गणना करें ।
- रिसाव बिंदुओं की संख्या (रोडामाइन डेक्सट्रान की पैरा-सेलुलर उपस्थिति) की गणना करें। यह घटना क्षणभंगुर है, जिसकी पुष्टि पिछले और गलत अधिग्रहीत चित्रों की जांच करके की जा सकती है।)
- रिसाव की संख्या/एपिथेलियल कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें । 10 विभिन्न विल्लस/नमूना/वीडियो का विश्लेषण करें और रिसाव और पारम करने योग्य कोशिकाओं/विल्लस की औसत संख्या की गणना करें ।
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Representative Results
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल आंतों के एपिथेलियल रिसाव की कल्पना करने और वास्तविक समय में आंत में सेल शेडिंग प्रदर्शन का निरीक्षण करने के लिए एक इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी-आधारित दृष्टिकोण का वर्णन करता है। संक्षेप में, चूहों को एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है और छोटी आंत म्यूकोसा की सतह को उजागर करने के लिए सर्जिकल तैयारी के लिए प्रस्तुत किया जाता है। आईईसी को तब एक्रिफ्लालिन के सामयिक अनुप्रयोग के माध्यम से दाग दिया जाता है; जबकि ल्यूमेन से उप-एपिथेलियल स्पेस तक ट्रांसम्यूकोसल मार्ग का पता लगाने के लिए ल्यूमिनल रोडामाइन बी-डेक्सट्रान का उपयोग ट्रेसर के रूप में किया जाता है। इस प्रकार, सर्जिकल तैयारी और एनेस्थेटाइज्ड माउस को पेट्री डिश में चढ़कर स्लाइड पर रखा जाता है और सीएलएसएसएम(चित्र 1)का उपयोग करके समय के साथ चित्रित किया जाता है। अधिग्रहण के बाद विश्लेषण एपिथेलियल सेल शेडिंग दर (बेसल झिल्ली की संख्या/मिनट/लंबाई) के साथ-साथ एक निर्धारित समय बिंदु पर क्षणभंगुर रिसाव (पैरासेलुलर पारमेबिलिटी) और "पारमीय कोशिकाओं" (पारकोशल पारमेबिलिटी) का प्रतिशत की गणना की अनुमति देता है ।
एपिथेलियल अखंडता के परिवर्तन को प्रेरित करने के लिए, हमने पहले वर्णित आईईसी-विशिष्ट जीजीटीएएस-कमी सशर्त माउस मॉडल(Pggt1biΤIEC चूहों) का लाभ उठाया, जो लोक्सपी-क्रे सिस्टम24के माध्यम से उत्पन्न हुआ। जैसा कि पहले वर्णित है, Pggt1biCieC चूहों(चित्रा 2ए)ने गंभीर आंतों की विकृति विकसित की है जैसा कि छोटी आंत(चित्रा 2बी)में बढ़ी हुई हिस्टोलॉजिकल क्षति स्कोर द्वारा दिखाया गया है। मौखिक रूप से प्रशासित फिटसी-डेक्सट्रान (4 केडीए)(चित्रा 2सी)का उपयोग करके वीवो प्रयोगों में ट्रेसर के माध्यम से आंतों की एपिथेलियल पारगम्यता का पता लगाया जा सकता है, और फिर इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी(चित्रा 2डी-2E)के माध्यम से पुष्टि की जा सकती है। जबकि रोडामाइन डेक्सट्रान नियंत्रण चूहों में ल्यूमिनल डिब्बे तक सीमित है, हम Pggt1biCIEC चूहों में आईईसी के भीतर GGTase अभिव्यक्ति के निराकरण पर उप-epithelial डिब्बे के भीतर ट्रेसर का पता लगा सकते हैं। छवि अधिग्रहण के दौरान, सेल शेडिंग घटनाओं को एपिथेलियल मोनोलेयर से ल्यूमेन में जाने वाली कोशिकाओं के रूप में पहचाना जा सकता है, जिससे एपिथेलियम की सीलिंग में अस्थायी अंतराल होता है, जो अंततः पड़ोसी कोशिकाओं के बीच संपर्क से बंद हो जाता है, जिसे ज़िप-प्रभाव(चित्रा 3ए)कहा जाता है। हम स्पष्ट रूप से इन अंतरालों का निरीक्षण कर सकते हैं, जिसे हम नियंत्रण और Pggt1biCIEC चूहों दोनों में अस्थायी एपिथेलियल रिसाव कहते हैं, हालांकि इन घटनाओं की आवृत्ति बाद में अधिक थी(चित्र 3बी, 3 सी)। दिलचस्प बात यह है कि हम अन्य कोशिकाओं की भी पहचान कर सकते हैं जहां डेक्सट्रान का इंट्रासेल्युलर रूप से पता लगाया जा सकता है, जिसे "पारगम्य कोशिकाएं" कहा जाता है; ये घटनाएं मुख्य रूप से Pggt1biCIEC चूहों(चित्रा 3बी, 3 डी)में हुई । एक साथ, यहां प्रस्तुत इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण का लाभ उठाते हुए, हम यह निर्धारित कर सकते हैं कि Pggt1bi.ieC चूहों में बिगड़ा एपिथेलियल अखंडता सेल बहा प्रदर्शन परिवर्तन और वृद्धि हुई पैरा और आंत में ट्रांस सेलुलर epithelial पारगम्यता की ओर जाता है ।
चित्रा 1: यहां प्रस्तुत इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण का योजनाबद्ध विवरण। (A) फ्लो चार्ट। (B) आरेख । सर्जिकल तैयारी के बाद, आंतों म्यूकोसा को एक्रिफ्लालिन और रोडामाइन डेक्सट्रान के साथ एक कवर-स्लाइड पर लगाया जाता है जो पेट्री डिश पर एम्बेडेड होता है ताकि खारा समाधान (चमकदार सतह नीचे) के साथ परफ्यूजन की अनुमति दी जा सके। आंतों म्यूकोसा तो समय के साथ एक CLSM माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: Pggt1biCIEC चूहों में बिगड़ा एपिथेलियल अखंडता आंतों की पारगम्यता में वृद्धि हुई है। (A)पश्चिमी दाग दिखा टैमोक्सिफेन प्रेरित Pggt1bi A.IEC बनाम नियंत्रण चूहों में IECs के भीतर GGTase-1B अभिव्यक्ति समाप्त । (ख)नियंत्रण और Pggt1bicIEC चूहों से छोटी आंत का हिस्टोलॉजिकल स्कोर । (ग)मौखिक रूप से प्रशासित फिटसी-डेक्सट्रान (4 केडीए) के ट्रांसमुकोसल मार्ग द्वारा मापा गया वीवो में आंतों के एपिथेलियल पारगम्यता का मात्राकरण। (घ)चित्र चित्र छवि अधिग्रहण की दिशा का वर्णन, ल्यूमेन से नीचे की ओर विल्लस धुरी के लिए । एक जेड स्टैक से प्रतिनिधि तस्वीरें । (ई)इस पांडुलिपि में वर्णित नियंत्रण और Pggt1bi.ieC चूहों से सामयिक रूप से लागू एक्रिफ्लालिन और रोडामाइन बी-डेक्सट्रान का उपयोग करके इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी की प्रतिनिधि तस्वीरें । डेटा को मीन ± एसईएम गैर-युग्मित टी-टेस्ट के रूप में व्यक्त किया जाता है। * पी मूल्य ≤ 0.05; पी मूल्य 0.0001 ≤। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: एपिथेलियल सेल शेडिंग प्रदर्शन और इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पैरा/ट्रांस-सेलुलर एपिथेलियल पारगम्यता। (A)प्रतिनिधि तस्वीरें वास्तविक समय (सफेद तीर) पर एक सेल बहा घटना दिखा । शेड सेल को एपिथेलियल मोनोलेयर से लुमेन तक निकाला जाता है। पड़ोसी कोशिकाएं बाधा कार्य के नुकसान से बचने के लिए अस्थायी रिसाव (ज़िप-प्रभाव) को सील करती हैं। (ख)प्रतिनिधि चित्र जिसमें रिसाव (सफेद तीर) और पारमी आंतों की एपिथेलियल कोशिकाएं (नीले तीर) दिखाई देती हैं । (सी-डी) नियंत्रण में अस्थायी रिसाव(सी)और पारगम्य कोशिकाओं(डी)और Pggt1biCIEC चूहों की मात्रा। डेटा को मीन ± एसईएम गैर-युग्मित टी-टेस्ट के रूप में व्यक्त किया जाता है। * पी मूल्य ≤ 0.05; 0.0001 ≤ पी वैल्यू । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
हालांकि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण, इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी-आधारित पद्धति वास्तविक समय में अत्यधिक गतिशील सेलुलर प्रक्रिया की कल्पना करने के लिए एक अद्वितीय प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती है, जैसे सेल शेडिंग प्रदर्शन। इस प्रकार अब तक, वीवो में सेल एक्सट्रूज़न की कल्पना करने के लिए कोई वैकल्पिक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण नहीं है। हमारा मानना है कि यह प्रोटोकॉल आंतों के होरोस्टेसिस के रखरखाव में भूमिका निभाने वाली विविध सेलुलर प्रक्रियाओं के विवरण में योगदान दे सकता है।
इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी का लाभ उठाते हुए, यहां प्रस्तुत विधि जीवित जानवरों में आंतों के एपिथेलियल सेल शेडिंग के वास्तविक समय के दृश्य को सक्षम बनाती है। इसलिए, एनेस्थेटाइज्ड चूहों के सामयिक रूप से दाग वाली आंतों म्यूकोसा (एक्क्रिवाइन और रोडामाइन बी-डेक्सट्रान) को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एकल-कोशिका संकल्प तक चित्रित किया जाता है। मानक ट्रेसर प्रयोगों के संयोजन में, यह वीवो में आंतों की पारियता गड़बड़ी की पहचान और पैरा-और ट्रांस-सेलुलर पारमेबिलिटी के बीच अंतर की अनुमति देता है। रिपोर्टर चूहों के संयोजन में, एपिथेलियल सेल शेडिंग की निगरानी के लिए चुने गए समान प्रोटोकॉल बाहर निकाले गए कोशिकाओं (ज़िप-जैसे प्रभाव)22, 26,26द्वारा छोड़े गए क्षणभंगुर रिसाव को सील करने के लिए तंग जंक्शन पुनर्वितरण दिखा सकते हैं।
एपिथेलियल सेल शेडिंग के अलावा, यहां प्रस्तुत विधि पर संशोधनों को आंतों के म्यूकोसा की सतह पर होने वाली अन्य अत्यधिक गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया है। उदाहरण के लिए, ट्रेसर अणुओं और रक्त वाहिका के नसों में प्रशासन विरोधी CD31 एंटीबॉडी के साथ धुंधला आंत27में एंडोथेलियल अखंडता का मूल्यांकन करने का अवसर प्रदान की है । एपिथेलियम के अलावा, इसी तरह के दृष्टिकोण ों का उपयोग प्रतिरक्षा कोशिकाओं के आंत होमिंग गुणों की जांच करने के लिए किया गया है28,29,साथ ही आंतों के संक्रमण23के संदर्भ में प्रतिरक्षा कोशिकाओं और आईईसी के बीच बातचीत ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल के संभावित अनुप्रयोगों की अधिकता के बावजूद, इसके उपयोग के लिए कुछ सीमाएं भी मौजूद हैं। नमूने के भीतर प्रकाश बिखरने से ऊतक के अंदर गहराई से इमेजिंग के अधिग्रहण को ख़राब कर देता है। छोटी आंत के मामले में, छवि अधिग्रहण म्यूकोसा (विल्लस टिप) की सतह पर होने वाली घटनाओं तक ही सीमित है। दूसरी ओर, आंत की संरचना और कार्य ही इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी के प्रदर्शन को सीमित करता है। इष्टतम अंग ऑप्टिकल गुणों के बावजूद, परिस्टाल्टिक ऊतक संकुचन के साथ-साथ आंतों के प्रवाह-प्रेरित आंदोलन छवि अधिग्रहण के दौरान फोकस विमान पर लगातार संशोधनों का संकेत देते हैं।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल पर संभावित संशोधनों इन सीमाओं में से कुछ को दूर हो सकता है । वैकल्पिक माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग, जैसे कि एक-फोटॉन या मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी, नमूने की सतह के नीचे 50-100 माइक्रोन तक स्थित फोकस विमानों की कल्पना करने के लिए उच्च पेनेट्रांस गहराई का तात्पर्य है। हालांकि, छवि संकल्प और अधिग्रहण के समय के बीच समझौते पर विचार करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि इन प्रयोगों का उद्देश्य तेज और गतिशील प्रक्रियाओं के अवलोकन पर है । माइक्रोस्कोप विन्यास और/या सेटिंग्स के संदर्भ में, लंबे समय तक तरंगदैर्ध्य के उपयोग के साथ-साथ उच्च संख्यात्मक अपर्चर के साथ लंबे समय तक मुफ्त काम करने की दूरी के उद्देश्यों के चयन के लिए इंट्राविटल इमेजिंग के लिए अनुकूलित सेटिंग्स आवश्यक हैं ।
साथ में, इन प्रयोगों से सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए उपयुक्त फ्लोरोसेंट रंगों और माइक्रोस्कोपी तकनीक के चयन को ध्यान में रखते हुए इष्टतम प्रयोगात्मक डिजाइन को ध्यान में रखते हुए इमेजिंग डिवाइस के विन्यास को महत्वपूर्ण चरणों के रूप में माना जाना चाहिए। भविष्य के परिप्रेक्ष्य के रूप में, छवि आधारित भविष्यवाणी/परिमाणीकरण उपकरणों के विकास से अधिग्रहीत डेटा की व्याख्या को सुविधाजनक बनाया जा सकता है ।
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Disclosures
कोई नहीं।
Acknowledgments
इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) के REA अनुदान समझौते संख्या ३०२१७० के तहत लोगों के कार्यक्रम (मैरी क्यूरी कार्रवाई) से धन प्राप्त हुआ है; विश्वविद्यालय एर्लैंन-न्यूरेमबर्ग का इंटरडिसिप्लिनरी सेंटर फॉर क्लीनिकल रिसर्च (IZKF); सहयोगी अनुसंधान केंद्र TRR241 और जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG) के नैदानिक अनुसंधान समूह KFO257; और डीएफजी।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | - |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | - |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | - | - |
| LSM microscope SP8 | Leica | - | - |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | - |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | - |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
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