Summary
Unter Ausnutzung der intravitalen Mikroskopie ermöglicht die hier vorgestellte Methode die Echtzeit-Visualisierung des Darmepithelzellvergießens bei lebenden Tieren. Daher wird topisch gefärbte Darmschleimhaut (Acriflavine und RhodamineB-Dextran) von anästhesierten Mäusen bis zur einzelzelligen Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet.
Abstract
Die intravitale Mikroskopie des Darms mittels konfokaler Bildgebung ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von Epithelzellvergießen und Barrierelecks bei lebenden Tieren. Daher ist die Darmschleimhaut von anästhesierten Mäusen topisch mit unspezifischen Färbungen (Acriflavin) und einem fluoreszierenden Tracer (Rhodamine-B-Dextran) befleckt, auf einer kochstofffreien, vorspülenden Platte montiert und direkt mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Diese Technik kann andere nicht-invasive Techniken ergänzen, um Leckagen der Darmdurchlässigkeit zu identifizieren, wie z. B. transmukosale Passagen oral verabreichter Tracer. Darüber hinaus ermöglicht der hier vorgestellte Ansatz die direkte Beobachtung von Zellabwurfereignissen in Echtzeit. In Kombination mit geeigneten fluoreszierenden Reportermäusen eignet sich dieser Ansatz, um Licht in zelluläre und molekulare Mechanismen zur Steuerung der Darmepithelzellextrusion sowie in andere biologische Prozesse zu werfen. In den letzten Jahrzehnten haben interessante Studien mit intravitaler Mikroskopie unter anderem zu Erkenntnissen über endotheliale Permeabilität, Immunzelldarmhoming, immunepitheliale Kommunikation und Invasion von Leuchtkörperkomponenten beigetragen. Zusammen würde das hier vorgestellte Protokoll nicht nur dazu beitragen, das Verständnis von Mechanismen zur Steuerung der Epithelzellextrusion zu erhöhen, sondern könnte auch die Grundlage für die Entwicklung anderer Ansätze sein, die als Instrumente zur Visualisierung anderer hochdynamischer zellulärer Prozesse, auch in anderen Geweben, verwendet werden sollen. Unter den technischen Einschränkungen würden die optischen Eigenschaften des spezifischen Gewebes sowie die ausgewählte Bildgebungstechnologie und Mikroskopkonfiguration wiederum den bildgebenden Arbeitsabstand und die Auflösung der aufgenommenen Bilder bestimmen.
Introduction
Der Darm ist ein hochspezialisiertes Organ mit einer streng regulierten Funktion, die widersprüchliche Prozesse ermöglicht, nämlich Ernährung und Schutz vor schädlichen Leuchtstoffen. Das Darmepithel wirkt als physikalische und immunologische Barriere und trägt zur Aufrechterhaltung der Schleimhautostase im Darm1,2bei. Verlust der epitheliale Integrität und erhöhte enge Knotendurchlässigkeit ist bekannt, mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) verbunden sein3,4,5,6. Epithelveränderungen werden dann als Ursachen und Sekundärverstärker für chronische Darmentzündungen bei IBD betrachtet. Somit wäre ein verbessertes Verständnis der frühen epitheliale Veränderungen im Darm von IBD-Patienten von immensem Wert für die Entwicklung neuer Strategien zur Wiederherstellung der Epithelintegrität für eine zuverlässige Vorhersage und anschließende Prävention von IBD-Rückfällen.
Das Darmepithel folgt einem komplexen und streng regulierten Umsatzprozess. Vom Kryptaboden wandern endlos differenzierte Darmepithelzellen (IECs), die aus pluripotenten Stammzellen abgeleitet sind, nach oben zur Villusspitze, wo gealterte/geschädigte Zellen in das Lumen7vergossen werden. Das Gleichgewicht zwischen Teilung und Zellextrusion ermöglicht die Aufrechterhaltung von Darmepithelzellzahlen, wodurch die Bildung von Lücken und Leckagen vermieden wird, sowie die Ansammlung von Epithelzellen, die potenziell zu Zellmassen und Tumorgenese8,9,10führen. Trotz der Schlüsselrolle des Epithelzellvergießens bei der physiologischen Erneuerung des Darmepithels ist das Wissen über die molekularen Mechanismen, die die Extrusion von Zellen an der Villusspitze vorantreiben, begrenzt. Daher ist eine Grundlagenforschung erforderlich, die eine genaue Beschreibung der Abfolge molekularer Ereignisse liefert, die an der Epithelzellvergießen beteiligt sind.
Komplexe Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb der Darmschleimhaut sind der Schlüssel zum Verständnis der molekularen Mechanismen, die den Epithelumsatz und die Darmhomöostase regulieren. In-vivo-Studien bieten in diesem Zusammenhang hohe Vorteile gegenüber In-vitro- und Ex-vivo-Ansätzen. Darüber hinaus ermöglichen Echtzeit-Bildgebungstechniken die Beschreibung der Abfolge von Ereignissen, die bestimmte Phänomene steuern. In diesem Zusammenhang erfordert die Untersuchung hochdynamischer Prozesse den Einsatz optimierter hochauflösender Techniken zur direkten Beobachtung des Gewebes. Intravitale bildgebende Verfahren erscheinen als einzigartige geeignete Werkzeuge für die Untersuchung von Epithelzellvergießen im Darm.
Der Begriff "Intravitale Mikroskopie" bezieht sich auf experimentelle Ansätze, bei denen hochauflösende bildgebende Verfahren (Multiphotonen- oder Konfokalmikroskopie) genutzt werden, um Zellen und Gewebe in ihrer heimischen Umgebung innerhalb eines lebenden Tieres direkt zu visualisieren11. Es ermöglicht die Echtzeiterfassung von In-vivo-Informationen bis hin zur Einzelzellauflösung und bringt klare Vorteile gegenüber statischen oder niedrig auflösenden Methoden mit sich. Die Intravital-Mikroskopie bietet ergänzende Informationen und überwindet einige Einschränkungen klassischer und/oder High-End-Techniken, wie z. B. Artefakte aufgrund der Gewebeverarbeitung. Im Gegensatz dazu besteht die Hauptbeschränkung der intravitalen Mikroskopie darin, dass das Gewebe direkt dem Mikroskop ausgesetzt werden sollte, was in den meisten Fällen einer Operation bedarf. Obwohl ausgeklügelte Ansätze die Vitalität bewahren und die Auswirkungen des abgebildeten Gewebes (Hautkammern und bildgebende Fenster)12,13minimieren, wird in den meisten Fällen ein einfacher Hautschnitt für die Externalisierung des Gewebes (Hautklappen) durchgeführt14. In den letzten zehn Jahren haben diese Ansätze wichtige Beweise für hochdynamische Prozesse beigesteuert, die zuvor undurchschaubar waren. Übersetzt lieferte die Echtzeit-Bildgebung neue biologische Erkenntnisse über Stammzell und Leukozyten mit15, sowie Krebsverbreitung und Metastasenbildung13,16. Im klinischen Kontext wird die Endomikroskopie derzeit als diagnostisches Instrument für Krebs17 und Magen-Darm-Erkrankungen wie IBD18,19genutzt; während konfokale Mosaikmikroskopie wurde ein schnelles Pathologie-Werkzeug während der Operation20. Gemeinsam hat sich die intravitale Mikroskopie in letzter Zeit zu einem wertvollen und vielseitigen Werkzeug für die biomedizinische Forschung und zukünftige Anwendung in der Klinik entwickelt.
Die Intravital-Mikroskopie ist hier für die Echtzeit-Visualisierung der Darmepithel-Leckage und die Beobachtung von Epithelzellabwurfereignissen implementiert. Die Leckage der Darmdurchlässigkeit kann durch andere in vivo nichtinvasive Techniken identifiziert werden, wie die Quantifizierung der oralen Verabreichung von fluoreszierenden Tracern im Serum21. Diese Technik erlaubt jedoch weder die direkte Beobachtung der Abwurfleistung noch die Segregation zwischen para- und transzellulärer Durchlässigkeit. Die Kombination von Standard-Tracer-Experimenten und intravitaler Mikroskopie stellt einen geeigneten Ansatz dar, um: i) Störungen der Darmdurchlässigkeit zu identifizieren und ii) zwischen para- und transzellulärer Epithelpermeabilität zu trennen. Neben dem Zellabwurf ermöglicht die intravitale Mikroskopie in Kombination mit der In-vivo-Fluoreszenzkennzeichnung die Untersuchung anderer zellulärer und molekularer Mechanismen (z. B. enge Umverteilung der Verbindung beim Zellabwurf mit fluoreszierenden Reportermäusen22 oder Wechselwirkungen zwischen IECs und anderen Zellen innerhalb der Darmschleimhaut23).
Die hier vorgestellte Methode stellt eine Anpassung der intravitalen Mikroskopie dar, um die Echtzeitbeobachtung der Darmschleimhaut mittels konfokaler Laserscanmikroskopie (CLSM) zu ermöglichen. Daher verwenden wir bedingte Knock-out-Mäuse von GGTase (Geranylgeranyltransferase) in Darmepithelzellen (IECs) bei (Pggt1bi-IEC-Mäusen), da sie an einer schweren Darmerkrankung und erhöhter epithelialen Permeabilität leiden24. Die chirurgische Präparation der Maus und die Färbung der Darmschleimhaut sowie geeignete Einstellungen für die bildgebende Erfassung und Nacherfassungsanalyse werden beschrieben. Dieses Protokoll könnte zukünftige Studien ermöglichen, die zum aktuellen Wissen über Dynamik und Kinetik des Darmepithelzellabwurfs beitragen. Darüber hinaus könnte das Protokoll als Grundlage für verschiedene Anpassungen dienen, um andere Phänomene zu untersuchen, die an der Oberfläche der Darmschleimhaut und sogar an anderen Geweben auftreten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Das folgende Protokoll wurde von den zuständigen Gemeinden in Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Deutschland) genehmigt. Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen untergebracht.
HINWEIS: Die Hemmung der GGTase-vermittelten Pränylierung innerhalb der IECs führt zu einer starken Veränderung der24Darmdurchlässigkeit bei Pggt1b-I-IEC-Mäusen 24 . Pggt1biΔIEC Daher wurde dieses Mausmodell verwendet, um zu demonstrieren, wie das Protokoll nützlich sein kann, um Darmbarrieredefekte zu untersuchen. Dieses Protokoll könnte jedoch für das Studium jeder anderen Mauslinie verwendet werden.
1. Chirurgische Präparation und Maus Darmschleimhaut Färbung
HINWEIS: Das chirurgische Präparat basiert auf den zuvor beschriebenen Protokollen25. Halten Sie die anästhesierte Maus während der chirurgischen Vorbereitung unter einer roten Lampe, um einen Rückgang der Körpertemperatur zu vermeiden.
- Anästhesisieren Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion von Ketamin/Xylazin (96 mg/kg Ketamin; und 12,8 mg/kg Xylazin). Überprüfen Sie die Anästhesie, indem Sie auf das Fehlen eines Augenlidreflexes überprüfen.
- Tragen Sie Augenschutzcreme mit einer Baumwollknospe auf.
- Machen Sie einen Schnitt (1 cm) auf dem linken ventralen Bereich mit Standardzange und gerade feine Schere.
- Exteriorisieren Sie ein Segment des Darms (5-7 cm, ungefähr).
- Öffnen Sie das exteriorisierte Darmsegment längs durch Elektrokauterisierung an der antimesenterseite.
- Stellen Sie die Schleimhaut aus und spülen Sie sie kurz mit einer Salinelösung ab, um den Fäkaliengehalt zu entfernen.
HINWEIS: Optional wenden Sie Xylazin direkt auf den Darm an, um Bewegungsartefakte aufgrund von Peristalsis zu vermeiden. - Färben Sie die Oberfläche der Darmschleimhaut mit Akriflavine und Rhodamine-B-Dextran (10 kDa).
- Tragen Sie die 1 mg/ml-Akriflavinlösung (100 l) auf, indem Sie Tropfen für Tropfen auf die Schleimhaut pfeifen und 3 min brüten. Waschen Sie die restliche Lösung mit PBS aus.
- Tragen Sie die 2 mg/ml Rhodamine-Dextran-Lösung (100 l) auf, indem Sie Tropfen für Tropfen auf die Schleimhaut pfeifen und 3 min brüten. Waschen Sie die restliche Lösung mit PBS aus.
HINWEIS: Optional bluten Sie mit aseptischer Baumwolle aus der Zubereitung.
- Legen Sie die anästhesierte Maussupine auf einen Abdeckschlitten, der in einer kammerförmigen, mit vorgewärmter Herz-Skelett-Lösung (37 °C) gespült ist.
HINWEIS: Das geöffnete Darmsegment wird dann luminal oberfläche nach unten platziert, auf dem Deckschlitten. - Legen Sie das Präparat (anästhetisierte Maus in der Kammer) auf die invertierte Mikroskopstufe.
- Bedecken Sie das Tier mit einem isothermen Pad (ca. 37 °C).
- Fahren Sie sofort mit der intravitalen Mikroskopie fort.
HINWEIS: Bewahren Sie das chirurgische Präparat mit vorgewärmter Herzlösung vor, um eine Austrocknung des Gewebes und den Zelltod zu vermeiden.
2. Intravitale Mikroskopie
HINWEIS: Führen Sie Schritt 2.1 vor Beginn der chirurgischen Vorbereitung durch, um lange Wartezeiten zwischen Anästhesie, Operation und Bildaufnahme zu vermeiden. Bei Bedarf können chirurgisch zubereiteten Tieren zusätzliche Dosen von Anästhetika verabreicht werden, um sie für die bildgebenden Experimente unter Narkose zu halten.
- Richten Sie das CLSM-Mikroskop ein.
- Starten Sie das CLSM-Mikroskop, indem Sie die Mikroskopbasis und die Scannerbox einschalten. Schalten Sie den Computer ein, indem Sie die Starttaste drücken.
- Starten Sie die Bildaufnahmesoftware (z.B. LAS X) durch Doppelklick auf das Symbol. Wählen Sie die entsprechende Konfiguration (Konfiguration: Maschine; Mikroskop: DMI6000) und klicken Sie auf OK.
- Definieren Sie die entsprechende Auflösung. Gehen Sie zu Konfiguration | Hardware | Auflösung | Bittiefe. Wählen Sie 12.
- Wechseln Sie zum Menü "Anschaffung". Wählen Sie xyzt für den Bildaufnahmemodus aus dem Dropdown-Menü aus. Wählen Sie das Ziel aus dem Drop-off-Menü (20x oder 40x).
- Entwerfen Sie die sequenzielle Erfassungseinstellung. Klicken Sie auf Seq. Fügen Sie eine zweite Sequenz hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen (+) klicken. Wählen Sie Zwischen Frames.
- Konfigurieren Sie Sequenz 1 (Erkennung von Akriflavine; 416 nm Anregung; 514 nm Emission). Schalten Sie die sichtbare Laserbox ein. Aktivieren Sie den PMT1 (ON). Definieren Sie das Emissionswellenlängenfenster (490-550 nm).
- Konfigurieren Sie Sequenz 2 (Nachweis von RhodamineB-Dextran; 570 nm Anregung; 590 nm, Emission). Schalten Sie die sichtbare Laserbox ein. Aktivieren Sie das PMT2 (ON). Definieren Sie das Emissionswellenlängenfenster (550-760).
- Aktivieren Sie die entsprechenden Laser (488 und 552). Gehen Sie zu Konfiguration | Laser. Aktivieren Sie 488- und 552-nm-Laser (einschalten).
- Passen Sie die Einstellung an die spezifischen Features des aktuellen Experiments an.
- Schalten Sie die Lichtquelle ein (drücken Sie die Leistung). Legen Sie das Präparat (anästhetisierte Maus in der Kammer) auf die Mikroskopstufe und ändern Sie die xy-Position, bis die Beleuchtungsachse auf das Gewebepräparat fokussiert ist.
- Wählen Sie das Interessenfeld mit der Standard-Lichtquelle und den Okularen aus.
- Wählen Sie den Filterwürfel (I3) aus. Öffnen Sie den Verschluss. Konzentrieren Sie sich mit dem Makro- und Mikrorad auf die Oberfläche der Darmschleimhaut. Suchen Sie nach einem Bereich, in dem mehrere Zotten im Sichtfeld visualisiert werden können, indem Sie die XY-Position ändern.
- Stellen Sie sicher, dass die Rhodamine-Dextran-Färbung auch in diesem Bereich sichtbar ist. Ändern Sie den Filterwürfel (N2.1). Überprüfen Sie das Bild durch die Okularen.
- Starten Sie die CLSM-Bildaufnahme aus der Software. Optimieren Sie die Einstellungen für die beiden Sequenzen.
- Wählen Sie Sequenz 1 aus. Passen Sie Laserleistung, Verstärkung und Offset für Sequenz 1 an.
- Wählen Sie Sequenz 2. Passen Sie Laserleistung, Verstärkung und Offset für Sequenz 2 an.
- Definieren Sie den Z-Stack-Bereich.
- Öffnen Sie das Z-Stack-Drop-off-Menü. Konzentrieren Sie sich mit der Z-Achsen-Steuerung auf die Oberfläche der Schleimhaut. Drücken Sie Begin.
- Konzentrieren Sie sich auf die untere Grenze, an der das Signal noch nachweisbar ist. Drücken Sie Ende.
- Definieren Sie die Anzahl der z-Stacks (10). Vermeiden Sie Zeitraffer länger als 2 min für zwei aufeinander folgende Zeitpunkte.
- Definieren Sie die Zeiteinstellungen. Gehen Sie zum Menü Zeit. Klicken Sie auf Minimieren. Wählen Sie Acquire aus, bis sie beendet wurden.
- Definieren Sie den Zeilendurchschnitt. Wählen Sie Seq 1. Wählen Sie Zeilendurchschnitt 2 aus. Wählen Sie Seq 2. Wählen Sie Zeilendurchschnitt 2 aus.
- Erfassen Sie entsprechende Bilder.
- Wählen Sie Format (1024 x 1024) und Geschwindigkeit (400). Drücken Sie Start.
- Drücken Sie nach der gewünschten Bildaufnahmezeit auf Stopp.
- Speichern Sie die Datei. Wechseln Sie zu Projekt. Rechtsklick auf die entsprechende Datei. Drücken Sie Speichern als.
- Benennen Sie die Datei entsprechend. Wählen Sie den entsprechenden Ordner aus. Drücken Sie Speichern.
- Euthanisieren Sie das Tier (zervikale Dislokation) und sammeln Sie Gewebe für die zusätzliche Analyse, wenn nötig.
3. Bildanalyse: Bestimmen der Zellabwurfrate und des Darmepithels
- Zellabwurfrate
- Starten Sie die Bildaufnahmesoftware.
- Wechseln Sie zu Offene Projekte. Wählen Sie die entsprechende Datei aus.
- Definieren Sie die Gesamtzeit der Bildaufnahme.
- Wählen Sie den letzten vollständigen z-Stack aus. Wählen Sie die letzte Z-Position aus dem zuvor ausgewählten Zeitpunkt aus. Lesen Sie die Uhrzeit in der rechten unteren Ecke des Bildschirms (Gesamtzeit der Bildaufnahme).
- Wählen Sie einen Villus aus.
- Wählen Sie die entsprechende Z-Stack-Position (Oberfläche des Villus, aber tief genug, um die Interferenz mit bereits vergossenen Zellen und anderen Komponenten, die am Lumen vorhanden sind) zu vermeiden.
- Messen Sie die Länge der Basalmembran. Wählen Sie das Linealwerkzeug aus. Teilen Sie den Villus in mehrere Linien, um den gesamten Villus-Umfang zu bedecken oder zu zeichnen. Fügen Sie die verschiedenen Werte hinzu (Gesamtlänge der Basalmembran). Löschen Sie die Segmente des Linealwerkzeugs.
- Zählen Sie die Anzahl der Ereignisse, die während der gesamten Dauer der Bildaufnahme auftreten.
- Teilen Sie den Villus in Segmente mit einer angemessenen Größe auf. Analysieren Sie die Abfolge von Ereignissen/Segmenten, indem Sie den Balken durch die verschiedenen Zeitpunkte schieben. Kommentieren Sie die identifizierten Zellabwurfereignisse.
- Berechnen Sie die Anzahl der Abwurfereignisse/Zeit/Länge der Basalmembran, die die Zellabwurfrate angibt. Zählen Sie bis zu 5 Villi/Video und mindestens zwei Videos/Maus. Berechnen Sie den Mittelwert dieser 10 Messungen.
- Leckage
- Wählen Sie einen Villus aus.
- Wählen Sie die entsprechende Z-Stack-Position (Oberfläche des Villus, aber tief genug, um die Interferenz mit bereits vergossenen Zellen und anderen Komponenten, die am Lumen vorhanden sind) zu vermeiden. Zählen Sie die Gesamtzahl der Epithelzellen/Villus.
- Zählen Sie die Anzahl der Leckagepunkte (Parazelluläre Präsenz von Rhodamine dextran. Dieses Ereignis ist vorübergehend, was durch Die Überprüfung früherer und nachstehender aufgenommener Bilder bestätigt werden kann).
- Berechnen Sie die Anzahl der Leckage/Gesamtanzahl der Epithelzellen. Analysieren Sie 10 verschiedene Villus/Sample/Video und berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von Leckagen und durchlässigen Zellen/Villus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt einen intravitalen Mikroskopie-basierten Ansatz zur Visualisierung von Darmepithellecks und zur Beobachtung der Zellabwurfleistung im Darm in Echtzeit. Kurz gesagt, Mäuse werden anästhesiert und der chirurgischen Präparation unterzogen, um die Oberfläche der Dünndarmschleimhaut freizulegen. IECs werden dann durch topische Anwendung von Acriflavine gefärbt; während luminale Rhodalin B-Dextran als Tracer verwendet wird, um transmukosale Passage vom Lumen in den subepithelialen Raum zu erkennen. So werden das chirurgische Präparat und die anästhesierte Maus auf einem in einer Petrischale montierten Dia platziert und im Laufe der Zeit mit CLSM abgebildet (Abbildung 1). Die Analyse nach dem Erwerb ermöglicht die Berechnung der Epithelzellabwurfrate (Anzahl der Zellabwurfereignisse/Minute/Länge der Basalmembran) sowie den Prozentsatz der vorübergehenden Leckage (parazelluläre Durchlässigkeit) und "durchlässigen Zellen" (transzelluläre Durchlässigkeit) zu einem bestimmten Zeitpunkt.
Um Veränderungen der epithelialen Integrität zu induzieren, nutzten wir das zuvor beschriebene IEC-spezifische GGTase-mangelhafte bedingte Mausmodell (Pggt1bi-IEC-Mäuse), das über das LoxP-Cre-System24erzeugt wurde. Wie bereits beschrieben, entwickelten Pggt1b-I-IEC-MäuseiΔIEC (Abbildung 2A) eine schwere Darmpathologie, wie durch erhöhte histologische Schadenspunkte im Dünndarm gezeigt wird (Abbildung 2B). Erhöhte Darmepithelpermeabilität konnte über Tracer-in-vivo-Experimente mit oral verabreichtem FITC-Dextran (4 kDa)(Abbildung 2C) nachgewiesen und dann mittels intravitaler Mikroskopie bestätigt werden ( Abbildung2D-2E). Während Rhodamine dextran auf das Luminalfach bei Kontrollmäusen beschränkt ist, konnten wir den Tracer innerhalb des subepithelialen Kompartimments nach Aufhebung der GGTase-Expression innerhalb der IECs inPggt1b-I-IEC-Mäusen erkennen. Pggt1b Während der Bildaufnahme konnten Zellabwurfereignisse als Zellen identifiziert werden, die sich aus der epithelialen Monoschicht in das Lumen bewegten, was zu temporären Lücken in der Versiegelung des Epithels führte, die schließlich durch den Kontakt zwischen benachbarten Zellen, dem sogenannten Zip-Effekt, geschlossen werden (Abbildung 3A). Wir konnten diese Lücken deutlich beobachten, was wir vorübergehende epitheliale Leckage sowohl in der Kontrolle als auch Pggt1bi-I-IEC-Mäuse nennen, obwohl die Häufigkeit dieser Phänomene in letzteren höher war (Abbildung 3B,3C). Interessanterweise konnten wir auch andere Zellen identifizieren, in denen Dextran intrazellulär nachgewiesen werden könnte, so genannte "durchlässige Zellen"; diese Ereignisse traten hauptsächlich bei Pggt1b-I-IEC-Mäusen auf ( Pggt1biΔIEC Abbildung 3B,3D). Unter Ausnutzung des hier vorgestellten intravitalen Mikroskopie-Ansatzes konnten wir feststellen, dass eine beeinträchtigte Epithelintegrität beiPggt1b-I-IEC-Mäusen zu Zellabwurfleistungsänderungen und erhöhter para- und transzellulärer Epitheldurchlässigkeit im Darm führt. Pggt1b
Abbildung 1: Schematische Beschreibung des hier vorgestellten intravitalen Mikroskopieansatzes. (A) Flussdiagramm. (B) Diagramm. Nach der chirurgischen Vorbereitung wird die mit Acriflavine und Rhodamindextran topisch gefärbte Darmschleimhaut auf einem auf einer Petrischale eingebetteten Deckschlitten montiert, um eine Durchblutung mit einer Kochlösung (Luminaloberfläche nach unten) zu ermöglichen. Die Darmschleimhaut wird dann im Laufe der Zeit mit einem CLSM-Mikroskop abgebildet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Beeinträchtigte epitheliale Integrität bei Pggt1bi-IEC-Mäusen, was zu erhöhter Darmdurchlässigkeit führt. (A) Westlicher Fleck, der tamoxifeninduzierte abgeschaffte GGTase-1B-Expression innerhalb von IECs in Pggt1bi-IEC versus Kontrollmäuse zeigt. (B) Histologische Punktzahl des Dünndarms aus der Kontrolle und Pggt1bi-IEC-Mäuse. (C) Quantifizierung der Darmepithelpermeabilität in vivo gemessen durch transmukosale Passage von oral verabreichtem FITC-Dextran (4 kDa). (D) Diagramm, das die Richtung der Bildaufnahme beschreibt, vom Lumen nach unten bis zur Villusachse. Repräsentative Bilder aus einem Z-Stack. (E) Repräsentative Bilder der intravitalen Mikroskopie mit topisch aufgetragenem Acriflavine und Rhodamin B-Dextran aus der Kontrolle und Pggt1bi-I-IEC-Mäusen, wie in diesem Manuskript beschrieben. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Nicht gekoppelter t-Test. * P-Wert ≤ 0,05; P-Wert ≤ 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Epithelzellvergießen Leistung und para/transzelluläre Epithelpermeabilität mittels intravitaler Mikroskopie. (A) Repräsentative Bilder, die ein Zellabwurfereignis in Echtzeit zeigen (weißer Pfeil). Die Schuppenzelle wird von der epitheliaalen Monolayer in das Lumen extrudiert. Benachbarte Zellen versiegeln die temporäre Leckage (Zip-Effekt), um den Verlust der Barrierefunktion zu vermeiden. (B) Repräsentatives Bild mit Leckage (weiße Pfeile) und durchlässigen Darmepithelzellen (blaue Pfeile). (C-D) Quantifizierung von temporären Leckage (C) und durchlässigen Zellen (D) unter Kontrolle und Pggt1bi-IEC-Mäusen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Nicht gekoppelter t-Test. * P-Wert ≤ 0,05; P-Wert ≤ 0,0001 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Obwohl die intravitale Mikroskopie-basierte Methodik technisch anspruchsvoll ist, stellt sie einen einzigartigen experimentellen Ansatz dar, um hochdynamische zelluläre Prozesse in Echtzeit zu visualisieren, wie z. B. die Zellabwurfleistung. Bisher gibt es keinen alternativen experimentellen Ansatz zur Visualisierung der Zellextrusion in vivo. Wir glauben, dass dieses Protokoll zur Beschreibung verschiedener zellulärer Prozesse beitragen kann, die eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmhomöostase spielen.
Unter Ausnutzung der intravitalen Mikroskopie ermöglicht die hier vorgestellte Methode die Echtzeit-Visualisierung des Darmepithelzellvergießens bei lebenden Tieren. Daher wird topisch gefärbte Darmschleimhaut (Acriflavin und Rhodamin B-Dextran) von anästhesierten Mäusen bis zur einzelzelligen Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet. In Kombination mit Standard-Tracer-Experimenten ermöglicht es die Identifizierung von Darmpermeabilitätsstörungen in vivo und die Unterscheidung zwischen para- und transzellulärer Durchlässigkeit. In Kombination mit Reportermäusen könnten ähnliche Protokolle, die zur Überwachung des Epithelzellabwurfs genutzt werden, eine enge Umverteilung der Kreuzung zeigen, um die vorübergehende Leckage zu versiegeln, die von den extrudierten Zellen hinterlassen wird (zip-like effect)22,26.
Neben dem Epithelzellabwurf wurden Änderungen an der hier vorgestellten Methode an die Analyse anderer hochdynamischer zellulärer Prozesse angepasst, die an der Oberfläche der Darmschleimhaut auftreten. Zum Beispiel bot die intravenöse Verabreichung von Tracermolekülen und Blutgefäßfärbung mit Anti-CD31-Antikörpern die Möglichkeit, die endotheliale Integrität im Darm27zu bewerten. Jenseits des Epithels wurden ähnliche Ansätze verwendet, um die Eigenschaften der Darmhoming-Eigenschaften der Immunzellen28,29, sowie die Interaktion zwischen Immunzellen und IECs im Kontext einer Darminfektion zu untersuchen23.
Trotz der Vielzahl möglicher Anwendungen des hier beschriebenen Protokolls gibt es auch einige Einschränkungen in seiner Verwendung. Die Lichtstreuung innerhalb der Probe beeinträchtigt die Erfassung der Bildgebung tief im Gewebe. Im Falle des Dünndarms beschränkt sich die Bildaufnahme auf Phänomene, die an der Oberfläche der Schleimhaut auftreten (Villusspitze). Andererseits schränkt die Struktur und Funktion des Darms selbst die Leistung der intravitalen Mikroskopie ein. Trotz optimaler organoptischer Eigenschaften implizieren peristaltische Gewebekontraktion sowie strömungsinduzierte Bewegungen der Darmzotten häufige Veränderungen auf der Fokusebene während der Bildaufnahme.
Potenzielle Änderungen am hier vorgestellten Protokoll könnten einige dieser Einschränkungen überwinden. Der Einsatz alternativer Mikroskopietechniken, wie z. B. ein Photonen- oder Multiphotonenmikroskopie, impliziert eine höhere Penetranztiefe, um Fokusebenen zu visualisieren, die sich bis zu 50-100 m unter der Oberfläche der Probe befinden. Es ist jedoch wichtig, den Kompromiss zwischen Bildauflösung und Aufnahmezeit zu berücksichtigen, da diese Experimente auf die Beobachtung schneller und dynamischer Prozesse abzielen. In Bezug auf die Mikroskopkonfiguration und/oder Einstellungen erfordern die Verwendung längerer Wellenlängen sowie die Auswahl von langen freien Arbeitswegobjektiven mit hoher numerischer Blende optimierte Einstellungen für die intravitale Bildgebung.
Zusammen sollte ein optimales experimentelles Design unter Berücksichtigung der Auswahl geeigneter Fluoreszenzfarbstoffe und der Mikroskopietechnik sowie der Konfiguration des Bildgebungsgeräts als Schlüsselschritte betrachtet werden, um ein erfolgreiches Ergebnis dieser Experimente zu erzielen. Als Zukunftsperspektive könnte die Entwicklung von bildbasierten Vorhersage-/Quantifizierungstools die Interpretation erworbener Daten erleichtern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
nichts.
Acknowledgments
Die Zu diesem Ergebnis führten Forschungsarbeiten wurden aus dem People Program (Marie-Curie-Maßnahmen) im Rahmen der REA-Zuschussvereinbarung Nr. 302170 des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (RP7/2007-2013) finanziert. das Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) der Universität Erlangen-Nürnberg; das Sonderforschungsbereich TRR241 und die Klinische Forschungsgruppe KFO257 des Deutschen Forschungsrates (DFG); und der DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | - |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | - |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | - | - |
| LSM microscope SP8 | Leica | - | - |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | - |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | - |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
References
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation? Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics. Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).
- Kiesslich, R., et al. Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease. Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).
- Dourmashkin, R. R., et al. Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease. Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).
- Soderholm, J. D., et al. Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease. Gut. 50 (3), 307-313 (2002).
- Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface. American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
- Fan, Y., Bergmann, A. Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell! Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).
- Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways. Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research. Cytometry A. , (2019).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance. Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).
- Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases. Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).
- Kiesslich, R., et al. Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).
- Krishnamurthy, S., et al. Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Lopez-Posadas, R., et al. Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).
- Duckworth, C. A., Watson, A. J. Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium. Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Haep, L., et al. Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).
- Lopez-Posadas, R., et al. Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice. Gastroenterology. , (2019).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
