Summary
Ved å dra nytte av intravital mikroskopi, gjør metoden som presenteres her, sanntidsvisualisering av tarmepitelcelleshedding hos levende dyr. Derfor er lokalt farget tarmslimhinne (acriflavine og rhodamineB-dextran) av bedøvet mus avbildet opp til encelleoppløsning ved hjelp av konfokal mikroskopi.
Abstract
Intravital mikroskopi av tarmen ved hjelp av konfokal avbildning gjør det mulig å se på epitelcelleshedding og barrierelekkasje hos levende dyr. Derfor er tarmslimhinnen til bedøvede mus lokalt farget med uspesifikk farging (acriflavine) og en fluorescerende tracer (rhodamine-B dextran), montert på en saltløsningsskyllet plate og direkte avbildet ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Denne teknikken kan utfylle andre ikke-invasive teknikker for å identifisere lekkasje av intestinal permeabilitet, for eksempel transmukosal passasje av oralt administrerte tracers. Foruten dette, tilnærmingen presentert her tillater direkte observasjon av celle shedding hendelser i sanntid. I kombinasjon med passende fluorescerende reportermus er denne tilnærmingen egnet for å kaste lys inn i cellulære og molekylære mekanismer som kontrollerer tarmepitelcelleprofilering, samt til andre biologiske prosesser. I de siste tiårene har interessante studier ved hjelp av intravital mikroskopi bidratt til kunnskap om endotelpermeabilitet, immuncelleme gut homing, immunepitelkommunikasjon og invasjon av luminalkomponenter, blant andre. Sammen ville protokollen som presenteres her ikke bare bidra til å øke forståelsen av mekanismer som kontrollerer epitelcelleprofilering, men kan også være grunnlaget for utviklingen av andre tilnærminger som skal brukes som instrumenter for å visualisere andre svært dynamiske cellulære prosesser, selv i andre vev. Blant tekniske begrensninger ville optiske egenskaper av det spesifikke vevet, samt den valgte bildeteknologien og mikroskopkonfigurasjonen, i sin tur bestemme bildeavstanden og oppløsningen av oppkjøpte bilder.
Introduction
Tarmen er et høyt spesialisert organ med en tett regulert funksjon som muliggjør motstridende prosesser, nemlig ernæring og beskyttelse mot skadelige luminale stoffer. Fôr mellom menneskekroppen og miljøet, fungerer tarmepitelet som en fysisk og immunologisk barriere og bidrar til vedlikehold av slimhinnehjemostase i tarmen1,2. Tap av epitelintegritet og økt tett knutepunktpermeabilitet er kjent for å være forbundet med inflammatorisk tarmsykdom (IBD)3,,4,,5,,6. Epitelendringer anses da som årsaker og sekundære forsterkere for kronisk tarmbetennelse i IBD. Dermed vil en forbedret forståelse av tidlige epitelendringer i tarmen til IBD-pasienter være av enorm verdi for utviklingen av nye strategier for å gjenopprette epitelintegritet for pålitelig prediksjon og påfølgende forebygging av IBD-tilbakefall.
Tarmepitel følger en kompleks og tett regulert omsetningsprosess. Fra krypten bunnen, terminalt differensiert intestinal epitelceller (IECer) avledet fra pluripotente stamceller migrere oppover til villus spissen, hvor eldre / skadede celler er kastet inn i lumen7. Likevekten mellom deling og celleprofil gjør det mulig å opprettholde tarmepitelcellenumre, unngå dannelse av hull og lekkasje, samt akkumulering av epitelceller som potensielt fører til cellemasser og tumorgenese8,9,10. Til tross for nøkkelrollen til epitelcelleshedding i den fysiologiske fornyelsen av tarmepitelet, er kunnskapen om molekylære mekanismer som driver ekstrudering av celler på villusspissen begrenset. Dermed er det behov for grunnleggende forskning som gir en nøyaktig beskrivelse av sekvensen av molekylære hendelser involvert i epitelcelleshedding.
Komplekse interaksjoner mellom ulike celletyper i tarmslimhinnen er nøkkelen til å forstå molekylære mekanismer som regulerer epitelomsetning og intestinal homeostase. Dermed gir in vivo-studier høye fordeler fremfor in vitro- og ex vivo-tilnærminger i denne sammenhengen. Videre tillater sanntidsbildeteknikker beskrivelsen av hendelsesforløpet som kontrollerer spesifikke fenomener. I denne sammenheng krever studien av svært dynamiske prosesser bruk av optimaliserte høyoppløselige teknikker for direkte observasjon av vevet. Intravital bildeteknikker vises som unike egnede verktøy for studiet av epitelcelleshedding i tarmen.
Begrepet "intravital mikroskopi" refererer til eksperimentelle tilnærminger som drar nytte av høyoppløselige bildeteknikker (multiphoton eller konfokal mikroskopi) for å visualisere celler og vev direkte i sine innfødte omgivelser i et levende dyr11. Det muliggjør sanntidsinnhenting av in vivo-informasjon opp til encellede oppløsning, og medfører klare fordeler ved statiske eller lave oppløsningsmetoder. Intravital mikroskopi gir komplementær informasjon og overvinner noen begrensninger fra klassiske og / eller high-end teknikker, for eksempel gjenstander på grunn av vevbehandling. I motsetning er den viktigste begrensningen av intravital mikroskopi at vevet skal være direkte utsatt for mikroskopet, som i de fleste tilfeller krever kirurgi. Selv om sofistikerte tilnærminger bevare vitalitet og minimere virkningen av avbildet vev (skinfold kamre og bildevinduer)12,13, i de fleste tilfeller en enkel hud snitt utføres for eksternisering av vevet (hudklaffer)14. I det siste tiåret har disse tilnærmingene bidratt med viktige bevis om svært dynamiske prosesser, som tidligere var ugjennomtrengelige. Translasjonelt ga sanntidsavbildning ny biologisk innsikt om stamcelle og leukocytter homing15, samt kreftformidling og metastasedannelse13,16. I klinisk sammenheng utnyttes endomikoskopi for tiden som et diagnostisk verktøy for kreft17 og gastrointestinale sykdommer, som IBD18,19; mens konfokal mosaikkmikroskopi ble et raskt patologiverktøy under operasjonen20. Sammen har intravital mikroskopi i det siste dukket opp som et verdifullt og allsidig verktøy for biomedisinsk forskning og fremtidig anvendelse i klinikken.
Intravital mikroskopi er her implementert for sanntidsvisualisering av tarmepitellekkasje og observasjon av epitelcellesheddinghendelser. Lekkasje av intestinal permeabilitet kan identifiseres ved andre in vivo ikke-invasive teknikker, for eksempel kvantifisering av muntlig administrering av fluorescerende sporstoffer i serum21. Denne teknikken tillater imidlertid ikke direkte observasjon av shedding ytelse eller segregering mellom para- og transcellulær permeabilitet. Kombinasjonen av standard tracer eksperimenter og intravital mikroskopi representerer en passende tilnærming til: i) identifisere forstyrrelser i intestinal permeabilitet, og ii) segregere mellom para- og transcellulær epitelpermeabilitet. Foruten celle shedding, intravital mikroskopi i kombinasjon med in vivo fluorescens merking muliggjør studiet av andre cellulære og molekylære mekanismer (f.eks tight junction omfordeling under celle shedding ved hjelp av fluorescerende reporter mus22 eller interaksjoner mellom IECer og andre celler i tarmslimhinnen23).
Metoden som presenteres her representerer en tilpasning av intravital mikroskopi for å muliggjøre sanntidsobservasjon av tarmslimhinnen, ved hjelp av konfokal laserskanning mikroskopi (CLSM). Derfor bruker vi betingede knock-out mus av GGTase (Geranylgeranyltransferase) i tarm epitelceller (IECer) i (Pggt1biΔIEC mus), siden de lider av en alvorlig tarmsykdom og økt epitelpermeabilitet24. Kirurgisk fremstilling av musen og farging av tarmslimhinnen, samt passende innstillinger som brukes til bildeanskaffelse og analyse etter oppkjøp, er beskrevet. Denne protokollen kan muliggjøre fremtidige studier som bidrar til dagens kunnskap om dynamikk og kinetikk av intestinal epitelcelleshedding. Videre kan protokollen tjene som grunnlag for ulike tilpasninger for å studere andre fenomener som forekommer på overflaten av tarmslimhinnen, og til og med ved andre vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoll er godkjent av relevante lokale myndigheter i Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland). Mus ble plassert under spesifikke patogenfrie forhold.
MERK: Hemming av GGTase-mediert prenylation i IECer forårsaker en alvorlig endring av intestinal permeabilitet hos Pggt1biΔIEC-mus 24. Derfor ble denne musemodellen brukt til å demonstrere hvordan protokollen kan være nyttig for å studere tarmbarrieredefekter. Denne protokollen kan imidlertid brukes til å studere en annen muselinje.
1. Kirurgisk forberedelse og mus tarmslimhinne farging
MERK: Det kirurgiske preparatet er basert på tidligere beskrevne protokoller25. Hold den bedøvede musen under en rød lampe under det kirurgiske preparatet, for å unngå fall i kroppstemperaturen.
- Bedøve musen ved intraperitoneal injeksjon av ketamin/xylazin (96 mg/kg ketamin, og 12,8 mg/kg xylazin). Kontroller anestesi ved å se etter mangel på øyelokkrefleks.
- Påfør øyevernkrem ved hjelp av en bomullspinne.
- Lag et snitt (1 cm) på venstre ventral område ved hjelp av standard tang og rett fin saks.
- Eksteriør et segment av tarmen (5-7 cm, ca. ).
- Åpne det eksterierte tarmsegmentet langsgående ved elektrocauterization på antimesenterisk side.
- Utsett slimhinnen og skyll kort tid med saltvannsløsning for å fjerne fekalt innhold.
MERK: Bruk eventuelt xylazin direkte på tarmen for å unngå bevegelsesartefakter på grunn av peristaltikk. - Flekk overflaten av tarmslimhinnen med acriflavine og rhodamine-B dextran (10 kDa).
- Påfør 1 mg/ml acriflavine oppløsning (100 μL) ved pipettering dråpe for dråpe på slimhinnen og inkuber i 3 min. Vask ut den gjenværende oppløsningen med PBS.
- Påfør 2 mg/ml rhodamin-dextran oppløsning (100 μL) ved å pipettering dråpe for dråpe på slimhinnen og inkubere i 3 min. Vask ut den gjenværende oppløsningen med PBS.
MERK: Fjern eventuelt blod fra preparatet ved hjelp av aseptisk bomull.
- Plasser den bedøvede musen liggende på et dekselsklie montert i et kammer som skylles med forvarmet saltvannsløsning (37 °C).
MERK: Det åpnede tarmsegmentet plasseres deretter på luminaloverflaten nede på dekselet. - Plasser preparatet (bedøvet mus i kammeret) på det inverterte mikroskopstadiet.
- Dekk dyret med en isotermisk pute (ca. 37 °C).
- Fortsett umiddelbart til intravital mikroskopi.
MERK: Hold det kirurgiske preparatet skyllet med forvarmet saltvannsløsning for å unngå dehydrering av vev og celledød.
2. Intravital mikroskopi
MERK: Utfør trinn 2.1 før du starter det kirurgiske preparatet, for å unngå lange ventetider mellom anestesi, kirurgi og bildeoppkjøp. Om nødvendig kan ytterligere doser av anestetika gis til kirurgisk forberedte dyr for å holde dem under anestesi for bildeforsøkene.
- Sett opp CLSM-mikroskopet.
- Start CLSM-mikroskopet ved å slå på mikroskopbasen og skannerboksen. Slå på datamaskinen ved å trykke på Start-knappen.
- Start programvare for bildeanskaffelse (f.eks. LAS X) ved å dobbeltklikke på ikonet. Velg riktig konfigurasjon (Konfigurasjon: maskin; Mikroskop: DMI6000), og klikk OK.
- Definer riktig oppløsning. Gå til Konfigurasjon | Maskinvare | Oppløsning | Bitdybde. Velg 12.
- Gå til Anskaffelse-menyen. Velg xyzt for bildeanskaffelsesmodus fra rullegardinmenyen. Velg målet fra rullegardinmenyen (20x eller 40x).
- Utforme innstillingen for sekvensiell anskaffelse. Klikk på Seq. Legg til en ny sekvens ved å klikke på Legg til-knappen (+). Velg Mellom rammer.
- Konfigurer sekvens 1 (påvisning av acriflavine; 416 nm eksitasjon; 514 nm utslipp). Slå på den synlige laserboksen. Aktiver PMT1 (PÅ). Definer vinduet for utslippsbølgelengde (490-550 nm).
- Konfigurer sekvens 2 (påvisning av rhodamineB-dextran; 570 nm eksitasjon; 590 nm, utslipp). Slå på den synlige laserboksen. Aktiver PMT2 (PÅ). Definer vinduet for utslippsbølgelengde (550-760).
- Aktiver de tilsvarende laserne (488 og 552). Gå til Konfigurasjon | Lasere. Aktiver 488 og 552 nm lasere (slå PÅ).
- Juster innstillingen til de spesifikke funksjonene i det gjeldende eksperimentet.
- Slå på lyskilden (trykk på strøm). Plasser preparatet (bedøvet mus i kammeret) på mikroskopstadiet og endre xy-posisjonen til belysningsaksen er fokusert på vevspreparatet.
- Velg interessefeltet ved hjelp av standard lyskilde og okularene.
- Velg filterkuben (I3). Åpne lukkeren. Fokuser på overflaten av tarmslimhinnen ved hjelp av makro- og mikrohjulet. Søk etter et område der flere villi kan visualiseres i synsfeltet ved å endre XY-posisjonen.
- Kontroller at rhodamin-dextran farging er også synlig i dette området. Endre filterkuben (N2.1). Kontroller bildet gjennom okularene.
- Start CLSM-bildeoppkjøpet fra programvaren. Optimaliser innstillingene for de to sekvensene.
- Velg Sekvens 1. Juster laserkraft, forsterkning og offset for sekvens 1.
- Velg Sekvens 2. Juster laserkraft, forsterkning og offset for sekvens 2.
- Definer z stack-området.
- Åpne Z-stakk-rullegardinmenyen. Fokuser på overflaten av slimhinnen ved hjelp av z-aksekontrollen. Trykk på Start.
- Fokuser på den nedre grensen der signalet fortsatt kan oppdages. Trykk på Avslutt.
- Definer antall z-stabler (10). Unngå at tiden bortser lenger enn 2 min for to påfølgende tidspoeng.
- Definer tidsinnstillingene. Gå til Tid-menyen. Klikk Minimer. Velg Hent til stoppet.
- Definer linjegjennomsnittet. Velg Seq 1. Velg Linjegjennomsnitt 2. Velg Seq 2. Velg Linjegjennomsnitt 2.
- Hent tilsvarende bilder.
- Velg Format (1024 x 1024) og Hastighet (400). Trykk på Start.
- Trykk på Stopp etter ønsket bildeanskaffelsestid.
- Lagre filen. Gå til Project. Høyreklikk på den tilsvarende filen. Trykk lagre som.
- Gi filen et navn på riktig måte. Velg den tilstrekkelige mappen. Trykk lagre.
- Euthanize dyret (cervical forvridning) og samle vev for ulterior analyse, om nødvendig.
3. Bildeanalyse: Bestem cellesheddinghastighet og tarmepitelet
- Celle shedding rate
- Start programvare for bildeanskaffelse.
- Gå til Åpne prosjekter. Velg riktig fil.
- Definer den totale tiden for bildeanskaffelse.
- Velg den siste komplette z-stakken. Velg den siste Z-posisjonen fra det tidligere valgte tidspunktet. Les tiden nederst nederst på skjermen (total tid for bildeinnhenting).
- Velg en villus.
- Velg riktig Z-stabelposisjon (overflaten av villusen, men dypt nok til å unngå interferens med allerede skurceller og andre komponenter som finnes på lumen).
- Mål lengden på basalmembranen. Velg linjalverktøyet. Del villus i flere linjer for å dekke eller tegne hele villus omkretsen. Tilsett de forskjellige verdiene (total lengde på basalmembranen). Slett segmentene i linjalverktøyet.
- Telle antall hendelser som oppstår i løpet av hele varigheten av bildeanskaffelsen.
- Del villusen i segmenter med en tilstrekkelig størrelse. Analyser hendelsesforløpet/segmentet ved å skyve linjen gjennom de ulike tidspunktene. Kommenter de identifiserte cellesheddinghendelsene.
- Beregn antall shedding hendelser / tid / lengde på basalmembran, noe som indikerer cellen shedding rate. Tell opptil 5 villi /video, og minst to videoer / mus. Beregn gjennomsnittet av disse 10 målingene.
- Lekkasje
- Velg en villus.
- Velg riktig Z-stabelposisjon (overflaten av villusen, men dypt nok til å unngå interferens med allerede skurceller og andre komponenter som finnes på lumen). Telle totalt antall epitelceller/ villus.
- Telle antall lekkasjepunkter (Paracellulær tilstedeværelse av rhodamin dextran. Denne hendelsen er forbigående, som kan bekreftes ved å sjekke tidligere og ulterior ervervet bilder).
- Beregn antall lekkasje/totalt antall epitelceller. Analyser 10 forskjellige villus / eksempel / video og beregn gjennomsnittlig antall lekkasje og gjennomtrengelige celler / villus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen som presenteres her beskriver en intravital mikroskopibasert tilnærming for å visualisere tarmepitellekkasje og observere cellesheddingytelse i tarmen i sanntid. Kort sagt blir mus bedøvet og sendt til kirurgisk forberedelse for å avsløre overflaten av tynntarmenslimhinnen. IECer blir deretter farget via aktuell anvendelse av acriflavine; mens luminal rhodamine B-dextran brukes som tracers for å oppdage transmukosal passasje fra lumen til sub-epitelrommet. Dermed er det kirurgiske preparatet og den bedøvede musen plassert på et lysbilde montert i en petriskål og avbildet over tid ved hjelp av CLSM (figur 1). Analyse etter oppkjøpet tillater beregning av epitelcellesheddinghastighet (antall cellesheddinghendelser/ minutt / lengde på basalmembran) samt prosentandelen av forbigående lekkasje (paracellulær permeabilitet) og "gjennomtrengelige celler" (transcellulær permeabilitet) på et bestemt tidspunkt.
For å indusere endringer av epitelintegritet, benyttet vi oss av den tidligere beskrevne IEC-spesifikke GGTase-mangelfulle betingede musemodellen (Pggt1biΔIEC-mus), generert via LoxP-Cre-systemet24. Som beskrevet tidligere utviklet Pggt1biΔIEC-mus (figur 2A) alvorlig tarmpatologi som vist ved økt histologisk skadescore i tynntarmen (figur 2B). Økt intestinal epitelpermeabilitet kan oppdages via tracer in vivo eksperimenter ved hjelp av oralt administrert FITC-dextran (4 kDa) (figur 2C), og deretter bekreftet via intravital mikroskopi (figur 2D-2E). Mens rhodamindextran er begrenset til luminalrommet i kontrollmus, kan vi oppdage tracer i sub-epitelrommet ved abrogation av GGTase uttrykk i IECs i Pggt1biΔIEC mus. Under bildeoppkjøp kan celleshedding hendelser identifiseres som celler som beveger seg ut av epitelmonolaget inn i lumen, noe som fører til midlertidige hull i forseglingen av epitelet, som til slutt lukkes av kontakten mellom nærliggende celler, såkalt zip-effekt (figur 3A). Vi kunne tydelig observere disse hullene, det vi kaller midlertidig epitellekkasje både i kontroll og Pggt1biΔIEC-mus, selv om frekvensen av dette fenomenet var høyere i sistnevnte (figur 3B,3C). Interessant, vi kunne også identifisere andre celler hvor dextran kunne oppdages intracellulært, såkalte "gjennomtrengelige celler"; disse hendelsene forekom hovedsakelig hos Pggt1biΔIEC-mus (figur 3B,3D). Sammen, dra nytte av her presentert intravital mikroskopi tilnærming, vi kunne fastslå at nedsatt epitelintegritet i Pggt1biΔIEC mus fører til celle shedding ytelse endringer og økt para- og trans-cellulær epitelpermeabilitet i tarmen.
Figur 1: Skjematisk beskrivelse av her presentert intravital mikroskopi tilnærming. (A) Flytskjema. (B) Diagram. Etter kirurgisk forberedelse er tarmslimhinnen lokalt farget med akriflavin og rhodamin dextran montert på et deksel-slide innebygd på en petriskål for å tillate perfusjon med en saltløsning (luminal overflate ned). Tarmslimhinnen blir deretter avbildet ved hjelp av et CLSM-mikroskop over tid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Nedsatt epitelintegritet hos Pggt1biΔIEC-mus som fører til økt intestinal permeabilitet. (A)Vestlig flekk som viser tamoxifen-indusert avskaffet GGTase-1B uttrykk i IECer i Pggt1biΔIEC versus kontroll mus. (B)Histologisk score av tynntarmen fra kontrollen og Pggt1biΔIEC mus. (C)Kvantifisering av intestinal epitelpermeabilitet in vivo målt ved transmukosal passasje av oralt administrert FITC-Dextran (4 kDa). (D) Diagram som beskriver retningen av bildeinnhenting, fra lumen nedover til villusaksen. Representative bilder fra en z-stabel. (E)Representative bilder av intravital mikroskopi ved hjelp av lokalt anvendt akriflavin og rhodamine B-dextran fra kontroll og Pggt1biΔIEC mus, som beskrevet i dette manuskriptet. Data uttrykkes som Mean ± SEM. Ikke-paret t-test. * P verdi ≤ 0,05; P-≤ 0,0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Epitelcelle shedding ytelse og para / trans-cellulær epitelpermeabilitet ved hjelp av intravital mikroskopi. (A) Representative bilder som viser en celle shedding hendelse i sanntid (hvit pil). Skurcellen ekstruderes fra epitelmonolaget til lumen. Nærliggende celler forsegler den midlertidige lekkasjen (zip-effekt) for å unngå tap av barrierefunksjon. (B)Representativt bilde som viser lekkasje (hvite piler) og gjennomtrengelige tarmepitelceller (blå piler). -Det er ikke noe å si på. Kvantifisering av midlertidig lekkasje (C) og gjennomtrengelige celler (D) i kontroll og Pggt1biΔIEC mus. Data uttrykkes som Mean ± SEM. Ikke-paret t-test. * P verdi ≤ 0,05; P-≤ 0,0001 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om teknisk utfordrende, intravital mikroskopibasert metodikk representerer en unik eksperimentell tilnærming for å visualisere svært dynamisk cellulær prosess i sanntid, for eksempel cellesheddingytelse. Så langt er det ingen alternativ eksperimentell tilnærming for å visualisere celleprofil in vivo. Vi tror at denne protokollen kan bidra til beskrivelsen av ulike cellulære prosesser som spiller en rolle i vedlikehold av intestinal homeostase.
Ved å dra nytte av intravital mikroskopi, gjør metoden som presenteres her, sanntidsvisualisering av tarmepitelcelleshedding hos levende dyr. Derfor er lokalt farget tarmslimhinne (acriflavine og rhodamine B-dextran) av bedøvet mus avbildet opp til encelleoppløsning ved hjelp av konfokal mikroskopi. I kombinasjon med standard tracer eksperimenter, tillater det identifisering av intestinal permeabilitet forstyrrelser in vivo og skillet mellom para- og transcellulær permeabilitet. I kombinasjon med reportermus kan lignende protokoller som utnyttes til å overvåke epitelcelleshedding, vise tett omfordeling av veikryss for å forsegle den forbigående lekkasjen som er igjen av de ekstruderte cellene (zip-lignende effekt)22,,26.
Foruten epitelcelleshedding, har modifikasjoner på metoden som presenteres her, blitt tilpasset analysen av andre svært dynamiske cellulære prosesser som forekommer på overflaten av tarmslimhinnen. For eksempel ga intravenøs administrering av tracer molekyler og blodkarfarging med anti-CD31 antistoffer muligheten til å evaluere endotelintegritet i tarmen27. Utover epitelet har lignende tilnærminger blitt brukt til å undersøke tarmhoming egenskapene til immunceller28,29, samt interaksjon mellom immunceller og IECer i sammenheng med tarminfeksjon23.
Til tross for overflod av potensielle anvendelser av den her beskrevne protokollen, finnes det også noen begrensninger for bruken. Lyssppapping i prøven svekker oppkjøpet av bildebehandling dypt inne i vevet. I tilfelle av tynntarmen er bildeoppkjøpet begrenset til fenomener som forekommer på overflaten av slimhinnen (villusspissen). På den annen side begrenser strukturen og funksjonen til tarmen selv ytelsen til intravital mikroskopi. Til tross for optimale organoptiske egenskaper innebærer peristaltisk vevsammentrekning samt strømningsindusert bevegelse av tarmderli hyppige modifikasjoner på fokusplanet under bildeoppkjøp.
Potensielle endringer på den her presenterte protokollen kan overvinne noen av disse begrensningene. Bruken av alternative mikroskopiteknikker, for eksempel en-foton eller multiphoton mikroskopi, innebærer høyere penetrance dybde for å visualisere fokusplan som ligger opptil 50-100 μm under overflaten av prøven. Det er imidlertid viktig å vurdere kompromisset mellom bildeoppløsning og oppkjøpstid, siden disse eksperimentene tar sikte på observasjon av raske og dynamiske prosesser. Når det gjelder mikroskopkonfigurasjon og/eller innstillinger, innebærer bruk av lengre bølgelengder samt valg av lange frie arbeidsavstandsmål med høy numerisk blenderåpning optimaliserte innstillinger for intravital bildebehandling.
Sammen bør optimal eksperimentell design med hensyn til valg av passende fluorescerende fargestoffer og mikroskopiteknikken, samt konfigurasjonen av bildeenheten betraktes som viktige skritt for å oppnå et vellykket resultat fra disse eksperimentene. Som fremtidig perspektiv kan utviklingen av bildebaserte prediksjons-/kvantifiseringsverktøy legge til rette for tolkningen av ervervede data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Forskningen som fører til disse resultatene har mottatt støtte fra People Program (Marie Curie Actions) under REA tilskuddsavtale nummer 302170 av EUs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013); Tverrfaglig senter for klinisk forskning (IZKF) ved Universitetet Erlangen-Nürnberg; Collaborative Research Center TRR241 og den kliniske forskningsgruppen KFO257 i det tyske forskningsrådet (DFG); og DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | - |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | - |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | - | - |
| LSM microscope SP8 | Leica | - | - |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | - |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | - |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
References
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation? Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics. Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).
- Kiesslich, R., et al. Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease. Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).
- Dourmashkin, R. R., et al. Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease. Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).
- Soderholm, J. D., et al. Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease. Gut. 50 (3), 307-313 (2002).
- Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface. American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
- Fan, Y., Bergmann, A. Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell! Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).
- Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways. Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research. Cytometry A. , (2019).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance. Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).
- Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases. Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).
- Kiesslich, R., et al. Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).
- Krishnamurthy, S., et al. Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Lopez-Posadas, R., et al. Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).
- Duckworth, C. A., Watson, A. J. Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium. Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Haep, L., et al. Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).
- Lopez-Posadas, R., et al. Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice. Gastroenterology. , (2019).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
