Summary
Drage fordel af intravital mikroskopi, den metode, der præsenteres her gør det muligt real-time visualisering af intestinal epitelcelle udgydelse i levende dyr. Derfor, topisk plettet tarmslimhinden (acriflavine og rhodamineB-dextran) af bedøvede mus er afbildet op til encellet opløsning ved hjælp af konfokal mikroskopi.
Abstract
Intravital mikroskopi af tarmen ved hjælp af konfokale billeddannelse giver realtid observation af epitelcelle udgydelse og barriere lækage i levende dyr. Derfor er tarmslimhinden af bedøvede mus topisk plettet med uspecifik farvning (acriflavine) og en fluorescerende sporstof (rhodamine-B dextran), monteret på en saltvandsopløsning-skyllet plade og direkte afbildet ved hjælp af et konfokal mikroskop. Denne teknik kan supplere andre ikke-invasive teknikker til at identificere lækage af intestinal permeabilitet, såsom transmucosal passage af oralt administrerede tracer... Ud over dette, den tilgang, der præsenteres her giver mulighed for direkte observation af celle kaste begivenheder i realtid. I kombination med passende fluorescerende reporter mus, denne fremgangsmåde er velegnet til at kaste lys i cellulære og molekylære mekanismer, der styrer intestinal epitelcelle ekstrudering, samt til andre biologiske processer. I de sidste årtier har interessante undersøgelser ved hjælp af intravital mikroskopi bidraget til viden om endotelperabilitet, immuncelle gut homing, immun-epitel kommunikation og invasion af luminal komponenter, blandt andre. Sammen vil den protokol, der præsenteres her, ikke blot bidrage til at øge forståelsen af mekanismer, der styrer epitelcelleudtrudering, men også kunne danne grundlag for udvikling af andre tilgange, der skal anvendes som instrumenter til at visualisere andre meget dynamiske cellulære proces, selv i andre væv. Blandt de tekniske begrænsninger, optiske egenskaber af det specifikke væv, samt den valgte billeddannelse teknologi og mikroskop konfiguration, ville igen, bestemme billeddannelse arbejdsafstand, og opløsning af erhvervede billeder.
Introduction
Tarmen er et højt specialiseret organ med en stramt reguleret funktion, der muliggør modstridende processer, nemlig ernæring og beskyttelse mod skadelige luminalstoffer. Foring mellem den menneskelige krop og miljøet, tarmepitel fungerer som en fysisk og immunologisk barriere og bidrager til opretholdelsen af slimhinde homøostase itarmen 1,,2. Tab af epitelintegritet og øget tæt vejkrydspermeabilitet er velkendt for at være forbundet med inflammatorisk tarmsygdom (IBD)3,4,5,6. Epitelændringer betragtes derefter som årsager og sekundære forstærkere til kronisk tarmbetændelse i IBD. Således, en forbedret forståelse af tidlige epitelændringer i tarmen af IBD patienter ville være af enorm værdi for udviklingen af nye strategier til at genoprette epitelintegritet for pålidelig forudsigelse og efterfølgende forebyggelse af IBD tilbagefald.
Intestinal epitel følger en kompleks og stramt reguleret omsætningsproces. Fra kryptbunden, terminalt differentierede tarm epitelceller (IEC' er) stammer fra pluripotente stamceller migrere opad til villus spids, hvor alderen / beskadigede celler er kastet i lumen7. Ligevægten mellem deling og celle ekstrudering gør det muligt at opretholde tarm epitelcelletal, undgå dannelsen af huller og lækage, samt ophobning af epitelceller potentielt fører til cellemasser og tumorigenesis8,9,10. På trods af den centrale rolle epitelcelleudsedeling i den fysiologiske fornyelse af tarmepitelet er kendskabet til de molekylære mekanismer, der driver ekstruderingen af celler på villus-spidsen, begrænset. Der er således behov for grundforskning, der giver en præcis beskrivelse af rækkefølgen af molekylære hændelser, der er involveret i epitelcelleudgydelse.
Komplekse interaktioner mellem forskellige celletyper i tarmslimhinden er nøglen til at forstå de molekylære mekanismer, der regulerer epitelomsætning og tarmhomøostase. In vivo-undersøgelser giver således store fordele i forhold til in vitro- og ex vivo-tilgange i denne sammenhæng. Desuden giver realtidsbilleddannelsesteknikker mulighed for beskrivelse af rækkefølgen af begivenheder, der styrer specifikke fænomener. I denne sammenhæng kræver studiet af meget dynamiske processer brugen af optimerede højopløsningsteknikker til direkte observation af vævet. Intravital billeddannelse teknikker fremstå som unikke egnede værktøjer til undersøgelse af epitelcelle kaste i tarmen.
Udtrykket "intravital mikroskopi" henviser til eksperimentelle tilgange, der udnytter billedbehandlingsteknikker med høj opløsning (multiphoton eller konfokal mikroskopi) til direkte at visualisere celler og væv i deres oprindelige omgivelser i et levende dyr11. Det muliggør realtidserhvervelse af in vivo-oplysninger op til encelleløsning og medfører klare fordele i forhold til statiske eller lave opløsningsmetoder. Intravital mikroskopi giver supplerende oplysninger og overvinde nogle begrænsninger fra klassiske og / eller high-end teknikker, såsom artefakter på grund af vævsbehandling. I modsætning hertil er den vigtigste begrænsning af intravital mikroskopi, at vævet skal være direkte udsat for mikroskopet, som i de fleste tilfælde kræver operation. Selv om sofistikerede tilgange bevare vitalitet og minimere virkningen af det afbildede væv (skinfold kamre og billeddannelse vinduer)12,13, i de fleste tilfælde en simpel hud snit udføres for eksternalisering af vævet (hud flapper)14. I det seneste årti har disse tilgange bidraget med nøglevidne om meget dynamiske processer, som tidligere var uudgrundelige. Translationelt, real-time billeddannelse forudsat nye biologiske indsigter på stamceller og leukocytter homing15, samt kræft formidling og metastasedannelse 13,16. I den kliniske sammenhæng udnyttes endomikroskopi i øjeblikket som et diagnostiskværktøj for kræft 17 og gastrointestinale sygdomme, såsom IBD18,19; mens konfokale mosaicking mikroskopi blev en hurtig patologi værktøj under kirurgi20. Sammen har intravital mikroskopi på det seneste vist sig som et værdifuldt og alsidigt værktøj til biomedicinsk forskning og fremtidig anvendelse i klinikken.
Intravital mikroskopi er her implementeret for real-time visualisering af intestinal epitellækage og observation af epitelcelle kaste begivenheder. Udsivning af intestinal gennemtrængelighed kan identificeres ved hjælp af andre in vivo noninvasive teknikker, såsom kvantificering af mundtlig administration af fluorescerende stoffer i serum21. Denne teknik gør det imidlertid ikke muligt at foretage direkte observation af udskillelsen af ydeevnen eller adskillelsen mellem para- og transcellulær permeabilitet. Kombinationen af standardsporingsforsøg og intravital mikroskopi repræsenterer en passende tilgang til: i) identificere forstyrrelser i tarmpermeabilitet og ii) adskille mellem para- og transcellulære epitelperabilitet. Ud over celleudgydelse muliggør intravital mikroskopi i kombination med in vivo fluorescensmærkning studiet af andre cellulære og molekylære mekanismer (f.eks. tæt krydsfordeling under celleudgydelse ved hjælp af fluorescerende reportermus22 eller interaktioner mellem IEC'er og andre celler i tarmslimhinden23).
Den metode, der præsenteres her, repræsenterer en tilpasning af intravital mikroskopi for at muliggøre real-time observation af tarmslimhinden ved hjælp af konfokal laserscanningmikroskopi (CLSM). Derfor bruger vi betingede knock-out mus af GGTase (Geranylgeranyltransferase) i intestinal epitelceller (IEC' er) i (Pggt1biΔIEC mus), da de lider af en alvorlig tarmsygdom og øget epitelperabilitet24. Kirurgisk forberedelse af musen og farvning af tarmslimhinden, samt passende indstillinger, der anvendes til billeddannelse erhvervelse og post-erhvervelse analyse er beskrevet. Denne protokol kan muliggøre fremtidige undersøgelser, der bidrager til den nuværende viden om dynamik og kinetik af intestinal epitelcelleudgydelse. Desuden kunne protokollen danne grundlag for forskellige tilpasninger for at undersøge andre fænomener, der forekommer på overfladen af tarmslimhinden, og selv på andre væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol er godkendt af de relevante lokale myndigheder i Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland). Mus blev anbragt under specifikke patogen-fri betingelser.
BEMÆRK: Hæmning af GGTase-medieret prenylation inden for IEC'er forårsager en alvorlig ændring af intestinal permeabilitet i Pggt1biΔIEC mus24. Derfor blev denne musemodel brugt til at demonstrere, hvordan protokollen kan være nyttig til at studere tarmbarrierefejl. Denne protokol kan dog bruges til undersøgelse af en hvilken som helst anden muselinje.
1. Kirurgisk forberedelse og mus tarmslimhinden farvning
BEMÆRK: Det kirurgiske præparat er baseret på tidligere beskrevne protokoller25. Hold den bedøvede mus under en rød lampe under det kirurgiske præparat for at undgå et fald i kropstemperaturen.
- Bedøve musen ved intraperitoneal injektion af ketamin/xylazin (96 mg/kg ketamin; og 12,8 mg/kg xylazin). Kontroller anæstesi ved at kontrollere for manglen på et øjenlåg refleks.
- Påfør øjenbeskyttelse creme ved hjælp af en vatpind.
- Lav et snit (1 cm) på venstre ventrale område ved hjælp af standard hnaft og lige fine saks.
- Eksteriør et segment af tarmen (5-7 cm, ca.).
- Åbn det eksteriøriserede tarmsegment i længderetningen ved elektrocauterisering på antimesenteric side.
- Udsæt slimhinden og skyl om kort tid med saltvandsopløsning for at fjerne fækalt indhold.
BEMÆRK: Eventuelt anvende xylazin direkte på tarmen for at undgå bevægelse artefakter på grund af peristaltik. - Pletten overfladen af tarmslimhinden med acriflavine og rhodamine-B dextran (10 kDa).
- Påfør 1 mg/ml acriflavineopløsningen (100 μL) ved pipettering dråbe for dråbe på slimhinden og inkuberes i 3 min. Vask den resterende opløsning ud med PBS.
- Påfør 2 mg/ml rhodamine-dextranopløsningen (100 μL) ved pipettering dråbe for dråbe på slimhinden og inkuberes i 3 min. Vask den resterende opløsning ud med PBS.
BEMÆRK: Tag eventuelt blod ud af præparatet ved hjælp af aseptisk bomuld.
- Den bedøvede mus liggende på et dækselglas monteret i et kammer skyllet med forvarmt saltvandsopløsning (37 °C).
BEMÆRK: Det åbnede tarmsegment placeres derefter lysfladen ned på dækslet. - Anlæg præparatet (bedøvet mus i kammeret) på den omvendte mikroskopfase.
- Dyret dækkes med en isotermisk pude (ca. 37 °C).
- Fortsæt straks til intravital mikroskopi.
BEMÆRK: Hold det kirurgiske præparat skyllet med forvardt saltvandsopløsning for at undgå dehydrering af væv og celledød.
2. Intravital mikroskopi
BEMÆRK: Udfør trin 2.1, før du starter det kirurgiske præparat, for at undgå lange ventetider mellem anæstesi, kirurgi og billederhvervelse. Om nødvendigt kan der gives yderligere doser af bedøvelsesmidler til kirurgisk forberedte dyr for at holde dem under bedøvelse til billedforsøg.
- Konfigurer CLSM-mikroskopet.
- Start CLSM-mikroskopet ved at tænde for mikroskopbasen og scannerboksen. Tænd computeren ved at trykke på knappen Start.
- Start billedopkøbssoftwaren (f.eks. Vælg den relevante konfiguration (Konfiguration: maskine; Mikroskop: DMI6000) og klik på OK.
- Definer den relevante løsning. Gå til Konfiguration | Hardware | Beslutning | Bitdybde. Vælg 12.
- Gå til menuen Anskaffelse. Vælg xyzt for billedopkøbstilstanden i rullemenuen. Vælg målsætningen i rullemenuen (20x eller 40x).
- Design indstillingen for sekventiel anskaffelse. Klik på Seq. Tilføj en anden sekvens ved at klikke på knappen Tilføj (+). Vælg Mellem rammer.
- Konfigurer sekvens 1 (påvisning af acriflavine; 416 nm excitation; 514 nm emission). Tænd for den synlige laserboks. Aktiver PMT1 (TIL). Angiv bølgebølgevinduet (490-550 nm).
- Konfigurer sekvens 2 (påvisning af rhodamineB-dextran; 570 nm excitation; 590 nm, emission). Tænd for den synlige laserboks. Aktivér PMT2 (TIL). Definer vinduet med emissionsbølgelængde (550-760).
- Aktiver de tilsvarende lasere (488 og 552). Gå til Konfiguration | Lasere. Aktiver 488 og 552 nm lasere (slå til).
- Juster indstillingen til de specifikke funktioner i det aktuelle eksperiment.
- Tænd for lyskilden (tryk på strømmen). Anlæg præparatet (bedøvet mus i kammeret) placeres på mikroskopstadiet, og xy-positionen ændres, indtil belysningsaksen er fokuseret på vævspræparatet.
- Vælg interessefeltet ved hjælp af standardlyskilden og okularerne.
- Vælg filterkuben (I3). Åbn lukkeren. Fokuser på overfladen af tarmslimhinden ved hjælp af makro- og mikrohjulet. Søg efter et område, hvor flere villi kan visualiseres i synsfeltet ved at ændre XY-positionen.
- Kontroller, at rhodamine-dextran farvning er også synlig i dette område. Skift filterkuben (N2.1). Kontroller billedet gennem okularerne.
- Start CLSM-billedopkøb fra softwaren. Optimer indstillingerne for de to sekvenser.
- Vælg sekvens 1. Juster lasereffekt, forstærkning og forskydning for sekvens 1.
- Vælg sekvens 2. Juster lasereffekt, forstærkning og forskydning for sekvens 2.
- Definer z stack-området.
- Åbn drop-off-menuen Z-stack. Fokuser på overfladen af slimhinden ved hjælp af z-akse kontrol. Tryk på Begynd.
- Fokuser på den nederste grænse, hvor signalet stadig kan spores. Tryk på End.
- Definer tallene for z stacks (10). Undgå tid bortfalder længere end 2 min for to på hinanden følgende tidspoint.
- Definer tidsindstillingerne. Gå til menuen Tid. Klik på Minimer. Vælg Hent indtil stoppet.
- Definer linjegennemsnittet. Vælg Seq 1. Vælg Linjegennemsnit 2. Vælg Seq 2. Vælg Linjegennemsnit 2.
- Ansk af tilsvarende billeder.
- Vælg Format (1024 x 1024) og Hastighed (400). Tryk på Start.
- Tryk på Stop efter det ønskede tidspunkt for anskaffelse af billedet.
- Gem filen. Gå til Project. Højreklik på den tilsvarende fil. Tryk på Gem som.
- Navnd filen korrekt. Vælg den passende mappe. Tryk på Gem.
- Aflive dyret (cervikal dislokation) og indsamle væv til bagtanker analyse, hvis det er nødvendigt.
3. Billedanalyse: Bestemme celleudgædelseshastigheden og tarmepitel
- Celleudgydelsesrate
- Start billedopkøbssoftwaren.
- Gå til Åbne projekter. Vælg den relevante fil.
- Definer det samlede tidspunkt for erhvervelse af billeder.
- Vælg den sidste komplette z-stak. Vælg den sidste Z-position på det tidligere valgte tidspunkt. Læs tiden i øverste højre hjørne af skærmen (samlet tidspunkt for erhvervelse af billeder).
- Vælg en villus.
- Vælg den relevante Z-stakposition (villusens overflade, men dyb nok til at undgå interferens med allerede kaste celler og andre komponenter til stede ved lumen).
- Mål længden af basalmembranen. Vælg linealværktøjet. Opdel villus i flere linjer for at dække eller tegne hele villus perimeter. Tilsæt de forskellige værdier (den samlede længde af den basale membran). Slet segmenterne i linealværktøjet.
- Tæl antallet af hændelser, der indtræffer i hele billedopekøbets varighed.
- Opdel villus i segmenter med en tilstrækkelig størrelse. Analysér rækkefølgen af hændelser/segmenter ved at skubbe linjen gennem de forskellige tidspunkter. Anmærk de identificerede celleudgydelseshændelser.
- Beregn antallet af kastehændelser/tid/længde af basalmembranen, hvilket angiver celleudgædningshastigheden. Tæl op til 5 villi/video og mindst to videoer/mus. Beregne gennemsnittet af disse 10 målinger.
- Lækage
- Vælg en villus.
- Vælg den relevante Z-stakposition (villusens overflade, men dyb nok til at undgå interferens med allerede kaste celler og andre komponenter til stede ved lumen). Tæl det samlede antal epitelceller/villus.
- Tæl antallet af lækagepunkter (Para-cellulær tilstedeværelse af rhodamin dextran. Denne begivenhed er forbigående, hvilket kan bekræftes ved at kontrollere tidligere og skjulte erhvervede billeder).
- Beregn antallet af lækage/det samlede antal epitelceller. Analysér 10 forskellige villus/sample/video, og beregn det gennemsnitlige antal udsivnings- og gennemtrængelige celler/villus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen præsenteres her beskriver en intravital mikroskopi-baseret tilgang til at visualisere intestinal epitellækager og observere celle kaste ydeevne i tarmen i realtid. Kort, mus er bedøvet og underkastes kirurgisk forberedelse for at udsætte overfladen af tyndtarmen slimhinden. IECs er derefter farves via lokal anvendelse af acriflavine; mens luminal rhodamin B-dextran bruges som sporstoffer til at detektere transmucosal passage fra lumen til sub-epitel rummet. Således er det kirurgiske præparat og bedøvet musen placeret på et dias monteret i en petriskål og afbilledet over tid ved hjælp af CLSM (Figur 1). Analyse efter erhvervelsen gør det muligt at beregne epitelcelleskursen (antal celleafgængningshændelser/minut/længde af basalmembran) samt procentdelen af forbigående lækage (paracellulær permeabilitet) og "gennemtrængelige celler" (transcellulær permeabilitet) på et bestemt tidspunkt.
For at fremkalde ændringer af epitelintegriteten benyttede vi os af den tidligere beskrevne IEC-specifikke GGTase-mangelfuld betinget musemodel (Pggt1biΔIEC mus), der blev genereret via LoxP-Cre-systemet24. Som beskrevet før udviklede Pggt1biΔIEC mus (Figur 2A) alvorlig tarmpatologi som vist ved øget histologisk skadesscore i tyndtarmen (Figur 2B). Øget intestinal epitelperibilitet kan påvises via sporstof in vivo-forsøg ved hjælp af oralt administreret FITC-dextran (4 kDa) (Figur 2C) og derefter bekræftet via intravital mikroskopi (Figur 2D-2E). Mens rhodamin dextran er begrænset til luminalrummet i kontrolmus, kunne vi detektere sporstof i subpitelrummet ved ophævelse af GGTase-ekspression i IEC'er i Pggt1biΔIEC mus. Under erhvervelse af billeder, celle kaste begivenheder kunne identificeres som celler bevæger sig ud af epitelmonal monolayer i lumen, hvilket fører til midlertidige huller i forseglingen af epitel, som er endeligt lukket af kontakten mellem tilstødende celler, såkaldte zip-effekt (Figur 3A). Vi kunne tydeligt observere disse huller, hvad vi kalder midlertidig epitellækage både i kontrol og Pggt1biΔIEC mus, selv om hyppigheden af disse fænomen var højere i sidstnævnte (figur 3B,3C). Interessant, vi kunne også identificere andre celler, hvor dextran kunne påvises intracellularly, såkaldte "gennemtrængelige celler"; disse hændelser forekom hovedsageligt hos Pggt1biΔIEC-mus (Figur 3B,3D). Sammen kunne vi ved at udnytte den her præsenterede intravital mikroskopitilgang fastslå, at nedsat epitelintegritet i Pggt1biΔIEC-mus fører til celleudgydelsesændringer og øget para- og transcellulære epitelperabilitet i tarmen.
Figur 1: Skematisk beskrivelse af her præsenteret intravital mikroskopi tilgang. (A) Rutediagram. (B) Diagram. Efter kirurgisk forberedelse, tarmslimhinden topisk plettet med acriflavine og rhodamine dextran er monteret på et cover-slide indlejret på en petriskål til at tillade perfusion med en saltvandsopløsning (luminal overflade ned). Tarmslimhinden afbildes derefter ved hjælp af et CLSM-mikroskop over tid. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Nedsat epitelintegritet i Pggt1biΔIEC mus, der fører til øget intestinal permeabilitet. a)Western blot viser tamoxifen-induceret afskaffet GGTase-1B udtryk inden for IECs i Pggt1biΔIEC versus kontrol mus. bB) Den histologiske score for tyndtarmen fra kontrolmusene og Pggt1biΔIEC-musene. c) Kvantificering af intestinal epitelperibilitet in vivo målt ved transmucosal passage af oralt administreret FITC-Dextran (4 kDa). DD) Diagram, der beskriver retningen af erhvervelse af billeder, fra lumen nedad til villus aksen. Repræsentative billeder fra en z-stack. eE) Repræsentative billeder af intravital mikroskopi med topisk anvendt acriflavine og rhodamin B-dextran fra kontrol og Pggt1biΔIEC mus, som beskrevet i dette manuskript. Data udtrykkes som middelværdi ± SEM. Ikke-parret t-test. * P-≤ 0,05; P-≤ 0,0001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Epitelcelleudsegelsesydelse og para/transcellulære epitelperabilitet ved hjælp af intravital mikroskopi. (A) Repræsentative billeder, der viser en celle kaste begivenhed i realtid (hvid pil). Skuret celle er ekstruderet fra epitel monolayer til lumen. Tilstødende celler forsegle den midlertidige lækage (zip-effekt) for at undgå tab af barriere funktion. (B) Repræsentativt billede, der viser lækage (hvide pile) og gennemtrængelige intestinale epitelceller (blå pile). (C-D) Kvantificering af midlertidig lækage (C) og permeable celler (D) i kontrol og Pggt1biΔIEC mus. Data udtrykkes som middelværdi ± SEM. Ikke-parret t-test. * P-≤ 0,05; P-≤ 0,0001 . Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om teknisk udfordrende, intravital mikroskopi-baseret metode repræsenterer en unik eksperimentel tilgang til at visualisere meget dynamisk cellulære proces i realtid, såsom celle kaste ydeevne. Hidtil er der ingen alternativ eksperimentel tilgang til visualisering celle ekstrudering in vivo. Vi mener, at denne protokol kan bidrage til beskrivelsen af forskellige cellulære processer, der spiller en rolle i vedligeholdelsen af tarmhomostase.
Drage fordel af intravital mikroskopi, den metode, der præsenteres her gør det muligt real-time visualisering af intestinal epitelcelle udgydelse i levende dyr. Derfor, topisk plettet tarmslimhinden (acriflavine og rhodamin B-dextran) af bedøvede mus er afbildet op til encellet opløsning ved hjælp af konfokal mikroskopi. I kombination med standard sporstofforsøg gør det det muligt at identificere intestinalpermeabilitetsforstyrrelser in vivo og sondringen mellem para- og transcellulær permeabilitet. I kombination med reportermus kan lignende protokoller, der udnyttes til at overvåge epitelcelleudgydelse, vise en stram krydsfordeling for at forsegle den forbigående lækage, som de ekstruderede celler (zip-lignende effekt)22,26.
Ud over epitelcelleafgydelse er ændringer af den metode, der præsenteres her, blevet tilpasset til analysen af andre meget dynamiske cellulære processer, der forekommer på overfladen af tarmslimhinden. For eksempel, intravenøs administration af sporstof molekyler og blodkar farvning med anti-CD31 antistoffer gav mulighed for at evaluere endotel integritet itarmen 27. Ud over epitelet er lignende tilgange blevet anvendt til at undersøge immuncellernes tarmpræsentationer28,29samt interaktion mellem immunceller og IEC'er i forbindelse med tarminfektion23.
På trods af den overflod af potentielle anvendelser af den her beskrevne protokol, der findes også nogle begrænsninger for dens anvendelse. Lyssprænde i prøven svækker erhvervelsen af billeddannelse dybt inde i vævet. I tilfælde af tyndtarmen, billedet erhvervelse er begrænset til fænomener, der forekommer på overfladen af slimhinden (villus tip). På den anden side begrænser selve tarmens struktur og funktion effektiviteten af intravital mikroskopi. På trods af optimale organoptiske egenskaber, peristaltisk væv sammentrækning samt flow-induceret bevægelse af tarmen villi indebærer hyppige ændringer på fokus flyet under billedet erhvervelse.
Potentielle ændringer af den her præsenterede protokol kan overvinde nogle af disse begrænsninger. Brugen af alternative mikroskopiteknikker, såsom mikroskopi med én foton eller multifoton, indebærer højere peneancedybde for at visualisere fokusplaner, der er placeret op til 50-100 μm under prøvens overflade. Det er imidlertid vigtigt at overveje kompromiset mellem billedopløsning og anskaffelsestid, da disse eksperimenter har til formål at observation af hurtige og dynamiske processer. Med hensyn til mikroskop konfiguration og / eller indstillinger, brug af længere bølgelængder samt udvælgelse af lange gratis arbejdsafstand mål med høj numerisk blænde indebærer optimerede indstillinger for intravital billeddannelse.
Tilsammen bør optimalt eksperimentelt design under hensyntagen til valget af passende fluorescerende farvestoffer og mikroskopiteknikken samt konfigurationen af billedbehandlingsanordningen betragtes som vigtige skridt for at opnå et vellykket resultat af disse forsøg. Som et fremtidigt perspektiv kan udviklingen af billedbaserede forudsigelses-/kvantificeringsværktøjer lette fortolkningen af erhvervede data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Den forskning, der fører til disse resultater, har modtaget støtte fra People Program (Marie Curie-aktionerne) under REA-tilskudsaftalen nummer 302170 i Eu's syvende rammeprogram (RP7/2007-2013); det tværfaglige Center for Klinisk Forskning (IZKF) ved Universitetet Erlangen-Nürnberg; Det Kollaborative Forskningscenter TRR241 og den kliniske forskningsgruppe KFO257 fra det tyske forskningsråd (DFG); og DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | - |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | - |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | - | - |
| LSM microscope SP8 | Leica | - | - |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | - |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | - |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
References
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation? Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics. Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).
- Kiesslich, R., et al. Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease. Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).
- Dourmashkin, R. R., et al. Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease. Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).
- Soderholm, J. D., et al. Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease. Gut. 50 (3), 307-313 (2002).
- Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface. American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
- Fan, Y., Bergmann, A. Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell! Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).
- Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways. Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research. Cytometry A. , (2019).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance. Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).
- Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases. Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).
- Kiesslich, R., et al. Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).
- Krishnamurthy, S., et al. Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Lopez-Posadas, R., et al. Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).
- Duckworth, C. A., Watson, A. J. Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium. Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Haep, L., et al. Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).
- Lopez-Posadas, R., et al. Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice. Gastroenterology. , (2019).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
