Summary
生体内顕微鏡を利用して、ここで提示される方法は、生きている動物の腸上皮細胞脱落のリアルタイム視覚化を可能にする。従って、麻酔化マウスの局所染色された腸粘膜(アクリフラビン及びローダミンB-デキストラン)は、共焦点顕微鏡を用いて単細胞分解能まで画像化される。
Abstract
共焦点イメージングを用いた腸内顕微鏡検査により、生きている動物における上皮細胞脱落やバリア漏れのリアルタイム観察が可能です。したがって、麻酔化マウスの腸管粘膜は、非特異的染色(アクリフラビン)および蛍光トレーサー(rhodamine-Bデキストラン)で局所染色され、生理食い溶液リンスプレートに取り付けられ、共焦点顕微鏡を用いて直接画像化される。この技術は、経口投与トレーサーの経粘膜通過のような腸透過性の漏れを同定する他の非侵襲的な技術を補完することができる。この他に、ここで紹介するアプローチでは、リアルタイムで細胞脱落イベントを直接観察することができます。適切な蛍光レポーターマウスと組み合わせて、このアプローチは、腸上皮細胞の押出を制御する細胞および分子機構、ならびに他の生物学的プロセスに光を流すのに適しています。過去数十年の間に、生体内顕微鏡を用いた興味深い研究は、内皮透過性、免疫細胞腸管ホーミング、免疫上皮通信、および発光成分の侵入に関する知識に寄与してきた。ここで紹介するプロトコルは、上皮細胞押出を制御するメカニズムの理解を深めるだけでなく、他の組織であっても他の非常に動的な細胞プロセスを視覚化する手段として使用される他のアプローチの発達の基礎となる可能性もある。技術的な制限の中で、特定の組織の光学特性、ならびに選択されたイメージング技術および顕微鏡構成は、順番に、撮像作業距離、および取得画像の分解能を決定するであろう。
Introduction
腸は、競合するプロセス、すなわち栄養と有害な発光物質に対する保護を可能にする厳しく調節された機能を持つ高度に専門化された器官です。腸上皮は、人体と環境の間に内層であり、物理的および免疫学的障壁として作用し、腸内の粘膜恒常性の維持に寄与する。上皮完全性の喪失および緊密な接合透過性の増加は、炎症性腸疾患(IBD)3、4、5、6に関連することがよく知られている。3,4,5,6上皮変化は、IBDにおける慢性腸炎の原因および二次増幅器と考えられる。したがって、IBD患者の腸内の初期上皮変化に対する理解の向上は、信頼性の高い予測とその後のIBD再発の予防のために上皮の完全性を回復するための新しい戦略の開発にとって非常に価値があるだろう。
腸上皮は複雑で厳しく調節されたターンオーバープロセスに従う。陰窩下から、多能性幹細胞に由来する末期分化された腸上皮細胞(IEC)が、上方に移動して、老化/損傷した細胞が内腔7に流される。分裂と細胞押出との間の平衡は、腸の上皮細胞数の維持を可能にし、ギャップおよび漏出の形成を回避し、また細胞塊および腫瘍化をもたらす可能性のある上皮細胞の蓄積を88、9、109,10に導く。腸上皮の生理的再生における上皮細胞脱落の重要な役割にもかかわらず、ビロス先端で細胞の押出を駆動する分子メカニズムに関する知識は限られている。したがって、上皮細胞の脱落に関与する分子事象の配列を正確に記述する基礎研究が必要である。
腸粘膜内の異なる細胞型間の複雑な相互作用は、上皮のターンオーバーと腸内恒常性を調節する分子メカニズムを理解する鍵となる。したがって、in vivo研究は、この文脈におけるin vitroおよびex vivoアプローチよりも高い利点を提供する。さらに、リアルタイムイメージング技術により、特定の現象を制御する一連のイベントの記述が可能になります。この文脈では、高度に動的なプロセスの研究は、組織の直接観察のための最適化された高解像度技術の使用を要求する。生体内イメージング技術は、腸内の上皮細胞脱落の研究に適したユニークなツールとして現れます。
「生体内顕微鏡」という用語は、高解像イメージング技術(多光子または共焦点顕微鏡)を利用して、生きている動物11内の自在の環境内の細胞および組織を直接可視化する実験的アプローチを指す。それは単一細胞の決断にin vivo情報の実時間獲得を可能にし、静的か低い決断方法より明確な利点を伴う。生体内顕微鏡は補完的な情報を提供し、組織処理による人工物など、古典的な技術やハイエンド技術からいくつかの制限を克服します。対照的に、生体内顕微鏡の主な制限は、組織が顕微鏡に直接さらされるべきであり、ほとんどの場合、手術が必要です。高度なアプローチは、生力性を維持し、画像化された組織(皮膚の外向室およびイメージング窓)12、13の影響を最小限に抑えるが、ほとんどの場合、13組織(皮膚フラップ)14の外的化のために単純な皮膚切開が行われる。過去10年間で、これらのアプローチは、以前は不可解であった非常にダイナミックなプロセスに関する重要な証拠を貢献してきました。翻訳的には、リアルタイムイメージングは、幹細胞および白血球ホーミング15、ならびに癌播種および転移形成13、16に関する新たな生物学的洞察を提供した。13臨床文脈では、内視鏡検査は現在、癌17および胃腸疾患の診断ツールとして利用されている、例えばIBD18、19;,19共焦点モザイク顕微鏡は手術中に急速な病理学ツールとなった間 20.一緒に、生体内顕微鏡は最近、バイオメディカル研究とクリニックでの将来の応用のための貴重で汎用性の高いツールとして浮上しています。
腸上皮漏れのリアルタイム可視化と上皮細胞脱落事象の観察のために、インビタル顕微鏡が実施されています。腸透過性の漏出は、血清21における蛍光トレーサーの経口投与の定量化などの生体内非侵襲的技術によって同定することができる。しかし、この技術は、流れ性能の直接的な観察や、パラセルラーとトランスセルラー透過性の間の分離を直接観察することはできません。標準的なトレーサー実験と生体内顕微鏡の組み合わせは、i)腸透過性の障害を同定し、ii)パラ細胞とトランス細胞上皮透過性の間で分離する適切なアプローチを表す。細胞流動以外にも、生体内蛍光標識と組み合わせた生体内顕微鏡検査は、他の細胞および分子機構の研究を可能にする(例えば、蛍光レポーターマウス22 を用いた細胞脱落時の緊密な接合点の再分配または腸粘膜23内のIECと他の細胞との相互作用)。
ここで提示した方法は、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を用いて腸粘膜をリアルタイムに観察できるように、生体内顕微鏡の適応を表しています。したがって、GGTAS(ゲラニルゲラニルトランスビセ酵素)の条件付きノックアウトマウスを腸管上皮細胞(Pggt1biΔIEC マウス)において用い、重度の腸疾患および上皮透過性の増加に苦しんでおります。マウスの外科的調製および腸粘膜の染色、ならびにイメージング獲得および取得後分析に使用される適切な設定が記載されている。このプロトコルは、腸上皮細胞脱落のダイナミクスと運動学に関する現在の知識に寄与する将来の研究を可能にする可能性がある。さらに、このプロトコルは、腸粘膜の表面、さらには他の組織で起こる他の現象を研究するための様々な適応の基礎として役立つ可能性があります。
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Protocol
次の議定書は、エルランゲン(ドイツ、ヴュルツブルク、レジエルン・フォン・ウンターフランケン)の関連する地方自治体によって承認されています。マウスは、特定の病原体を含まない状態で収容された。
注:ICs内でGGTase媒介性プレニルの阻害は 、Pggt1biΔIEC マウス24における腸透過性の深刻な変化を引き起こす。したがって、このマウスモデルは、プロトコルが腸の障壁の欠陥を研究するのにどのように有用であるかを実証するために使用された。しかし、このプロトコルは、他のマウスラインの研究に使用することができます。
1. 手術準備とマウス腸粘膜染色
注: 手術準備は、前述のプロトコル25に基づいています。麻酔薬を手術中に赤いランプの下に置いて体温の低下を避ける。
- ケタミン/キシラジンの腹腔内注射によるマウスの麻酔薬(96 mg/kgケタミン;12.8 mg/kgキシラジン)。眼瞼反射の欠如を確認して麻酔を確認します。
- 綿棒を使用して目の保護クリームを適用します。
- 標準的な鉗子およびまっすぐな細かいはさみを使用して左腹側区域の切開(1cm)を作る。
- 腸のセグメント(5〜7cm、およそ)を外装する。
- 前腸側で電気焼灼することにより、外側に入った腸管セグメントを縦方向に開きます。
- 粘膜を露出し、すぐに生理食い溶液ですすい、便の内容を除去します。
注:必要に応じて、蠕動による動きのアーティファクトを避けるために、腸に直接キシラジンを適用します。 - 腸粘膜の表面をアクリフラビンとローダミンBデキストラン(10kDa)で染色する。
- 粘膜に滴下して滴下し、3分間インキュベートして1mg/mLアクリフラビン溶液(100 μL)を塗布します。残りの溶液をPBSで洗い流します。
- 2 mg/mL ローダミンデキストラン溶液(100 μL)を粘膜に滴下してピペット化し、3分間インキュベートします。残りの溶液をPBSで洗い流します。
注:必要に応じて、無菌綿を使用して準備から血液を除去します。
- 麻酔マウスの上に、あらかじめ温めた生理食液(37°C)ですすいでチャンバーに取り付けられたカバースライドに取り付けます。
注:開いた腸管セグメントは、カバースライド上の発光表面を下に配置されます。 - 逆顕微鏡ステージ上に調製物(麻酔用マウス)を置きます。
- 等温パッド(約37°C)で動物を覆います。
- すぐに生体内顕微鏡に進みます。
注:組織および細胞死の脱水を避けるために、手術準備を事前に温めた生理液ですすいで保管してください。
2. 生体内顕微鏡
注:手術の準備を開始する前にステップ2.1を実行し、麻酔、手術、画像取得の間の長い待ち時間を避けてください。必要に応じて、麻酔薬の追加用量は、画像実験のための麻酔下でそれらを維持するために外科的に調製された動物に与えることができる。
- CLSM顕微鏡を設置します。
- 顕微鏡ベースとスキャナーボックスをオンにして、CLSM顕微鏡を起動します。 [スタート ]ボタンを押して、コンピュータの電源を入れます。
- アイコンをダブルクリックして画像取得ソフトウェア(例えば、LAS X)を起動します。適切な構成を選択します (構成: マシン;顕微鏡: DMI6000) をクリックし 、[OK] をクリックします。
- 適切な解像度を定義します。設定に移動 |ハードウェア |解決策 |ビット深度。12 を選択します。
- 取得メニューに移動します。ドロップダウン メニューからイメージ取得モードのxyztを選択します。ドロップオフメニューから目的を選択します(20xまたは40倍)。
- 順次取得設定を設計します。 [Seq]をクリックします。追加ボタン(+)をクリックして、2番目のシーケンスを 追加 します。[ フレーム間]を選択します。
- シーケンス1(アクリフラビンの検出;416 nm励起;514 nm放出)を構成する。可視レーザーボックスの電源を入れます。PMT1 (オン) をアクティブにします。発光波長ウィンドウ(490~550 nm)を定義します。
- 構成シーケンス 2 (ローダミンB-デキストランの検出; 570 nm 励起; 590 nm, 放出).可視レーザーボックスの電源を入れます。PMT2 (オン) をアクティブにします。発光波長ウィンドウ(550-760)を定義します。
- 対応するレーザー(488および552)をアクティブにします。設定に移動 |レーザー.488および552 nmレーザーをアクティブにします(オンにします)。
- 現在の実験の特定の機能に設定を調整します。
- 光源をオンにします(電源を入れます)。調製物(チャンバー内の麻酔マウス)を顕微鏡ステージに置き、照射軸が組織調製物に焦点を合わせるまでキシポジションを変更する。
- 標準光源と接眼点を使用して、対象のフィールドを選択します。
- フィルタ キューブ (I3) を選択します。シャッターを開けろ。マクロとマイクロホイールを使用して腸粘膜の表面に焦点を当てます。XY位置を変更して、視野内で複数の絨毛を視覚化できる領域を検索します。
- ローダミンデキストラン染色もその領域に見えるようにしてください。フィルタ キューブ (N2.1) を変更します。接眼点を通して画像を確認してください。
- ソフトウェアからCLSMイメージの取得を開始します。2 つのシーケンスの設定を最適化します。
- シーケンス 1 を選択します。シーケンス1のレーザーパワー、ゲイン、オフセットを調整します。
- シーケンス 2 を選択します。シーケンス2のレーザーパワー、ゲイン、オフセットを調整します。
- z スタック範囲を定義します。
- Z スタックのドロップオフ メニューを開きます。z軸コントロールを使用して粘膜の表面に焦点を当てます。 を押します。
- 信号がまだ検出可能な下限に焦点を当てます。 終了 を押します。
- z スタックの数を定義します (10)。2 つの連続したタイム ポイントの 2 分より長い時間経過を避けます。
- 時間設定を定義します。 [時刻 ] メニューに移動します。[ 最小化]をクリックします。[ 停止するまで取得 ] を選択します。
- ライン平均を定義します。[Seq 1] を選択します。[ライン平均 2] を選択します。[Seq 2] を選択します。[ライン平均 2] を選択します。
- 対応する画像を取得します。
- フォーマット(1024 x 1024)と速度(400)を選択します。スタート を押 します。
- 目的の画像取得時間の後に [停止] を押します。
- ファイルを保存します。 プロジェクトに移動します。対応するファイルを右クリックします。 [名前を付けて保存] を押します。
- ファイルに適切な名前を付けます。適切なフォルダを選択してください。 をクリックして保存します。
- 動物を安楽死させる(子宮頸部脱臼)、必要に応じて下心分析のために組織を収集します。
3. 画像解析:細胞脱落率と腸上皮を決定する
- セルの脱落率
- 画像取得ソフトウェアを起動します。
- [プロジェクトを開く] に移動します。適切なファイルを選択します。
- 画像取得の合計時間を定義します。
- 最後に完了した z スタックを選択します。直前に選択したタイム ポイントから最後の Z 位置を選択します。画面の右下隅の時間(画像取得の合計時間)を読みます。
- バイラスを選択します。
- 適切な Z スタック位置(villus の表面が、すでにルーメンに存在する細胞や他のコンポーネントとの干渉を避けるために十分な深さ)を選択します。
- 基底膜の長さを測定します。ルーラー ツールを選択します。バイラスを数行に分割して、ヴィラスの周囲全体を覆ったり描いたりします。異なる値(基底膜の全長)を追加します。ルーラー ツールのセグメントを削除します。
- 画像取得の全期間中に発生したイベントの数をカウントします。
- ヴィラスを適切なサイズのセグメントに分割します。異なる時間ポイントを通してバーをスライドさせることによって、イベント/セグメントのシーケンスを分析します。識別されたセル・脱落イベントにコメントを付けます。
- 細胞の脱落率を示す基底膜の脱落事象/時間/長さの数を計算します。5絨毛/ビデオ、および少なくとも2つのビデオ/マウスまでカウントします。これらの10の測定値の平均を計算します。
- 漏れ
- バイラスを選択します。
- 適切な Z スタック位置(villus の表面が、すでにルーメンに存在する細胞や他のコンポーネントとの干渉を避けるために十分な深さ)を選択します。上皮細胞/絨細胞の総数を数える。
- 漏れ点の数を数える(ローダミンデキストランのパラセルラー存在。このイベントは一時的なものであり、以前の下心と下心取得した写真を確認することで確認できます)。
- 上皮細胞の漏れ/総数の数を計算します。10種類のvillus/サンプル/ビデオを分析し、漏れと透過性細胞/villusの平均数を計算します。
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Representative Results
ここで示すプロトコルは、腸内上皮漏れを可視化し、腸内の細胞脱落性能をリアルタイムで観察するための生体内顕微鏡ベースのアプローチを説明しています。簡単に言えば、マウスは麻酔を受け、小腸粘膜の表面を露出させるために外科用調製物に提出される。IPCは、アクリフラビンの局所適用によって染色されます。一方、ルダミンB-dextranは、内腔から上皮下空間への経粘膜通過を検出するためのトレーサーとして使用される。従って、外科用調製および麻酔マウスは、ペトリ皿に取り付けられたスライド上に置かれ、CLSMを用いて時間の経過とともに画像化される(図1)。取得後の解析により、上皮細胞の脱落率(細胞脱落事象数/基底膜の分/長さ)、一過性漏れ(細胞透過性)および「透過性細胞」(細胞透過性)の割合を特定の時点で計算できます。
上皮完全性の変化を誘導するために、我々は、先に説明したIEC特異的GGTase欠損条件マウスモデル(Pggt1biΔIEC マウス)を利用して、LoxP-Creシステム24を介して生成した。前に述べたように 、Pggt1biΔIEC マウス(図2A)は、小腸における組織学的損傷スコアの増加によって示されるように、重度の腸病理を発症した(図2B)。腸上皮透過性の増加は、経口投与FITC-dextran(4kDa)を用いたインビボ実験でトレーサーを介して検出することができ(図2C)、次いで、生体内顕微鏡を介して確認した(図2D-2E)。ローダミンデキストランはコントロールマウスのルミナルコンパートメントに限定されているが 、Pggt1biΔIEC マウスのIEC内でGGTase発現が廃止された際に、上皮下区画内のトレーサーを検出することができた。画像取得中に、細胞脱落事象は上皮単層から内腔に移動する細胞として同定することができ、最終的にジプ効果と呼ばれる隣接細胞間の接触によって閉じられる上皮の密封における一時的なギャップを引き起こすことができる(図3A)。これらのギャップを明確に観察することができ、制御と Pggt1biΔIEC マウスの両方で一時的な上皮漏れと呼ばれるものは、後者では高かったが(図3B,3C)。興味深いことに、我々はまた、デキストランが細胞内で検出することができる他の細胞を同定することができた、いわゆる「透過性細胞」;これらのイベントは、主に Pggt1biΔIEC マウス(図3B,3D)で発生しました。一緒に、ここで提示された生体内顕微鏡アプローチを利用して 、Pggt1biΔIEC マウスの上皮完全性の障害が、細胞脱落性能の変化および腸内のパラ細胞およびトランス細胞上皮透過性の増加につながることを決定することができた。
図1:ここでの概略的な説明は、生体内顕微鏡アプローチを提示した。 (A) フローチャート. (B) 図。 手術準備後、局所的にアクリフラビンとローダミンデキストランで染色された腸粘膜をペトリ皿に埋め込んだカバースライドに取り付け、生理食い溶液(発光表面下)で灌流を可能にする。腸粘膜は、時間の経過とともにCLSM顕微鏡を使用して画像化される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:Pggt1biΔIECマウスにおける上皮完全性の障害が腸透過性の増加をもたらす。(A)コントロールマウスに対してPggt1biΔIECにおけるIEC内のタモキシフェン誘発性廃止GGTase-1B発現を示すウェスタンブロット。(B)コントロールおよびPggt1biΔIECマウスからの小腸の組織学的スコア。(C)経口投与FITC-Dextranの経粘膜通過により測定された生体内の腸上皮透過性の定量化(4kDa)。(D) 画像取得の方向を説明する図で、ルーメンからビラス軸まで下向きにする。Z スタックからの代表的な画像。(E)本原稿に記載されているように、コントロールおよびPggt1biΔIECマウスから局所的に適用されたアクリフラビンおよびローダミンB-デキストランを用いた生体内顕微鏡の代表的な写真。データは、SEM ±平均値として表されます。* P 値≤ 0.05;P 値≤ 0.0001 です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:上皮細胞の脱落性能と、生体内顕微鏡を用いたパラ/トランスセルラー上皮透過性(A) リアルタイムでセル脱落イベントを示す代表的な写真 (白い矢印)。小屋の細胞は上皮単層から内腔に押し出される。隣接する細胞は、バリア機能の損失を避けるために一時的な漏れ(zip効果)を密封します。(B)漏れ(白矢印)と透過性腸上皮細胞(青い矢印)を示す代表的な画像。(C-D)制御およびPggt1biΔIECマウスにおける一時的な漏出(C)および透過性細胞(D)の定量化。データは、SEM ±平均値として表されます。* P 値≤ 0.05;P 値≤ 0.0001 。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
技術的には困難ですが、生体内顕微鏡ベースの方法論は、細胞流動性能など、動的な細胞プロセスをリアルタイムで可視化する独自の実験的アプローチを表しています。これまでのところ、生体内で細胞押出を可視化する代替実験的アプローチはない。このプロトコルは、腸内恒常性の維持に役割を果たす多様な細胞プロセスの記述に寄与できると考えています。
生体内顕微鏡を利用して、ここで提示される方法は、生きている動物の腸上皮細胞脱落のリアルタイム視覚化を可能にする。従って、麻酔化マウスの局所染色された腸粘膜(アクリフラビン及びローダミンB-デキストラン)は、共焦点顕微鏡を用いて単細胞分解能まで画像化される。標準的なトレーサー実験との組み合わせで、生体内の腸透過性障害の同定と、パラ細胞透過性とトランスセルラー透過性の区別を可能にする。レポーターマウスと組み合わせて、上皮細胞脱落を監視するために利用された同様のプロトコルは、押出された細胞によって残された一時的な漏出を封じるために緊密な接合部再分配を示すことができる(zip様効果)22、26。22,
上皮細胞の脱落に加えて、ここで提示される方法の修飾は、腸粘膜の表面で起こる他の非常に動的な細胞プロセスの分析に適応されてきた。例えば、抗CD31抗体によるトレーサー分子および血管染色の静脈内投与は、腸内27における内皮完全性を評価する機会を提供した。上皮を超えて、同様のアプローチが免疫細胞28、29の29腸管ホーミング特性を調べるのに用いられてきたが、同様に、腸管感染23の文脈における免疫細胞とIECとの相互作用も調べてきた。
ここに記載されているプロトコルの潜在的なアプリケーションの多くにもかかわらず、その使用にはいくつかの制限もあります。検体内の光散乱は、組織の奥深くでイメージングの取得を損なう。小腸の場合、画像取得は粘膜の表面(絨盤先端)で起こる現象に限定される。一方、腸の構造と機能は、生体内顕微鏡の性能を制限します。最適な臓器光学特性にもかかわらず、蠕動組織収縮ならびに腸絨毛の流動誘導運動は、画像取得中に焦点面に頻繁に修飾を示唆する。
ここで提示されたプロトコルでの潜在的な変更は、これらの制限のいくつかを克服するかもしれません。1光子顕微鏡や多光子顕微鏡などの代替顕微鏡技術を使用すると、サンプルの表面から最大50〜100μm下に位置する焦点面を視覚化するために、より高い浸透深度が示唆されます。しかし、これらの実験は高速かつ動的なプロセスの観察を目指すため、画像の解像度と取得時間の間の妥協点を考慮することが重要です。顕微鏡の構成および/または設定の面では、より長い波長の使用だけでなく、高い数値開口を持つ長い自由な作業距離目標の選択は、生体内イメージングのための最適化された設定を必要とします。
一緒に、適切な蛍光色素の選択と顕微鏡技術を考慮した最適な実験計画、ならびにイメージングデバイスの構成は、これらの実験から成功した結果を得るために重要なステップとして考慮されるべきである。将来の視点として、画像ベースの予測/定量化ツールの開発は、取得したデータの解釈を容易にする可能性があります。
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Disclosures
なし。
Acknowledgments
これらの結果に至る研究は、欧州連合(EU)第7回枠組みプログラム(FP7/2007-2013)のREA交付契約番号302170の下でピープルプログラム(マリー・キュリー・アクションズ)から資金を受け取っています。エアランゲン・ニュルンベルク大学の臨床研究のための学際的なセンター (IZKF) ;ドイツ研究評議会(DFG)の共同研究センターTRR241および臨床研究グループKFO257;とDFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | - |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | - |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | - | - |
| LSM microscope SP8 | Leica | - | - |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | - |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | - |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
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