Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Montage von Drosophila-Larven, um länger als 10 h ununterbrochene Zeitraffer-Bildgebung bei intakten lebenden Tieren zu erreichen. Diese Methode kann verwendet werden, um viele biologische Prozesse in der Nähe der Larvenkörperwand abzubilden.
Abstract
Live Imaging ist ein wertvoller Ansatz zur Untersuchung zellbiologischer Fragen. Die Drosophila Larve eignet sich besonders für in vivo Live-Bildgebung, da die Larvenkörperwand und die meisten inneren Organe transparent sind. Die kontinuierliche Live-Bildgebung intakter Drosophila-Larven über 30 min war jedoch eine Herausforderung, da es schwierig ist, Larven lange Zeit nicht invasiv zu immobilisieren. Hier präsentieren wir eine Larvenmontagemethode namens LarvaSPA, die eine kontinuierliche Bildgebung von lebenden Drosophila-Larven mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung für länger als 10 Stunden ermöglicht. Bei diesem Verfahren werden Larven teilweise mit einem UV-reaktiven Kleber am Deckschein befestigt und zusätzlich die Larvenbewegung mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Block zurückgeschraubt. Diese Methode ist mit Larven in Entwicklungsstadien vom zweiten Instar bis zum wandernden dritten Instern kompatibel. Wir zeigen Anwendungen dieser Methode bei der Untersuchung dynamischer Prozesse von Drosophila somatosensorischen Neuronen, einschließlich Dendritenwachstum und verletzungsinduzierter Dendritendegeneration. Diese Methode kann auch angewendet werden, um viele andere zelluläre Prozesse zu studieren, die in der Nähe der Larvenkörperwand passieren.
Introduction
Die Zeitraffer-Live-Bildgebung ist eine leistungsstarke Methode zur Untersuchung dynamischer zellulärer Prozesse. Die räumlichen und zeitlichen Informationen, die von Zeitrafferfilmen bereitgestellt werden, können wichtige Details für die Beantwortung zellbiologischer Fragen aufdecken. Die Drosophila Larve ist ein beliebtes In-vivo-Modell für Untersuchungen mit Live-Bildgebung, weil ihre transparente Körperwand eine nichtinvasive Bildgebung der inneren Strukturen1,2ermöglicht. Darüber hinaus stehen in Drosophila zahlreiche genetische Werkzeuge zur Fluoreszenz zur Kennzeichnung anatomischer Strukturen und Makromoleküle zur Verfügung3. Jedoch, langfristige Zeitraffer-Bildgebung von Drosophila Larven ist eine Herausforderung. Im Gegensatz zu stationären frühen Embryonen oder Pupas bewegen sich Drosophila-Larven ständig, was eine Immobilisierung für die Live-Bildgebung erforderlich macht. Effektive Möglichkeiten zur Immobilisierung lebender Drosophila-Larven umfassen die Montage in Halocarbonöl mit Chloroform4,anästhesieren mit Isofluran- oder Dichlorvos-Lösung5, und das Komprimieren zwischen dem Deckelrutsch und dem Mikroskopschlitten6. Obwohl einige dieser Methoden für die Mikroskopie verwendet wurden, keine von ihnen ist wirksam für langfristige Live-Bildgebung. Andere Methoden wurden für die Bildgebung von Körperwandneuronen in kriechenden Larven mittels konventioneller konfokaler Mikroskopie oder Lichtbogenmikroskopie7,8,9entwickelt. Diese Methoden sind jedoch nicht ideal für die Überwachung der zellulären Dynamik aufgrund der Bewegung der Larven.
Neue Methoden wurden entwickelt, um eine langfristige Zeitraffer-Bildgebung von Drosophila-Larven zu erreichen. Mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS) "Larvenchip" können Drosophila-Larven durch vakuumgenerierte Absaugung in einer spezialisierten Mikrokammer ohne Anästhesisierung effektiv immobilisiert werden. Diese Methode bietet jedoch keine hohe zeitliche Auflösung für zellbiologische Studien und hat strenge Einschränkungen für die Tiergröße10. Eine andere Methode mit einem Anästhesisierungsgerät erreicht Live-Bildgebung von Drosophila Larven an mehreren Zeitpunkten und wurde angewendet, um neuromuskuläre Knoten11,12,13,14,15,16. Diese Methode erlaubt jedoch auch keine kontinuierliche Bildgebung länger als 30 min und erfordert die wiederholte Verwendung von Desfluran, was die neuronale Aktivität hemmen und den untersuchten biologischen Prozess beeinflussen kann17,18. Kürzlich wurde eine neue Methode, die mikrofluidische Vorrichtung und Kryoanesthesie kombiniert, verwendet, um Larven verschiedener Größen für kurze Zeiträume (Minuten) zu immobilisieren19. Diese Methode erfordert jedoch spezielle Geräte wie ein Kühlsystem und längere Immobilisierungsphasen erfordern eine wiederholte Kühlung der Larven.
Hier präsentieren wir eine vielseitige Methode zur Immobilisierung von Drosophila-Larven, die mit ununterbrochener Zeitraffer-Bildgebung länger als 10 h kompatibel ist. Bei dieser Methode, die wir "Larvenstabilisierung durch Partielle Befestigung" (LarvaSPA) nennen, wird die Larvenhaut an einem Deckblatt für die Bildgebung in einer kundenspezifischen Bildgebungskammer anhaften. Dieses Protokoll beschreibt, wie man die Bildkammer macht und wie man Larven in einer Vielzahl von Entwicklungsstadien montiert. Bei der LarvaSPA-Methode werden die gewünschten Körpersegmente mit einem UV-reaktiven Kleber am Deckschein befestigt. Ein PDMS-Quader übt zusätzlich Druck auf die Larven aus und verhindert so das Entweichen. Die Luft und Feuchtigkeit in der Bildkammer sichern das Überleben der teilweise immobilisierten Larven während der Bildgebung. Vorteile von LarvaSPA gegenüber anderen Techniken sind die folgenden: (1) Es ist die erste Methode, die eine kontinuierliche Live-Bildgebung intakter Drosophila-Larven für Stunden mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ermöglicht; (2) Die Methode hat weniger Beschränkungen für die Larvengröße; (3) Die Bildkammer und PDMS-Quader können zu minimalen Kosten hergestellt werden und sind wiederverwendbar.
Neben der Beschreibung der Larvenmontagemethode, bieten wir mehrere Beispiele für seine Anwendung für die Untersuchung der Dendritenentwicklung und Dendritendegeneration von Drosophila dendritischen Arborisation (da) Neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Herstellung der Bildgebungskammer
- Der Metallrahmen kann aus einem Aluminiumblock in einer typischen Maschinenwerkstatt gefertigt werden. Die Spezifikationen des Rahmens sind in Abbildung 1Adargestellt.
- Um die Bildkammer zu konstruieren, versiegeln Sie die Unterseite des Metallrahmens mit einem langen Abdeckschlupf (22 mm x 50 mm) und UV-Kleber(Abbildung 1A). Den UV-Kleber mit einer handgehaltenen UV-Lampe aushärten.
2. Herstellung von PDMS-Quadern
- Bereiten Sie die Form für PDMS-Quader vor.
- Befestigen Sie Schichten von Verpackungsband an der Innenfläche einer rechteckigen (80 mm x 55 mm) Petrischale oder runden Zellkulturplatte. Verwenden Sie eine Schicht (0,063 mm dick) für zweite Instar-Larven, 2 Schichten (0,126 mm dick) für frühe dritte Insternlarven oder drei Schichten (0,189 mm dick) für spätdritte Instarlarven(Abbildung 1B).
- Schneiden Sie das Band in Streifen mit spezifischer Breite mit einer Rasierklinge: 1,5 mm für das 1-Schicht-Band und 2 mm für 2-Schicht- oder 3-Schicht-Band. Die Breite und Dicke des Streifens bestimmt die Größe der Larven, die der endgültige PDMS-Quader aufnehmen kann. Lassen Sie mindestens einen Abstand von 5 mm zwischen den beiden Streifen. Entfernen Sie die Bandschichten, die den Raum abdecken (Abbildung 1B).
- Entfernen Sie Staub von der Innenfläche der Platte mit Klebeband. Die Form ist einsatzbereit.
- Bereiten Sie den PDMS-Mix vor.
- 7 g PDMS-Basis und 0,7 g Aushärtungsmittel (10:1-Verhältnis) in einem kleinen Behälter gründlich mischen.
- Legen Sie den Behälter mindestens 15 min in einen Vakuumaustrocknungsor, um Luft aus dem Gemisch zu entfernen.
- Etwa 5,5 g PDMS-Mischung langsam auf die Form gießen, um eine Dicke von 1–2 mm zu erreichen (Abbildung 1B).
- Legen Sie das PDMS-Gemisch mindestens 15 min im Vakuumaustrocknungsor wieder auf, um die verbleibenden Luftblasen aus der Mischung zu entfernen. Brechen Sie die letzten Blasen mit einer Pipettenspitze.
- Das PDMS auf einer ebenen Oberfläche in einem Wärmeinkubator bei 65 °C für 2 h aushärten.
- Verwenden Sie eine Rasierklinge, um das ausgehärtete PDMS entlang der Kante der Form zu lösen und von der Form zu lösen. Bewahren Sie das PDMS zwischen zwei Stücken großem Klebeband bei Raumtemperatur auf.
- Schneiden Sie das PDMS für frühe und späte dritte Instar-Larven in 8 mm x 2 mm x 1 mm Quader (entlang der gepunkteten Linien in Abbildung 1B) durch Positionierung der Nut, die durch den Bandstreifen (Schritt 2.1.2) in der Mitte der langen Seite des Quaders erzeugt wird (Abbildung 1B,C). Für zweite Instar-Larven den Quader auf 8 mm x 1 mm x 1 mm schneiden.
3. Montage von Larven für langzeitzeitliche Zeitraffer-Bildgebung
- Bereiten Sie den oberen Deckelschlupf für die Montage vor.
- Wählen Sie sechs PDMS-Quader mit Nuten, die den Größen der Larven entsprechen. Befolgen Sie die empfohlene Nut und Größe von PDMS basierend auf den Schritten 2.1.1, 2.1.2 und 2.2.7.
- Entfernen Sie Staub von der Oberfläche des PDMS mit Klebeband.
- Befestigen Sie vier Stück doppelseitiges Klebeband (12 mm x 5 mm) auf einem langen Abdecksch (22 mm x 50 mm) zur späteren Befestigung von PDMS-Quadern. Die Leerzeichen zwischen den beiden Stücken doppelseitig liegendem Band sollten mit der Breite der PDMS-Nut identisch sein.
- Tragen Sie einen kleinen Tropfen UV-Kleber in die Nut jedes PDMS-Quaders auf und fügen Sie sechs kleine Tropfen UV-Kleber in den Raum zwischen dem doppelseitigen Klebeband auf dem Deckel.
- Bereiten Sie die Larven für die Montage vor.
- Reinigen Sie die Larven mit einem Zangenpaar in Wasser, um Nahrung von der Körperoberfläche zu entfernen.
- Legen Sie saubere Larven auf ein kleines Stück befeuchtetes Tissuepapier in eine kleine (35 mm) Petrischale ohne Deckel. Legen Sie die kleine Petrischale in eine große (60 mm) Petrischale mit einem Stück Trockenpapier. In einer chemischen Haube 8–12 Tropfen (160–240 l) Isofluran e.V. mit einer Kunststoff-Transferpipette auf das Trockenepapier auftragen und den Deckel der großen Petrischale schließen.
- Warten Sie 2–3 min, während Sie die Larven überwachen. Nehmen Sie die Larven aus der großen Petrischale heraus, sobald ihre Mundhaken aufhören sich zu bewegen.
- Montieren Sie die Tiere.
- Um Strukturen auf der Dorsalseite des Tieres abzubilden, legen Sie die immobilisierten Larven auf den UV-Kleber zwischen dem doppelseitigen Klebeband auf dem Deckblatt mit der dorsalen Nagelhaut, die dem Deckel zugewandt ist.
- Bedecken Sie jede Larve mit einem PDMS-Block und passen Sie den Stamm der Larve in die Nut des PDMS. Lassen Sie den Kopf und den Schwanz der Larve außerhalb der PDMS-Nut. Vermeiden Sie es, die Spappel der Larve durch den Kleber zu blockieren.
- Drücken Sie auf die Enden des PDMS-Blocks auf das doppelseitige Band, ohne Kraft auf die Nut anzuwenden. Ziehen Sie vorsichtig am Schwanz der Larve, um die Nagelhaut unter dem PDMS abzuflachen.
- Den UV-Kleber 4 min mit einer handgehaltenen UV-Lampe an der hohen Einstellung (bei ca. 0,07 mW/mm2)aushärten.
VORSICHT: Schützen Sie die Augen mit einer Schutzbrille, während Sie die UV-Lampe verwenden. - Drehen Sie den Coverslip auf den Kopf und wiederholen Sie Schritt 3.3.4.
- Befeuchten Sie ein kleines Stück Linsenpapier (15 mm x 30 mm) mit 20 l–30 l Wasser. Legen Sie das befeuchtete Linsenpapier an der Unterseite der Bildkammer (Abbildung 1A,D).
- Legen Sie den Deckelaufschub auf die Kammer, so dass die Larven nach innen in die Kammer blicken. Mit UV-Kleber an beiden Enden des Deckels an der Metalloberfläche anhaften (Abbildung 1A,D). Die Dorsalseite der Larven ist unter dem konfokalen Mikroskop zur Bildgebung bereit (Abbildung 1E).
4. Imaging
- Bildlarven mit einem geeigneten Mikroskop. Alle in diesem Protokoll gezeigten Ergebnisse (Abbildung 2, Abbildung 3, Video S2, Video S3und Video S4) wurden mit einem konfokalen System mit einem 40x (1.30 NA) Ölobjektiv erworben.
5. Wiederherstellung von Bildkammer und PDMS-Quadern
- Entfernen Sie nach der Bildgebung das Öl auf dem oberen Deckelmitrutsche mit einem Linsenpapier. Lösen Sie den oberen Deckelrutsch vom Metallrahmen, indem Sie mit einer Rasierklinge in den Raum zwischen dem Coverslip und dem Metallrahmen schneiden. Die Bildgebungskammer ist wiederverwendreif.
- Lösen Sie die PDMS-Quader mit Zangen vom oberen Deckel. Rollen Sie die PDMS-Quader auf Klebeband, um Klebstoffrückstände und Staub zu entfernen. Die PDMS-Quader sind wiederverwendreif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Larven-Bildkammer wird durch Verkleben eines maßgeschneiderten Metallrahmens und zweier Abdeckungen konstruiert. Das Design des Metallrahmens ist in Abbildung 1Aangegeben. Drosophila-Larven in der Kammer werden mit Hilfe von UV-Kleber und PDMS-Quadern am oberen Deckelbedeckungsslip aufgeklebt. Die Nut auf dem PDMS-Quader und das doppelseitige Band des Quaders wird befestigt, um den Raum für die Larven zu schaffen (Abbildung 1B,C). Das PDMS übt auch sanften Druck aus, um die Larvenkörperwand abzuflachen und die Larvenbewegung physisch einzuschränken. Schließlich wird ein kleines Stück Nasslinsenpapier an der Unterseite der Kammer platziert, um Feuchtigkeit zu spenden. Dieses Setup kann Drosophila-Larven länger als 10 h für eine kontinuierliche Bildgebung immobilisieren. Die meisten Tiere sind nach 10 h am Leben und können geborgen werden, um in die Pupal-Phase zu wachsen. Die Bildgebungskammer kann bis zu neun Larven gleichzeitig aufnehmen. Abbildung 1D zeigt sechs späte dritte Instar-Larven, die in der Kammer montiert sind. Die Stämme der Larven sind fixiert, während ihre Köpfe und Schwänze frei zu bewegen sind (Abbildung 1E und Video S1). Diese Methode wurde erfolgreich verwendet, um zweiten Instar zu wandernden dritten Instar Larven mit kontinuierlicher hochauflösender Bildgebung für bis zu 15 h zu bilden. Die Kammer ist für die Bildgebung mit aufrechten Mikroskopen konzipiert, aber das Setup funktioniert auch für invertierte Mikroskope, indem die Kammer einfach umgedreht wird.
Hier zeigen wir die Anwendung von LarvaSPA bei der Untersuchung der neuronalen Dendritendynamik und Dendritendegeneration mit Neuronen der Klasse IV da (C4 da) als Modell (Abbildung 2, Abbildung 3, Videos S2–S4). C4 da Neuronen sind somatosensorische Nozizeptoren an der Larvenkörperwand, deren Dendriten die Larvenepidermis1,20,21,22. C4 da Dendriten weisen hochdynamische Wachstumsverhalten während der gesamten Larvenentwicklung auf, was zu einer vollständigen Abdeckung der Körperoberfläche oder raumfüllenden23führt. C4 da Neuronen wurden auch erfolgreich verwendet, um Dendritendegeneration und Regeneration nach körperlichen Verletzungen zu studieren24,25,26,27.
Für die bildgebende Dendritendynamik wurden Larven von 48 h nach Eiablage (AEL) beim zweiten Instern bis 120 h AEL beim wandernden dritten Instern in der Bildgebungskammer montiert, um die Zeitraffer-Bildgebung mittels Punkt-Scanning-Konfokalmikroskopie zu erstellen. Zeitrafferfilme wurden mit einem Intervall von 3 min aufgenommen, um das Wachstumsverhalten von C4 da Dendriten zu erfassen, die von ppk-CD4-tdTom oder UAS-CD4-tdTom mit ppk-Gal46bezeichnet werden. Während der gesamten Bildgebungsphase (bis zu 12 h) wiesen die dendritischen Zweige von C4 da Neuronen komplexe Wachstumsverhalten auf, einschließlich Erweiterung, Rückzug, Verzweigungsbildung und Zweigelbeseitigung (Abbildung 2A–2F), was auf den Zustand der Neuronen hindeutet. Unsere Filme erfassten auch homotypische Dendro-Dendrit-Abstoßungen, bei denen dendritische Spitzen nach Kontakt mit anderen Dendriten zurückgezogen wurden (Abbildung 2F). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass Zeitraffer-Bildgebung mit LarvaSPA wirksam für die Untersuchung der Neuroentwicklung ist.
Um die Dendritendegeneration abzubilden, verwendeten wir einen MaiTai-Laser, um primäre Dendriten in der Nähe von C4 da neuronalen Zellkörpern zu trennen. Die Larven wurden geborgen und in der Kammer zur Bildgebung ab 1,5 h nach Verletzung (AI) montiert (Abbildung 3, Video S4). Die Filme zeichneten schlüsselweise bei der Degeneration von Dendriten auf, darunter Dendritenschwellungen, Dendritenfragmentierung und die Clearance von Dendritenablagerungen. Im selben Experiment wurde der Larvenfettkörper auch entwickelt, um Annexin V-GFP (AV-GFP) abzusondern, einen Sensor, der externalisiertes Phosphatidylserin (PS) auf der Zelloberfläche27beschriftet. Wir beobachteten eine spezifische Kennzeichnung der degenerierenden Dendriten durch AV-GFP (Abbildung 3), was darauf hindeutet, dass PS auf der Oberfläche degenerierender Dendriten exponiert war, um als Ess-Me-Signal für die nachfolgende Clearance durch Phagozytose27zu dienen.
Abbildung 1: Die Bildkammer für die LarvaSPA-Montage. (A) Diagramme der Bildkammer mit detaillierten Spezifikationen, die sowohl die obere Ansicht als auch die Seitenansicht anzeigen. Die hellblaue Schattierung in der oberen Ansicht zeigt das befeuchtete Linsenpapier an. Die Kammer ist durch einen oberen Deckelund einen unteren Deckelschlupf versiegelt. Die Position einer montierten Larve wird dargestellt. (B) Diagramme der PDMS-Form (obere Ansicht) und der Form nach dem Befüllen mit dem PDMS-Gemisch (Seitenansicht). Streifen in Grau zeigen zwei 1-Schicht-, zwei 2-Schicht- und zwei 3-Schicht-Bandstreifen an. Die gelbe Schattierung in der Seitenansicht zeigt die PDMS-Mischung in der Form an. Die gepunkteten Linien geben an, wo das ausgehärtete PDMS geschnitten werden soll. Die Seitenansicht des Diagramms wird nicht maßstabsgetreu gezeichnet. (C) Fotos mit einer Ansicht von oben und einer Seitenansicht eines PDMS-Quaders. Scale bar = 1 mm. (D) Fotografien, die eine Bildkammer vor der Montage zeigen, und eine Bildkammer mit sechs immobilisierten späten dritten Instar Drosophila Larven montiert dorsale Seite nach oben. Maßstabsstange = 10 mm. (E) Eine nähere Sicht auf eine Larve in (D). Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zeitraffer-Bildgebung der Dendritendynamik. (A-F) Ausgewählte Bilder aus Zeitrafferfilmen der Klasse IV da Neuron dendriten zu bestimmten Zeitpunkten nach Beginn der Bildgebung. Bilder der Larven wurden 48 h AEL (A und F), 72 h AEL (B), 96 h AEL (C) und 120 h AEL (D) aufgenommen. Die Neuronen sind mit ppk>CD4-tdTom (A, D, Eund F) oder ppk >CD4-tdTom (B und C) gekennzeichnet. Blaue Pfeile zeigen dendriten-Rückzugime im Vergleich zum vorherigen Zeitpunkt an. Gelbe Pfeile zeigen Dendritenerweiterungen im Vergleich zum vorherigen Zeitpunkt an. (E) Dendritenmorphologie am Ende von 12 h Bildgebung. (F) Konsekutierte Rahmen mit 3 min Intervallen in einem Film, der veranschaulicht, wie sich ein Dendritenzweig in einer zweiten Instarlarve verlängerte (gelbe Pfeile) und anschließend (blaue Pfeile) eingefahren wurde, nachdem er Kontakt mit einem anderen Dendriten aufgenommen hatte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Zeitraffer-Bildgebung der Dendritendegeneration und Exposition eines Ess-Me-Signals. Ausgewählte Bilder aus einem Zeitrafferfilm von degenerierenden Dendriten einer Klasse IV da Neuron nach Laserverletzungen. Dendriten wurden mit ppk>CD4-tdTombeschriftet. Das Ess-mich-Signal PS auf degenerierenden Dendriten wurde von Annexin-GFP (AV-GFP) nachgewiesen, das vom Fettkörper abgesondert wird. Gelbe Pfeile zeigen auf die Zweige, die die AV-GFP-Beschriftung anzeigen. Blaue Pfeile weisen auf Dendriten hin, die fragmentiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video S1: Eine dritte Instar-Larve wird in der Kerbe eines PDMS-Quaders immobilisiert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Video S2: Dendriten dehnen sich in einer zweiten Instar-Larve dynamisch aus und ziehen sie zurück. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Video S3: Dendriten dehnen sich in einer wandernden dritten Instar-Larve dynamisch aus und ziehen sie zurück. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Video S4: Dendriten degenerieren und setzen Phosphatidylserin nach Laserverletzung in einer dritten Instar-Larve aus. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreiben wir LarvaSPA, eine vielseitige Methode zur Montage lebender Drosophila-Larven für die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung. Diese Methode erfordert keine Wiederherstellung oder Wiedermontage von Larven, was eine unterbrechungsfreie Bildgebung ermöglicht. Es ist daher ideal für die Verfolgung biologischer Prozesse, die Stunden in Anspruch nehmen, wie Zerstitendegeneration und Regeneration. Diese Methode kann auch für die Bildgebung intrazellulärer Kalziumdynamik und subzelluläre Ereignisse wie Mikrotubuliwachstum verwendet werden. Da die Larvenkörperwand während der Bildgebung stabil ist, kann die räumliche und zeitliche Auflösung an die vorliegende bildgebende Anwendung angepasst werden (z. B. um schnelle subzelluläre Vesikelbewegungen zu verfolgen oder langsame globale Veränderungen neuronaler Zweigmuster zu überwachen). Darüber hinaus ist diese Methode mit Larven in verschiedenen Entwicklungsstadien kompatibel und erfordert keine spezielle Ausrüstung. So kann LarvaSPA potenziell von vielen Drosophila-Laboren verwendet werden, um verschiedene Fragen zu beantworten.
Faktoren, die den Erfolg der Methode beeinflussen, einschließlich der Art des PDMS-Quaders und der Entwicklungsphase der Larven
Die Größe des PDMS-Quaders und die Tiefe der Nut müssen der Größe der Larven entsprechen. Ein PDMS-Quader, der zu breit für die Larven ist, kann den Kopf und den Schwanz bedecken und Hypoxie verursachen. Ein schmaler PDMS-Quader kann jedoch nicht wirksam sein, um die Bewegung der Larven zu verhindern. Eine zu tiefe Nut würde ähnlich wenig Druck erzeugen, um die Bewegung der Larven zu bremsen. Eine zu flache Nut würde nicht genug Kleber halten, um die Larven an der Abdeckung zu haften. Basierend auf unserer Erfahrung werden für verschiedene Larvenstufen folgende Abmessungen des PDMS und der Nut empfohlen: 8 mm x 1 mm x 1 mm PDMS-Quader mit 1,5 mm x 1 mm x 0,063 mm Nuten für zweite Instar-Larven (ca. 48 h AEL); 8 mm x 2 mm x 1 mm PDMS-Quader mit 2 mm x 2 mm x 0,126 mm Nuten für frühe dritte Insternlarven (ca. 72 h AEL); 8 mm x 2 mm x 1 mm PDMS-Quader mit 2 mm x 2 mm x 0,189 mm Nuten für spätdritte Insternlarven (96 h AEL oder älter).
Wandernde dritte Instar Larven (bei oder älter als 120 h AEL) bewegen sich weniger im Vergleich zu jüngeren und benötigen weniger Feuchtigkeit, um zu überleben, einmal in der Kammer montiert. Sie haben auch eine dickere Nagelhaut und können mehr körperlichen Stress ertragen. Daher haben Experimente mit wandernden dritten Instarlarven die höchste Erfolgsrate. In unseren Händen überlebten mehr als 80% der wandernden dritten Instarlarven und blieben nach der Montage 12 h unbeweglich. Um zu verhindern, dass Larven während der Bildgebung verpuparien, empfehlen wir, die Larven zwischen 96 h und 120 h AEL zu montieren. Jüngere dritte Instar Larven haben eine größere Chance zu entkommen oder tod während der Bildgebung. In der Regel würden mindestens 2 von 6 jungen dritten Instar-Larven, die in derselben Kammer montiert sind, überleben und nach der Montage 10 h unbeweglich bleiben. Unsere Erfahrung mit zweiten Instar-Larven ist begrenzt und die Überlebensrate ist schwer abzuschätzen. Nichtsdestotrotz haben wir mit dieser Methode erfolgreich zweite Instar-Larven für 7 h abgebildet.
Potenzielle Bedenken der Langzeitbildgebung
Obwohl LarvaSPA sehr nützlich für die Bildgebung der Dendritenwachstumsdynamik und Degeneration war, gibt es einige mögliche Vorbehalte zu berücksichtigen. Erstens, in unserer aktuellen Methode, die Larven werden der Nahrung für die gesamte Dauer der Bildgebung beraubt, was zu Hunger-induzierten Reaktionen in vielen Geweben führen kann. Wir haben die Bildung von körnigen Strukturen in epidermalen Zellen um 10 h nach der Montage beobachtet, die durch Autophagie entstehen können. Daher sollten die Ergebnisse, die in den ersten Stunden der Bildgebung erzielt wurden, physiologisch relevanter sein. Ergebnisse über längere Zeitskalen erfordern eine vorsichtigere Interpretation. Um dieses Problem zu minimieren, könnte unser Verfahren möglicherweise an die Larvenfütterung angepasst werden. Zweitens kann unsere Methode das schnelle Wachstum jüngerer Larven aufgrund der körperlichen Zwänge und der fehlenden Nährstoffaufnahme beeinträchtigen. Diese Sorge gilt jedoch möglicherweise nicht für ältere Tiere. Zum Beispiel können wandernde dritte Instarlarven auch nach 12 h kontinuierlicher Bildgebung in Pupae umgewandelt werden, was diese Methode ideal für Untersuchungen der frühen Metamorphose macht. Drittens stellt die Abbildung tieferer Strukturen wie fetten Körper und Darm einige Herausforderungen dar. Ein Hauptgrund dafür ist, dass sich tiefere Gewebe oft während der Bildgebung bewegen und daher eine Bewegungskorrektur in der Nachbearbeitung erfordern. Darüber hinaus können Inkongruenzen von Brechungsindizes im Lichtpfad sphärische Aberrationen verursachen, wenn tiefere Gewebe dargestellt werden. Während Ölziele für die Abbildung von Da-Neuronen geeignet sind, da ihre Dendriten innerhalb von 15 m von der Körperoberfläche entfernt sind, könnten Wasser-Immersionsziele bessere Optionen sein, um Refractive-Index-Inkongruenzen für die Bildgebung tiefer in den Larven zu korrigieren. Viertens, weil C4 da Neuronen durch UV-Licht28aktiviert werden können, kann die Verwendung von UV-Licht während der Larvenmontage möglicherweise die C4 da Neuronphysiologie verändern. Obwohl die Lichtintensität, die wir empfehlen, weit unter den Niveaus liegt, die C4da Neuronen28robust aktivieren, müssen die Ergebnisse im Zusammenhang mit der neuronalen Aktivität von C4da vorsichtig interpretiert werden. Der UV-Kleber wurde für die Abbildung einer Vielzahl von biologischen Proben29,30,31 verwendet und verursacht keine offensichtliche Toxizität für die Larven in unseren Händen. Schließlich sollte man die richtige Mikroskop-Setup für in vivo Live-Bildgebung in Betracht ziehen. Beispielsweise sind Resonanzscanner und konfokale Mikroskope, die sich drehen, bessere Optionen für langfristige Live-Bildgebung, da sie weniger Phototoxizität und Photobleichungen verursachen; Multi-Photonenmikroskopie ist effektiver für die Abbildung tieferer interner Strukturen in den Larven; Langzeit-Bildgebung könnte anfällig für Proben- oder Fokusdriften sein, die möglicherweise durch Post-Imaging-Verarbeitung korrigiert werden könnten.
Die häufigsten Fehlerursachen für LarvaSPA und die empfohlenen Lösungen, um sie anzugehen
- Larven bewegen sich zu viel oder entkommen: Zwei häufige Gründe könnten zu diesem Problem beitragen. Die erste ist, dass die PDMS-Nut zu flach oder zu tief für die Larven sein kann. Das Ausprobieren eines anderen PDMS-Quaders mit einer anderen Nuttiefe kann das Problem lösen. Der zweite Grund ist, dass zu viel Feuchtigkeit in der Kammer ist, was den UV-Kleber schwächt. Die Verringerung des Wasservolumens, das dem Linsenpapier in der Kammer zugesetzt wird, kann dazu beitragen, die Larven immobilisieren zu können. Versuchen Sie außerdem, nur die Vom PDMS-Quader abgedeckten Segmente abzubilden, da sich Kopf und Schwanz frei bewegen können.
- Larven sterben während der Bildgebung: Stirbt eine Larve kurz nach der Bildgebung, ist es wahrscheinlich, dass sie zu viel Anästhetikum ausgesetzt war. Richtig anästhesierte Larven sollten nach der Montage aufwachen und Bewegungen zeigen, einschließlich Mundhakenverlängerung und Rückzug und Rückengefäßkontraktion. Um dieses Problem zu lösen, könnte weniger Isofluran verwendet werden, um Larven zu beästhesieren. Übertragen Sie eine Larve aus der Anästhesie Petrischale unmittelbar nachdem der Mundhaken aufhört sich zu bewegen. Wenn die Larve etwa eine Stunde nach der Bildgebung stirbt, ist es in der Regel wegen Dehydrierung. Denken Sie daran, ein Stück befeuchtetes Linsenpapier vor der Versiegelung in die Bildkammer zu legen. Ein weiterer häufiger Grund für die Letalität ist, dass der UV-Kleber die Spiracles blockiert. Versuchen Sie, UV-Kleber auf die mittleren Segmente der Larve zu begrenzen und vermeiden Sie, den Kopf und den Schwanz zu bedecken. Ein zu breiter PDMS-Quader kann auch leicht dazu führen, dass der UV-Kleber die Spiracles blockiert.
- Falten an der Körperwand stören die Bildgebung: Um Falten während der Montage zu vermeiden, ist es wichtig, die Larven während des Anästhesieschritts vollständig zu immobilisieren. Wenn eine Larve gelähmt ist, ist es einfacher, den Körper zu begradigen und zu dehnen. Bei Tieren, die älter als 96 h AEL sind, kann das sanfte Ziehen der Schwänze vor dem Aushärten des UV-Klebers die Faltenbildung effektiv reduzieren. Ziehen der Schwänze von jungen Larven ist nicht zu empfehlen, weil ihre Körperwände zerbrechlich sind.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Lingfeng Tang für die Einrichtung einer früheren Version der LarvaSPA-Methode; Glenn Swan von Cornell Olin Hall Machine Shop für frühere Prototypen der Bildgebungskammer; Philipp Isermann für den Bau von Metallrahmen und Vorschläge zur Herstellung von PDMS-Quadern; Cornell BRC Imaging-Anlage für den Zugang zu Mikroskopen (finanziert durch NIH-Zuschuss S10OD018516); Maria Sapar für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch ein Cornell Fellowship unterstützt, das H.J. verliehen wurde; ein Cornell-Start-up-Fonds und NIH-Stipendien (R01NS099125 und R21OD023824), die an C.H. H.J. und C.H. vergeben wurden, konzipierten das Projekt und entwarfen die Experimente. H.J. führte die Experimente durch. H.J. und C.H. schrieben das Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, Pt 2 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
