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Biology

लार्वास्पा, लंबी अवधि के समय-चूक इमेजिंग के लिए बढ़ते ड्रोसोफिला लारवा के लिए एक विधि

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60792
Automatic Translation
1, 1
1Weill Institute for Cell and Molecular Biology and Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University

Summary

यह प्रोटोकॉल बढ़ते ड्रोसोफिला लार्वा के लिए एक विधि का वर्णन करता है ताकि बरकरार जीवित जानवरों में 10 घंटे से अधिक समय तक निर्बाध समय-चूक इमेजिंग प्राप्त की जा सके। इस विधि का उपयोग लार्वा शरीर की दीवार के करीब कई जैविक प्रक्रियाओं को छवि देने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

लाइव इमेजिंग सेल जीव विज्ञान के सवालों की जांच के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण है । ड्रोसोफिला लार्वा विशेष रूप से वीवो लाइव इमेजिंग में उपयुक्त है क्योंकि लार्वा शरीर की दीवार और अधिकांश आंतरिक अंग पारदर्शी हैं। हालांकि, 30 से अधिक समय तक बरकरार ड्रोसोफिला लार्वा की निरंतर लाइव इमेजिंग चुनौतीपूर्ण रही है क्योंकि लंबे समय तक लार्वा को स्थिर करना मुश्किल है। यहां हम लारवास्पा नामक लार्वा बढ़ते विधि पेश करते हैं जो 10 घंटे से अधिक समय तक उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ लाइव ड्रोसोफिला लार्वा की निरंतर इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। इस विधि में यूवी-प्रतिक्रियाशील गोंद का उपयोग करके कवरस्लिप में लार्वा को आंशिक रूप से संलग्न करना और इसके अतिरिक्त पॉलीडिमिथाइलसिलिऑक्सेन (पीडीएम) ब्लॉक का उपयोग करके लार्वा आंदोलन को रोकना शामिल है। यह विधि दूसरे इंस्टार से तीसरे इंस्टार को भटकने के लिए विकासात्मक चरणों में लार्वा के साथ संगत है। हम ड्रोसोफिला सोमाटोसेंसरी न्यूरॉन्स की गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में इस विधि के अनुप्रयोगों को प्रदर्शित करते हैं, जिसमें डेंराइट विकास और चोट-प्रेरित डेन्डराइट डिजनरेशन शामिल हैं। इस विधि को लार्वा शरीर की दीवार के पास होने वाली कई अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है।

Introduction

समय-चूक लाइव इमेजिंग गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। समय चूक फिल्मों द्वारा प्रदान की स्थानिक और लौकिक जानकारी सेल जीव विज्ञान के सवालों के जवाब देने के लिए महत्वपूर्ण विवरण प्रकट कर सकते हैं । ड्रोसोफिला लार्वा लाइव इमेजिंग का उपयोग करके जांच के लिए वीवो मॉडल में एक लोकप्रिय रहा है क्योंकि इसकी पारदर्शी शरीर की दीवार आंतरिक संरचनाओं की नॉनइनवेसिव इमेजिंग के लिए अनुमति देती है1,2। इसके अलावा, ड्रोसोफिला में कई आनुवंशिक उपकरण उपलब्ध हैं जो शारीरिक संरचनाओं और मैक्रोमॉलिक्यूल्स3को फ्लोरोसेंटी लेबल करने के लिए हैं। हालांकि, ड्रोसोफिला लार्वा की दीर्घकालिक समय-चूक इमेजिंग चुनौतीपूर्ण है। स्थिर प्रारंभिक भ्रूण या पिल्ले के विपरीत, ड्रोसोफिला लार्वा लगातार चलते हैं, लाइव इमेजिंग के लिए स्थिरीकरण की आवश्यकता होती है। लाइव ड्रोसोफिला लार्वा को स्थिर करने के प्रभावी तरीकों में क्लोरोफॉर्म4के साथ हेलोकार्बन तेल में बढ़ते हुए, आइसोफ्लोरान या डिक्लोरवोस सॉल्यूशन5का उपयोग करके एनेस्थेटाइजिंग और कवरस्लिप और माइक्रोस्कोप स्लाइड6के बीच संकुचित होना शामिल है। हालांकि इनमें से कुछ तरीकों का उपयोग माइक्रोस्कोपी के लिए किया गया है, लेकिन उनमें से कोई भी दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग के लिए प्रभावी नहीं है। इमेजिंग बॉडी वॉल न्यूरॉन्स के लिए पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी या लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी7,8,9का उपयोग करके लार्वा रेंगने के लिए अन्य तरीके विकसित किए गए थे । हालांकि, लार्वा के आंदोलन के कारण सेलुलर गतिशीलता की निगरानी के लिए ये विधियां आदर्श नहीं हैं।

ड्रोसोफिला लार्वा की दीर्घकालिक समय-चूक इमेजिंग प्राप्त करने के लिए नए तरीके विकसित किए गए हैं। पॉलीडिमेथिलसिलोक्सेन (पीडीएम) "लार्वा चिप" का उपयोग करके, ड्रोसोफिला लार्वा को एनेस्थेटाइजेशन के बिना एक विशेष माइक्रोचैंबर में वैक्यूम-जनित सक्शन के माध्यम से प्रभावी ढंग से स्थिर किया जा सकता है। हालांकि, यह विधि सेल जीव विज्ञान अध्ययन के लिए उच्च लौकिक संकल्प प्रदान नहीं करती है और इसकी पशु आकार10पर सख्त सीमाएं हैं। एनेस्थेटाइजेशन डिवाइस का उपयोग करने वाली एक अन्य विधि ने कई समय बिंदुओं पर ड्रोसोफिला लार्वा की लाइव इमेजिंग हासिल की और इसे न्यूरोमस्कुलरजंक्शनों 11, 12,13,14,15,16का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है । हालांकि, यह विधि 30 से अधिक समय तक निरंतर इमेजिंग की अनुमति नहीं देती है और बार-बार डिफ्लूरन का उपयोग करने की आवश्यकता होती है, जो तंत्रिका गतिविधि को बाधित कर सकती है और17,18अध्ययन की गई जैविक प्रक्रिया को प्रभावित कर सकती है। हाल ही में, माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस और क्रायोएनेस्थीसिया को जोड़ती एक नई विधि का उपयोग कम समय (मिनट)19के लिए विभिन्न आकारों के लार्वा को स्थिर करने के लिए किया गया है। हालांकि, इस विधि के लिए विशेष उपकरणों जैसे कूलिंग सिस्टम की आवश्यकता होती है और स्थिरीकरण की लंबी अवधि के लिए लार्वा के बार-बार ठंडा होने की आवश्यकता होती है।

यहां हम ड्रोसोफिला लार्वा को स्थिर करने की एक बहुमुखी विधि पेश करते हैं जो 10 घंटे से अधिक समय तक निर्बाध समय-चूक इमेजिंग के साथ संगत है। इस विधि, जिसे हम "आंशिक लगाव द्वारा लार्वा स्थिरीकरण" (लार्वास्पा) कहते हैं, में कस्टम-निर्मित इमेजिंग कक्ष में इमेजिंग के लिए एक कवरस्लिप में लार्वा छल्ली का पालन करना शामिल है। यह प्रोटोकॉल इमेजिंग चैंबर बनाने के तरीके और विभिन्न प्रकार के विकास चरणों में लार्वा को कैसे माउंट करना है, इसका वर्णन करता है। लारवास्पा विधि में, वांछित शरीर खंडों को यूवी-प्रतिक्रियाशील गोंद का उपयोग करके कवरस्लिप से चिपका दिया जाता है। एक पीडीएम क्यूबॉइड अतिरिक्त रूप से लार्वा पर दबाव लागू करता है, जिससे बचने को रोका जा सकता है। इमेजिंग चैंबर में हवा और नमी इमेजिंग के दौरान आंशिक रूप से स्थिर लार्वा के अस्तित्व को सुनिश्चित करती है। अन्य तकनीकों पर लार्वास्पा के फायदों में निम्नलिखित शामिल हैं: (1) यह पहली विधि है जो उच्च लौकिक और स्थानिक समाधान के साथ घंटों तक बरकरार ड्रोसोफिला लार्वा की निरंतर लाइव इमेजिंग के लिए अनुमति देती है; (2) विधि लार्वा आकार पर कम सीमाएं हैं; (3) इमेजिंग चैंबर और पीडीएम क्यूबॉइड का निर्माण न्यूनतम लागत पर किया जा सकता है और पुन: उपयोग करने योग्य हैं।

लार्वा बढ़ते विधि का वर्णन करने के अलावा, हम ड्रोसोफिला डेंड्रिटिक आर्बोराइजेशन (दा) न्यूरॉन्स के डेंराइट विकास और डेंराइट डिजनरेशन का अध्ययन करने के लिए इसके आवेदन के कई उदाहरण प्रदान करते हैं।

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Protocol

1. इमेजिंग चैंबर बनाना

  1. धातु फ्रेम एक ठेठ मशीन की दुकान में एक एल्यूमीनियम ब्लॉक से बनाया जा सकता है। फ्रेम के विनिर्देशों को चित्र ा 1एमें दर्शाया गया है।
  2. इमेजिंग चैंबर का निर्माण करने के लिए, एक लंबी कवरस्लिप (22 मिमी x 50 मिमी) और यूवी गोंद(चित्रा 1ए)का उपयोग करके धातु फ्रेम के नीचे सील करें। हाथ से आयोजित यूवी लैंप का उपयोग करयू गोंद का इलाज करें।

2. पीडीएम क्यूबॉइड बनाना

  1. पीडीएमएस क्यूबॉइड के लिए मोल्ड तैयार करें।
    1. आयताकार (80 मिमी x 55 मिमी) पेट्री डिश या गोल सेल कल्चर प्लेट की आंतरिक सतह पर पैकेजिंग टेप की परतें संलग्न करें। दूसरे इंस्टार लार्वा के लिए एक परत (0.063 मिमी मोटी), शुरुआती तीसरे इनस्टार लार्वा के लिए 2 परतें (0.126 मिमी मोटी), या देर से तीसरे इंस्टार लार्वा(चित्रा 1बी)के लिए तीन परतों (0.189 मिमी मोटी) का उपयोग करें।
    2. एक रेजर ब्लेड के साथ विशिष्ट चौड़ाई की स्ट्रिप्स में टेप काटें: 1-लेयर टेप के लिए 1.5 मिमी, और 2-लेयर या 3-लेयर टेप के लिए 2 मिमी। पट्टी की चौड़ाई और मोटाई लार्वा के आकार को निर्धारित करेगी जिसे अंतिम पीडीएफक्यूक्यूइड पकड़ सकता है। दो स्ट्रिप्स के बीच कम से कम 5 मिमी जगह छोड़ दें। अंतरिक्ष को कवर टेप परतों को हटा दें(चित्रा 1बी)।
    3. चिपचिपा टेप का उपयोग कर प्लेट की भीतरी सतह से धूल निकालें। मोल्ड उपयोग के लिए तैयार है।
  2. पीडीएम मिक्स तैयार करें।
    1. एक छोटे कंटेनर में 7 ग्राम पीडीएफएस बेस और 0.7 ग्राम क्यूरिंग एजेंट (10:1 अनुपात) को अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. मिश्रण से हवा निकालने के लिए कम से कम 15 किमी के लिए कंटेनर को वैक्यूम डिसिकाटर में रखें।
    3. धीरे-धीरे मोल्ड पर लगभग 5.5 ग्राम पीडीएम मिश्रण डालें ताकि 1-2 मिमी मोटाई(चित्रा 1बी)तक पहुंच जाएं।
    4. मिश्रण से शेष हवा के बुलबुले को हटाने के लिए कम से कम 15 किमी के लिए वैक्यूम डिसिकाटर में पीडीएफएस मिश्रण को फिर से रखें। एक पिपेट टिप के साथ पिछले कुछ बुलबुले तोड़ें।
    5. 2 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी इनक्यूबेटर में एक फ्लैट सतह पर पीडीएम का इलाज करें।
    6. मोल्ड के किनारे ठीक पीडीएफ को ढीला करने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें और इसे मोल्ड से अलग करें। कमरे के तापमान पर बड़े चिपचिपा टेप के दो टुकड़ों के बीच पीडीएम स्टोर करें।
    7. जल्दी और देर से तीसरे इंस्टार लार्वा के लिए, क्यूबॉइड (चित्रा 1 बी मेंबिंदीदार लाइनों के साथ) में पीडीएमएस को काट लें, जो क्यूबोइड(चित्रा 1बी, सी)के लंबे पक्ष के केंद्र में टेप स्ट्रिप (चरण 2.1.2) द्वारा बनाई गई नाली को पोजिशन करके। दूसरे इंस्टार लार्वा के लिए, क्यूबॉइड को 8 मिमी x 1 मिमी x 1 मिमी तक काट लें।

3. दीर्घकालिक समय-चूक इमेजिंग के लिए बढ़ते लार्वा

  1. बढ़ते के लिए शीर्ष कवरस्लिप तैयार करें।
    1. लार्वा के आकार से मेल खाते हुए खांचे के साथ छह पीडीएफ क्यूबॉइड चुनें। चरण 2.1.1, 2.1.2 और 2.2.7 के आधार पर अनुशंसित नाली और पीडीएफएमएस के आकार का पालन करें।
    2. चिपचिपा टेप के साथ पीडीएम की सतह से धूल निकालें।
    3. बाद में पीडीएमएस क्यूबॉइड को ठीक करने के लिए एक लंबी कवरस्लिप (22 मिमी x 50 मिमी) पर डबल-साइडटेप (12 मिमी x 5 मिमी) के चार टुकड़े संलग्न करें। दो तरफा टेप के दो टुकड़ों के बीच रिक्त स्थान पीडीएम नाली की चौड़ाई के समान होना चाहिए।
    4. प्रत्येक पीडीएफक्यूब के नाली में यूवी गोंद की एक छोटी बूंद (~ 1.2 माइक्रोन) लागू करें और कवरस्लिप पर दो तरफा टेप के बीच अंतरिक्ष में यूवी गोंद की छह छोटी बूंदें जोड़ें।
  2. बढ़ते के लिए लार्वा तैयार करें।
    1. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके, शरीर की सतह से भोजन को हटाने के लिए पानी में लार्वा को साफ करें।
    2. ढक्कन के बिना एक छोटे (35 मिमी) पेट्री डिश में गीले ऊतक कागज के एक छोटे से टुकड़े पर साफ लार्वा रखें। छोटे पेट्री डिश को एक बड़े (60 मिमी) पेट्री डिश में रखें जिसमें ड्राई टिश्यू पेपर का एक टुकड़ा होता है। रासायनिक हुड में, प्लास्टिक स्थानांतरित करने वाले पिपेट का उपयोग करके सूखे ऊतक कागज पर आइसोफ्लोरीन की 8-12 बूंदें (160-240 माइक्रोन) लागू करें और बड़े पेट्री डिश के ढक्कन को बंद करें।
    3. लार्वा की निगरानी करते समय 2-3 मिन का इंतजार करें। बड़े पेट्री डिश से लार्वा बाहर ले लो एक बार उनके मुंह हुक चलती बंद करो ।
  3. जानवरों को माउंट करते हैं।
    1. जानवर के पृष्ठीय पक्ष पर छवि संरचनाओं के लिए, कवरस्लिप का सामना कर रहे पृष्ठीय छल्ली के साथ कवरस्लिप पर दो तरफा टेप के बीच यूवी गोंद पर स्थिर लार्वा रखें।
    2. प्रत्येक लार्वा को पीडीएम ब्लॉक के साथ कवर करें और लार्वा के ट्रंक को पीडीएम के नाली में फिट करें। पीडीएम नाली के बाहर लार्वा के सिर और पूंछ को छोड़ दें। गोंद द्वारा लार्वा के सर्पिल को अवरुद्ध करने से बचें।
    3. नाली पर बल लागू किए बिना दो तरफा टेप पर पीडीएम ब्लॉक के सिरों पर नीचे प्रेस । पीडीएफएमएस के नीचे छल्ली को समतल करने के लिए लार्वा की पूंछ पर धीरे-धीरे खींचें।
    4. उच्च सेटिंग में हाथ से आयोजित यूवी लैंप का उपयोग करके 4 मिन के लिए यूवी गोंद का इलाज करें (लगभग 0.07 मीटर डब्ल्यूडब्ल्यू/मिमी2पर)।
      सावधानी: यूवी लैंप का उपयोग करते समय सुरक्षा चश्मे के साथ आंखों की रक्षा करें।
    5. कवरस्लिप को उल्टा फ्लिप करें और स्टेप 3.3.4 दोहराएं।
    6. लेंस पेपर (15 मिमी x 30 मिमी) का एक छोटा टुकड़ा गीला करें जिसमें 20 माइक्रोन-30 माइक्रोन पानी हो। इमेजिंग चैंबर(चित्रा 1ए, डी)के तल पर गीला लेंस पेपर रखें।
    7. कवरस्लिप को चैंबर पर रखें ताकि लार्वा को चैंबर के अंदर का सामना करना पड़ रहा हो। यूवी गोंद(चित्रा 1ए, डी)का उपयोग करके धातु की सतह पर कवरस्लिप के दोनों सिरों का पालन करें। लार्वा का पृष्ठीय पक्ष कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप(चित्रा 1ई)के तहत इमेजिंग के लिए तैयार है।

4. इमेजिंग

  1. एक उपयुक्त माइक्रोस्कोप के साथ छवि लार्वा। इस प्रोटोकॉल(चित्रा 2, चित्रा 3, वीडियो S2, वीडियो S3,और वीडियो S4)में दिखाए गए सभी परिणाम40x (1.30 एनए) तेल उद्देश्य के साथ एक कॉन्फोकल सिस्टम का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे।

5. इमेजिंग चैंबर और पीडीएस क्यूबॉइड की वसूली

  1. इमेजिंग के बाद लेंस पेपर का इस्तेमाल करते हुए टॉप कवरस्लिप पर तेल निकाल लें। एक रेजर ब्लेड के साथ कवरस्लिप और धातु फ्रेम के बीच की जगह में काटकर धातु फ्रेम से शीर्ष कवरस्लिप को अलग करें। इमेजिंग चैंबर पुन: उपयोग के लिए तैयार है।
  2. संदंश के साथ शीर्ष कवरस्लिप से पीडीएफक्यूइड को अलग करें। गोंद अवशेषों और धूल को हटाने के लिए चिपचिपा टेप पर पीडीएम क्यूकोइड रोल करें। पीडीएम क्यूलॉयड्स पुन: उपयोग के लिए तैयार हैं।

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Representative Results

लार्वा इमेजिंग चैंबर का निर्माण एक कस्टम-निर्मित धातु फ्रेम और दो कवरस्लिप को एक साथ चिपकाकर किया जाता है। धातु के फ्रेम का डिजाइन चित्र 1एमें निर्दिष्ट है। चैंबर के अंदर ड्रोसोफिला लार्वा यूवी गोंद और पीडीएम क्यूकोइड की सहायता से शीर्ष कवरस्लिप का पालन किया जाता है। पीडीएम क्यूबॉइड पर नाली और दो तरफा टेप क्यूबॉइड लार्वा को पकड़ने के लिए जगह बनाने के लिए जुड़ा हुआ है(चित्रा 1बी, सी)। पीडीएम लार्वा शरीर की दीवार को समतल करने और लार्वा आंदोलन को शारीरिक रूप से प्रतिबंधित करने के लिए कोमल दबाव भी लागू करता है। अंत में, नमी प्रदान करने के लिए गीले लेंस पेपर का एक छोटा सा टुकड़ा कक्ष के तल पर रखा जाता है। यह सेटअप लगातार इमेजिंग के लिए 10 घंटे से अधिक समय तक ड्रोसोफिला लार्वा को स्थिर कर सकता है। अधिकांश जानवर 10 घंटे के बाद जीवित हैं और उन्हें प्यूपल चरण में विकसित करने के लिए बरामद किया जा सकता है। इमेजिंग चैंबर एक बार में नौ लार्वा तक समायोजित कर सकता है। चित्रा 1डी कक्ष में घुड़सवार छह देर से तीसरे इंस्टार लार्वा दिखाता है। लार्वा के चड्डी तय किए जाते हैं जबकि उनके सिर और पूंछ स्थानांतरित करने के लिए स्वतंत्र हैं(चित्रा 1ई और वीडियो S1)। इस विधि का सफलतापूर्वक 15 घंटे तक लगातार उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के साथ तीसरे इंस्टार लार्वा को भटकने के लिए दूसरे इंस्टार को छवि देने के लिए उपयोग किया गया है। कक्ष ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग कर इमेजिंग के लिए बनाया गया है, लेकिन सेटअप भी बस चैंबर फ्लिपिंग द्वारा उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए काम करता है ।

यहां हम एक मॉडल के रूप में चतुर्थ श्रेणी दा (C4 दा) न्यूरॉन्स का उपयोग कर न्यूरोनल डेंडराइट गतिशीलता और dendrite पतन का अध्ययन करने में LarvaSPA के आवेदन का प्रदर्शन(चित्रा 2, चित्रा 3, वीडियो S2-S4)। C4 दा न्यूरॉन्स लार्वा शरीर की दीवार पर स्थित सोमाटोसेंसरी नोसिकेप्टर हैं, जिनके dendrites लार्वा एपिडर्मिस1,20,21,22innervate । C4 दा dendrites लार्वा विकास भर में अत्यधिक गतिशील विकास व्यवहार का प्रदर्शन, शरीर की सतह या अंतरिक्ष भरने23की पूरी कवरेज में जिसके परिणामस्वरूप । शारीरिक चोट24,25 ,26,27के बाद डेंराइट डिजनरेशन और उत्थान का अध्ययन करने के लिए सी4 दा न्यूरॉन्स का भी सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है .

इमेजिंग डेंडराइट गतिशीलता के लिए, दूसरे इंस्टार में अंडा बिछाने (एईएल) के बाद 48 घंटे से लेकर तीसरे इंस्टार में 120 घंटे एईएल तक के लार्वा को पॉइंट-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके समय-चूक इमेजिंग के लिए इमेजिंग चैंबर में रखा गया था। पीप-सीडी4-टीडीटॉम या यूएएस-सीडी4-टीडीटॉम द्वारा पीपीके-Gal46द्वारा संचालित C4 दा dendrites के विकास व्यवहार पर कब्जा करने के लिए समय-चूक फिल्मों को 3 मिन अंतराल के साथ लिया गया था। इमेजिंग अवधि (12 घंटे तक) के दौरान, सी 4 दा न्यूरॉन्स की उच्च आदेश डेन्राइट शाखाओं ने जटिल विकास व्यवहार का प्रदर्शन किया, जिसमें विस्तार, रिऐक्शन, शाखा गठन और शाखा उन्मूलन(चित्रा 2ए-2एफ),न्यूरॉन्स के स्वास्थ्य का संकेत है। हमारी फिल्मों ने होमोटाइपिक डेंड्रो-डेंडराइट रिपल्स नहोने पर भी कब्जा कर लिया जिसमें अन्य dendrites(चित्रा 2एफ)से संपर्क करने के बाद डिंडराइट टिप्स मुकर गए । कुल मिलाकर, ये परिणाम दर्शाते हैं कि लार्वास्पा का उपयोग करके समय-चूक इमेजिंग न्यूरोडेवलपमेंट का अध्ययन करने के लिए प्रभावी है।

इमेज डेंडराइट डिजनरेशन के लिए, हमने सी4 दा न्यूरोनल सेल बॉडी जने के पास प्राइमरी डेंडराइट्स को तोड़ने के लिए मैताई लेजर का इस्तेमाल किया । लार्वा को चोट (एआई) (एआई)(चित्रा 3, वीडियो एस 4)के बाद 1.5 घंटे से शुरू होने वाली इमेजिंग के लिए कक्ष में बरामद किया गया और घुड़सवार किया गया। फिल्मों में डेंडराइट डिजनरेशन के दौरान प्रमुख घटनाओं को दर्ज किया गया, जिसमें डेंडराइट सूजन, डेंडराइट विखंडन और डेंराइट मलबे की निकासी शामिल है । इसी प्रयोग में, लार्वा वसा शरीर को एनेक्सिन वी-जीएफपी (एवी-जीएफपी) को स्रावित करने के लिए भी इंजीनियर किया गया था, जो एक सेंसर था जो सेल सतह27पर बाहरी फॉस्फेटिल्डसेरीन (पीएस) को लेबल करता है। हमने एवी-जीएफपी(चित्रा 3)द्वारा अपक्षयी dendrites की विशिष्ट लेबलिंग देखी, जिससे यह सुझाव दिया गया कि पीएस को फेगोसाइटोसिस27द्वारा बाद में मंजूरी के लिए खाने-मुझे संकेत के रूप में काम करने के लिए डिजनिंग डेंडराइट्स की सतह पर उजागर किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: LarvaSPA बढ़ते के लिए इमेजिंग चैंबर । (ए)विस्तृत विनिर्देशों के साथ इमेजिंग चैंबर के चित्र, शीर्ष दृश्य और साइड व्यू दोनों दिखा । शीर्ष दृश्य में हल्का नीला छायांकन गीला लेंस पेपर इंगित करता है। चैंबर को एक टॉप कवरस्लिप और बॉटम कवरस्लिप द्वारा सील किया जाता है । घुड़सवार लार्वा की स्थिति सचित्र है। (ख)पीडीएम मोल्ड (शीर्ष दृश्य) के चित्र और पीडीएमएस मिश्रण (साइड व्यू) से भरने के बाद मोल्ड। ग्रे में स्ट्रिप्स क्रमशः दो 1-परत, दो 2-परत, और दो 3-परत टेप स्ट्रिप्स का संकेत देते हैं। साइड व्यू में पीला छायांकन मोल्ड में पीडीएम मिश्रण को इंगित करता है। बिंदीदार लाइनें बताती हैं कि ठीक हुए पीडीएम को कहां काटा जाए। आरेख का साइड व्यू स्केल करने के लिए तैयार नहीं है । (ग)एक शीर्ष दृश्य और एक पीडीएफ क्यूबॉइड का एक साइड व्यू दिखाते हुए तस्वीरें । स्केल बार = 1 मिमी.(डी)बढ़ते से पहले एक इमेजिंग चैंबर दिखा तस्वीरें, और छह स्थिर देर से तीसरे इंस्टार ड्रोसोफिला लार्वा के साथ एक इमेजिंग चैंबर पृष्ठीय पक्ष ऊपर घुड़सवार । स्केल बार = 10 मिमी.(ई)में एक लार्वा(डी)का करीब से दृश्य। स्केल बार = 1 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: dendrite गतिशीलता के समय चूक इमेजिंग । (A-एफ) इमेजिंग की शुरुआत के बाद विशिष्ट समय बिंदुओं पर चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन dendrites की समय चूक फिल्मों से चयनित फ्रेम। लार्वा की छवियां 48 घंटे एईएल(ए और एफ),72 एच एईएल(बी),96 एच एईएल(सी),और 120 घंटे एईएल(डी)ली गई थीं। न्यूरॉन्स पीपीके एंड जीटी;सीडी4-टीडीटॉम (ए, डी, ईऔर एफ)या पीपीके एंड जीटीडी4-टीडीटॉम (बी और सी)द्वारा लेबल किए जाते हैं। नीले तीर पिछले समय बिंदु की तुलना में dendrite रिऐक्शन का संकेत देते हैं। पीले तीर पिछले समय बिंदु की तुलना में डेंराइट एक्सटेंशन का संकेत देते हैं। (ई)इमेजिंग के 12 घंटे के अंत में डेंडराइट आकृति विज्ञान। (एफ)एक फिल्म में 3 मिन अंतराल के साथ लगातार फ्रेम कैसे एक दूसरे इंस्टार लार्वा में एक dendrite शाखा बढ़ाया (पीले तीर) और बाद में मुकर (नीले तीर) के बाद यह एक और dendrite के साथ संपर्क किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: dendrite पतन और एक खाने के जोखिम की समय चूक इमेजिंग मुझे संकेत । लेजर चोट के बाद चतुर्थ श्रेणी के दा न्यूरॉन के डिजनिंग dendrites की एक समय चूक फिल्म से चयनित फ्रेम । Dendrites पीपीके एंड gt;CD4-tdTomद्वारा लेबल किया गया । डिजनिंग डेंडराइट्स पर खाने-एमई सिग्नल पीएस को एनेक्सिन-जीएफपी (एवी-जीएफपी) द्वारा पाया गया था, जो वसा शरीर द्वारा स्रावित है। पीले तीर एवी-जीएफपी लेबलिंग दिखाने वाली शाखाओं की ओर इशारा करते हैं। नीले तीर विखंडन के दौर से गुजर dendrites को इंगित करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Video 1
वीडियो S1: एक तिहाई इंस्टार लार्वा एक पीडीएफएस क्यूबॉइड के पायदान में स्थिर है। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

Video 2
वीडियो S2: Dendrites विस्तार और एक दूसरे इंस्टार लार्वा में गतिशील वापस लेना । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

Video 3
वीडियो S3: Dendrites विस्तार और एक भटक तीसरे इंस्टार लार्वा में गतिशील वापस लेना । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

Video 4
वीडियो S4: Dendrites पतित और एक तिहाई इंस्टार लार्वा में लेजर चोट के बाद फॉस्फेटिल्डसेरीन बेन का पर्दाफाश । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

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Discussion

यहां हम लार्वास्पा का वर्णन करते हैं, जो दीर्घकालिक समय-चूक इमेजिंग के लिए लाइव ड्रोसोफिला लार्वा को बढ़ाते हुए एक बहुमुखी विधि है। इस विधि को लार्वा को ठीक करने या फिर से बढ़ाने की आवश्यकता नहीं है, जिससे निर्बाध इमेजिंग सक्षम होती है। इसलिए यह जैविक प्रक्रियाओं को ट्रैक करने के लिए आदर्श है जिन्हें पूरा होने में घंटों लगते हैं, जैसे कि डेंराइट डिजनरेशन और पुनर्जनन। इस विधि का उपयोग इमेजिंग इंट्रासेल्युलर कैल्शियम गतिशीलता और माइक्रोट्यूबबुल विकास जैसी उपकोशिकीय घटनाओं के लिए भी किया जा सकता है। चूंकि इमेजिंग के दौरान लार्वा शरीर की दीवार स्थिर है, इसलिए स्थानिक और लौकिक संकल्प को हाथ में इमेजिंग एप्लिकेशन को फिट करने के लिए समायोजित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, तेजी से उपसेलुलर वेसिकल आंदोलन को ट्रैक करने या न्यूरोनल शाखा पैटर्न के धीमे वैश्विक परिवर्तनों की निगरानी करने के लिए)। इसके अलावा, यह विधि विभिन्न विकासात्मक चरणों में लार्वा के साथ संगत है और इसके लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है। इस प्रकार, लार्वास्पा का उपयोग विभिन्न प्रश्नों को संबोधित करने के लिए कई ड्रोसोफिला प्रयोगशालाओं द्वारा संभावित रूप से किया जा सकता है।

विधि की सफलता को प्रभावित करने वाले कारक, जिसमें पीडीएमएस क्यूबॉइड की प्रकृति और लार्वा के विकासात्मक चरण शामिल हैं
पीडीएम क्यूबॉइड के आकार और नाली की गहराई को लार्वा के आकार से मेल खाने की आवश्यकता होती है। लार्वा के लिए बहुत व्यापक एक पीडीएम क्यूबॉइड सिर और पूंछ को कवर कर सकता है और हाइपोक्सिया का कारण बन सकता है। हालांकि, लार्वा को आगे बढ़ने से रोकने में एक संकीर्ण पीडीएम क्यूबॉइड प्रभावी नहीं हो सकता है। एक बहुत गहरी नाली इसी तरह लार्वा के आंदोलन को नियंत्रित करने के लिए पर्याप्त दबाव उत्पन्न नहीं करेगी। एक बहुत उथली नाली कवरस्लिप के लार्वा का पालन करने के लिए पर्याप्त गोंद नहीं रखेगी। हमारे अनुभव के आधार पर, लार्वा के विभिन्न चरणों के लिए पीडीएफएम और नाली के निम्नलिखित आयामों की सिफारिश की जाती है: दूसरे इंस्टार लार्वा (~ 48 एच एईएल) के लिए 1.5 मिमी x 1 मिमी x 0.063 मिमी खांचे के साथ 8 मिमी x 1 मिमी x 1 मिमी पीडीएम क्यूबॉइड; 8 मिमी x 2 मिमी x 1 मिमी पीडीएमएस क्यूबॉइड के साथ 2 मिमी x 2 मिमी x 0.126 मिमी ग्रूव ्सव्स शुरुआती तीसरे इनस्टार लार्वा (~ 72 घंटे एईएल) के लिए; देर से तीसरे इंस्टार लार्वा (~ 96 एच एईएल या पुराने) के लिए 2 मिमी x 2 मिमी x 0.189 मिमी खांचे के साथ 8 मिमी x 2 मिमी 1 मिमी पीडीएमएस क्यूबॉइड।

तीसरे इंस्टार लार्वा (पर या पुराने 120 घंटे एईएल से अधिक) भटकछोटे लोगों की तुलना में कम चलते हैं और एक बार कक्ष में घुड़सवार जीवित रहने के लिए कम नमी की आवश्यकता होती है। इनमें मोटा छल्ली भी होती है और वे ज्यादा शारीरिक तनाव सह सकते हैं। इसलिए, तीसरे इंस्टार लार्वा को भटकने का उपयोग करने वाले प्रयोगों में उच्चतम सफलता दर होती है। हमारे हाथों में, तीसरे इंस्टार लार्वा भटकने के 80% से अधिक बच गए और बढ़ते के बाद 12 घंटे स्थिर रहे। इमेजिंग के दौरान लार्वा को प्यूरीट करने से रोकने के लिए, हम 96 एच से 120 घंटे एईएल के बीच लार्वा को बढ़ाने की सलाह देते हैं। छोटे तीसरे इंस्टार लार्वा इमेजिंग के दौरान भागने या मौत का एक बड़ा मौका है। आमतौर पर, एक ही कक्ष में घुड़सवार 6 युवा तीसरे इंस्टार लार्वा में से कम से कम 2 जीवित रहेंगे और बढ़ते होने के बाद 10 घंटे स्थिर रहेंगे। दूसरे इंस्टार लार्वा के साथ हमारा अनुभव सीमित है और जीवित रहने की दर का अनुमान लगाना मुश्किल है। फिर भी, हमने इस विधि का उपयोग करके 7 एच के लिए दूसरे इंस्टार लार्वा को सफलतापूर्वक चित्रित किया है।

दीर्घकालिक इमेजिंग की संभावित चिंताएं
हालांकि LarvaSPA इमेजिंग dendrite विकास गतिशीलता और पतन के लिए बहुत उपयोगी रहा है, वहां कुछ संभावित चेतावनी पर विचार कर रहे हैं । सबसे पहले, हमारी वर्तमान विधि में, लार्वा इमेजिंग की पूरी अवधि के लिए भोजन से वंचित हैं, जिससे कई ऊतकों में भुखमरी से प्रेरित प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं। हमने बढ़ते के बाद 10 घंटे के आसपास एपिडर्मल कोशिकाओं में दानेदार संरचनाओं का गठन देखा है, जो ऑटोफैगी से परिणाम हो सकता है। इसलिए, इमेजिंग के पहले कुछ घंटों में प्राप्त परिणाम अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक होने चाहिए। लंबे समय के पैमाने पर परिणाम अधिक सतर्क व्याख्या की आवश्यकता होती है। इस चिंता को कम करने के लिए, हमारी प्रक्रिया संभवतः लार्वा खिलाने के लिए अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । दूसरा, हमारी विधि शारीरिक बाधा और पोषक तत्वों के सेवन की कमी के कारण युवा लार्वा के तेजी से विकास में हस्तक्षेप कर सकती है। हालांकि, यह चिंता पुराने जानवरों पर लागू नहीं हो सकती है। उदाहरण के लिए, तीसरे इंस्टार लार्वा को भटकना 12 घंटे की निरंतर इमेजिंग के बाद भी पिल्ले में बदल सकता है, जिससे यह विधि प्रारंभिक कायापलट की जांच के लिए आदर्श बन जाती है। तीसरा, वसा शरीर और आंत जैसी गहरी संरचनाओं की इमेजिंग कुछ चुनौतियां प्रस्तुत करती है। एक मुख्य कारण यह है कि गहरे ऊतक अक्सर इमेजिंग के दौरान आगे बढ़ते हैं और इसलिए पोस्टप्रोसेसिंग में गति सुधार की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, प्रकाश पथ में अपवर्तक सूचकांकों के बेमेल गहरे ऊतकों की इमेजिंग करते समय गोलाकार विचलन का कारण बन सकते हैं। जबकि तेल के उद्देश्य दा न्यूरॉन्स इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं क्योंकि उनके dendrites शरीर की सतह से 15 μm के भीतर हैं, पानी विसर्जन उद्देश्यलार्वा के अंदर गहरी इमेजिंग के लिए अपवर्तक-सूचकांक बेमेल को सही करने के लिए बेहतर विकल्प हो सकते हैं। चौथा, क्योंकि C4 दा न्यूरॉन्स यूवी प्रकाश28द्वारा सक्रिय किया जा सकता है, लार्वा बढ़ते के दौरान यूवी प्रकाश का उपयोग कर संभवतः C4 दा न्यूरॉन शरीर विज्ञान बदल सकते हैं । यद्यपि हम जो प्रकाश तीव्रता की सलाह देते हैं वह उन स्तरों से काफी नीचे है जो C4da न्यूरॉन्स28को मजबूती से सक्रिय करते हैं, C4da न्यूरोनल गतिविधि से संबंधित परिणामों की सावधानी से व्याख्या किए जाने की आवश्यकता है। यूवी गोंद जैविक नमूनों की एक विस्तृत विविधता इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है29,30,31 और हमारे हाथों में लार्वा के लिए स्पष्ट विषाक्तता का कारण नहीं है । अंत में, किसी को वीवो लाइव इमेजिंग में उचित माइक्रोस्कोप सेटअप पर विचार करना चाहिए। उदाहरण के लिए, अनुनाद स्कैनर और कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग के लिए बेहतर विकल्प हैं क्योंकि वे कम फोटोटॉक्सिकिटी और फोटोब्लीचिंग का कारण बनते हैं; मल्टी-फोटॉन माइक्रोस्कोपी लार्वा में गहरी आंतरिक संरचनाओं को इमेजिंग करने के लिए अधिक प्रभावी है; दीर्घकालिक इमेजिंग नमूना या ध्यान बहती है, जो संभवतः पोस्ट इमेजिंग प्रसंस्करण द्वारा सही किया जा सकता है के लिए प्रवण हो सकता है ।

लार्वास्पा के लिए विफलता के सबसे आम कारण और उन्हें संबोधित करने के लिए अनुशंसित समाधान

  1. लार्वा बहुत अधिक चलते हैं या बच जाते हैं: दो सामान्य कारण इस समस्या में योगदान दे सकते हैं। पहला यह है कि पीडीएम नाली लार्वा के लिए बहुत उथली या बहुत गहरी हो सकती है। एक अलग नाली गहराई के साथ एक और पीडीएफ क्यूबॉइड की कोशिश करने से समस्या का समाधान हो सकता है। दूसरा कारण यह है कि चैंबर में बहुत ज्यादा नमी होती है, जिससे यूवी ग्लू कमजोर हो जाता है। कक्ष में लेंस पेपर में जोड़े गए पानी की मात्रा को कम करने से लार्वा को स्थिर करने में मदद मिल सकती है। इसके अलावा, केवल पीडीएफक्यूब द्वारा कवर किए गए खंडों को छवि देने का प्रयास करें, क्योंकि सिर और पूंछ स्थानांतरित करने के लिए स्वतंत्र हैं।
  2. इमेजिंग के दौरान लार्वा मर जाता है: यदि इमेजिंग के तुरंत बाद एक लार्वा मर जाता है, तो यह संभावना है कि यह बहुत अधिक संवेदनाकारियों के संपर्क में था। ठीक से एनेस्थेटाइज्ड लार्वा बढ़ते के बाद जागना चाहिए और मुंह हुक विस्तार और रिऐक्शन और पृष्ठीय पोत संकुचन सहित गति दिखाना चाहिए। इस समस्या को हल करने के लिए, लार्वा को एनेस्थेटिज़ करने के लिए कम आइसोफ्लोरीन का उपयोग किया जा सकता है। मुंह के हुक के चलने के तुरंत बाद संज्ञाहरण पेट्री डिश से एक लार्वा स्थानांतरित करें। अगर इमेजिंग के करीब एक घंटे बाद लार्वा मर जाता है तो आमतौर पर डिहाइड्रेशन की वजह से ऐसा होता है। सीलिंग से पहले इमेजिंग चैंबर में गीला लेंस पेपर का एक टुकड़ा रखना याद रखें। घातकता का एक और आम कारण यह है कि यूवी गोंद सर्पिल को अवरुद्ध करता है। लार्वा के मध्य खंडों के लिए यूवी गोंद को सीमित करने की कोशिश करें और सिर और पूंछ को कवर करने से बचें। एक पीढ़ी चौड़ा पीडीएफक्यूब भी आसानी से यूवी गोंद को सर्पिल को अवरुद्ध करने का कारण बन सकता है।
  3. शरीर की दीवार पर सिलवटों इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप: बढ़ते के दौरान सिलवटों पैदा करने से बचने के लिए, संज्ञाहरण कदम के दौरान लार्वा को पूरी तरह से स्थिर करना महत्वपूर्ण है। जब लार्वा लकवाग्रस्त हो जाता है, तो शरीर को सीधा और खिंचाव करना आसान होता है। 96 एच एईएल से पुराने जानवरों के लिए, यूवी गोंद का इलाज करने से पहले पूंछ को धीरे से खींचने से गुना गठन को प्रभावी ढंग से कम किया जा सकता है। युवा लार्वा की पूंछ खींचने की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि उनके शरीर की दीवारें नाजुक हैं।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

हम लारवास्पा विधि के एक पुराने संस्करण की स्थापना के लिए लिंगफेंग तांग का शुक्रिया अदा करते हैं; इमेजिंग चैंबर के पहले प्रोटोटाइप बनाने के लिए कॉर्नेल ओलिन हॉल मशीन की दुकान पर ग्लेन हंस; धातु के फ्रेम के निर्माण और पीडीएफक्यूब्स बनाने पर सुझाव प्रदान करने के लिए फिलिप इसरमैन; माइक्रोस्कोप तक पहुंच के लिए कॉर्नेल बीआरसी इमेजिंग सुविधा (एनआईएच ग्रांट S10OD018516 द्वारा वित्त पोषित); पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए मारिया सापड़। इस काम को एचजे को सम्मानित एक कॉर्नेल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था; एक कॉर्नेल स्टार्ट-अप फंड और एनआईएच अनुदान (R01NS099125 और R21OD023824) सीएच एचजे और सीएच को प्रदान की परियोजना की कल्पना की और प्रयोगों को डिजाइन किया । एचजे ने प्रयोग किए । एचजे और सीएच ने पांडुलिपि लिखी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6061 Aluminum bars McMaster-Carr 9246K421
3M double-sided tape Ted Pella, Inc. 16093
3M Scotch Packaging tape 3M 1.88"W x 22.2 Yards
DUMONT #3 Forceps Fisher Scientific 50-241-34
Glass coverslip Azer Scientific 1152250
Isoflurane Midwest Veterinary Supply 193.33161.3
Leica Confocal Microscope Leica SP8 equipped with a resonant scanner
Lens paper Berkshire LN90.0406.24
Petri dishes (medium) VWR 25373-085
Petri dishes (small) VWR 10799-192
Razor blade Ted Pella, Inc. 121-20
Rectangular petri dish VWR 25384-322
SYLGARD 184 kit (PBMS kit) Electron Microscopy Sciences 24236-10
Transferring pipette Thermo Fisher Scientific 1371126
UV glue Norland products #6106, NOA 61 Refractive Index 1.56
UV lamp (Workstar 2003) Maxxeon MXN02003
Vacuum desiccator Electron Microscopy Sciences 71232
Wipes Kimberly-Clark Kimwipes

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References

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Ji, H., Han, C. LarvaSPA, A Method… More

Ji, H., Han, C. LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging. J. Vis. Exp. (156), e60792, doi:10.3791/60792 (2020).

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