Summary
Aproveitando a microscopia intravital, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real do derramamento de células epiteliais intestinais em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal topicamente manchada (acriflavina e rhodamineB-dextran) de camundongos anesthetizados é imageda até a resolução unicelular usando microscopia confocal.
Abstract
A microscopia intravital do intestino usando imagens confocal permite a observação em tempo real do derramamento de células epiteliais e vazamento de barreira em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal de camundongos anestesiados é topicamente manchada com coloração inespecífica (acriflavine) e um rastreador fluorescente (dextran rhodamine-B), montado em uma placa salina lavada e diretamente imageado usando um microscópio confocal. Esta técnica pode complementar outras técnicas não invasivas para identificar vazamento de permeabilidade intestinal, como a passagem transmucosal de rastreadores administrados oralmente. Além disso, a abordagem aqui apresentada permite a observação direta dos eventos de derramamento de células em tempo real. Em combinação com camundongos repórteres fluorescentes apropriados, esta abordagem é adequada para lançar luz em mecanismos celulares e moleculares que controlam a extrusão de células epiteliais intestinais, bem como para outros processos biológicos. Nas últimas décadas, estudos interessantes utilizando microscopia intravital contribuíram para o conhecimento sobre permeabilidade endotelial, homing intestinal de células imunes, comunicação imuno-epitelial e invasão de componentes luminosos, entre outros. Juntos, o protocolo aqui apresentado não só ajudaria a aumentar a compreensão dos mecanismos que controlam a extrusão de células epiteliais, mas também poderia ser a base para o desenvolvimento de outras abordagens a serem utilizadas como instrumentos para visualizar outros processos celulares altamente dinâmicos, mesmo em outros tecidos. Entre as limitações técnicas, as propriedades ópticas do tecido específico, bem como a configuração selecionada da tecnologia de imagem e microscópio, por sua vez, determinariam a distância de trabalho de imagem e a resolução de imagens adquiridas.
Introduction
O intestino é um órgão altamente especializado com uma função fortemente regulamentada que permite processos conflitantes, ou seja, nutrição e proteção contra substâncias luminais nocivas. Forro entre o corpo humano e o ambiente, o epitélio intestinal atua como uma barreira física e imunológica e contribui para a manutenção da homeostase mucosa no intestino1,,2. A perda de integridade epitelial e o aumento da permeabilidade da junção apertada é bem conhecido por estar associado à Doença Inflamatória Intestinal (DII)3,,4,,5,6. Alterações epiteliais são então consideradas como causas e amplificadores secundários para inflamação intestinal crônica no DII. Assim, uma melhor compreensão das alterações epiteliais precoces no intestino dos pacientes com IBD seria de imenso valor para o desenvolvimento de novas estratégias para restaurar a integridade epitelial para previsão confiável e posterior prevenção de recaídas do IBD.
O epitélio intestinal segue um processo de rotatividade complexo e bem regulado. A partir do fundo da cripta, as células epiteliais intestinais (IECs) terminantemente diferenciadas derivadas de células-tronco pluripotentes migram para cima para a ponta villus, onde células envelhecidas/danificadas são derramadas no lúmen7. O equilíbrio entre divisão e extrusão celular permite a manutenção dos números de células epiteliais intestinais, evitando a formação de lacunas e vazamentos, bem como o acúmulo de células epiteliais potencialmente levando a massas celulares e tumorigênese8,,9,,10. Apesar do papel fundamental do derramamento de células epiteliais na renovação fisiológica do epitélio intestinal, o conhecimento sobre os mecanismos moleculares que conduzem a extrusão das células na ponta villus é limitado. Assim, há a necessidade de pesquisas básicas fornecendo uma descrição precisa da sequência de eventos moleculares envolvidos no derramamento de células epiteliais.
Interações complexas entre diferentes tipos de células dentro da mucosa intestinal são fundamentais para entender os mecanismos moleculares que regulam a rotatividade epitelial e a homeostase intestinal. Assim, estudos in vivo oferecem altas vantagens sobre abordagens in vitro e ex vivo nesse contexto. Além disso, as técnicas de imagem em tempo real permitem a descrição da sequência de eventos que controlam fenômenos específicos. Nesse contexto, o estudo de processos altamente dinâmicos exige o uso de técnicas otimizadas de alta resolução para a observação direta do tecido. As técnicas de imagem intravital aparecem como ferramentas únicas e adequadas para o estudo do derramamento de células epiteliais no intestino.
O termo "microscopia intravital" refere-se a abordagens experimentais que aproveitam técnicas de imagem de alta resolução (microscopia multifotícola ou confocal) para visualizar diretamente células e tecidos em seus ambientes nativos dentro de um animal vivo11. Permite a aquisição em tempo real de informações in vivo até a resolução unicelular, e implica vantagens claras sobre métodos estáticos ou de baixa resolução. A microscopia intravital fornece informações complementares e supera algumas limitações de técnicas clássicas e/ou high-end, como artefatos devido ao processamento de tecidos. Em contrapartida, a principal limitação da microscopia intravital é que o tecido deve ser diretamente exposto ao microscópio, que na maioria dos casos requer cirurgia. Embora abordagens sofisticadas preservem a vitalidade e minimizem o impacto do tecido imageado (câmaras de dobras cutâneas e janelas de imagem)12,13, na maioria dos casos é realizada uma simples incisão cutânea para a externalização do tecido (retalhos de pele)14. Na última década, essas abordagens contribuíram com evidências fundamentais sobre processos altamente dinâmicos, antes inescrutáveis. Traduzindo, a imagem em tempo real forneceu novas percepções biológicas sobre células-tronco e leucócitos15,bem como a disseminação do câncer e a formação de metástases13,16. No contexto clínico, a endomicroscopia é atualmente explorada como ferramenta diagnóstica de câncer17 e doenças gastrointestinais, como o IBD18,19; enquanto a microscopia confocal mosaico tornou-se uma ferramenta de patologia rápida durante a cirurgia20. Juntas, a microscopia intravital tem emergido recentemente como uma ferramenta valiosa e versátil para pesquisa biomédica e futura aplicação na clínica.
A microscopia intravital está aqui implementada para visualização em tempo real de vazamento epitelial intestinal e observação de eventos de derramamento de células epiteliais. O vazamento da permeabilidade intestinal pode ser identificado por outras técnicas in vivo não invasivas, como a quantificação da administração oral de rastreadores fluorescentes no soro21. No entanto, essa técnica não permite a observação direta do desempenho de derramamento nem a segregação entre permeabilidade para-e transcelular. A combinação de experimentos de rastreador padrão e microscopia intravital representa uma abordagem adequada para: i) identificar distúrbios na permeabilidade intestinal, e ii) segregar entre permeabilidade epitelial para e transcelular. Além do derramamento de células, a microscopia intravital em combinação com a rotulagem de fluorescência in vivo permite o estudo de outros mecanismos celulares e moleculares (por exemplo, redistribuição de junção apertada durante o derramamento de células usando camundongos repórteres fluorescentes22 ou interações entre IECs e outras células dentro da mucosa intestinal23).
O método aqui apresentado representa uma adaptação da microscopia intravital para permitir a observação em tempo real da mucosa intestinal, utilizando microscopia de escaneamento a laser confocal (CLSM). Portanto, usamos camundongos eliminatórios condicionais de GGTase (Geranylgeranyltransferase) em células epiteliais intestinais (IECs) em(camundongos Pggt1biΔIEC), uma vez que sofrem de uma doença intestinal grave e aumento da permeabilidade epitelial24. São descritas a preparação cirúrgica do camundongo e a coloração da mucosa intestinal, bem como as configurações adequadas utilizadas para aquisição de imagens e análise pós-aquisição. Este protocolo poderia permitir estudos futuros contribuindo para o conhecimento atual sobre dinâmica e cinética do derramamento de células epiteliais intestinais. Além disso, o protocolo poderia servir de base para várias adaptações para estudar outros fenômenos que ocorrem na superfície da mucosa intestinal, e até mesmo em outros tecidos.
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Protocol
O seguinte protocolo foi aprovado pelas autoridades locais relevantes em Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Alemanha). Os camundongos foram alojados em condições específicas sem patógenos.
NOTA: A inibição da prenilação mediada por GGTase dentro dos IECs causa uma alteração severa da permeabilidade intestinal em camundongos Pggt1biΔIEC 24. Portanto, este modelo de mouse foi usado para demonstrar como o protocolo pode ser útil para estudar defeitos de barreira intestinal. No entanto, este protocolo poderia ser usado para o estudo de qualquer outra linha de mouse.
1. Preparação cirúrgica e coloração da mucosa intestinal do rato
NOTA: A preparação cirúrgica baseia-se nos protocolos descritos anteriormente25. Mantenha o rato anestesiado sob uma lâmpada vermelha durante a preparação cirúrgica, para evitar uma queda na temperatura corporal.
- Anesthetize o rato por injeção intraperitoneal de cetamina/xilazin (96 mg/kg de cetamina; e 12,8 mg/kg de xilazin. Verifique a anestesia verificando a falta de um reflexo das pálpebras.
- Aplique creme de proteção ocular usando um broto de algodão.
- Faça uma incisão (1 cm) na área ventral esquerda usando fórceps padrão e tesoura fina reta.
- Exteriorize um segmento do intestino (5-7 cm, aproximadamente).
- Abra o segmento intestinal exteriorizado longitudinalmente por eletrocauterização no lado antimesenteric.
- Exponha a mucosa e enxágue em breve com solução salina para remover o conteúdo fecal.
NOTA: Opcionalmente, aplique xilazin diretamente no intestino para evitar artefatos de movimento devido à peristalse. - Manche a superfície da mucosa intestinal com acriflavina e dextran rhodamina-B (10 kDa).
- Aplique a solução acriflavina de 1 mg/mL (100 μL) por pipetação gota a gota na mucosa e incubar por 3 min. Lave a solução restante com PBS.
- Aplique a solução rhodamine-dextran de 2 mg/mL (100 μL) por pipetação gota a gota na mucosa e incubar por 3 min. Lave a solução restante com PBS.
NOTA: Opcionalmente, remova o sangue da preparação usando algodão asséptico.
- Coloque o supino do rato anestesiado em um slide de cobertura montado em uma câmara enxaguada com solução salina pré-aquecida (37 °C).
NOTA: O segmento intestinal aberto é então colocado superfície luminal para baixo, no slide da tampa. - Coloque a preparação (rato anestesiado na câmara) no estágio do microscópio invertido.
- Cubra o animal com uma almofada isotérmica (aproximadamente 37 °C).
- Prossiga imediatamente para microscopia intravital.
NOTA: Mantenha a preparação cirúrgica enxaguada com solução salina pré-aquecida para evitar a desidratação do tecido e morte celular.
2. Microscopia intravital
NOTA: Realize a etapa 2.1 antes de iniciar a preparação cirúrgica, para evitar longos tempos de espera entre anestesia, cirurgia e aquisição de imagens. Se necessário, doses adicionais de anestésicos podem ser dadas a animais cirurgicamente preparados para mantê-los sob anestesia para os experimentos de imagem.
- Configure o microscópio CLSM.
- Inicie o microscópio CLSM ligando a base do microscópio e a caixa do scanner. Ligue o computador pressionando o botão Iniciar.
- Inicie o software de aquisição de imagens (por exemplo, LAS X) clicando duas vezes no ícone. Selecione a configuração apropriada (Configuração: máquina; Microscópio: DMI6000) e clique em OK.
- Defina a Resolução apropriada. Ir para Configuração | Hardware | Resolução | Profundidade de pouco. Selecione 12.
- Vá para o menu Aquisição. Selecione xyzt para o modo de aquisição de imagens no menu suspenso. Selecione o objetivo no menu suspenso (20x ou 40x).
- Projete a configuração de aquisição sequencial. Clique em Seq. Adicione uma segunda sequência, clicando no botão adicionar (+). Selecione entre quadros.
- Configure sequência 1 (detecção de acriflavine; excitação de 416 nm; emissão de 514 nm). Ligue a caixa de laser visível. Ative o PMT1 (ON). Defina a janela de comprimento de onda de emissão (490-550 nm).
- Configure sequência 2 (detecção de rhodamineB-dextran; excitação de 570 nm; 590 nm, emissão). Ligue a caixa de laser visível. Ative o PMT2 (ON). Defina a janela de comprimento de onda de emissão (550-760).
- Ative os lasers correspondentes (488 e 552). Ir para Configuração | Lasers. Ative lasers de 488 e 552 nm (ligue).
- Ajuste a configuração para as características específicas do experimento atual.
- Ligue a fonte de luz (pressione a energia). Coloque a preparação (rato anestesiado na câmara) no estágio do microscópio e altere a posição xii até que o eixo de iluminação esteja focado na preparação do tecido.
- Selecione o campo de interesse usando a fonte de luz padrão e as oculares.
- Selecione o cubo de filtro (I3). Abra o obturador. Concentre-se na superfície da mucosa intestinal usando a macro e micro-roda. Procure por uma área onde vários villi possam ser visualizados dentro do campo de visão alterando a posição XY.
- Verifique se a coloração rhodamine-dextran também é visível nessa área. Altere o cubo do filtro (N2.1). Verifique a imagem através das oculares.
- Inicie a aquisição de imagens CLSM a partir do software. Otimize as configurações para as duas sequências.
- Selecione sequência 1. Ajuste a potência do laser, ganho e deslocamento para a Sequência 1.
- Selecione sequência 2. Ajuste a potência do laser, ganho e deslocamento para a Sequência 2.
- Defina o intervalo de pilha z.
- Abra o menu de entrega de pilha Z. Concentre-se na superfície da mucosa usando o controle do eixo Z. Pressione Begin.
- Concentre-se no limite inferior onde o sinal ainda é detectável. Fim de prensa.
- Defina os números de pilhas z (10). Evite lapsos de tempo com mais de 2 minutos por dois pontos de tempo consecutivos.
- Defina as configurações de tempo. Vá para o menu Time. Clique em Minimizar. Selecione Adquirir até parar.
- Defina a média da linha. Selecione Seq 1. Selecione a linha Média 2. Selecione Seq 2. Selecione a linha Média 2.
- Adquira imagens correspondentes.
- Selecione Formato (1024 x 1024) e Velocidade (400). Pressione Start.
- Pressione Stop após o tempo de aquisição de imagem desejado.
- Salve o arquivo. Vá para o Projeto. Clique com o botão direito do mouse no arquivo correspondente. Pressione Salvar como.
- Nomeie o arquivo apropriadamente. Selecione a pasta adequada. Defesa de imprensa.
- Eutanize o animal (luxação cervical) e colete tecidos para análise ulterior, se necessário.
3. Análise de imagem: Determine a taxa de derramamento celular e o epitélio intestinal
- Taxa de derramamento de células
- Inicie o software de aquisição de imagens.
- Vá para projetos abertos. Selecione o arquivo apropriado.
- Defina o tempo total de aquisição de imagens.
- Selecione a última pilha z completa. Selecione a última posição Z do ponto de tempo selecionado anteriormente. Leia a hora no canto inferior direito da tela (tempo total de aquisição de imagens).
- Selecione um villus.
- Selecione a posição apropriada da pilha Z (superfície do villus, mas profunda o suficiente para evitar a interferência com células já derramadas e outros componentes presentes no lúmen).
- Meça o comprimento da membrana basal. Selecione a ferramenta régua. Divida o villus em várias linhas para cobrir ou desenhar todo o perímetro villus. Adicione os diferentes valores (comprimento total da membrana basal). Exclua os segmentos da ferramenta Régua.
- Conte o número de eventos ocorridos durante toda a duração da aquisição da imagem.
- Divida o villus em segmentos com um tamanho adequado. Analise a sequência de eventos/segmento deslizando a barra pelos diferentes pontos de tempo. Anote os eventos identificados de derramamento de células.
- Calcule o número de eventos de derramamento/tempo/comprimento da membrana basal, o que indica a taxa de derramamento de células. Conte até 5 villi/vídeo, e pelo menos dois vídeos/mouse. Calcule a média dessas 10 medidas.
- Vazamento
- Selecione um villus.
- Selecione a posição apropriada da pilha Z (superfície do villus, mas profunda o suficiente para evitar a interferência com células já derramadas e outros componentes presentes no lúmen). Conte o número total de células epiteliais/villus.
- Conte o número de pontos de vazamento (presença paracelular de rhodamine dextran. Este evento é transitório, o que pode ser confirmado verificando fotos anteriores e adquiridas.
- Calcule o número de vazamentos/número total de células epiteliais. Analise 10 villus/amostra/vídeo diferentes e calcule o número médio de vazamentos e células permeáveis/villus.
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Representative Results
O protocolo aqui apresentado descreve uma abordagem baseada em microscopia intravital para visualizar o vazamento epitelial intestinal e observar o desempenho de derramamento de células no intestino em tempo real. Resumidamente, os camundongos são anestesiados e submetidos à preparação cirúrgica a fim de expor a superfície da mucosa do intestino delgado. Os IECs são então manchados através da aplicação tópica de acriflavina; enquanto a rhodamina luminal B-dextran é usada como rastreadores para detectar passagem transmucosal do lúmen para o espaço sub-epitelial. Assim, a preparação cirúrgica e o camundongo anestesiado são colocados em um slide montado em uma placa de Petri e retratado ao longo do tempo usando CLSM (Figura 1). A análise pós-aquisição permite o cálculo da taxa de derramamento de células epiteliais (número de eventos de derramamento de células/minuto/comprimento da membrana basal), bem como a porcentagem de vazamento transitório (permeabilidade paracelular) e "células permeáveis" (permeabilidade transcelular) em um determinado momento.
Para induzir alterações de integridade epitelial, aproveitamos o modelo de rato condicional GGTase-deficiente anteriormente descrito pelo IEC(pggt1biΔIEC mice), gerado através do sistema LoxP-Cre24. Como descrito anteriormente, os camundongos Pggt1biΔIEC (Figura 2A) desenvolveram patologia intestinal grave, como mostrado pelo aumento do escore de dano histológico no intestino delgado(Figura 2B). O aumento da permeabilidade epitelial intestinal pode ser detectado por meio de experimentos rastreadores in vivo utilizando fitc-dextran administrado oralmente (4 kDa) (Figura 2C),e então confirmado via microscopia intravital(Figura 2D-2E). Enquanto o dextran de rhodamina é restrito ao compartimento luminal em ratos de controle, pudemos detectar o rastreador dentro do compartimento sub-epitelial após a revogação da expressão GGTase dentro de IECs em camundongos Pggt1biΔIEC. Durante a aquisição de imagens, os eventos de derramamento de células puderam ser identificados como células que saem da monocamada epitelial para o lúmen, levando a lacunas temporárias na vedação do epitélio, que são finalmente fechadas pelo contato entre as células vizinhas, o chamado efeito zip(Figura 3A). Pudemos observar claramente essas lacunas, o que chamamos de vazamento epitelial temporário tanto no controle quanto em camundongos Pggt1biΔIEC, embora a frequência desse fenômeno tenha sido maior no último(Figura 3B,3C). Curiosamente, também poderíamos identificar outras células onde o dextran poderia ser detectado intracelularmente, as chamadas "células permeáveis"; esses eventos ocorreram principalmente em camundongos Pggt1biΔIEC (Figura 3B,3D). Juntos, aproveitando a abordagem de microscopia intravital aqui apresentada, pudemos determinar que a integridade epitelial prejudicada em camundongos Pggt1biΔIEC leva a alterações de desempenho de derramamento de células e aumento da permeabilidade epitelial para e transcelular no intestino.
Figura 1: Descrição esquemática da abordagem de microscopia intravital aqui apresentada. (A) Gráfico de fluxo. (B) Diagrama. Após a preparação cirúrgica, a mucosa intestinal manchada topicamente com acriflavina e dextran de rhodamina é montada em um slide de cobertura embutido em uma placa de Petri para permitir a perfusão com uma solução salina (superfície luminal para baixo). A mucosa intestinal é então imagem usando um microscópio CLSM ao longo do tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Integridade epitelial prejudicada em camundongos Pggt1biΔIEC levando ao aumento da permeabilidade intestinal. (A) Mancha ocidental mostrando expressão GGTase-1B abolida induzida por tamoxifen dentro de IECs em Pggt1biΔIEC versus ratos de controle. (B) Pontuação histológica do intestino delgado a partir do controle e camundongos Pggt1biΔIEC. (C) Quantificação da permeabilidade epitelial intestinal in vivo medida pela passagem transmucosal do FITC-Dextran administrado oralmente (4 kDa). (D) Diagrama descrevendo a direção da aquisição de imagem, do lúmen para baixo até o eixo villus. Fotos representativas de uma pilha de z. (E) Imagens representativas da microscopia intravital utilizando acriflavina e rhodamina B-dextran aplicou topicamente do controle e camundongos Pggt1biΔIEC, conforme descrito neste manuscrito. Os dados são expressos como Teste T ± Sem. Não emparelhado. * Valor P ≤ 0,05; Valor P ≤ 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Desempenho de derramamento de células epiteliais e permeabilidade epitelial para/transcelular utilizando microscopia intravital. (A) Fotos representativas mostrando um evento de derramamento de celular em tempo real (seta branca). A célula do galpão é extrudida da monocamada epitelial para o lúmen. As células vizinhas selam o vazamento temporário (efeito zip) para evitar a perda da função da barreira. (B) Imagem representativa mostrando vazamento (setas brancas) e células epiteliais intestinais permeáveis (setas azuis). (C-D) Quantificação de vazamento temporário (C) e células permeáveis(D) no controle e camundongos Pggt1biΔIEC. Os dados são expressos como Teste T ± Sem. Não emparelhado. * Valor P ≤ 0,05; valor ≤ 0,0001 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Embora tecnicamente desafiadora, a metodologia baseada em microscopia intravital representa uma abordagem experimental única para visualizar o processo celular altamente dinâmico em tempo real, como o desempenho de derramamento de células. Até agora, não há uma abordagem experimental alternativa para visualizar a extrusão celular in vivo. Acreditamos que este protocolo pode contribuir para a descrição de diversos processos celulares desempenhando um papel na manutenção da homeostase intestinal.
Aproveitando a microscopia intravital, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real do derramamento de células epiteliais intestinais em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal topicamente manchada (acriflavine e rhodamina B-dextran) de camundongos anesthetizados é imageada até a resolução unicelular usando microscopia confocal. Em combinação com experimentos de rastreador padrão, permite a identificação de distúrbios de permeabilidade intestinal in vivo e a distinção entre permeabilidade para-e transcelular. Em combinação com ratos repórteres, protocolos semelhantes explorados para monitorar o derramamento de células epiteliais poderiam mostrar uma redistribuição de junção apertada para selar o vazamento transitório deixado pelas células extrudadas (efeito zip-like)22,26.
Além do derramamento de células epiteliais, as modificações no método aqui apresentado foram adaptadas à análise de outros processos celulares altamente dinâmicos que ocorrem na superfície da mucosa intestinal. Por exemplo, a administração intravenosa de moléculas de rastreadores e a coloração dos vasos sanguíneos com anticorpos anti-CD31 proporcionou a oportunidade de avaliar a integridade endotelial no intestino27. Além do epitélio, abordagens semelhantes têm sido utilizadas para investigar propriedades de homing intestinal das células imunes28,29, bem como interação entre células imunes e IECs no contexto da infecção intestinal23.
Apesar da infinidade de aplicações potenciais do protocolo aqui descrito, também existem algumas limitações para seu uso. A dispersão de luz dentro da amostra prejudica a aquisição de imagens no interior do tecido. No caso do intestino delgado, a aquisição da imagem limita-se a fenômenos que ocorrem na superfície da mucosa (ponta villus). Por outro lado, a estrutura e a função do próprio intestino limitam o desempenho da microscopia intravital. Apesar das propriedades ópticas ideais do órgão, a contração do tecido peristáltico, bem como o movimento induzido pelo fluxo do villi intestinal implicam modificações frequentes no plano de foco durante a aquisição da imagem.
Possíveis modificações no protocolo aqui apresentado podem superar algumas dessas limitações. O uso de técnicas alternativas de microscopia, como microscopia de um fóton ou multifotono, implica maior profundidade de penetração para visualizar planos focais localizados até 50-100 μm abaixo da superfície da amostra. No entanto, é importante considerar o compromisso entre resolução de imagem e tempo de aquisição, uma vez que esses experimentos visam a observação de processos rápidos e dinâmicos. Em termos de configuração de microscópio e/ou configurações, o uso de comprimentos de onda mais longos, bem como a seleção de objetivos de longa distância de trabalho livre com alta abertura numérica implicam configurações otimizadas para imagens intravitais.
Juntos, o design experimental ideal levando em conta a seleção de corantes fluorescentes apropriados e a técnica de microscopia, bem como a configuração do dispositivo de imagem devem ser considerados como passos-chave para obter um resultado bem-sucedido desses experimentos. Como perspectiva futura, o desenvolvimento de ferramentas de predição/quantificação baseadas em imagem pode facilitar a interpretação dos dados adquiridos.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
A pesquisa que levou a esses resultados recebeu financiamento do Programa Pessoas (Ações Marie Curie) sob o acordo de subvenção DA REA nº 302170 do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013); o Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica (IZKF) da Universidade Erlangen-Nuremberg; o Centro de Pesquisa Colaborativa TRR241 e o Grupo de Pesquisa Clínica KFO257 do Conselho Alemão de Pesquisa (DFG); e o DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | - |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | - |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | - | - |
| LSM microscope SP8 | Leica | - | - |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | - |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | - |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
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