Summary
Med fördel av intravital mikroskopi möjliggör den metod som presenteras här realtid visualisering av intestinala epitelcell avgivande i levande djur. Därför är lokalt färgade intestinala mukosa (acriflavine och rhodamineB-dextran) av sövda möss avbildas upp till encellig upplösning med hjälp av confocal mikroskopi.
Abstract
Intravital mikroskopi av tarmen med hjälp av konfokal avbildning möjliggör realtid observation av epitelial cell avgivande och barriärläckage i levande djur. Därför är tarmslemhinnan hos sövda möss lokalt färgas med ospecifik färgning (acriflavine) och en fluorescerande spårämne (rhodamine-B dextran), monterad på en saltlösning lösningssköljd platta och direkt avbildad med hjälp av ett confocalmikroskop. Denna teknik kan komplettera andra icke-invasiva tekniker för att identifiera läckage av tarmpermeabilitet, såsom transmucosal passage av oralt administrerade spårämnen. Förutom detta, det tillvägagångssätt som presenteras här möjliggör direkt observation av cell avgivande händelser i realtid. I kombination med lämpliga fluorescerande reportermöss är detta tillvägagångssätt lämpligt för att sprida ljus i cellulära och molekylära mekanismer som styr tarmepitetelcellextrudering, samt till andra biologiska processer. Under de senaste decennierna har intressanta studier med intravital mikroskopi bidragit till kunskap om endotelpermeabilitet, immuncells gut homing, immun-epitelial kommunikation och invasion av luminal komponenter, bland annat. Tillsammans skulle det protokoll som presenteras här inte bara bidra till att öka förståelsen av mekanismer som styr epitelcell extrudering, men kan också ligga till grund för utvecklingen av andra metoder som ska användas som instrument för att visualisera andra mycket dynamisk cellulär process, även i andra vävnader. Bland tekniska begränsningar, optiska egenskaper hos den specifika vävnaden, liksom den valda bildteknik och mikroskop konfiguration, skulle i sin tur, bestämma imaging arbetsavstånd, och upplösning av förvärvade bilder.
Introduction
Tarmen är ett högspecialiserad orgel med en hårt reglerad funktion som möjliggör motstridiga processer, nämligen näring och skydd mot skadliga luminal ämnen. Foder mellan människokroppen och miljön, tarmepitelet fungerar som en fysisk och immunologisk barriär och bidrar till upprätthållandet av slemhinnans homeostas itarmen 1,2. Förlust av epitelial integritet och ökad snäva korsningen permeabilitet är väl känt för att vara associerad med inflammatorisk tarmsjukdom (IBD)3,4,5,6. Epitelial ändringar är därefter ansett som orsakar och sekundära förstärkare för kronisk inälvs- inflammation i IBD. Således skulle en förbättrad förståelse av tidiga epitelial ändringar i tarmen av IBD patienter vara av enormt värde för utvecklingen av nya strategier för att återställa epitelial integritet för tillförlitlig förutsägelse och efterföljande förebyggande av IBD-återfall.
Tarmepitelet följer en komplex och hårt reglerad omsättningsprocess. Från kryptbotten migrerar terminalt differentierade tarmepitelceller (IECs) som härrör från pluripotenta stamceller uppåt till villusspetsen, där åldrad/skadade celler kastas in i lumen7. Jämvikten mellan delning och cellextrudering möjliggör underhåll av intestinala epitelcellnummer, undvikande av uppkomst av luckor och läckage, samt ansamling av epitelceller potentiellt leder till cellmassor och tumorigenesis8,9,10. Trots den nyckelroll som epitelcellsspillet i den fysiologiska förnyelsen av tarmepitelet, begränsas kunskapen om de molekylära mekanismer som driver extrudering av celler vid villus-spetsen. Således finns det ett behov av grundforskning som ger en exakt beskrivning av sekvensen av molekylära händelser som är inblandade i epitelcellssutgjutelse.
Komplexa interaktioner mellan olika celltyper inom tarmslemhinnan är nyckeln för att förstå de molekylära mekanismer som reglerar epitelomsättning och intestinal homeostas. Således erbjuder in vivo-studier höga fördelar jämfört med in vitro- och ex vivo-tillvägagångssätt i detta sammanhang. Dessutom tillåter bildteknik i realtid beskrivningen av händelseförloppet som styr specifika fenomen. I detta sammanhang kräver studiet av mycket dynamiska processer användning av optimerade högupplösningstekniker för direkt observation av vävnaden. Intravital avbildningstekniker visas som unika lämpliga verktyg för studier av epitelcellsspjut i tarmen.
Termen "intravital mikroskopi" avser experimentella metoder som drar nytta av högupplösta avbildningstekniker (multifoto eller konfokalmikroskopi) för att direkt visualisera celler och vävnader i sina inhemska omgivningar inom ett levande djur11. Det möjliggör förvärv av in vivo-information i realtid upp till encellig upplösning, och medför tydliga fördelar jämfört med statiska eller lågupplösta metoder. Intravital mikroskopi ger kompletterande information och övervinna vissa begränsningar från klassisk och/eller high-end tekniker, såsom artefakter på grund av vävnad bearbetning. Den huvudsakliga begränsningen av intravital mikroskopi är däremot att vävnaden ska vara direkt exponerad för mikroskopet, vilket i de flesta fall kräver operation. Även sofistikerade metoder bevara vitalitet och minimera effekterna av den avbildade vävnaden (skinfold kammare och bildrutor)12,13, i de flesta fall en enkel hud snitt utförs för externalisering av vävnaden (hud klaffar)14. Under det senaste årtiondet har dessa metoder bidragit med viktiga bevis om mycket dynamiska processer, som tidigare var outgrundliga. Translationellt gav realtidsavbildning nya biologiska insikter om stamceller och leukocyter homing15, samt cancerspridning och metastasbildning13,16. I det kliniska sammanhanget utnyttjas för närvarande endomicroscopy som ett diagnostiskt verktyg för cancer17 och gastrointestinala sjukdomar, såsom IBD18,19; medan confocal mosaicking mikroskopi blev en snabb patologi verktyg under kirurgi20. Tillsammans har intravital mikroskopi nyligen vuxit fram som ett värdefullt och mångsidigt verktyg för biomedicinsk forskning och framtida tillämpning på kliniken.
Intravital mikroskopi är här genomförs för realtid visualisering av intestinala epitelial läckage och observation av epitelial cell sprider händelser. Läckage av tarmpermeabilitet kan identifieras genom andra in vivo noninvasive tekniker, såsom kvantifiering av oriskt administrering av fluorescerande spårämnen i serum21. Denna teknik tillåter dock inte direkt observation av shedding prestanda eller segregeringen mellan para- och trans-cellulära permeabilitet. Kombinationen av standard tracer experiment och intravital mikroskopi representerar en lämplig metod för att: i) identifiera störningar i intestinala permeabilitet, och ii) segregera mellan para- och trans-cellulära epiteliapermeabilitet. Förutom cellavgivande möjliggör intravital mikroskopi i kombination med in vivo fluorescensmärkning studiet av andra cellulära och molekylära mekanismer (t.ex. snäva korsningsomfördelning under cellavgivande med hjälp av fluorescerande reportermöss22 eller interaktioner mellan IECs och andra celler inom tarmslemhinnan23).
Den metod som presenteras här representerar en anpassning av intravital mikroskopi för att möjliggöra realtid observation av tarmslemhinnan, med hjälp av confocal laserscanning mikroskopi (CLSM). Därför använder vi villkorliga knock-out möss av GGTas (Geranylgeranyltransferase) i intestinala epitelceller (IECs) i (Pggt1biΔIEC möss), eftersom de lider av en allvarlig tarmsjukdom och ökad epitelial permeabilitet24. Kirurgiska beredning av musen och färgning av tarmslemhinnan, samt lämpliga inställningar som används för bildframställning förvärv och efter förvärv analys beskrivs. Detta protokoll skulle kunna möjliggöra framtida studier som bidrar till den nuvarande kunskapen om dynamik och kinetik av intestinala epitelcell avgivande. Dessutom skulle protokollet kunna tjäna som grund för olika anpassningar för att studera andra fenomen som förekommer vid ytan av tarmslimhinnan, och även vid andra vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll har godkänts av de berörda lokala myndigheterna i Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland). Möss var inrymt under specifika patogenfria förhållanden.
OBS: Hämning av GGTase-medierad prenylation inom IECs orsakar en allvarlig förändring av tarmpermeabilitet i Pggt1biΔIEC möss24. Därför användes denna musmodell för att demonstrera hur protokollet kan vara användbart för att studera tarmbarriärdefekter. Detta protokoll kan dock användas för studier av någon annan muslinje.
1. Kirurgisk förberedelse och mus tarmslemhinnan färgning
OBS: Den kirurgiska beredningen är baserad på tidigare beskrivna protokoll25. Håll den sövda musen under en röd lampa under den kirurgiska beredningen, för att undvika en nedgång i kroppstemperaturen.
- Bedöva musen genom intraperitoneal injektion av ketamin/xylazin (96 mg/kg ketamin; och 12,8 mg/kg xylazin). Verifiera anestesin genom att kontrollera om det saknas en ögonlocksreflex.
- Applicera ögonskyddskräm med hjälp av en bomullstuss.
- Gör ett snitt (1 cm) på vänster ventrala område med hjälp av standard-tång och raka fina saxar.
- Exteriörisera ett segment av tarmen (5-7 cm, ungefär).
- Öppna det exteriöra tarmsegmentet longitudinellt genom elektrocauterisering vid den antimesenteriska sidan.
- Exponera slemhinnan och skölj inom kort med saltlösning för att avlägsna fekalt innehåll.
OBS: Valfritt, applicera xylazin direkt på tarmen för att undvika rörelseartefakter på grund av peristaltik. - Fläcka ytan av tarmslemhinnan med acriflavine och rhodamine-B dextran (10 kDa).
- Applicera acriflavinelösningen 1 mg/mL (100 μL) genom att pipettera droppe för droppe på slemhinnan och inkubera i 3 min. Tvätta ur den återstående lösningen med PBS.
- Applicera 2 mg/mL rhodamin-dextran-lösningen (100 μL) genom att pipettera droppe för droppe på slemhinnan och inkubera i 3 min. Tvätta ur den återstående lösningen med PBS.
OBS: Eventuellt, ta bort blod från preparatet med hjälp av aseptisk bomull.
- Placera den sövda mussen på en täcksglas monterad i en kammare som sköljs med förvärmd saltlösning (37 °C).
OBS: Det öppnade tarmsegmentet placeras sedan luminal yta nedåt, på täckglaset. - Placera preparatet (sövd mus i kammaren) på det inverterade mikroskopet skede.
- Täck djuret med en isotermisk pad (ca. 37 °C).
- Fortsätt omedelbart till intravital mikroskopi.
OBS: Håll den kirurgiska preparationen sköljd med förvrev saltlösning för att undvika uttorkning av vävnaden och celldöden.
2. Intravital mikroskopi
OBS: Utför steg 2.1 innan operationsberedningen påbörjas, för att undvika långa väntetider mellan anestesi, kirurgi och bildinhämtning. Vid behov kan ytterligare doser av bedövningsmedel ges till kirurgiskt beredda djur för att hålla dem under narkos för bildundersökningsexperimenten.
- Ställ in CLSM-mikroskopet.
- Starta CLSM-mikroskopet genom att slå på mikroskopbasen och skannerlådan. Slå på datorn genom att trycka på Start-knappen.
- Starta programvaran för bildanskaffning (t.ex. LAS X) genom att dubbelklicka på ikonen. Välj lämplig konfiguration (Konfiguration: maskin; Mikroskop: DMI6000) och klicka på OK.
- Definiera lämplig Upplösning. Gå till Konfiguration | Hårdvara | Upplösning | Bitdjup. Välj 12.
- Gå till menyn Förvärv. Välj xyzt för bildanskaffningsläget från rullgardinsmenyn. Välj målsättning i drop-off-menyn (20x eller 40x).
- Utforma inställningen för sekventiellt förvärv. Klicka på Seq. Lägg till en andra sekvens, genom att klicka på lägg till knappen (+). Markera Mellan ramar.
- Konfigurera Sekvens 1 (detektion av acriflavine; 416 nm excitation; 514 nm emission). Sätt på den synliga laserlådan. Aktivera PMT1 (PÅ). Definiera fönstret för emissionsvåglängd (490-550 nm).
- Konfigurera Sekvens 2 (detektion av rhodamineB-dextran; 570 nm excitation; 590 nm, emission). Sätt på den synliga laserlådan. Aktivera PMT2 (PÅ). Definiera fönstret för emissionsvåglängd (550-760).
- Aktivera motsvarande lasrar (488 och 552). Gå till Konfiguration | Lasrar. Aktivera 488 och 552 nm lasrar (slå PÅ).
- Justera inställningen till de specifika funktionerna i det aktuella experimentet.
- Slå PÅ ljuskällan (tryck på strömmen). Placera preparatet (sövd mus i kammaren) på mikroskopstadiet och ändra xy-positionen tills belysningsaxeln är fokuserad på vävnadspreparationen.
- Välj intresseområdet med hjälp av standardljuskällan och okularen.
- Välj filterkuben (I3). Öppna slutaren. Fokusera på tarmslemhinnans yta genom att använda makro- och mikrohjulet. Sök efter ett område där flera villi kan visualiseras inom synfältet genom att ändra XY-positionen.
- Kontrollera att infärgningen av rhodamin-dextran också syns i det området. Ändra filterkuben (N2.1). Kontrollera bilden genom okularen.
- Starta förvärvet av CLSM-avbildningen från programvaran. Optimera inställningar för de två sekvenserna.
- Välj Sekvens 1. Justera lasereffekt, förstärkning och förskjutning för Sekvens 1.
- Välj Sekvens 2. Justera lasereffekt, förstärkning och offset för Sekvens 2.
- Definiera z-stackintervallet.
- Öppna avlämningsmenyn Z-stack. Fokusera på slemhinnans yta med hjälp av z-axelns kontroll. Tryck på Begin.
- Fokusera på den nedre gränsen där signalen fortfarande är detekterbar. Tryck på Slut.
- Definiera numren på z-stackar (10). Undvik tidsförlopp längre än 2 min under två på varandra följande tidspoäng.
- Definiera tidsinställningarna. Gå till Time-menyn. Klicka på Minimera. Välj Acquire tills det har stoppats.
- Definiera radgenomsnittet. Välj Seq 1. Välj Linje medeltal 2. Välj Seq 2. Välj Linje medeltal 2.
- Skaffa motsvarande bilder.
- Välj Format (1024 x 1024) och Hastighet (400). Tryck på Start.
- Tryck på Stopp efter önskad bildanskaffningstid.
- Spara filen. Gå till Project. Högerklicka på motsvarande fil. Tryck på Spara som.
- Namnge filen på lämpligt sätt. Välj adekvat mapp. Tryck på Spara.
- Avliva djuret (livmoderhalscancer störning) och samla vävnader för baktanke analys, om det behövs.
3. Bildanalys: Bestäm cellavgivande takt och tarmepitelet
- Cells avgivande
- Starta programvaran för bildförvärv.
- Gå till Öppna projekt. Välj lämplig fil.
- Definiera den totala tiden för bildförvärv.
- Välj den senast kompletta z-stacken. Välj den sista Z-positionen från den tidigare valda tidspunkten. Läs tiden på höger nedre hörnet av skärmen (total tid för bild förvärv).
- Välj en villus.
- Välj lämplig Z stack position (yta av villus, men tillräckligt djup för att undvika störningarna med redan skjul celler och andra komponenter som finns vid lumen).
- Mät längden på basalmembranet. Markera linjalverktyget. Dela villusen i flera rader för att täcka eller rita hela villusperimetern. Lägg till de olika värdena (total längd på basalmembranet). Ta bort segmenten i linjalverktyget.
- Räkna antalet händelser som inträffar under hela varaktigheten av bildförvärvet.
- Dela in villusen i segment med en tillräcklig storlek. Analysera händelseförloppet/segmentet genom att skjuta stapeln genom de olika tidspunkterna. Kommentera de identifierade cellutgjutelsehändelserna.
- Beräkna antalet avgivande händelser/tid/längd på basalmembranet, vilket indikerar cellsjuddingshastigheten. Räkna upp till 5 villi / video, och minst två videor / mus. Beräkna medelvärdet för dessa 10 mätningar.
- Läckage
- Välj en villus.
- Välj lämplig Z stack position (yta av villus, men tillräckligt djup för att undvika störningarna med redan skjul celler och andra komponenter som finns vid lumen). Räkna totalt antal epitelceller/villus.
- Räkna antalet läckagepunkter (Para-cellulär närvaro av rhodamindextran. Denna händelse är övergående, vilket kan bekräftas genom att kontrollera tidigare och ulterior förvärvade bilder).
- Beräkna antalet läckage/totalt antal epitelceller. Analysera 10 olika villus/sample/video och beräkna genomsnittligt antal läckage och genomsläppliga celler/villus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet presenteras här beskriver en intravital mikroskopi-baserade strategi för att visualisera intestinala epitelial läckage och observera cell avgivande prestanda i tarmen i realtid. Kortfattat, möss sövs och lämnas till kirurgisk beredning för att exponera ytan av tunntarmen slemhinnan. IECs färgas sedan via aktuell tillämpning av acriflavine; medan luminal rhodamin B-dextran används som spårämnen för att upptäcka transmukosal passage från lumen till sub-epitelial utrymme. Således är den kirurgiska beredningen och den sövda musen placeras på en bild monterad i en Petri-skål och avbildas över tiden med hjälp av CLSM (Bild 1). Analys efter förvärvet tillåter beräkning av epitelial cell shedding rate (antal cell shedding händelser/ minut / längd av basalmembran) samt andelen övergående läckage (paracellulär permeabilitet) och "permeabla celler" (transcellulär permeabilitet) vid en bestämd tidpunkt.
För att framkalla förändringar av epitelintegritet drog vi fördel av den tidigare beskrivna IEC-specifika GGTas-bristfälliga villkorade musmodellen (Pggt1biΔIEC-möss), som genererades via LoxP-Cre-systemet24. Som tidigare beskrivits utvecklade Pggt1biΔIEC-möss (Figur 2A) allvarlig tarmpatologi som visas genom ökad histologisk skadepoäng i tunntarmen (Figur 2B). Ökad tarmepitetelpermeabilitet kunde detekteras via tracer in vivo-experiment med hjälp av oralt administrerad FITC-dextran (4 kDa) (Figur 2C), och sedan bekräftas via intravital mikroskopi (Figur 2D-2E). Medan rhodamin dextran är begränsad till luminal avdelning i kontroll möss, kunde vi upptäcka spårämne i sub-epitelial facket vid upphävande av GGTas uttryck inom IECs i Pggt1biΔIEC möss. Under bild förvärv, cell avgivande händelser kunde identifieras som celler som rör sig ut ur epitelial monolayer i lumen, vilket leder till tillfälliga luckor i tätning av epitel, som slutligen stängs av kontakten mellan angränsande celler, så kallade zip-effekt (Figur 3A). Vi kunde tydligt observera dessa luckor, vad vi kallar tillfälligt epitelial läckage både i kontroll och Pggt1biΔIEC möss, även om frekvensen av dessa fenomen var högre i den senare (Figur 3B, 3C). Intressant nog kunde vi också identifiera andra celler där dextran kunde upptäckas intracellulärt, så kallade "permeabla celler"; dessa händelser inträffade främst hos Pggt1biΔIEC-möss (Figur 3B,3D). Tillsammans, dra nytta av här presenteras intravital mikroskopi strategi, vi kunde fastställa att nedsatt epitelial integritet i Pggt1biΔIEC möss leder till cell sprider prestanda förändringar och ökad para- och trans-cellulära epitelial permeabilitet i tarmen.
Figur 1: Schematisk beskrivning av den här presenterade intravital mikroskopi tillvägagångssätt. (A) Flödesdiagram. (B) Diagram. Efter kirurgisk beredning, tarmslemhinnan lokalt färgas med acriflavine och rhodamin dextran är monterad på en cover-slide inbäddade på en Petri-skålen för att möjliggöra perfusion med en saltlösning (luminal yta ner). Tarmslemhinnan avbildas sedan med hjälp av ett CLSM-mikroskop över tid. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Försämrad epitelintegritet hos Pggt1biΔIEC-möss som leder till ökad tarmpermeabilitet. (A) Western blot visar tamoxifen-inducerad avskaffade GGTas-1B uttryck inom IECs i Pggt1biΔIEC kontra kontroll möss. (B) Histologisk poäng av tunntarmen från kontroll- och Pggt1biΔIEC-mössen. (C) Kvantifiering av tarmepitepermeabilitet i vivo mätt med transmukosal passage av oralt administrerad FITC-Dextran (4 kDa). (D) Diagram som beskriver riktningen för bildförvärv, från lumen nedåt till villus-axeln. Representativa bilder från en z-stack. (E) Representativa bilder av intravital mikroskopi med hjälp av lokalt applicerad acriflavine och rhodamine B-dextran från kontroll och Pggt1biΔIEC möss, som beskrivs i detta manuskript. Data uttrycks som Mean ± SEM. Icke-parkopplat t-test. * P värde ≤ 0,05; P-≤ 0,0001. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Epitelial cell shedding prestanda och para/ trans-cellulära epitelial permeabilitet med hjälp av intravital mikroskopi. (A) Representativa bilder som visar en cell avgivande händelse i realtid (vit pil). Skjulcellen extruderades från epitelial monolayer till lumen. Angränsande celler förseglar det tillfälliga läckaget (zip-effekt) för att undvika förlust av barriärfunktion. (B) Representativ bild som visar läckage (vita pilar) och genomsläppliga tarmepitelceller (blå pilar). (C-D) Kvantifiering av tillfälligt läckage (C) och genomsläppliga celler (D) i kontroll och Pggt1biΔIEC-möss. Data uttrycks som Mean ± SEM. Icke-parkopplat t-test. * P värde ≤ 0,05; P-≤ 0,0001 . Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om den är tekniskt utmanande, representerar intravital mikroskopibaserad metodologi en unik experimentell metod för att visualisera mycket dynamisk cellulär process i realtid, till exempel cellsutgjutelseprestanda. Hittills finns det ingen alternativ experimentell metod för att visualisera cell extrudering in vivo. Vi anser att detta protokoll kan bidra till beskrivningen av olika cellulära processer spelar en roll i underhåll av intestinal homeostas.
Med fördel av intravital mikroskopi möjliggör den metod som presenteras här realtid visualisering av intestinala epitelcell avgivande i levande djur. Därför är lokalt färgade intestinala mukosa (acriflavine och rhodamine B-dextran) av sövda möss avbildas upp till encellig upplösning med hjälp av confocal mikroskopi. I kombination med standard tracer experiment, det tillåter identifiering av intestinal permeabilitet störningar in vivo och skillnaden mellan para- och trans-cellulära permeabilitet. I kombination med reporter möss, liknande protokoll utnyttjas för att övervaka epitelial cell avgivande kunde visa snäva korsningen omfördelning för att täta det övergående läckage kvar av extruderade celler (zip-liknande effekt)22,26.
Förutom epitelial cell shedding, modifieringar på den metod som presenteras här har anpassats till analys av andra mycket dynamiska cellulära processer som förekommer vid ytan av tarmslemhinnan. Till exempel, intravenös administrering av spårämne molekyler och blodkärl färgning med anti-CD31 antikroppar gav möjlighet att utvärdera endotel integritet itarmen 27. Bortom epitelet har liknande tillvägagångssätt använts för att undersöka tarmhoming egenskaper hos immunceller28,29, samt interaktion mellan immunceller och IECs i samband med tarminfektion23.
Trots den uppsjö av potentiella tillämpningar av det här beskrivna protokollet, det finns också vissa begränsningar för dess användning. Ljusspridning inom provexemplaret försämrar förvärvet av bildframställning djupt inne i vävnaden. När det gäller tunntarmen är bilden förvärvet begränsas till fenomen som inträffar vid ytan av slemhinnan (villus spets). Å andra sidan begränsar strukturen och funktionen av tarmen själv prestanda intravital mikroskopi. Trots optimala organ optiska egenskaper, peristaltic vävnad kontraktion samt flöde-inducerad förflyttning av tarmen villi innebära täta ändringar på fokus planet under bild förvärv.
Potentiella ändringar på det här presenterade protokollet kan övervinna några av dessa begränsningar. Användning av alternativa mikroskopitekniker, såsom en-foton eller multifotonmikroskopi, innebär högre peneritiseringsdjup för att visualisera fokusplan som ligger upp till 50-100 μm under provets yta. Det är dock viktigt att beakta kompromissen mellan bildupplösning och förvärvstid, eftersom dessa experiment syftar till observation av snabba och dynamiska processer. När det gäller mikroskopkonfiguration och/eller inställningar medför användningen av längre våglängder samt val av långa fria arbetsavståndsmål med hög numerisk bländare optimerade inställningar för intravital avbildning.
Tillsammans bör optimal experimentell design med hänsyn till valet av lämpliga fluorescerande färgämnen och mikroskopitekniken, samt bildåtergivningsanordningens konfiguration betraktas som viktiga steg för att få ett lyckat resultat från dessa experiment. Som framtidsperspektiv kan utvecklingen av bildbaserade prediktions-/kvantifieringsverktyg underlätta tolkningen av förvärvade data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Den forskning som leder till dessa resultat har fått finansiering från Programmet för människor (Marie Curie Actions) inom ramen för REA:s bidragsavtal nummer 302170 i Europeiska unionens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013); det tvärvetenskapliga centret för klinisk forskning (IZKF) vid universitetet Erlangen-Nürnberg; Forskningscentret för samarbete TRR241 och den kliniska forskningsgruppen KFO257 vid det tyska forskningsrådet (DFG); och DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | - |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | - |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | - | - |
| LSM microscope SP8 | Leica | - | - |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | - |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | - |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
References
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation? Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics. Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).
- Kiesslich, R., et al. Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease. Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).
- Dourmashkin, R. R., et al. Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease. Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).
- Soderholm, J. D., et al. Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease. Gut. 50 (3), 307-313 (2002).
- Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface. American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
- Fan, Y., Bergmann, A. Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell! Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).
- Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways. Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research. Cytometry A. , (2019).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance. Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).
- Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases. Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).
- Kiesslich, R., et al. Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).
- Krishnamurthy, S., et al. Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Lopez-Posadas, R., et al. Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).
- Duckworth, C. A., Watson, A. J. Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium. Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Haep, L., et al. Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).
- Lopez-Posadas, R., et al. Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice. Gastroenterology. , (2019).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
