Summary
Gebruikmakend van intravitale microscopie, maakt de hier gepresenteerde methode real-time visualisatie van darmeppitheelcelvergieten bij levende dieren mogelijk. Daarom is geigreerd darmslijmvlies (acriflavine en rhodamineB-dextran) van verdoofde muizen afgebeeld tot eencellige resolutie met behulp van confocale microscopie.
Abstract
Intravitale microscopie van de darm met behulp van confocale beeldvorming maakt real-time observatie van epitheelcelvergieten en barrièrelekkage bij levende dieren mogelijk. Daarom is het darmslijmvlies van verdoofde muizen geigreerd met niet-specifieke vlekken (acriflavine) en een fluorescerende tracer (rhodamine-B dextran), gemonteerd op een zoute oplossingsspoelplaat en direct afgebeeld met behulp van een confocale microscoop. Deze techniek kan een aanvulling vormen op andere niet-invasieve technieken om lekkage van darmdoorlatendheid te identificeren, zoals transmucosale passage van oraal toegediende tracers. Daarnaast maakt de hier gepresenteerde aanpak het mogelijk om de gebeurtenissen in celvergieten in real-time te observeren. In combinatie met geschikte fluorescerende reportermuizen is deze aanpak geschikt om licht af te werpen in cellulaire en moleculaire mechanismen die darmeppitheelcelextrusie controleren, evenals aan andere biologische processen. In de afgelopen decennia hebben interessante studies met behulp van intravitale microscopie bijgedragen aan kennis over endotheeldoorlatendheid, immuuncelearm homing, immuun-epitheliale communicatie en invasie van luminale componenten, onder anderen. Samen zou het hier gepresenteerde protocol niet alleen bijdragen tot een groter begrip van mechanismen die epitheliale celextrusie controleren, maar ook de basis kunnen vormen voor de ontwikkeling van andere benaderingen die moeten worden gebruikt als instrumenten om andere zeer dynamische cellulaire processen te visualiseren, zelfs in andere weefsels. Onder technische beperkingen zouden de optische eigenschappen van het specifieke weefsel, evenals de geselecteerde beeldvormingstechnologie en microscoopconfiguratie, op zijn beurt de beeldafstand en de resolutie van verworven beelden bepalen.
Introduction
De darm is een zeer gespecialiseerd orgaan met een strak gereguleerde functie die conflicterende processen mogelijk maakt, namelijk voeding en bescherming tegen schadelijke luminale stoffen. Voering tussen het menselijk lichaam en het milieu, het darmeptheel fungeert als een fysieke en immunologische barrière en draagt bij aan het behoud van mucosale homeostase in de darm1,2. Verlies van epitheliale integriteit en verhoogde nauwe verbindingdoorlaatbaarheid is bekend te worden geassocieerd met inflammatoire darmziekte (IBD)3,4,5,6. Epitheelveranderingen worden vervolgens beschouwd als oorzaken en secundaire versterkers voor chronische darmontsteking in IBD. Zo zou een beter begrip van vroege epitheliale veranderingen in de darm van IBD-patiënten van onschatbare waarde zijn voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën om epitheelintegriteit te herstellen voor betrouwbare voorspelling en latere preventie van IBD-terugval.
Darmeptheel volgt een complex en strak gereguleerd omzetproces. Vanaf de cryptebodem migreren terminaal gedifferentieerde darmeptropepitheelcellen (IECs) afkomstig van pluripotente stamcellen naar boven naar de villuspunt, waar verouderde/beschadigde cellen in het lumen7worden vergoten. Het evenwicht tussen deling en celextrusie maakt het behoud van darmeppitheelcelnummers mogelijk, waardoor de vorming van hiaten en lekkage wordt vermeden, evenals de accumulatie van epitheliale cellen die mogelijk leiden tot celmassa's en tumorigenese8,9,10. Ondanks de sleutelrol van epitheelcelvergieten in de fysiologische vernieuwing van het darmeptheel, is de kennis over de moleculaire mechanismen die de extrusie van cellen op de villus-tip stimuleren beperkt. Zo is er behoefte aan fundamenteel onderzoek dat een nauwkeurige beschrijving geeft van de volgorde van moleculaire gebeurtenissen die betrokken zijn bij epitheliale celvergieten.
Complexe interacties tussen verschillende celtypen binnen het darmslijmvlies zijn essentieel om de moleculaire mechanismen te begrijpen die epitheliale omzet en darmhomeostase reguleren. In vivo studies bieden in deze context dus hoge voordelen ten opzichte van in vitro- en ex vivo-benaderingen. Bovendien maken real-time beeldvormingstechnieken de beschrijving mogelijk van de volgorde van gebeurtenissen die specifieke verschijnselen beheersen. In deze context vereist de studie van zeer dynamische processen het gebruik van geoptimaliseerde hogeresolutietechnieken voor de directe observatie van het weefsel. Intravital imaging technieken verschijnen als unieke geschikte instrumenten voor de studie van epitheelcel vergieten in de darm.
De term "intravitale microscopie" verwijst naar experimentele benaderingen die gebruik maken van beeldvormingstechnieken met hoge resolutie (multifoton of confocale microscopie) om cellen en weefsels in hun eigen omgeving direct te visualiseren binnen een levend dier11. Het maakt real-time verwerving van in vivo informatie tot single-cell resolutie, en brengt duidelijke voordelen ten opzichte van statische of lage resolutie methoden. Intravital microscopie biedt aanvullende informatie en overwin enkele beperkingen van klassieke en/of high-end technieken, zoals artefacten als gevolg van weefselverwerking. De belangrijkste beperking van intravitale microscopie daarentegen is dat het weefsel direct aan de microscoop moet worden blootgesteld, wat in de meeste gevallen een operatie vereist. Hoewel geavanceerde benaderingen de vitaliteit behouden en de impact van het afgebeelde weefsel minimaliseren (huidplooikamers en beeldvensters)12,13, wordt in de meeste gevallen een eenvoudige huidincisie uitgevoerd voor de externalisatie van het weefsel (huidflappen)14. In de afgelopen tien jaar hebben deze benaderingen belangrijke bewijzen geleverd over zeer dynamische processen, die voorheen ondoorgrondelijk waren. Translationally, real-time imaging leverde nieuwe biologische inzichten op over stamcel en leukocyten homing15, evenals kanker verspreiding en metastase vorming13,16. In de klinische context wordt endomicroscopie momenteel gebruikt als diagnostisch instrument voor kanker17 en maag- en darmziekten, zoals IBD18,19; terwijl confocale mozaïeken microscopie een snelle pathologie tool werd tijdens de operatie20. Intravital microscopie is de laatste tijd samen uitgegroeid tot een waardevol en veelzijdig hulpmiddel voor biomedisch onderzoek en toekomstige toepassing in de kliniek.
Intravital microscopie wordt hier geïmplementeerd voor real-time visualisatie van darmeppitheellekkage en observatie van epitheliale celvergietende gebeurtenissen. Lekkage van darmpermeabiliteit kan worden geïdentificeerd door andere in vivo niet-invasieve technieken, zoals kwantificering van orale toediening van fluorescerende tracers in serum21. Deze techniek staat echter niet toe dat de prestaties direct worden waargenomen, noch de segregatie tussen para- en transcellulaire doorlaatbaarheid. De combinatie van standaard tracerexperimenten en intravitale microscopie is een geschikte benadering van: i) het identificeren van verstoringen in darmdoorlatendheid, en ii) scheiden tussen para- en transcellulaire epitheelpermeabiliteit. Naast celvergieten maakt intravitale microscopie in combinatie met in vivo fluorescentie-etikettering de studie van andere cellulaire en moleculaire mechanismen mogelijk (bijvoorbeeld een strikte verbindingsherverdeling tijdens celvergieten met tl-reportermuizen22 of interacties tussen IDC's en andere cellen binnen het darmslijmvlies23).
De hier gepresenteerde methode vertegenwoordigt een aanpassing van intravitale microscopie om real-time observatie van darmslijmvlies mogelijk te maken, met behulp van confocale laser scanning microscopie (CLSM). Daarom gebruiken we voorwaardelijke knock-out muizen van GGTase (Geranylgeranyltransferase) in darmeppitheelcellen (IECs) in (Pggt1biΔIEC muizen), omdat ze lijden aan een ernstige darmziekte en verhoogde epitheliale permeabiliteit24. Chirurgische voorbereiding van de muis en kleuring van het darmslijmvlies, evenals de juiste instellingen die worden gebruikt voor het verwerven van beeldvorming en analyse na de overname worden beschreven. Dit protocol zou toekomstige studies mogelijk kunnen maken die bijdragen aan de huidige kennis over dynamiek en kinetiek van darmepitheelcelvergieten. Bovendien zou het protocol kunnen dienen als basis voor verschillende aanpassingen om andere verschijnselen te bestuderen die zich voordoen aan het oppervlak van het darmslijmvlies, en zelfs bij andere weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol is goedgekeurd door de bevoegde lokale autoriteiten in Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Duitsland). Muizen werden ondergebracht onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden.
OPMERKING: Remming van GGTase-gemedieerde prenylation binnen IECs veroorzaakt een ernstige verandering van darmomvang bij Pggt1biΔIEC muizen24. Daarom werd dit muismodel gebruikt om aan te tonen hoe het protocol nuttig kan zijn om darmbarrièredefecten te bestuderen. Dit protocol kan echter worden gebruikt voor de studie van een andere muislijn.
1. Chirurgische voorbereiding en kleuring van het slijmvlies van de muis
LET OP: Het chirurgische preparaat is gebaseerd op eerder beschreven protocollen25. Houd de verdoofde muis onder een rode lamp tijdens de chirurgische voorbereiding, om een daling van de lichaamstemperatuur te voorkomen.
- Verdoof de muis door intraperitoneale injectie van ketamine/xylazin (96 mg/kg ketamine; en 12,8 mg/kg xylazin). Controleer de anesthesie door te controleren op het ontbreken van een ooglidreflex.
- Breng oogbescherming crème met behulp van een wattenstaafje.
- Maak een incisie (1 cm) op de linker ventrale gebied met behulp van standaard tangen en rechte fijne schaar.
- Exterioriseer een segment van de darm (5-7 cm, ongeveer).
- Open het buitengevelsegment in de lengterichting door elektrocauterisatie aan de antimesenterische kant.
- Leg het slijmvlies bloot en spoel kort af met een zoutoplossing om fecale inhoud te verwijderen.
OPMERKING: Breng optioneel xylazin rechtstreeks op de darm aan om bewegingsartefacten als gevolg van peristaltiek te voorkomen. - Bevlek het oppervlak van het darmslijmvlies met acriflavine en rhodamine-B dextran (10 kDa).
- Breng de 1 mg/mL acriflavine oplossing (100 μL) aan door druppelsgeval druppelend op het slijmvlies te pipetten en 3 min incubeer te plassen. Was de resterende oplossing met PBS.
- Breng de 2 mg/mL rhodamine-dextran oplossing (100 μL) aan door druppelsgevoudigde op het slijmvlies te pipetten en gedurende 3 minuten in te broeden. Was de resterende oplossing met PBS.
OPMERKING: Verwijder eventueel bloed uit het preparaat met aseptisch katoen.
- Plaats de verdoofde muis supine op een cover slide gemonteerd in een kamer gespoeld met voorverwarmde zoutoplossing (37 °C).
LET OP: Het geopende darmsegment wordt vervolgens op de afdekplaat geplaatst. - Plaats de bereiding (verdoofde muis in de kamer) op het omgekeerde microscoopstadium.
- Bedek het dier met een isothermale pad (ca. 37 °C).
- Ga onmiddellijk naar intravitale microscopie.
OPMERKING: Houd het chirurgische preparaat gespoeld met voorverwarmde zoutoplossing om uitdroging van het weefsel en de celdood te voorkomen.
2. Intravitale microscopie
OPMERKING: Voer stap 2.1 uit voordat u begint met de chirurgische voorbereiding, om lange wachttijden tussen anesthesie, chirurgie en beeldverwerving te voorkomen. Indien nodig kunnen extra doses verdovingsmiddelen worden toegediend aan chirurgisch voorbereide dieren om ze onder narcose te houden voor de beeldvormingsexperimenten.
- Stel de CLSM microscoop in.
- Start de CLSM microscoop door het inschakelen van de microscoop basis en de scanner doos. Schakel de computer in door op de knop Start te drukken.
- Start de software voor het verwerven van afbeeldingen (bijvoorbeeld LAS X) door dubbel op het pictogram te klikken. Selecteer de juiste configuratie (Configuratie: machine; Microscoop: DMI6000) en klik op OK.
- Definieer de juiste resolutie. Ga naar Configuratie | Hardware | Resolutie | Bitdiepte. Selecteer 12.
- Ga naar het menu Acquisitie. Selecteer xyzt voor de beeldacquisitiemodus in het vervolgkeuzemenu. Selecteer de doelstelling in het inlevermenu (20x of 40x).
- Ontwerp de sequentiële acquisitie-instelling. Klik op Seq. Voeg een tweede reeks toe door op de knop Toevoegen (+) te klikken. Selecteer Tussen frames.
- Serie 1 configureren (detectie van acriflavine; 416 nm excitatie; 514 nm emissie). Schakel de zichtbare laserbox in. Activeer de PMT1 (ON). Definieer het emissiegolflengtevenster (490-550 nm).
- Serie 2 configureren (detectie van rhodamineB-dextran; 570 nm excitatie; 590 nm, emissie). Schakel de zichtbare laserbox in. Activeer de PMT2 (ON). Definieer het emissiegolflengtevenster (550-760).
- Activeer de bijbehorende lasers (488 en 552). Ga naar Configuratie | Lasers. Activeer 488 en 552 nm lasers (inschakelen).
- Pas de instelling aan de specifieke kenmerken van het huidige experiment aan.
- Schakel de lichtbron in (druk op de knop). Plaats de bereiding (verdoofde muis in de kamer) op het microscoopstadium en verander de xy-positie totdat de verlichtingsas is gericht op de weefselvoorbereiding.
- Selecteer het interessegebied met behulp van de standaard lichtbron en de oculairs.
- Selecteer de filterkubus (I3). Open de sluiter. Focus op het oppervlak van het darmslijmvlies met behulp van het macro- en microwiel. Zoek naar een gebied waar meerdere villi kunnen worden gevisualiseerd binnen het gezichtsveld door de XY-positie te wijzigen.
- Controleer of de rhodamine-dextran kleuring ook zichtbaar is in dat gebied. Wijzig de filterkubus (N2.1). Controleer de afbeelding door de oculairs.
- Start de CLSM-beeldacquisitie vanuit de software. De instellingen voor de twee reeksen optimaliseren.
- Selecteer Reeks 1. Pas laserkracht, versterking en offset aan voor reeks 1.
- Selecteer Volgorde 2. Pas laserkracht, versterking en offset aan voor reeks 2.
- Definieer het z-stackbereik.
- Open het inlevermenu met Z-stack. Focus op het oppervlak van het slijmvlies met behulp van de z-as controle. Druk op Begin.
- Focus op de ondergrens waar het signaal nog detecteerbaar is. Druk op Einde.
- Definieer de getallen van z-stacks (10). Vermijd tijdverlopen langer dan 2 min voor twee opeenvolgende tijdstippen.
- Definieer de tijdinstellingen. Ga naar het menu Tijd. Klik op Minimaliseren. Selecteer Verwerven totdat gestopt.
- Definieer het regelgemiddelde. Selecteer Seq 1. Selecteer Regelgemiddeld 2. Selecteer Seq 2. Selecteer Regelgemiddeld 2.
- Het verwerven van overeenkomstige afbeeldingen.
- Selecteer Opmaak (1024 x 1024) en Snelheid (400). Druk op Start.
- Druk op Stop na de gewenste tijd voor het verkrijgen van afbeeldingen.
- Sla het bestand op. Ga naar Project. Klik met de rechtermuisknop op het bijbehorende bestand. Druk op Opslaan als.
- Geef het bestand de juiste naam. Selecteer de juiste map. Druk op Opslaan.
- Euthanaseer het dier (cervicale dislocatie) en verzamel weefsels voor bijbedoelingen, indien nodig.
3. Beeldanalyse: Bepaal de celvergieten en het darmeptheel
- Celvergieten tarief
- Start de software voor het verwerven van afbeeldingen.
- Ga naar Projecten openen. Selecteer het juiste bestand.
- Definieer de totale tijd van het verwerven van afbeeldingen.
- Selecteer de laatste volledige z-stack. Selecteer de laatste Z-positie in het eerder geselecteerde tijdspunt. Lees de tijd in de rechterbenedenhoek van het scherm (totale tijd van het verkrijgen van afbeeldingen).
- Selecteer een villus.
- Selecteer de juiste Z-stackpositie (oppervlak van de villus, maar diep genoeg om de interferentie met reeds afwerpcellen en andere componenten die aanwezig zijn in het lumen te voorkomen).
- Meet de lengte van het basale membraan. Selecteer het liniaalgereedschap. Verdeel de villus in verschillende lijnen om de hele villus-omtrek te bedekken of te tekenen. Voeg de verschillende waarden (totale lengte van het basale membraan) toe. Verwijder de segmenten van het gereedschap Liniaal.
- Tel het aantal gebeurtenissen dat zich gedurende de gehele duur van de afbeeldingsverwerving voordoet.
- Verdeel de villus in segmenten met een voldoende grootte. Analyseer de volgorde van gebeurtenissen/segment door de balk door de verschillende tijdspunten te schuiven. Annoteren van de geïdentificeerde cel vergieten gebeurtenissen.
- Bereken het aantal vergietende gebeurtenissen/tijd/lengte van het basale membraan, wat de celvergietenssnelheid aangeeft. Tel tot 5 villi/video en ten minste twee video's/muis. Bereken het gemiddelde van deze 10 metingen.
- Lekkage
- Selecteer een villus.
- Selecteer de juiste Z-stackpositie (oppervlak van de villus, maar diep genoeg om de interferentie met reeds afwerpcellen en andere componenten die aanwezig zijn in het lumen te voorkomen). Tel het totale aantal epitheelcellen/villus.
- Tel het aantal lekkagepunten (Para-cellulaire aanwezigheid van rhodamine dextran. Deze gebeurtenis is van voorbijgaande aard, die kan worden bevestigd door het controleren van eerdere en bijbedoelde foto's).
- Bereken het aantal lekkage/totaal aantal epitheelcellen. Analyseer 10 verschillende villus/sample/video en bereken het gemiddelde aantal lekkage en doorlatende cellen/villus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een intravitale microscopiegebaseerde benadering om darmepelende lekkage te visualiseren en de prestaties van celafstoten in de darm in real-time te observeren. Kortom, muizen worden verdoofd en voorgelegd aan chirurgische voorbereiding om het oppervlak van het dunne darmslijmvlies bloot te stellen. IECs worden vervolgens gekleurd via actuele toepassing van acriflavine; terwijl luminale rhodamine B-dextran wordt gebruikt als tracers om transmucosale doorgang van het lumen naar de subepitheelruimte te detecteren. Zo worden de chirurgische voorbereiding en de verdoofde muis geplaatst op een dia gemonteerd in een petrischaaltje en in de loop van de tijd afgebeeld met behulp van CLSM (Figuur 1). Analyse na de overname maakt de berekening mogelijk van de epitheelcelafstotende snelheid (aantal celafstotende gebeurtenissen/minuut/lengte van basaal membraan) evenals het percentage van de tijdelijke lekkage (paracellulaire permeabiliteit) en "permeabele cellen" (transcellulaire doorlaatbaarheid) op een bepaald tijdstip.
Om veranderingen in epitheliale integriteit te veroorzaken, maakten we gebruik van het eerder beschreven IEC-specifieke GGTase-deficiënte voorwaardelijke muismodel(Pggt1biΔIEC muizen), gegenereerd via het LoxP-Cre-systeem24. Zoals eerder beschreven, ontwikkelden Pggt1biΔIEC muizen (figuur 2A) ernstige darmpathologie, zoals blijkt uit een verhoogde histologische schadescore in dunne darm(figuur 2B). Verhoogde darmeptheelpermeabiliteit kan worden gedetecteerd via tracer in vivo experimenten met oraal toegediende FITC-dextran (4 kDa) (figuur 2C), en vervolgens bevestigd via intravitale microscopie (Figuur 2D-2E). Terwijl rhodamine dextran beperkt is tot het luminale compartiment in controlemuizen, konden we de tracer in het subepitheelcompartiment detecteren na intrekking van GGTase-expressie binnen IECs in Pggt1biΔIEC-muizen. Tijdens het verkrijgen van afbeeldingen kunnen celvergietende gebeurtenissen worden geïdentificeerd als cellen die zich uit de epitheelmonolaag in het lumen bewegen, wat leidt tot tijdelijke hiaten in de afdichting van het epitheel, die uiteindelijk worden gesloten door het contact tussen naburige cellen, het zogenaamde zip-effect(figuur 3A). We konden deze hiaten duidelijk waarnemen, wat we tijdelijke epitheliale lekkage noemen, zowel in de controle als Pggt1biΔIEC-muizen, hoewel de frequentie van dit fenomeen hoger was in de laatste(figuur 3B,3C). Interessant is dat we ook andere cellen kunnen identificeren waar dextran intracellulair kunnen worden gedetecteerd, zogenaamde "doorlatende cellen"; deze voorvallen deden zich voornamelijk voor bij Pggt1biΔIEC muizen(figuur 3B,3D). Samen, gebruik te maken van de hier gepresenteerde intravitale microscopie aanpak, konden we bepalen dat verminderde epitheliale integriteit in Pggt1biΔIEC muizen leidt tot cel vergieten prestaties veranderingen en verhoogde para- en transcellulaire epitheliale doorlaatbaarheid in de darm.
Figuur 1: Schematische beschrijving van de hier gepresenteerde intravitale microscopie benadering. aA) Stroomdiagram. (B) Diagram. Na chirurgische voorbereiding wordt darmslijmvlies actueel gekleurd met acriflavine en rhodamine dextran gemonteerd op een afdekplaat die is ingebed op een petrischaal om perfusie met een zoutoplossing (luminaal oppervlak naar beneden) mogelijk te maken. Het darmslijmvlies wordt vervolgens in beeld met behulp van een CLSM-microscoop na verloop van tijd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Verminderde epitheliale integriteit bij Pggt1biΔIEC muizen leidt tot verhoogde darmdoorlaatbaarheid. (A) Westerse vlek met tamoxifen-geïnduceerde afgeschafte GGTase-1B expressie binnen IECs in Pggt1biΔIEC versus bestrijding van muizen. (B) Histologische score van de dunne darm van de controle en Pggt1biΔIEC muizen. (C) Kwantificering van darmeppitheeldoorlatendheid in vivo gemeten door transmucosale passage van oraal toegediende FITC-Dextran (4 kDa). (D) Diagram met een beschrijving van de richting van beeldverwerving, van het lumen naar beneden naar de villus-as. Representatieve foto's van een z-stack. (E) Representatieve foto's van intravitale microscopie met behulp van lokaal aangebrachte acriflavine en rhodamine B-dextran van controle en Pggt1biΔIEC muizen, zoals beschreven in dit manuscript. Gegevens worden uitgedrukt als Mean ± SEM. Niet-gekoppelde t-test. * P-waarde ≤ 0,05; P-waarde ≤ 0,0001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Epitheelcelvergieten prestaties en para/ trans-cellulaire epitheeldoorlatendheid met behulp van intravitale microscopie. (A) Representatieve foto's tonen een cel vergieten gebeurtenis op real-time (witte pijl). De schuurcel wordt geëxtrudeerd van de epitheelmonolaag naar het lumen. Naburige cellen verzegelen de tijdelijke lekkage (zip-effect) om verlies van barrièrefunctie te voorkomen. (B) Representatieve afbeelding met lekkage (witte pijlen) en doorlatende darmepelende cellen (blauwe pijlen). (C-D) Kwantificering van tijdelijke lekkage(C)en doorlaatbare cellen(D)in controle en Pggt1biΔIEC muizen. Gegevens worden uitgedrukt als Mean ± SEM. Niet-gekoppelde t-test. * P-waarde ≤ 0,05; P-waarde ≤ 0,0001 . Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel technisch uitdagend, intravital microscopie-gebaseerde methodologie vertegenwoordigt een unieke experimentele aanpak om zeer dynamisch cellulair proces visualiseren in real time, zoals cel vergieten prestaties. Tot nu toe is er geen alternatieve experimentele benadering om celextrusie in vivo te visualiseren. Wij geloven dat dit protocol kan bijdragen aan de beschrijving van diverse cellulaire processen die een rol spelen bij het behoud van darmhomeostase.
Gebruikmakend van intravitale microscopie, maakt de hier gepresenteerde methode real-time visualisatie van darmeppitheelcelvergieten bij levende dieren mogelijk. Daarom is geigreerd darmslijmvlies (acriflavine en rhodamine B-dextran) van verdoofde muizen afgebeeld tot eencellige resolutie met behulp van confocale microscopie. In combinatie met standaardtracatorexperimenten maakt het de identificatie mogelijk van darmdoorlatendheidsstoornissen in vivo en het onderscheid tussen para- en transcellulaire doorlaatbaarheid. In combinatie met reporter muizen, soortgelijke protocollen benut om epitheelcel vergieten te controleren kon strakke knooppunt herverdeling tonen aan de tijdelijke lekkage achtergelaten door de geëxtrudeerde cellen (zip-achtig effect)22,26te verzegelen .
Naast epitheliale celvergieten, zijn wijzigingen aan de hier gepresenteerde methode aangepast aan de analyse van andere zeer dynamische cellulaire processen die zich voordoen aan het oppervlak van het darmslijmvlies. Zo bood intraveneuze toediening van tracermoleculen en bloedvatkleuring met anti-CD31-antilichamen de mogelijkheid om de endotheelintegriteit in de darm te evalueren27. Naast het epitheel zijn soortgelijke benaderingen gebruikt om darmen van immuuncellen28,29,evenals interactie tussen immuuncellen en IECs in het kader van darminfectie23te onderzoeken .
Ondanks de overvloed aan mogelijke toepassingen van het hier beschreven protocol, bestaan er ook enkele beperkingen aan het gebruik ervan. Lichtverstrooiing in het monster schaadt de verwerving van beeldvorming diep in het weefsel. In het geval van dunne darm is de beeldverwerving beperkt tot verschijnselen die zich voordoen aan het oppervlak van het slijmvlies (villus-tip). Anderzijds beperkt de structuur en functie van de darm zelf de prestaties van intravitale microscopie. Ondanks optimale orgaanoptische eigenschappen impliceren peristaltische weefselcontractie en flow-geïnduceerde beweging van de darmvilli frequente wijzigingen op het focusvlak tijdens beeldverwerving.
Mogelijke wijzigingen op het hier gepresenteerde protocol kunnen een aantal van deze beperkingen overwinnen. Het gebruik van alternatieve microscopietechnieken, zoals een foton of multifoton microscopie, impliceert een hogere penetrantiediepte om focusvlakken tot 50-100 μm onder het oppervlak van het monster te visualiseren. Het is echter belangrijk om het compromis tussen beeldresolutie en verwervingstijd te overwegen, omdat deze experimenten gericht zijn op het observeren van snelle en dynamische processen. In termen van microscoopconfiguratie en/of instellingen, het gebruik van langere golflengten evenals de selectie van lange vrije werkafstand doelstellingen met een hoog numeriek diafragma brengen geoptimaliseerde instellingen voor intravital imaging.
Samen moet een optimaal experimenteel ontwerp, rekening houdend met de selectie van geschikte fluorescerende kleurstoffen en de microscopietechniek, evenals de configuratie van het beeldvormingsapparaat worden beschouwd als belangrijke stappen om een succesvol resultaat uit deze experimenten te verkrijgen. In de toekomst kan de ontwikkeling van op afbeeldingen gebaseerde voorspellings-/kwantificeringsinstrumenten de interpretatie van verkregen gegevens vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Het onderzoek dat tot deze resultaten heeft geleid, heeft financiering ontvangen van het People Program (Marie Curie Actions) in het kader van REA-subsidieovereenkomst nummer 302170 van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie (KP7/2007-2013); het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) van de Universiteit Erlangen-Neurenberg; het Collaborative Research Center TRR241 en de Clinical Research Group KFO257 van de Duitse Onderzoeksraad (DFG); en de DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | - |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | - |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | - | - |
| LSM microscope SP8 | Leica | - | - |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | - |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | - |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
References
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation? Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics. Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).
- Kiesslich, R., et al. Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease. Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).
- Dourmashkin, R. R., et al. Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease. Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).
- Soderholm, J. D., et al. Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease. Gut. 50 (3), 307-313 (2002).
- Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface. American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
- Fan, Y., Bergmann, A. Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell! Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).
- Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways. Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research. Cytometry A. , (2019).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance. Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).
- Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases. Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).
- Kiesslich, R., et al. Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).
- Krishnamurthy, S., et al. Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Lopez-Posadas, R., et al. Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).
- Duckworth, C. A., Watson, A. J. Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium. Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Haep, L., et al. Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).
- Lopez-Posadas, R., et al. Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice. Gastroenterology. , (2019).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
