Summary
İntravital mikroskopiden yararlanan burada sunulan yöntem, canlı hayvanlarda bağırsak epitel hücresi dökülmesinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu nedenle anestezili farelerin topikal lekeli bağırsak mukozası (acriflavine ve rhodamineB-dextran) konfokal mikroskopi kullanılarak tek hücreçözünürlüğe kadar görüntülenir.
Abstract
Konfokal görüntüleme ile bağırsağın intravital mikroskobu, canlı hayvanlarda epitel hücre dökülmesi ve bariyer kaçağının gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesine olanak sağlar. Bu nedenle, anestezik farelerin bağırsak mukozası topikal olarak spesifik olmayan boyama (acriflavine) ve floresan izleyici (rhodamine-B dextran), tuzlu çözelti-durulanmış plaka üzerine monte ve doğrudan bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenmiştir. Bu teknik, ağızdan uygulanan izleyicilerin transmukozal geçişi gibi bağırsak geçirgenliğinin sızıntısını belirlemek için diğer non-invaziv teknikleri tamamlayabilir. Bunun yanı sıra, burada sunulan yaklaşım gerçek zamanlı olarak hücre dökülme olayları doğrudan gözlem sağlar. Uygun floresan muhabir fareler ile birlikte, bu yaklaşım hücresel ve moleküler mekanizmalar bağırsak epitel hücre ekstrüzyon kontrol içine ışık dökülmesi için uygundur, yanı sıra diğer biyolojik süreçler. Son yıllarda, intravital mikroskopi kullanarak ilginç çalışmalar endotel geçirgenliği hakkında bilgi katkıda bulunmuştur, bağışıklık hücresi bağırsak homing, bağışıklık-epitel iletişim ve luminal bileşenlerin invazyonu, diğerleri arasında. Burada sunulan protokol, sadece epitel hücre ekstrüzyonunu kontrol eden mekanizmaların anlaşılmasına yardımcı olmakla kalmıyor, aynı zamanda diğer dokularda bile diğer son derece dinamik hücresel süreci görselleştirmek için araç olarak kullanılacak diğer yaklaşımların gelişimsel temelini de oluşturacaktır. Teknik sınırlamalar arasında, belirli dokunun optik özelliklerinin yanı sıra seçilen görüntüleme teknolojisi ve mikroskop yapılandırması da görüntüleme çalışma mesafesini ve edinilmiş görüntülerin çözünürlüğünü belirleyecektir.
Introduction
Bağırsak, çatışan süreçleri sağlayan sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir işlevi olan son derece uzmanlaşmış bir organdır, yani beslenme ve zararlı luminal maddelere karşı koruma. Insan vücudu ve çevre arasında astar, bağırsak epitel fiziksel ve immünolojik bariyer olarak davranır ve bağırsakta mukozal homeostaz bakımına katkıda bulunur1,2. Epitel bütünlüğü kaybı ve artan sıkı kavşak geçirgenliği iyi Inflamatuar Barsak Hastalığı ile ilişkili olduğu bilinmektedir (IBD)3,4,5,6. Epitel değişiklikler daha sonra NEDEN ve İBH kronik bağırsak iltihabı için ikincil amplifikatör olarak kabul edilir. Böylece, IBD hastalarının bağırsaklarında erken epitel değişikliklerin geliştirilmiş bir anlayış güvenilir tahmin ve IBD relaps sonraki önlenmesi için epitel bütünlüğünü geri yüklemek için yeni stratejiler geliştirilmesi için büyük bir değer olacaktır.
Bağırsak epitelkarmaşık ve sıkı düzenlenmiş ciro süreci izler. Crypt alttan, ölümcül farklılaşmış bağırsak epitel hücreleri (IECs) pluripotent kök hücrelerden elde edilen villus ucu, yaşlı / hasarlı hücreler lümen içine dökülür yukarı doğru göç7. Bölünme ve hücre ekstrüzyonu arasındaki denge bağırsak epitel hücre sayılarının sürdürülmesini sağlar, boşluk ve sızıntı oluşumunu kaçınarak, yanı sıra potansiyel hücre kitleleri ve tümörigenez 8 yol açan epitel hücrelerinin birikimi8,9,10. Bağırsak epitelinin fizyolojik yenilenmesinde epitel hücrelerinin dökülmesinin kilit rolüne rağmen, villus ucundaki hücrelerin ekstrüzyonunu yönlendiren moleküler mekanizmalar hakkındaki bilgi sınırlıdır. Bu nedenle, epitel hücre dökülme dahil moleküler olayların dizisinin kesin bir açıklamasını sağlayan temel araştırma için bir ihtiyaç vardır.
Bağırsak mukozası içinde farklı hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimler epitel ciro ve intestinal homeostaz düzenleyen moleküler mekanizmaları anlamak için anahtardır. Bu bağlamda in vivo çalışmaları in vitro ve ex vivo yaklaşımlara göre yüksek avantajlar sunmaktadır. Ayrıca, gerçek zamanlı görüntüleme teknikleri belirli olayları kontrol olayların dizisinin açıklamasını sağlar. Bu bağlamda, son derece dinamik süreçlerin incelenmesi, dokunun doğrudan gözlemlenmesi için optimize edilmiş yüksek çözünürlüklü tekniklerin kullanılmasını gerektirir. İntravital görüntüleme teknikleri bağırsakta epitel hücre dökülmesi çalışma için benzersiz uygun araçlar olarak görünür.
"İntravital mikroskopi" terimi, canlı bir hayvan ın içindeki hücre ve dokuları doğrudan görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniklerinden (multifoton veya konfokal mikroskopi) yararlanan deneysel yaklaşımları ifade eder11. In vivo bilgilerin in vivo çözünürlüğe kadar gerçek zamanlı olarak elde edilmesini sağlar ve statik veya düşük çözünürlüklü yöntemlere göre net avantajlar sağlar. İntravital mikroskopi tamamlayıcı bilgi sağlar ve klasik ve / veya high-end teknikleri bazı sınırlamalar aşmak, doku işleme nedeniyle eserler gibi. Buna karşılık, intravital mikroskopi nin ana sınırlama doku doğrudan mikroskopa maruz olması gerektiğini, hangi çoğu durumda cerrahi gerektirir. Sofistike yaklaşımlar canlılığı korumak ve görüntülenmiş doku etkisini en aza indirmek rağmen (skinfold odaları ve görüntüleme pencereleri)12,13, çoğu durumda basit bir deri kesi doku (deri flepleri) dışsallaştırma için yapılır14. Son on yılda, bu yaklaşımlar daha önce anlaşılmaz olan son derece dinamik süreçler hakkında önemli kanıtlar alabildi. Çeviri, gerçek zamanlı görüntüleme kök hücre ve lökositler homing yeni biyolojik anlayışlar sağlanan15, yanı sıra kanser yayma ve metastaz oluşumu13,16. Klinik bağlamda, endomikroskopi şu anda kanser tanı aracı olarak istismar17 ve gastrointestinal hastalıklar, IBD gibi18,19; konfokal mozaik mikroskopi cerrahi sırasında hızlı bir patoloji aracı haline geldiiken 20. Birlikte, intravital mikroskopi son zamanlarda klinikte biyomedikal araştırma ve gelecekteki uygulama için değerli ve çok yönlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır.
İntravital mikroskopi burada intestinal epitel kaçağının gerçek zamanlı görüntülenmesi ve epitel hücre dökülme olaylarının gözlemlenmesi için uygulanmaktadır. Bağırsak geçirgenliğinin kaçağı, serum21'dekifloresan izleyicilerin sözlü olarak uygulanması gibi diğer in vivo noninvaziv teknikler ile tespit edilebilir. Ancak, bu teknik dökülme performansı nın doğrudan gözlemine veya para-ve hücre içi geçirgenlik arasındaki ayrımına izin vermez. Standart izleyici deneyleri ve intravital mikroskopi kombinasyonu uygun bir yaklaşımı temsil eder: i) bağırsak geçirgenliği bozuklukları tanımlamak, ve ii) para arasında ayırmak- ve trans-hücre içi geçirgenlik. Hücre dökülmesinin yanı sıra, in vivo floresan etiketleme ile birlikte intravital mikroskopi diğer hücresel ve moleküler mekanizmaların çalışmasını sağlar (örneğin, floresan muhabir fareler kullanarak hücre dökülmesi sırasında sıkı kavşak yeniden dağılımı22 veya bağırsak mukozası içindeki IEC'ler ve diğer hücreler arasındaki etkileşimler23).
Burada sunulan yöntem, konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılarak bağırsak mukozasının gerçek zamanlı gözlemini sağlamak için intravital mikroskopinin bir adaptasyonunu temsil etmektedir. Bu nedenle, ggtase koşullu knock-out fareler kullanın (Geranylgeranyltransferaze) bağırsak epitel hücrelerinde(IECs)iΔIEC içinde, onlar ciddi bir bağırsak hastalığı muzdarip ve artmış epitel geçirgenliği muzdarip beri24. Farenin cerrahi olarak hazırlanması ve bağırsak mukozasının boyanışı, görüntüleme kazanımı ve kazanım sonrası analiziçin kullanılan uygun ayarlar anlatılmaktadır. Bu protokol, bağırsak epitel hücresi dökülmesinin dinamiği ve kinetikleri hakkında güncel bilgilere katkıda bulunan gelecekteki çalışmalara olanak sağlayabilir. Ayrıca, protokol bağırsak mukozası yüzeyinde meydana gelen diğer olayları incelemek için çeşitli adaptasyonlar için bir temel olarak hizmet verebilir, ve hatta diğer dokularda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki protokol Erlangen'deki ilgili yerel makamlar tarafından onaylanmıştır (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Almanya). Fareler belirli patojeniçermeyen koşullar altında barındırıldı.
NOT: IEC'lerde GGTase aracılı prenilasyonin inhibisyonu Pggt1biΔIEC farelerde bağırsak geçirgenliğinin ciddi bir değişimine neden olur24. Bu nedenle, bu fare modeli protokolün bağırsak bariyeri defektlerini incelemek için nasıl yararlı olabileceğini göstermek için kullanılmıştır. Ancak, bu protokol başka bir fare satırının çalışması için kullanılabilir.
1. Cerrahi hazırlık ve fare bağırsak mukozası boyama
NOT: Cerrahi hazırlık daha önce açıklanan protokollere dayanmaktadır25. Vücut ısısında bir düşüş önlemek için, cerrahi hazırlık sırasında kırmızı bir lamba altında anestezili fare tutun.
- Ketamin/ksilazin intraperitoneal enjeksiyon (96 mg/kg ketamin; ve 12.8 mg/kg xylazin) ile fareyi anesteize edin. Göz kapağı refleksi eksikliğini kontrol ederek anesteziyi doğrulayın.
- Bir pamuk tomurcuk kullanarak göz koruma kremi uygulayın.
- Standart forceps ve düz ince makas kullanarak sol ventral alanda bir kesi (1 cm) olun.
- Bağırsağın bir bölümünü dışa doğru (yaklaşık 5-7 cm).
- Antimesenteric tarafında elektrokoterizasyon ile dışlanmış bağırsak segmentini uzunlamasına açın.
- Dışkı içeriğini kaldırmak için mukozayı ve durulayın kısa bir süre tuzlu çözelti ile durulayın.
NOT: İsteğe bağlı olarak, peristalsis nedeniyle hareket eserler önlemek için doğrudan bağırsak üzerine xylazin uygulayın. - Akrülvine ve rhodamine-B dekstran (10 kDa) ile bağırsak mukozayüzeyini leke.
- 1 mg/mL acriflavine çözeltisini (100 μL) mukozaya damla damla damla damla tutarak ve 3 dk kuluçkaya yatırın. Kalan çözeltiyi PBS ile yıkayın.
- 2 mg/mL rhodamine-dextran çözeltisini (100 μL) mukozaya damla damla damla damla ve 3 dakika kuluçkaya yatırArak uygulayın. Kalan çözeltiyi PBS ile yıkayın.
NOT: İsteğe bağlı olarak, aseptik pamuk kullanarak hazırlık kan çıkarın.
- Anestezili fare omurgasını önceden ısıtılmış tuzlu çözelti (37 °C) ile durulanmış bir hazneye monte edilmiş bir kapak kaydırakına yerleştirin.
NOT: Açılan bağırsak segmenti daha sonra kapak slayt üzerine, aşağı luminal yüzey yerleştirilir. - Ters mikroskop aşamasına preparatı (anestezili fare) yerleştirin.
- Hayvanı bir isothermal ped (yaklaşık 37 °C) ile kapatın.
- Hemen intravital mikroskopiye geçin.
NOT: Doku ve hücre ölümünün susuz kalmasını önlemek için cerrahi preparatı önceden ısıtılmış tuzlu solüsyonla durulayın.
2. İntravital mikroskopi
NOT: Anestezi, cerrahi ve görüntü edinimi arasında uzun bekleme sürelerinden kaçınmak için cerrahi hazırlıklara başlamadan önce 2.1. Gerekirse, anestezi ek dozlarda görüntüleme deneyleri için anestezi altında tutmak için cerrahi olarak hazırlanmış hayvanlara verilebilir.
- CLSM mikroskobunu ayarlayın.
- Mikroskop tabanını ve tarayıcı kutusunu açarak CLSM mikroskobu başlatın. Başlat düğmesine basarak bilgisayarı açın.
- Simgeye çift tıklayarak görüntü edinme yazılımını (örneğin, LAS X) başlatın. Uygun yapılandırmayı seçin (Yapılandırma: makine; Mikroskop: DMI6000) ve Tamam'ıtıklatın.
- Uygun Çözünürlüğü tanımlayın. Yapılandırmaya Git | Donanım | Çözünürlük | Bit derinliği. 12'yi seçin.
- Edinme menüsüne gidin. Açılan menüden görüntü edinme modu için xyzt'yi seçin. Açılan menüden (20x veya 40x) hedefi seçin.
- Sıralı edinme ayarını tasarla. Seqtıklayın . Ekle düğmesine (+) tıklayarak ikinci bir sıra ekleyin. Kareler arasındaseçin.
- Sıra 1'i yapılandırın (acriflavine tespiti; 416 nm uyarma; 514 nm emisyon). Görünür lazer kutusunu açın. PMT1'i (A)'yı etkinleştirin. Emisyon dalga boyu penceresini (490-550 nm) tanımlayın.
- Yapılandırılan Sequence 2 (rhodamineB-dextran tespiti; 570 nm uyarma; 590 nm, emisyon). Görünür lazer kutusunu açın. PMT2'yi (A)'yı etkinleştirin. Emisyon dalga boyu penceresini (550-760) tanımlayın.
- Karşılık gelen lazerleri etkinleştirin (488 ve 552). Yapılandırmaya Git | Lazerler. 488 ve 552 nm lazerleri etkinleştirin (AÇIN).
- Ayarı geçerli denemenin belirli özelliklerine ayarlayın.
- Işık kaynağını açın (güç tuşuna basın). Preparatı (anestezili fare) mikroskop aşamasına yerleştirin ve aydınlatma ekseni doku hazırlığına odaklanana kadar xy pozisyonunu değiştirin.
- Standart ışık kaynağını ve parçaları kullanarak ilgi alanını seçin.
- Filtre küpünü (I3) seçin. Deklanşörü aç. Makro ve mikro tekerleği kullanarak bağırsak mukozasının yüzeyine odaklanın. XY konumunu değiştirerek görüş alanı içinde birkaç villinin görüntülenebildiği bir alan arayın.
- Rhodamine-dextran boyama da bu alanda görülebilir olduğunu doğrulayın. Filtre küpünü değiştirin (N2.1). Görüntüyü gözlerinden kontrol edin.
- ClSM görüntü edinimi yazılımdan başlatın. İki dizi için ayarları optimize edin.
- Sıra 1'i seçin. Sıra 1 için lazer gücünü, kazancı ve mahsupı ayarlayın.
- Sıra 2'yi seçin. Sıra 2 için lazer gücünü, kazancı ve mahsupı ayarlayın.
- Z yığını aralığını tanımlayın.
- Z-stack bırakma menüsünü açın. Z ekseni kontrolünü kullanarak mukozanın yüzeyine odaklanın. Başlat'abasın.
- Sinyalin hala tespit edilebildiği alt sınıra odaklanın. Bitiş tuşunabasın.
- z yığınlarının sayılarını tanımlayın (10). Art arda iki zaman puanı için 2 dakikadan uzun zaman atlamalarından kaçının.
- Saat ayarlarını tanımlayın. Zaman menüsüne git. Simge durumuna küçült'etıklayın. Durdurulana kadar Kazan'ıseçin.
- Satır ortalamasını tanımlayın. Seq 1'i seçin. Satır Ortalaması 2'yi seçin. Seq 2'yi seçin. Satır Ortalaması 2'yi seçin.
- Karşılık gelen görüntüleri edinin.
- Biçim (1024 x 1024) ve Hız (400)'yi seçin. Başlat'abasın.
- İstenilen görüntü edinme süresinden sonra Durdur'a basın.
- Dosyayı kaydedin. Project'egit. İlgili dosyaya sağ tıklayın. Olarak Kaydettuşuna basın.
- Dosyayı uygun şekilde adlandırın. Yeterli klasörü seçin. Kaydettuşuna basın.
- Hayvan (servikal çıkış) ötenazi ve gerekirse art niyet analizi için dokuları toplamak.
3. Görüntü analizi: Hücre dökülme hızını ve bağırsak epitelini belirleme
- Hücre dökülme oranı
- Görüntü edinme yazılımını başlatın.
- Open projelerine gidin. Uygun dosyayı seçin.
- Görüntü edinmenin toplam süresini tanımlayın.
- Son tam z yığınını seçin. Daha önce seçili zaman noktasından son Z konumunu seçin. Ekranın sağ alt köşesindeki saati (toplam görüntü edinme süresi) okuyun.
- Bir villus seçin.
- Uygun Z yığını konumunu seçin (villus yüzeyi, ancak lümen mevcut zaten döken hücreleri ve diğer bileşenler ile girişim önlemek için yeterince derin).
- Bazal membranuzunu ölçün. Cetvel aracını seçin. Tüm villus çevresini kapsayacak veya çizmek için villus'u birkaç satıra bölün. Farklı değerleri (bazal membran Toplam uzunluğu) ekleyin. Cetvel aracının kesimlerini silin.
- Görüntü edinme nin tüm süresi boyunca meydana gelen olayların sayısını sayın.
- Yeterli boyutta segmentlere villus bölün. Çubuğu farklı zaman noktalarına kaydırarak olayların/segmentin dizisini analiz edin. Tanımlanan hücre dökülme olayları açıklama.
- Bazal membranın dökülme olaylarının/zamanının/uzunluğunu hesaplayın, bu da hücre dökülme oranını gösterir. En fazla 5 villi/video ve en az iki video/fare sayın. Bu 10 ölçümün ortalamasını hesaplayın.
- Sızıntı
- Bir villus seçin.
- Uygun Z yığını konumunu seçin (villus yüzeyi, ancak lümen mevcut zaten döken hücreleri ve diğer bileşenler ile girişim önlemek için yeterince derin). Epitel hücrelerinin/villusların toplam sayısını sayın.
- Sızıntı noktalarının sayısını sayın (Rhodamine dextran para-hücresel varlığı. Bu olay, önceki ve art niyetli kazanılmış resimleri kontrol ederek teyit edilebilir geçicidir).
- Epitel hücrelerinin sızıntı sayısını/toplam sayısını hesaplayın. 10 farklı villus/örnek/video analiz edin ve ortalama sızıntı ve geçirilebilir hücre/villus sayısını hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan protokol, bağırsak epitel kaçağı görselleştirmek ve gerçek zamanlı olarak bağırsakta hücre dökülme performansını gözlemlemek için intravital mikroskopi tabanlı bir yaklaşım açıklar. Kısaca, fareler anestezi ve ince bağırsak mukoza yüzeyini ortaya çıkarmak için cerrahi hazırlık teslim edilir. IEC'ler daha sonra acriflavine topikal uygulama ile boyanır; luminal rhodamine B-dextran lümenden alt epitel uzaya transmukozal geçişi tespit etmek için izleyici olarak kullanılırken. Böylece, cerrahi hazırlık ve anestezili fare bir Petri kabına monte edilmiş bir slayt üzerine yerleştirilir ve CLSM kullanılarak zaman içinde görüntülenir (Şekil 1). Kazanım sonrası analiz, epitel hücre dökülme hızının (bazal membranın hücre dökülme sayısı/dakika/uzunluğu) yanı sıra geçici sızıntı (parasellüler geçirgenlik) ve "geçirgen hücreler" (geçirgenlik geçirgenliği) yüzdesinin belirlenen bir zaman noktasında hesaplanmasına izin verir.
Epitel bütünlüğünde değişiklik yapmak için, LoxP-Cre sistemi24üzerinden üretilen daha önce açıklanan IEC'ye özgü GGTase-eksik koşullu fare modelinden(Pggt1biΔIEC fareler) yararlandık. Daha önce de açıklandığı gibi, Pggt1biΔIEC fareler (Şekil 2A) ince bağırsakta histolojik hasar skorunun artmasıyla gösterildiği gibi şiddetli bağırsak patolojisi geliştirdiler (Şekil 2B). Artmış intestinal epitel geçirgenliği, ağızdan uygulanan FITC-dextran (4 kDa)(Şekil 2C)kullanılarak intravital mikroskopi ile doğrulanan intravivo deneylerde izleyici ile saptayabiliyordu (Şekil 2D-2E). Rhodamine dextran kontrol farelerinde luminal bölme ile sınırlı iken, Pggt1biΔIEC farelerde IEC'lerde GGTase ekspresyonunun bozulması üzerine alt epitel bölmesi içindeki izleyiciyi tespit edebilirdik. Görüntü edinimi sırasında hücre dökülme olayları, epitel monotabakasından lümeniçine doğru hareket eden hücreler olarak tanımlanabilir ve epitelin sızdırmazlıkta geçici boşluklara yol açabilir ve bu boşluklar sonunda komşu hücreler arasındaki temasla kapatılır, bu da zip-effect olarak adlandırılır (Şekil 3A). Bu fenomenin sıklığı ikincisinde daha yüksek olmasına rağmen, hem kontrol hem de Pggt1biΔIEC farelerde geçici epitel kaçağı dediğimiz bu boşlukları net bir şekilde gözlemleyebiliyorduk(Şekil 3B,3C). İlginçtir ki, dextran hücre içi tespit edilebilir diğer hücreleri tespit edebilir, sözde "geçirilebilir hücreler"; bu olaylar çoğunlukla Pggt1biΔIEC farelerde meydana geldi (Şekil 3B,3D). Birlikte, burada sunulan intravital mikroskopi yaklaşımından yararlanarak, Pggt1biΔIEC farelerde bozulmuş epitel bütünlüğünün hücre kaybı performans değişikliklerine ve bağırsakta para ve hücre ötesi epitel geçirgenliğin artmasına yol açtığını belirleyebiliriz.
Şekil 1: Burada şematik tanımı intravital mikroskopi yaklaşımı sundu. (A) Akış şeması. (B) Diyagramı. Cerrahi hazırlıktan sonra, bağırsak mukozası topikal olarak acriflavine ve rhodamine dextran ile boyanmış bir kapak slayt üzerine bir Petri çanak üzerine gömülü üzerine monte edilir bir tuzlu çözelti ile perfüzyon sağlamak için (luminal yüzey aşağı). Bağırsak mukozası daha sonra zaman içinde bir CLSM mikroskobu kullanılarak görüntülenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Pggt1biΔIEC farelerde epitel bütünlüğü bozulmuş ve bağırsak geçirgenliğinin artmasına neden olmaktadır. (A) Pggt1biΔIEC karşı kontrol fareleri IECs içinde tamoksifen kaynaklı GGTase-1B ifade kaldırıldı gösteren Batı leke. (B) Kontrol ve Pggt1biΔIEC farelerince ince bağırsağın histolojik skoru. (C) Oral olarak uygulanan FITC-Dextran'ın transmukozal geçişi ile ölçülen in vivo intestinal epitelyal geçirgenliğin niceliği (4 kDa). (D) Lümenden aşağıya doğru villus eksenine doğru görüntü edinme yönünü açıklayan diyagram. Z yığınından temsilresimleri. (E) Bu el yazmasında açıklandığı gibi, kontrol den topikal uygulanan acriflavine ve rhodamine B-dextran ve Pggt1biΔIEC fareler kullanılarak intravital mikroskopi temsilcisi resimleri. Veriler Ortalama ± SEM olarak ifade edilir. * P değeri 0,05 ≤; P değeri ≤ 0,0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İntravital mikroskopi ile epitel hücre dökülme performansı ve para/trans-hücresel epitel geçirgenliği. (A) Gerçek zamanlı (beyaz ok) bir hücre dökülme olay gösteren temsilci resimleri. Dökülen hücre epitel monotabakasından lümene kadar ekstrüzyon edilir. Komşu hücreler bariyer işlevinin kaybını önlemek için geçici sızıntıyı (zip-effect) kapatır. (B) Sızıntıyı (beyaz oklar) ve geçirimli bağırsak epitel hücrelerini (mavi oklar) gösteren temsili resim. (C-D) Geçici sızıntı(C) ve geçirilebilir hücrelerin(D)kontrolünde ve Pggt1biΔIEC farelerinin sayısallaştırılması. Veriler Ortalama ± SEM olarak ifade edilir. * P değeri 0,05 ≤; P değeri ≤ 0,0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknik olarak zorlu olsa da, intravital mikroskopi tabanlı metodoloji, hücre dökülme performansı gibi son derece dinamik hücresel süreci gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için benzersiz bir deneysel yaklaşımı temsil eder. Şimdiye kadar hücre ekstrüzyonunu in vivo görselleştirmek için alternatif bir deneysel yaklaşım yoktur. Bu protokolün bağırsak homeostazının korunmasında rol oynayan çeşitli hücresel süreçlerin tanımlanmasına katkıda bulunabileceğine inanıyoruz.
İntravital mikroskopiden yararlanan burada sunulan yöntem, canlı hayvanlarda bağırsak epitel hücresi dökülmesinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu nedenle anestezili farelerin topikal lekeli bağırsak mukozası (acriflavine ve rhodamine B-dextran) konfokal mikroskopi kullanılarak tek hücreçözünürlüğe kadar görüntülenir. Standart izleyici deneyleri ile birlikte, in vivo intestinal geçirgenlik bozukluklarının tanımlanmasına ve para-ve trans-hücreli geçirgenlik arasındaki ayrıma izin verir. Muhabir fareler ile birlikte, epitel hücre dökülmesi izlemek için istismar benzer protokoller ekstrüzyon hücreleri (zip benzeri etkisi)22,26tarafından bırakılan geçici sızıntı mühür sıkı kavşak yeniden dağıtım gösterebilir .
Epitel hücre dökülmesinin yanı sıra, burada sunulan yöntemdeki değişiklikler, bağırsak mukozası yüzeyinde meydana gelen diğer son derece dinamik hücresel süreçlerin analizine uyarlanmıştır. Örneğin, anti-CD31 antikorları ile lekelenme izleyici molekülleri ve kan damarı intravenöz uygulama bağırsak27endotel bütünlüğünü değerlendirmek için fırsat sağladı. Epitel ötesinde, benzer yaklaşımlar bağışıklık hücrelerinin bağırsak homing özelliklerini araştırmak için kullanılmıştır28,29, bağırsak enfeksiyonu bağlamında bağışıklık hücreleri ve IEP'ler arasındaki etkileşimin yanı sıra23.
Burada açıklanan protokolün potansiyel uygulamaları bolluk rağmen, aynı zamanda kullanımı için bazı sınırlamalar vardır. Numunenin içindeki ışık saçılımı, dokunun derinliklerinde görüntüleme elde edilmesine zarar verar. İnce bağırsak durumunda, görüntü edinimi mukoza yüzeyinde meydana gelen fenomenlerle sınırlıdır (villus ucu). Öte yandan, bağırsak yapısı ve fonksiyonu kendisi intravital mikroskopi performansını sınırlar. Optimal organ optik özelliklerine rağmen, peristaltik doku daralması ve bağırsak villi akış kaynaklı hareketi görüntü edinimi sırasında odak düzleminde sık değişiklikler anlamına gelir.
Burada sunulan protokoldeki olası değişiklikler bu sınırlamaların bazılarının üstesinden gelebilir. Tek foton veya multifoton mikroskopi gibi alternatif mikroskopi tekniklerinin kullanılması, numune yüzeyinin 50-100 m altında bulunan odak düzlemlerini görselleştirmek için daha yüksek penetran suyum derinliği anlamına gelir. Ancak, bu deneyler hızlı ve dinamik süreçlerin gözlemlenmesi amaçlanır, çünkü görüntü çözünürlüğü ve edinme süresi arasındaki uzlaşma dikkate almak önemlidir. Mikroskop konfigürasyonu ve/veya ayarları açısından, daha uzun dalga boylarının kullanımı ve yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip uzun serbest çalışma mesafesi hedeflerinin seçilmesi intravital görüntüleme için optimize edilmiş ayarları gerektirir.
Birlikte, uygun floresan boyaların seçimi ve mikroskopi tekniği nin yanı sıra görüntüleme cihazının konfigürasyonu dikkate alınarak, bu deneylerden başarılı bir sonuç elde etmek için önemli adımlar olarak düşünülmelidir. Gelecek perspektif olarak, görüntü tabanlı tahmin/niceleme araçlarının geliştirilmesi, edinilen verilerin yorumlanmasını kolaylaştırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbiri.
Acknowledgments
Bu sonuçlara yol açan araştırma, Avrupa Birliği'nin Yedinci Çerçeve Programı'nın (FP7/2007-2013) 302170 sayılı REA hibe anlaşması kapsamında İnsan Programı'ndan (Marie Curie Eylemleri) fon almıştır; Erlangen-Nürnberg Üniversitesi Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi (İZKF); Ortak Araştırma Merkezi TRR241 ve Alman Araştırma Konseyi'nin (DFG) KFO257 Klinik Araştırma Grubu; ve DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | - |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | - |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | - | - |
| LSM microscope SP8 | Leica | - | - |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | - |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | - |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
References
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation? Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics. Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).
- Kiesslich, R., et al. Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease. Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).
- Dourmashkin, R. R., et al. Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease. Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).
- Soderholm, J. D., et al. Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease. Gut. 50 (3), 307-313 (2002).
- Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface. American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
- Fan, Y., Bergmann, A. Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell! Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).
- Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways. Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research. Cytometry A. , (2019).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance. Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).
- Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases. Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).
- Kiesslich, R., et al. Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).
- Krishnamurthy, S., et al. Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Lopez-Posadas, R., et al. Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).
- Duckworth, C. A., Watson, A. J. Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium. Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Haep, L., et al. Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).
- Lopez-Posadas, R., et al. Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice. Gastroenterology. , (2019).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
