Summary
Este protocolo descreve um método para montar larvas drosophila para alcançar mais de 10 h de imagens ininterruptas de lapso de tempo em animais vivos intactos. Este método pode ser usado para visualizar muitos processos biológicos próximos à parede do corpo larval.
Abstract
Imagens vivas são uma abordagem valiosa para investigar questões de biologia celular. A larva Drosophila é particularmente adequada para imagens ao vivo ao vivo porque a parede do corpo larval e a maioria dos órgãos internos são transparentes. No entanto, imagens contínuas ao vivo de larvas Drosophila intactas por mais de 30 min têm sido desafiadoras porque é difícil imobilizar larvas não invasivamente imobilizadas por muito tempo. Aqui apresentamos um método de montagem larval chamado LarvaSPA que permite imagens contínuas de larvas Drosophila vivas com alta resolução temporal e espacial por mais de 10 horas. Este método envolve anexar parcialmente larvas ao deslizamento de cobertura usando uma cola uv-reativa e também restringir o movimento larval usando um bloco de polidimetilsiloxano (PDMS). Este método é compatível com larvas em estágios de desenvolvimento de segunda instar a terceira instar vagando. Demonstramos aplicações desse método no estudo de processos dinâmicos de neurônios somatosensoriais Drosophila, incluindo crescimento dendrito e degeneração induzida por lesões. Este método também pode ser aplicado para estudar muitos outros processos celulares que acontecem perto da parede corporal larval.
Introduction
A imagem ao vivo por lapso de tempo é um método poderoso para estudar processos celulares dinâmicos. As informações espaciais e temporais fornecidas por filmes de lapso de tempo podem revelar detalhes importantes para responder a perguntas de biologia celular. A larva Drosophila tem sido um modelo popular in vivo para investigações usando imagens vivas porque sua parede corporal transparente permite imagens não invasivas de estruturas internas1,2. Além disso, inúmeras ferramentas genéticas estão disponíveis em Drosophila para rotular fluorescentemente estruturas anatômicas e macromoléculas3. No entanto, a imagem de lapso de tempo de longo prazo das larvas de Drosophila é desafiadora. Ao contrário dos embriões estacionários ou pupas, as larvas de Drosophila se movem constantemente, necessitando de imobilização para imagens vivas. Formas eficazes de imobilizar larvas drosophila vivas incluem montagem em óleo de halcarbono com clorofórmio4,anestesia usando solução isoflurano ou Dichlorvos5, e comprimindo entre o deslizamento de cobertura e o deslizamento de microscópio6. Embora alguns desses métodos tenham sido usados para microscopia, nenhum deles é eficaz para imagens ao vivo de longo prazo. Outros métodos foram desenvolvidos para imagens de neurônios da parede corporal em larvas rastejantes usando microscopia confocal convencional ou microscopia de folha de luz7,8,9. No entanto, esses métodos não são ideais para monitorar a dinâmica celular devido ao movimento das larvas.
Novos métodos foram desenvolvidos para alcançar imagens de lapso de tempo de longo prazo de larvas drosophila. Usando um "chip larva" de polidimetiletilsiloxano (PDMS), as larvas de Drosophila podem ser efetivamente imobilizadas através da sucção gerada pelo vácuo em uma microcâmara especializada sem anestesia. No entanto, este método não oferece alta resolução temporal para estudos de biologia celular e possui limitações estritas no tamanhoanimal 10. Outro método utilizando um dispositivo de anestesia alcançou imagens vivas de larvas de Drosophila em vários pontos de tempo e foi aplicado para estudar junções neuromusculares11,12,13,14,15,16. No entanto, este método também não permite imagens contínuas por mais de 30 min e requer o uso de desflurane repetidamente, o que pode inibir a atividade neural e afetar o processo biológico estudado17,18. Recentemente, um novo método que combina dispositivo microfluido e crioanesteria tem sido usado para imobilizar larvas de vários tamanhos por curtos períodos de tempo (minutos)19. No entanto, este método requer dispositivos especializados, como um sistema de resfriamento e períodos mais longos de imobilização, requerem resfriamento repetido das larvas.
Aqui apresentamos um método versátil de imobilizar larvas drosophila que é compatível com imagens ininterruptas de lapso de tempo por mais de 10 h. Este método, que chamamos de "Estabilização de Larvas por Anexo Parcial" (LarvaSPA), envolve a adesão da cutícula larval a um deslizamento de cobertura para imagem em uma câmara de imagem personalizada. Este protocolo descreve como fazer a câmara de imagem e como montar larvas em uma variedade de estágios de desenvolvimento. No método LarvaSPA, os segmentos do corpo desejado são afixados ao deslizamento de cobertura usando uma cola reativa UV. Um cuboide PDMS adicionalmente aplica pressão às larvas, impedindo a fuga. O ar e a umidade na câmara de imagens garantem a sobrevivência das larvas parcialmente imobilizadas durante a imagem. As vantagens do LarvaSPA sobre outras técnicas incluem o seguinte: (1) É o primeiro método que permite imagens contínuas ao vivo de larvas Drosophila intactas por horas com alta resolução temporal e espacial; (2) O método tem menos limitações no tamanho larval; (3) Os cuboides da câmara de imagem e do PDMS podem ser fabricados a um custo mínimo e são reutilizáveis.
Além de descrever o método de montagem larval, fornecemos vários exemplos de sua aplicação para estudar desenvolvimento dendrito e degeneração dendrite de neurônios de arborização dendríticas drosophila (da).
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Protocol
1. Fazendo a câmara de imagem
- A estrutura metálica pode ser construída a partir de um bloco de alumínio em uma loja de máquinas típica. As especificações do quadro são ilustradas na Figura 1A.
- Para construir a câmara de imagem, veda a parte inferior da estrutura metálica usando um deslizamento de cobertura longo (22 mm x 50 mm) e cola UV(Figura 1A). Cure a cola UV usando uma lâmpada UV portátil.
2. Fazendo cuboides PDMS
- Prepare o molde para cuboides PDMS.
- Conecte camadas de fita de embalagem à superfície interna de uma placa de petri retangular (80 mm x 55 mm) placa de petri ou placa de cultura celular redonda. Use uma camada (0,063 mm de espessura) para segunda larvas instar, 2 camadas (0,126 mm de espessura) para larvas de terceira instar precoce, ou três camadas (0,189 mm de espessura) para larvas de terceira instar(Figura 1B).
- Corte a fita em tiras de largura específica com uma lâmina de barbear: 1,5 mm para a fita de 1 camada e 2 mm para fita de 2 camadas ou 3 camadas. A largura e espessura da tira determinarão o tamanho das larvas que o cuboide PDMS final pode conter. Deixe pelo menos um espaço de 5 mm entre as duas tiras. Remova as camadas de fita que cobrem o espaço(Figura 1B).
- Remova a poeira da superfície interna da placa usando fita adesiva. O molde está pronto para uso.
- Prepare o mix PDMS.
- Misture 7 g de base PDMS e 0,7 g de agente de cura (proporção 10:1) completamente em um recipiente pequeno.
- Coloque o recipiente em um dessecador a vácuo por pelo menos 15 min para remover o ar da mistura.
- Despeje lentamente cerca de 5,5 g de mistura pdms no molde para atingir uma espessura de 1-2 mm (Figura 1B).
- Coloque a mistura PDMS no dessecador a vácuo novamente por pelo menos 15 minutos para remover bolhas de ar restantes da mistura. Quebre as últimas bolhas com uma ponta de pipette.
- Cure o PDMS em uma superfície plana em uma incubadora de calor a 65 °C por 2 h.
- Use uma lâmina de barbear para soltar o PDMS curado ao longo da borda do molde e desatura-a do molde. Armazene o PDMS entre duas peças de fita adesiva grande à temperatura ambiente.
- Para larvas de terceira instar precoce e tardia, corte o PDMS em cuboides de 8 mm x 2 mm x 1 mm (ao longo das linhas pontilhadas na Figura 1B) posicionando o sulco criado pela tira de fita (passo 2.1.2) no centro do lado longo do cuboide (Figura 1B,C). Para segunda larvas instar, corte o cuboide para 8 mm x 1 mm x 1 mm.
3. Larvas de montagem para imagens de lapso de tempo a longo prazo
- Prepare o deslizamento de cobertura superior para montagem.
- Escolha seis cuboides PDMS com ranhuras que correspondam aos tamanhos das larvas. Siga o ritmo e o tamanho recomendados de PDMS com base nas etapas 2.1.1, 2.1.2 e 2.2.7.
- Remova a poeira da superfície do PDMS com fita adesiva.
- Conecte quatro peças de fita dupla (12 mm x 5 mm) em um longo deslizamento de cobertura (22 mm x 50 mm) para fixar cuboides PDMS mais tarde. Os espaços entre as duas peças de fita dupla face devem ser os mesmos da largura do sulco PDMS.
- Aplique uma pequena gota (~1,2 μL) de cola UV no sulco de cada cuboide PDMS e adicione seis pequenas gotas de cola UV no espaço entre a fita de dois lados no tampado.
- Prepare as larvas para montagem.
- Usando um par de fórceps, limpe as larvas na água para remover alimentos da superfície do corpo.
- Coloque larvas limpas em um pequeno pedaço de papel tecido umedecido em uma pequena (35 mm) placa de petri sem tampa. Coloque a pequena placa de Petri em uma grande (60 mm) placa de petri contendo um pedaço de papel de tecido seco. Em uma capa química, aplique 8-12 gotas (160-240 μL) de isoflurano no papel de tecido seco usando uma pipeta de transferência de plástico e feche a tampa da grande placa de Petri.
- Espere de 2 a 3 min enquanto monitora as larvas. Tire as larvas da grande placa de Petri quando seus ganchos de boca pararem de se mover.
- Monte os animais.
- Para estruturas de imagem no lado dorsal do animal, coloque as larvas imobilizadas na cola UV entre a fita de dois lados no deslizamento de cobertura com a cutícula dorsal voltada para o deslizamento de cobertura.
- Cubra cada larva com um bloco PDMS e encaixe o tronco da larva no sulco do PDMS. Deixe a cabeça e a cauda da larva fora do sulco PDMS. Evite bloquear os spiracles da larva pela cola.
- Pressione para baixo nas extremidades do bloco PDMS na fita dupla lateral sem aplicar força no sulco. Puxe suavemente a cauda da larva para achatar a cutícula o PDMS.
- Cure a cola UV por 4 min usando uma lâmpada UV portátil na configuração alta (a cerca de 0,07 mW/mm2).
ATENÇÃO: Proteja os olhos com óculos de segurança enquanto usa a lâmpada UV. - Vire o deslizamento de cobertura de cabeça para baixo e repita o passo 3.3.4.
- Umedecer um pequeno pedaço de papel de lente (15 mm x 30 mm) com 20 μL-30 μL de água. Coloque o papel de lente umedecido na parte inferior da câmara de imagem (Figura 1A,D).
- Coloque o deslizamento de cobertura na câmara para que as larvas estejam voltadas para o interior da câmara. Adere ambas as extremidades do deslizamento de cobertura à superfície metálica usando cola UV(Figura 1A,D). O lado dorsal das larvas está pronto para imagens microscópio confocal (Figura 1E).
4. Imagem
- Larvas de imagem com um microscópio apropriado. Todos os resultados apresentados neste protocolo (Figura 2, Figura 3,Vídeo S2, Vídeo S3e Vídeo S4) foram adquiridos utilizando um sistema confocal com um objetivo de óleo de 40x (1,30 NA).
5. Recuperação de câmara de imagem e cuboides PDMS
- Após a imagem, remova o óleo no deslizamento de cobertura superior usando um papel de lente. Desaque o tampamento superior da estrutura metálica cortando o espaço entre o tampado e a estrutura metálica com uma lâmina de barbear. A câmara de imagens está pronta para reutilização.
- Desative os cuboides PDMS do tampamento superior com fórceps. Enrole os cuboides PDMS em fita adesiva para remover resíduos de cola e poeira. Os cuboides PDMS estão prontos para reutilização.
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Representative Results
A câmara de imagem larva é construída colando uma estrutura metálica feita medida e dois coverslips juntos. O design da estrutura metálica é especificado na Figura 1A. Larvas de drosophila dentro da câmara são aderidas ao deslizamento de cobertura superior com o auxílio de cola UV e cuboides PDMS. O sulco no cuboide PDMS e a fita dupla lateral o cuboide é anexado para criar o espaço para segurar as larvas(Figura 1B,C). O PDMS também aplica pressão suave para achatar a parede do corpo larval e restringir fisicamente o movimento larval. Por fim, um pequeno pedaço de papel de lente molhada é colocado na parte inferior da câmara para fornecer umidade. Esta configuração pode imobilizar larvas drosophila por mais de 10 h para imagens contínuas. A maioria dos animais está vivo após 10h e pode ser recuperada para crescer no estágio pupal. A câmara de imagens pode acomodar até nove larvas ao mesmo tempo. A Figura 1D mostra seis larvas instar montadas na câmara. Os troncos das larvas são fixados enquanto suas cabeças e caudas estão livres para se mover (Figura 1E e Vídeo S1). Este método tem sido usado com sucesso para visualizar a segunda instar para vagar em terceira larvas instar com imagens contínuas de alta resolução por até 15 h. A câmara foi projetada para imagens usando microscópios eretos, mas a configuração também funciona para microscópios invertidos simplesmente virando a câmara.
Aqui demonstramos a aplicação da LarvaSPA no estudo da dinâmica dendrite neuronal e degeneração dendrite utilizando neurônios classe IV da (C4 da) como modelo (Figura 2, Figura 3, Vídeos S2-S4). C4 da neurons são nociceptores somatosensoriais localizados na parede do corpo larval, cujos dendritos inervam a epidermelarval1,20,21,22. C4 da dendrites apresentam comportamentos de crescimento altamente dinâmicos durante todo o desenvolvimento larval, resultando em cobertura completa da superfície corporal ou preenchimento espacial23. C4 da neurons também foram usados com sucesso para estudar degeneração e regeneração após lesão física24,25,26,27.
Para a dinâmica de dendrito de imagem, larvas que variam de 48 h após a colocação de ovos (AEL) na segunda instar a 120 h AEL na terceira instar errante foram montadas na câmara de imagem para imagens de lapso de tempo usando microscopia confocal de varredura de ponto. Filmes de lapso de tempo foram feitos com um intervalo de 3 minutos para capturar comportamentos de crescimento de C4 da dendrites rotulados por ppk-CD4-tdTom ou UAS-CD4-tdTom impulsionado sem ppk-Gal46. Durante todo o período de imagem (até 12h), os ramos dendritos de alta ordem de C4 da neurons apresentaram comportamentos complexos de crescimento, incluindo extensão, retração, formação de galhos e eliminação de galhos(Figura 2A-2F),indicando a saúde dos neurônios. Nossos filmes também capturaram repulsões homotípicas dendro-dendrite em que dicas dendrite se retiraram após entrar em contato com outros dendritos(Figura 2F). No geral, esses resultados demonstram que a imagem em lapso de tempo usando larvaSPA é eficaz para estudar o neurodesenvolvimento.
Para imaginar a degeneração dendrite, usamos um laser MaiTai para cortar dendritos primários perto de C4 da célula neuronal. As larvas foram recuperadas e montadas na câmara para imagens a partir de 1,5 h após lesão(IA)( Figura 3, Vídeo S4). Os filmes gravaram eventos-chave durante a degeneração dendrite, incluindo inchaço dendrito, fragmentação dendrite e liberação de detritos dendritos. No mesmo experimento, o corpo de gordura larval também foi projetado para segregar o Annexin V-GFP (AV-GFP), um sensor que rotula fosfatidylserina externa (PS) na superfície celular27. Observamos rotulagem específica dos dendritos degenerados pela AV-GFP (Figura 3),sugerindo que o PS foi exposto na superfície de dendritos degenerados para servir como sinal de eat-me para liberação subsequente por fagocitose27.
Figura 1: A câmara de imagem para montagem larvaSPA. (A)Diagramas da câmara de imagem com especificações detalhadas, mostrando tanto a vista superior quanto a vista lateral. O sombreamento azul claro na vista superior indica o papel de lente umedecida. A câmara é selada por um deslizamento de cobertura superior e um deslizamento de cobertura inferior. A posição de uma larva montada é ilustrada. (B) Diagramas do molde PDMS (a vista superior) e o molde após o recheio com a mistura PDMS (vista lateral). Tiras em cinza indicam duas camadas, duas camadas e duas tiras de fita de 3 camadas, respectivamente. O sombreamento amarelo na vista lateral indica a mistura PDMS no molde. As linhas pontilhadas indicam onde cortar o PDMS curado. A visão lateral do diagrama não é atraída para a escala. (C) Fotografias mostrando uma vista superior e uma vista lateral de um cuboide PDMS. Barra de escala = 1 mm.(D) Fotografias mostrando uma câmara de imagem antes da montagem, e uma câmara de imagem com seis larvas imobilizadas no final da terceira instar Drosophila montada sodora para cima. Barra de escala = 10 mm.(E) Uma visão mais próxima de uma larva em(D). Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Imagem de lapso de tempo da dinâmica dendrite. (A-F) Selecionados quadros de filmes de lapso de tempo de dendritos de neurônios classe IV em pontos de ponto específicos após o início da imagem. Imagens das larvas foram tiradas 48h AEL (A e F), 72 h AEL(B),96 h AEL(C)e 120 h AEL (D). Os neurônios são rotulados por ppk>CD4-tdTom (A, D, Ee F) ou ppk >CD4-tdTom (B e C). As setas azuis indicam retrações dendritos em comparação com o ponto de tempo anterior. As setas amarelas indicam extensões dendritos em comparação com o ponto de tempo anterior. (E)Morfologia dendrite no final de 12h de imagem. (F) Quadros consecutivos com intervalos de 3 min em um filme ilustrando como um ramo dendrito em uma segunda larva instar se estendia (flechas amarelas) e posteriormente se retratou (setas azuis) depois que fez contato com outro dendrito. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Imagem de lapso de tempo de degeneração dendrite e exposição de um sinal de comer-me. Quadros selecionados de um filme de lapso de tempo de dendritos degeneração de um neurônio iv classe após lesão laser. Os dendritos foram rotulados por ppk>CD4-tdTom. O sinal de eat-me PS sobre denrites degeneração foi detectado pelo Annexin-GFP (AV-GFP), que é secretado pelo corpo gordo. As setas amarelas apontam para os ramos que mostram rotulagem AV-GFP. Flechas azuis apontam para dendritos submetidos à fragmentação. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Vídeo S1: Uma terceira larva instar é imobilizada no entalhe de um cuboide PDMS. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito de baixar.)
Vídeo S2: Dendritos estendem e se retraím dinamicamente em uma segunda larva instar. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito de baixar.)
Vídeo S3: Dendritos estendem e se retraím dinamicamente em uma terceira larva instar errante. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito de baixar.)
Vídeo S4: Dendritos degeneram e expõem fosfatidylserina após lesão laser em uma terceira larva instar. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito de baixar.)
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Discussion
Aqui descrevemos larvaspa, um método versátil de montagem larvas drosophila vivas para imagens de lapso de tempo a longo prazo. Este método não requer recuperação ou remontagem de larvas, permitindo imagens ininterruptas. Por isso, é ideal para acompanhar processos biológicos que levam horas para serem concluídos, como degeneração e regeneração. Este método também pode ser usado para imagens de dinâmica scalcicelular e eventos subcelulares, como o crescimento de microtúbulos. Como a parede do corpo larval é estável durante a imagem, a resolução espacial e temporal pode ser ajustada para encaixar a aplicação de imagem à mão (por exemplo, para rastrear o movimento rápido do vesículo subcelular ou para monitorar mudanças globais lentas dos padrões do ramo neuronal). Além disso, este método é compatível com larvas em várias etapas de desenvolvimento e não requer equipamentos especiais. Assim, o LarvaSPA pode potencialmente ser usado por muitos laboratórios drosophila para abordar diversas questões.
Fatores que afetam o sucesso do método, incluindo a natureza do cuboide PDMS e o estágio de desenvolvimento das larvas
O tamanho do cuboide PDMS e a profundidade do sulco precisam corresponder ao tamanho das larvas. Um cuboide PDMS muito largo para as larvas pode cobrir a cabeça e a cauda e causar hipóxia. No entanto, um cuboide PDMS estreito pode não ser eficaz para evitar que as larvas se movam. Um sulco muito profundo da mesma forma não geraria pressão suficiente para conter o movimento das larvas. Um sulco muito raso não seguraria cola suficiente para aderir às larvas ao deslizamento de cobertura. Com base em nossa experiência, as seguintes dimensões do PDMS e do sulco são recomendadas para vários estágios de larvas: 8 mm x 1 mm x 1 mm Cuboides PDMS com 1,5 mm x 1 mm x 0,063 mm para segunda larva instar (~48 h AEL); Cuboides PDMS de 8 mm x 2 mm x 1 mm com 2 mm x 2 mm x 0,126 mm para as larvas iniciais da terceira instar (~72 h AEL); Cuboides PDMS de 8 mm x 2 mm x 1 mm com 2 mm x 2 mm x 0,189 mm para larvas de terceira estrela (~96 h AEL ou mais velhos).
Larvas de terceira instar errantes (com ou mais de 120 h AEL) se movem menos em comparação com as mais jovens e requerem menos umidade para sobreviver uma vez montadas na câmara. Eles também têm uma cutícula mais grossa e podem suportar mais estresse físico. Portanto, experimentos usando larvas errantes de terceiros instar têm a maior taxa de sucesso. Em nossas mãos, mais de 80% das larvas de terceira estrela sobreviveram e permaneceram imóveis 12 h após a montagem. Para evitar que larvas se prevaletem durante a imagem, recomendamos a montagem das larvas entre 96 h e 120 h AEL. As larvas mais jovens do terceiro instar têm maior chance de escapar ou morrer durante a imagem. Normalmente, pelo menos 2 das 6 jovens larvas de terceira estrela montadas na mesma câmara sobreviveriam e permaneceriam imóveis 10 h após a montagem. Nossa experiência com larvas de segunda estrela é limitada e a taxa de sobrevivência é difícil de estimar. No entanto, temos imagens com sucesso de larvas instar por 7h usando este método.
Preocupações potenciais de imagem de longo prazo
Embora o LarvaSPA tenha sido muito útil para a dinâmica de crescimento dendrito de imagem e degeneração, existem algumas ressalvas potenciais a considerar. Primeiro, em nosso método atual, as larvas são privadas de alimentos durante toda a duração da imagem, o que pode levar a respostas induzidas pela fome em muitos tecidos. Observamos a formação de estruturas granulares em células epidérmicas em torno de 10h após a montagem, o que pode resultar da autofagia. Portanto, os resultados obtidos nas primeiras horas de imagem devem ser mais fisiologicamente relevantes. Os resultados em escalas de tempo mais longas requerem uma interpretação mais cautelosa. Para minimizar essa preocupação, nosso procedimento poderia potencialmente ser adaptado para permitir a alimentação larval. Em segundo lugar, nosso método pode interferir no rápido crescimento das larvas mais jovens devido à restrição física e à falta de ingestão de nutrientes. No entanto, essa preocupação pode não se aplicar a animais mais velhos. Por exemplo, a terceira larva errante pode se transformar em pupas mesmo após 12h de imagem contínua, tornando este método ideal para investigações de metamorfose precoce. Em terceiro lugar, a imagem de estruturas mais profundas, como o corpo gordo e o intestino, apresenta alguns desafios. Uma das principais razões é que tecidos mais profundos muitas vezes se movem durante a imagem e, portanto, requerem correção de movimento no pós-processamento. Além disso, incompatibilidades de índices refrativos no caminho da luz podem causar aberração esférica ao fotografar tecidos mais profundos. Embora os objetivos do óleo sejam apropriados para a imagem dos neurônios porque seus dendritos estão a 15 μm da superfície corporal, os objetivos de imersão da água podem ser melhores escolhas para corrigir incompatibilidades de índice refrativo para imagens mais profundas dentro das larvas. Em quarto lugar, porque os neurônios C4 da podem ser ativados pela luz UV28,usando luz UV durante a montagem larval pode potencialmente alterar fisiologia do neurônio C4 da. Embora a intensidade de luz que recomendamos esteja muito abaixo dos níveis que ativam robustamente os neurônios C4da28,os resultados relacionados à atividade neuronal C4da precisam ser interpretados com cautela. A cola UV tem sido usada para a imagem de uma grande variedade de amostras biológicas29,30,31 e não causa toxicidade óbvia às larvas em nossas mãos. Por fim, deve-se considerar a configuração adequada do microscópio para imagens ao vivo ao vivo. Por exemplo, scanners de ressonância e microscópios confocais de disco giratório são melhores opções para imagens ao vivo de longo prazo, porque causam menos fototoxicidade e fotobranqueamento; microscopia multifófona é mais eficaz para imagens de estruturas internas mais profundas nas larvas; A imagem a longo prazo pode ser propensa a amostrar ou foco à deriva, que poderia potencialmente ser corrigida pelo processamento pós-imagem.
As causas mais comuns de falha para larvaSPA e as soluções recomendadas para enfrentá-los
- Larvas se movem demais ou escapam: Duas razões comuns podem contribuir para esse problema. A primeira é que o sulco PDMS pode ser muito raso ou muito profundo para as larvas. Tentar outro cuboide PDMS com uma profundidade de sulco diferente pode resolver o problema. A segunda razão é que há muita umidade na câmara, enfraquecendo a cola UV. Reduzir o volume de água adicionado ao papel de lente na câmara pode ajudar a imobilizar as larvas. Além disso, tente visualizar apenas os segmentos cobertos pelo cuboide PDMS, pois a cabeça e a cauda são livres para se mover.
- Larvas morrem durante a imagem: Se uma larva morre logo após a imagem, é provável que tenha sido exposta a muito anestésico. Larvas anestesiadas adequadamente devem acordar após a montagem e mostrar movimentos incluindo extensão do gancho bucal e retração e contração do vaso dorsal. Para resolver esse problema, menos isoflurano poderia ser usado para anestesiar larvas. Transfira uma larva para fora da antena de anestesia Petri imediatamente após o gancho bucal parar de se mover. Se a larva morre cerca de uma hora após a imagem, geralmente é por causa da desidratação. Lembre-se de colocar um pedaço de papel de lente umedecido na câmara de imagem antes de selar. Outra razão comum de letalidade é que a cola UV bloqueia os spiracles. Tente limitar a cola UV aos segmentos médios da larva e evite cobrir a cabeça e a cauda. Um cuboide PDMS excessivamente largo também pode facilmente fazer com que a cola UV bloqueie os spiracles.
- Dobras na parede do corpo interferem na imagem: Para evitar gerar dobras durante a montagem, é importante imobilizar totalmente as larvas durante a etapa de anestesia. Quando uma larva fica paralisada, é mais fácil endireitar e esticar o corpo. Para animais com mais de 96 h AEL, arrastar suavemente as caudas antes de curar a cola UV pode efetivamente reduzir a formação de dobras. Arrastar as caudas de larvas jovens não é recomendado porque suas paredes corporais são frágeis.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos a Lingfeng Tang por estabelecer uma versão anterior do método LarvaSPA; Glenn Swan na loja Cornell Olin Hall Machine para fazer protótipos anteriores da câmara de imagem; Philipp Isermann para a construção de esquadrias metálicas e sugestões sobre a fabricação de cuboides PDMS; Instalação de imagem cornell BRC para acesso a microscópios (financiada pelo NIH grant S10OD018516); Maria Sapar para leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma Bolsa Cornell concedida a H.J.; um fundo inicial de Cornell e subvenções nih (R01NS099125 e R21OD023824) concedidos a C.H. H.J. e C.H. conceberam o projeto e projetaram os experimentos. H.J. conduziu os experimentos. H.J e C.H. escreveram o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
References
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