Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

LarvaSPA, en metode for montering drosophila larve for langsiktig time-lapse imaging

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60792
Automatic Translation
1, 1
1Weill Institute for Cell and Molecular Biology and Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for montering av Drosophila larver for å oppnå mer enn 10 timer uavbrutt time-lapse imaging hos intakte levende dyr. Denne metoden kan brukes til å bilde mange biologiske prosesser nær larval kroppen veggen.

Abstract

Live imaging er en verdifull tilnærming for å undersøke cellebiologi spørsmål. Drosophila larve er spesielt egnet for in vivo levende bildebehandling fordi larval kroppen veggen og de fleste indre organer er gjennomsiktig. Imidlertid har kontinuerlig levende avbildning av intakte Drosophila larver i mer enn 30 min vært utfordrende fordi det er vanskelig å ikke-invasivt immobilisere larver i lang tid. Her presenterer vi en larvemonteringsmetode kalt LarvaSPA som muliggjør kontinuerlig avbildning av levende Drosophila larver med høy temporal og romlig oppløsning i mer enn 10 timer. Denne metoden innebærer delvis å feste larver til dekkslip ved hjelp av et UV-reaktivt lim og i tillegg begrense larval bevegelse ved hjelp av en polydimethylsiloxane (PDMS) blokk. Denne metoden er kompatibel med larver på utviklingsstadier fra andre instar til vandrende tredje instar. Vi viser anvendelser av denne metoden for å studere dynamiske prosesser av Drosophila somatosensoriske nevroner, inkludert dendrittvekst og skadeindusert dendrittdegenerasjon. Denne metoden kan også brukes til å studere mange andre cellulære prosesser som skjer nær larval kroppsveggen.

Introduction

Time-lapse live imaging er en kraftig metode for å studere dynamiske cellulære prosesser. Den romlige og timelige informasjonen fra time-lapse-filmer kan avsløre viktige detaljer for å svare på cellebiologispørsmål. Drosophila larve har vært en populær in vivo modell for undersøkelser ved hjelp av live imaging fordi den gjennomsiktige kroppsveggen tillater ikke-invasiv avbildning av interne strukturer1,2. I tillegg er mange genetiske verktøy tilgjengelig i Drosophila for å fluorescerende merke anatomiske strukturer og makromolekyler3. Langvarig tidsforløpsavbildning av Drosophila larver er imidlertid utfordrende. I motsetning til stasjonære tidlige embryoer eller pupper beveger Drosophila larver seg hele tiden, noe som nødvendiggjør immobilisering for levende bildebehandling. Effektive måter å immobilisere levende Drosophila larver inkluderer montering i halokarbonolje med kloroform4, beholdende ved hjelp av isofluran eeller Dichlorvos løsning5,og komprimere mellom dekkslip og mikroskoplysbilde6 . Selv om noen av disse metodene har blitt brukt til mikroskopi, er ingen av dem effektive for langsiktig live imaging. Andre metoder ble utviklet for bildeveggnevroner i krypende larver ved hjelp av konvensjonell konfokal mikroskopi eller lysarkmikroskopi7,8,9. Disse metodene er imidlertid ikke ideelle for overvåking av cellulær dynamikk på grunn av larverbevegelsen.

Nye metoder er utviklet for å oppnå langsiktig time-lapse avbildning av Drosophila larver. Ved hjelp av en polydimethylsiloxane (PDMS) "larvechip", kan Drosophila larver effektivt immobiliseres gjennom vakuumgenerert suging i et spesialisert mikrokammer uten betisering. Denne metoden gir imidlertid ikke høy timelig oppløsning for cellebiologistudier, og den har strenge begrensninger på dyrstørrelse10. En annen metode ved hjelp av en anestesilege oppnådde levende avbildning av Drosophila larver på flere tidspunkter og har blitt brukt til å studere nevromuskulære veikryss11,12,13,14,15,16. Denne metoden tillater imidlertid heller ikke kontinuerlig bildebehandling i mer enn 30 min og krever bruk av desfluran gjentatte ganger, noe som kan hemme nevrale aktivitet og påvirke den biologiske prosessen som studeres17,18. Nylig har en ny metode som kombinerer mikrofluidisk enhet og kryoanesthesi blitt brukt til å immobilisere larver av forskjellige størrelser i korte perioder (minutter)19. Denne metoden krever imidlertid spesialiserte enheter som et kjølesystem og lengre perioder med immobilisering krever gjentatt kjøling av larver.

Her presenterer vi en allsidig metode for å immobilisere Drosophila larver som er kompatible med uavbrutt time-lapse imaging i mer enn 10 timer. Denne metoden, som vi kaller "Larva Stabilisering av Delvis Vedlegg" (LarvaSPA), innebærer å følge larval cuticle til en coverslip for bildebehandling i et spesialbygd bildekammer. Denne protokollen beskriver hvordan man lager bildekammeret og hvordan man monterer larver på en rekke utviklingsstadier. I LarvaSPA-metoden festes de ønskede kroppssegmentene til dekksslip ved hjelp av et UV-reaktivt lim. En PDMS cuboid i tillegg legger press på larver, hindrer flukt. Luften og fuktigheten i bildekammeret sikrer overlevelsen av de delvis immobiliserte larver under bildebehandling. Fordeler med LarvaSPA over andre teknikker inkluderer følgende: (1) Det er den første metoden som tillater kontinuerlig levende avbildning av intakte Drosophila larver i timevis med høy temporal og romlig oppløsning; (2) Metoden har færre begrensninger på larval størrelse; (3) Bildekammeret og PDMS cuboids kan produseres til en minimal kostnad og kan brukes på nytt.

I tillegg til å beskrive larval monteringsmetoden, gir vi flere eksempler på sin søknad om å studere dendrittutvikling og dendrittdegenerasjon av Drosophila dendritic arborization (da) nevroner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Lage bildekammeret

  1. Metallrammen kan konstrueres fra en aluminiumsblokk i en typisk maskinbutikk. Spesifikasjonene til rammen er illustrert i figur 1A.
  2. For å konstruere bildekammeret, forsegle bunnen av metallrammen ved hjelp av en lang dekkslip (22 mm x 50 mm) og UV-lim (Figur 1A). Herd UV-limet ved hjelp av en håndholdt UV-lampe.

2. Lage PDMS cuboids

  1. Forbered formen for PDMS cuboids.
    1. Fest lag med emballasjetape til den indre overflaten av en rektangulær (80 mm x 55 mm) Petriskål eller rund cellekulturplate. Bruk ett lag (0,063 mm tykt) for andre instar larver, 2 lag (0,126 mm tykk) for tidlig tredje instar larver, eller tre lag (0,189 mm tykke) for sen tredje instar larver(Figur 1B).
    2. Skjær tapen i strimler av spesifikk bredde med et barberblad: 1,5 mm for 1-lags tape og 2 mm for 2-lags eller 3-lags tape. Bredden og tykkelsen på stripen vil bestemme størrelsen på larver som den endelige PDMS cuboid kan holde. La minst 5 mm mellomrom mellom de to stripene. Fjern tapelagene som dekker plassen (Figur 1B).
    3. Fjern støv fra den indre overflaten av platen ved hjelp av klebrig tape. Formen er klar til bruk.
  2. Klargjør PDMS-blandingen.
    1. Bland 7 g PDMS-sokkel og 0,7 g herdemiddel (10:1-forhold) grundig i en liten beholder.
    2. Plasser beholderen i en vakuumdesiccator i minst 15 min for å fjerne luft fra blandingen.
    3. Hell langsomt ca 5,5 g PDMS-blandingen på formen for å nå en tykkelse på 1–2 mm (figur 1B).
    4. Plasser PDMS-blandingen i vakuumutsiccatoren igjen i minst 15 min for å fjerne gjenværende luftbobler fra blandingen. Bryt de siste boblene med en pipettespiss.
    5. Herd PDMS på en flat overflate i en varmeinkubator ved 65 °C i 2 timer.
    6. Bruk et barberblad til å løsne de herdede PDMS langs kanten av formen og løsne den fra formen. Oppbevar PDMS mellom to stykker stort klebrig tape ved romtemperatur.
    7. For tidlig og sent tredje instar larver, kutt PDMS i 8 mm x 2 mm x 1 mm cuboids (langs de stiplede linjene i figur 1B) ved å plassere sporet som er opprettet av båndstripen (trinn 2.1.2) i midten av langsiden av cuboid (Figur 1B,C). For andre instar larver, kutt cuboid til 8 mm x 1 mm x 1 mm.

3. Montering av larver for langtidsforløpsbilde

  1. Klargjør toppdekselet slip for montering.
    1. Velg seks PDMS cuboids med spor som samsvarer med størrelsenpå larver. Følg anbefalt spor og størrelse på PDMS basert på trinn 2.1.1, 2.1.2 og 2.2.7.
    2. Fjern støv fra overflaten av PDMS med klebrig tape.
    3. Fest fire stykker dobbeltsidig tape (12 mm x 5 mm) på en lang dekkslip (22 mm x 50 mm) for å feste PDMS cuboids senere. Mellomrom mellom de to stykkene av dobbeltsidig tape bør være det samme som bredden på PDMS-sporet.
    4. Påfør en liten dråpe (~ 1,2 μL) UV-lim i sporet på hver PDMS cuboid og legg til seks små dråper UV-lim i mellomrommet mellom det dobbeltsidige båndet på dekksslip.
  2. Forbered larvene for montering.
    1. Bruk et par tang til å rengjøre larver i vann for å fjerne mat fra kroppsoverflaten.
    2. Legg rene larver på et lite stykke fuktet vevpapir i en liten (35 mm) Petriskål uten lokk. Legg den lille Petri-fatet i en stor (60 mm) Petriskål som inneholder et stykke tørrvevspapir. I en kjemisk hette, påfør 8-12 dråper (160–240 μL) isofluran på tørrvevspapiret ved hjelp av en plastoverføringspipette og lukk lokket på den store Petri-fatet.
    3. Vent 2–3 min mens du overvåker larver. Ta ut larver fra den store Petri-parabolen når munnkrokene slutter å bevege seg.
  3. Monter dyrene.
    1. Til bildestrukturer på dyrets dorsalside plasserer du de immobiliserte larver på UV-limet mellom det dobbeltsidige båndet på dekksslipen med dorsalsøta mot dekkslip.
    2. Dekk hver larve med en PDMS-blokk og monter stammen på larven inn i sporet på PDMS. La hodet og halen på larven utenfor PDMS-sporet. Unngå å blokkere spirakler av larven ved limet.
    3. Trykk ned på endene av PDMS-blokken på det dobbeltsidige båndet uten å bruke kraft på sporet. Trekk forsiktig på larvens hale for å flate skjellaget under PDMS.
    4. Herd UV-limet i 4 min ved hjelp av en håndholdt UV-lampe ved høy innstilling (på ca. 0,07 mW/mm2).
      FORSIKTIG: Beskytt øynene med vernebriller mens du bruker UV-lampen.
    5. Vend trekkseddelen opp ned og gjenta trinn 3.3.4.
    6. Fukt et lite stykke linsepapir (15 mm x 30 mm) med 20 μL–30 μL vann. Plasser det fuktede linsepapiret nederst i bildekammeret(figur 1A,D).
    7. Plasser dekksslip på kammeret slik at larvene vender mot innsiden av kammeret. Fest begge endene av dekksslipen til metalloverflaten ved hjelp av UV-lim(figur 1A,D). Den dorsal siden av larver er klar for bildebehandling under konfokal mikroskop (Figur 1E).

4. Bildebehandling

  1. Bilde larver med et passende mikroskop. Alle resultatene som vises i denne protokollen (Figur 2, Figur 3, Video S2, Video S3og Video S4) ble kjøpt ved hjelp av et konfokalsystem med et 40x (1.30 NA) oljemål.

5. Gjenoppretting av bildekammer og PDMS cuboids

  1. Etter bildebehandling fjerner du oljen på toppdekselet slip med et linsepapir. Løsne toppdekselet slip fra metallrammen ved å kutte inn i rommet mellom dekkslip og metallrammen med et barberblad. Bildekammeret er klart for gjenbruk.
  2. Løsne PDMS cuboids fra toppdekselet slip med tang. Rull PDMS cuboids på klebrig tape for å fjerne limrester og støv. PDMS cuboids er klar for gjenbruk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Larvens bildekammer er konstruert ved å lime en skreddersydd metallramme og to coverslips sammen. Utformingen av metallrammen er angitt i figur 1A. Drosophila larver inne i kammeret er festet til toppdekselet slip ved hjelp av UV-lim og PDMS cuboids. Sporet på PDMS cuboid og dobbeltsidig tape cuboid er festet for å skape plass til å holde larver (Figur 1B, C). PDMS bruker også mildt trykk for å flate ut larvalenslegeveggen og fysisk begrense larvalbevegelsen. Til slutt plasseres et lite stykke vått linsepapir nederst i kammeret for å gi fuktighet. Dette oppsettet kan immobilisere Drosophila larver i mer enn 10 timer for kontinuerlig bildebehandling. De fleste dyrene er i live etter 10 timer og kan gjenopprettes for å vokse inn i pupalstadiet. Bildekammeret kan romme opptil ni larver samtidig. Figur 1D viser seks sene tredje instar larver montert i kammeret. Stammene i larver er festet mens hodet og halene er fri til å bevege seg (Figur 1E og Video S1). Denne metoden har blitt brukt til å bilde andre instar til vandrende tredje instar larver med kontinuerlig høyoppløselig bildebehandling i opptil 15 timer. Kammeret er designet for bildebehandling ved hjelp av oppreist mikroskop, men oppsettet fungerer også for inverterte mikroskoper ved ganske enkelt å vende kammeret.

Her demonstrerer vi anvendelsen av LarvaSPA i å studere nevronal dendrittdynamikk og dendrittdegenerasjon ved hjelp av klasse IV da (C4 da) nevroner som modell (Figur 2, Figur 3, Videoer S2-S4). C4 da nevroner er somatosensoriske nociceptors som ligger på larval kroppen veggen, hvis dendritter innervate larval epidermis1,20,21,22. C4 da dendritts viser svært dynamisk vekstatferd gjennom larvalutviklingen, noe som resulterer i fullstendig dekning av kroppsoverflaten eller romfylling23. C4 da nevroner har også blitt brukt til å studere dendrittdegenerasjon og regenerering etter fysisk skade24,25,26,27.

For bildedendrittdynamikk ble larver fra 48 timer etter egglegging (AEL) ved andre instar til 120 h AEL ved vandrende tredje instar montert i bildekammeret for time-lapse imaging ved hjelp av punktskanning konfokal mikroskopi. Time-lapse filmer ble tatt med en 3 min intervall for å fange vekst atferd av C4 da dendritts merket av ppk-CD4-tdTom eller UAS-CD4-tdTom drevet av ppk-Gal46. Gjennom bildebehandlingsperioden (opptil 12 timer) viste de høye ordredendrittgrenene av C4 da nevroner kompleks vekstatferd, inkludert forlengelse, tilbaketrekking, grensdannelse og greneliminering (figur 2A-2F), som indikerer nevronenes helse. Våre filmer fanget også homotypic dendro-dendrite frastøtelser der dendritttips trukket tilbake etter å ha kontaktet andre dendritter (Figur 2F). Samlet sett viser disse resultatene at tidsforløpsavbildning ved hjelp av LarvaSPA er effektiv for å studere nevroutvikling.

Til bilde dendrittdegenerasjon brukte vi en MaiTai-laser til å bryte primære dendritter i nærheten av C4 da nevronale cellelegemer. Larvene ble gjenopprettet og montert i kammeret for bildebehandling fra 1,5 timer etter skade (AI) (Figur 3, Video S4). Filmene spilte inn viktige hendelser under dendrittdegenerasjon, inkludert dendritthevelse, dendrittfragmentering og clearance av dendrittavfall. I samme eksperiment ble larvalfettkroppen også utviklet for å skille ut Annexin V-GFP (AV-GFP), en sensor som merker eksternisert fosfatidylserin (PS) på celleoverflaten27. Vi observerte spesifikk merking av de degenererende dendrittene av AV-GFP (figur 3), noe som tyder på at PS ble utsatt på overflaten av degenererende dendritter for å tjene som et spise-meg-signal for påfølgende clearance av fagocytose27.

Figure 1
Figur 1: Bildekammeret for LarvaSPA-montering. (A) Diagrammer av bildekammeret med detaljerte spesifikasjoner, som viser både øverste visning og sidevisningen. Den lyseblå skyggeleggingen i toppvisningen indikerer det fuktede linsepapiret. Kammeret er forseglet av en toppdekselslip og en bunndekselslip. Posisjonen til en montert larve er illustrert. (B) Diagrammer av PDMS-formen (øverste visning) og formen etter fylling med PDMS-blandingen (sidevisning). Striper i grått indikerer henholdsvis to 1-lags, to 2-lags og to 3-lags tapestrimler. Den gule skyggeleggingen i sidevisningen indikerer PDMS-blandingen i formen. De stiplede linjene angir hvor de herdede PDMS skal kuttes. Sidevisningen av diagrammet tegnes ikke til skalering. (C) Fotografier som viser en toppvisning og en sidevisning av en PDMS cuboid. Skala bar = 1 mm. (D) Fotografier som viser et bildekammer før montering, og et bildekammer med seks immobilisert sen tredje instar Drosophila larver montert dorsal side opp. Skala bar = 10 mm. (E) En nærmere visning av en larve i (D). Skala bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Time-lapse bildebehandling av dendrittdynamikk. -Jeghar ikke noe åsitil deg. Utvalgte rammer fra time-lapse filmer av klasse IV da neuron dendritts på bestemte tidspunkter etter starten av bildebehandling. Bilder av larver ble tatt 48 h AEL (A og F), 72 h AEL (B), 96 h AEL (C) og 120 h AEL (D). Nevronene er merket av ppk>CD4-tdTom (A, D, Eog F) eller ppk > CD4-tdTom (B og C). Blå piler indikerer dendritttilbaketrekking sammenlignet med forrige tidspunkt. Gule piler indikerer dendrittutvidelser sammenlignet med forrige tidspunkt. (E) Dendritt morfologi på slutten av 12 h bildebehandling. (F) Sammenhengende rammer med 3 min intervaller i en film som illustrerer hvordan en dendrittgren i en annen instar larve utvidet (gule piler) og deretter trukket tilbake (blå piler) etter at den fikk kontakt med en annen dendritt. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Tidsforløpavbildning av dendrittdegenerasjon og eksponering av et spise-meg-signal. Utvalgte rammer fra en time-lapse film av degenererende dendritter av en klasse IV da neuron etter laserskade. Dendritter ble merket av ppk>CD4-tdTom. Eat-me signal PS på degenererende dendritter ble oppdaget av Annexin-GFP (AV-GFP), som utskilles av fettkroppen. Gule piler peker mot grenene som viser AV-GFP-merking. Blå piler peker på dendritter som gjennomgår fragmentering. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Video 1
Video S1: En tredje instar larve er immobilisert i hakket av en PDMS cuboid. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 2
Video S2: Dendritts strekker seg og trekkes dynamisk tilbake i en annen instar larve. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 3
Video S3: Dendritts strekker seg og trekkes dynamisk tilbake i en vandrende tredje instar larve. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 4
Video S4: Dendritts degenererer og eksponerer fosfatidylserin etter laserskade i en tredje instar larve. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi LarvaSPA, en allsidig metode for montering live Drosophila larver for langsiktig time-lapse imaging. Denne metoden krever ikke utvinne eller remontering larver, slik at uavbrutt bildebehandling. Det er derfor ideelt for å spore biologiske prosesser som tar timer å fullføre, for eksempel dendrittdegenerasjon og regenerering. Denne metoden kan også brukes til bildebehandling intracellulær kalsiumdynamikk og subcellulære hendelser som mikrotubulvekst. Siden larvalensvegg er stabil under avbildningen, kan den romlige og timelige oppløsningen justeres for å passe til bildebehandlingsprogrammet for hånden (f.eks. for å spore rask subcellulær vesikkelbevegelse eller for å overvåke langsomme globale endringer av nevronale grenmønstre). I tillegg er denne metoden kompatibel med larver på ulike utviklingsstadier og krever ikke spesialutstyr. Dermed kan LarvaSPA potensielt brukes av mange Drosophila laboratorier for å løse ulike spørsmål.

Faktorer som påvirker suksessen til metoden, inkludert arten av PDMS cuboid og utviklingsstadiet av larver
Størrelsen på PDMS cuboid og dybden av sporet må matche størrelsen på larver. En PDMS cuboid for bred for larver kan dekke hodet og halen og forårsake hypoksi. En smal PDMS cuboid kan imidlertid ikke være effektiv for å forhindre at larvene beveger seg. Et for dypt spor på samme måte ville ikke generere nok trykk for å begrense bevegelsen av larver. Et for grunt spor ville ikke holde nok lim til å feste larver til dekkslip. Basert på vår erfaring anbefales følgende dimensjoner av PDMS og sporet for ulike stadier av larver: 8 mm x 1 mm x 1 mm x 1 mm PDMS cuboids med 1,5 mm x 1 mm x 0,063 mm grooves for andre instar larver (~ 48 h AEL); 8 mm x 2 mm x 1 mm PDMS cuboids med 2 mm x 2 mm x 0,126 mm spor for tidlig tredje instar larver (~ 72 h AEL); 8 mm x 2 mm x 1 mm PDMS cuboids med 2 mm x 2 mm x 0,189 mm spor for sen tredje instar larver (~ 96 h AEL eller eldre).

Vandrende tredje instar larver (ved eller eldre enn 120 h AEL) beveger seg mindre sammenlignet med yngre og krever mindre fuktighet for å overleve en gang montert i kammeret. De har også en tykkere skjellaget og kan tåle mer fysisk stress. Derfor har eksperimenter ved hjelp av vandrende tredje instar larver den høyeste suksessraten. I våre hender overlevde mer enn 80% av vandrende tredje instar larver og forble immobile 12 timer etter montering. For å forhindre larver fra å pupariating under bildebehandling, anbefaler vi at du monterer larver mellom 96 timer og 120 timer AEL. Yngre tredje instar larver har større sjanse for å unnslippe eller død under bildebehandling. Vanligvis ville minst 2 av 6 unge tredje instar larver montert i samme kammer overleve og forbli immobile 10 timer etter montering. Vår erfaring med andre instar larver er begrenset og overlevelsesraten er vanskelig å anslå. Likevel har vi med hell avbildet andre instar larver i 7 t ved hjelp av denne metoden.

Potensielle bekymringer for langsiktig bildebehandling
Selv om LarvaSPA har vært svært nyttig for imaging dendritt vekstdynamikk og degenerasjon, er det noen potensielle advarsler å vurdere. For det første, i vår nåværende metode, blir larvene fratatt mat for hele avbildningens varighet, noe som kan føre til sultinduserte reaksjoner i mange vev. Vi har observert dannelse av granulære strukturer i epidermale celler rundt 10 timer etter montering, noe som kan skyldes autofagi. Derfor bør resultatene oppnådd i de første timene av bildebehandling være mer fysiologisk relevant. Resultater over lengre tidsskalaer krever mer forsiktig tolkning. For å minimere denne bekymringen, kan vår prosedyre potensielt tilpasses for å tillate larvalfôring. For det andre kan vår metode forstyrre den raske veksten av yngre larver på grunn av den fysiske begrensningen og mangelen på næringsinntak. Denne bekymringen gjelder imidlertid ikke for eldre dyr. For eksempel kan vandrende tredje instar larver bli til pupper selv etter 12 t kontinuerlig avbildning, noe som gjør denne metoden ideell for undersøkelser av tidlig metamorfose. For det tredje, bildebehandling av dypere strukturer som fettkroppen og tarmen presenterer noen utfordringer. En hovedårsak er at dypere vev ofte beveger seg under bildebehandling og krever derfor bevegelseskorreksjon i etterbehandling. I tillegg kan uoverensstemmelser av brytningsindekser i lysbanen forårsake sfærisk avvik når man forestiller dypere vev. Mens oljemål er hensiktsmessig for bildebehandling da nevroner fordi deres dendritter er innenfor 15 μm fra kroppsoverflaten, kan vannnedsenking mål være bedre valg for å korrigere brytningsindeks uoverensstemmelser for bildebehandling dypere inne i larver. Fjerde, fordi C4 da nevroner kan aktiveres av UV-lys28, ved hjelp av UV-lys under larval montering kan potensielt endre C4 da neuron fysiologi. Selv om lysintensiteten vi anbefaler er langt under nivåene som robust aktiverer C4da nevroner28,må resultatene knyttet til C4da nevronal aktivitet tolkes forsiktig. UV-limet har blitt brukt til å forestille seg et bredt utvalg av biologiske prøver29,30,31 og forårsaker ikke åpenbar toksisitet for larver i våre hender. Til slutt bør man vurdere riktig mikroskopoppsett for in vivo live imaging. For eksempel er resonansskannere og spinnende platekonfokale mikroskoper bedre alternativer for langsiktig live imaging fordi de forårsaker mindre fototoksisitet og fotobleking; multi-fotonmikroskopi er mer effektiv for å forestille dypere indre strukturer i larver; langtidsbildebehandling kan være utsatt for prøve- eller fokusdrifting, noe som potensielt kan korrigeres ved behandling etter bildebehandling.

De vanligste årsakene til svikt for LarvaSPA og de anbefalte løsningene for å håndtere dem

  1. Larver beveger seg for mye eller unnslipper: To vanlige grunner kan bidra til dette problemet. Den første er at PDMS-sporet kan være for grunt eller for dypt for larver. Prøver en annen PDMS cuboid med en annen groove dybde kan løse problemet. Den andre grunnen er at det er for mye fuktighet i kammeret, noe som svekker UV-limet. Redusere volumet av vann tilsatt linsepapiret i kammeret kan bidra til å immobilisere larver. I tillegg kan du prøve å bilde bare segmentene som dekkes av PDMS cuboid, fordi hodet og halen er fri til å bevege seg.
  2. Larver dør under bildebehandling: Hvis en larve dør kort tid etter bildebehandling, er det sannsynlig at det ble utsatt for for mye bedøvelse. Riktig bedøvet larver bør våkne opp etter montering og vise bevegelser inkludert munnkrokforlengelse og tilbaketrekking og dorsal fartøysammentrekning. For å løse dette problemet kan mindre isofluran brukes til å bedøve larver. Overfør en larve ut av anestesi Petri-skålen umiddelbart etter at munnkroken slutter å bevege seg. Hvis larven dør omtrent en time etter bildebehandling, er det vanligvis på grunn av dehydrering. Husk å plassere et stykke fuktet linsepapir i bildekammeret før tetting. En annen vanlig årsak til dødelighet er at UV-limet blokkerer spirakler. Prøv å begrense UV-lim til de midterste segmentene av larven og unngå å dekke hodet og halen. En altfor bred PDMS cuboid kan også lett føre til at UV-limet blokkerer spirakler.
  3. Bretter på kroppsveggen forstyrrer bildebehandling: For å unngå å generere folder under montering, er det viktig å fullstendig immobilisere larver under anestesitrinnet. Når en larve er lammet, er det lettere å rette opp og strekke kroppen. For dyr eldre enn 96 h AEL kan det å dra halene forsiktig før du kurerer UV-limet effektivt redusere folddannelse. Å dra halen eav unge larver anbefales ikke fordi kroppsveggene er skjøre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Lingfeng Tang for å etablere en tidligere versjon av LarvaSPA-metoden; Glenn Swan på Cornell Olin Hall Machine butikk for å lage tidligere prototyper av bildekammeret; Philipp Isermann for å konstruere metallrammer og gi forslag til å lage PDMS cuboids; Cornell BRC Imaging-anlegg for tilgang til mikroskoper (finansiert av NIH grant S10OD018516); Maria Sapar for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av et Cornell Fellowship tildelt H.J.; et Cornell oppstartsfond og NIH-tilskudd (R01NS099125 og R21OD023824) tildelt C.H. H.J. og C.H. unnfanget prosjektet og designet eksperimentene. H.J. gjennomførte eksperimentene. H.J og C.H. skrev manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6061 Aluminum bars McMaster-Carr 9246K421
3M double-sided tape Ted Pella, Inc. 16093
3M Scotch Packaging tape 3M 1.88"W x 22.2 Yards
DUMONT #3 Forceps Fisher Scientific 50-241-34
Glass coverslip Azer Scientific 1152250
Isoflurane Midwest Veterinary Supply 193.33161.3
Leica Confocal Microscope Leica SP8 equipped with a resonant scanner
Lens paper Berkshire LN90.0406.24
Petri dishes (medium) VWR 25373-085
Petri dishes (small) VWR 10799-192
Razor blade Ted Pella, Inc. 121-20
Rectangular petri dish VWR 25384-322
SYLGARD 184 kit (PBMS kit) Electron Microscopy Sciences 24236-10
Transferring pipette Thermo Fisher Scientific 1371126
UV glue Norland products #6106, NOA 61 Refractive Index 1.56
UV lamp (Workstar 2003) Maxxeon MXN02003
Vacuum desiccator Electron Microscopy Sciences 71232
Wipes Kimberly-Clark Kimwipes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
  2. Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
  3. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
  4. Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
  5. Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
  6. Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
  7. He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
  8. Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
  9. Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
  10. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
  11. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
  12. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
  13. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
  14. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
  15. Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
  16. Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
  17. Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, Pt 2 489-502 (2004).
  18. Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
  19. Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
  20. Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
  21. Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
  22. Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
  23. Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
  24. Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
  25. Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
  26. Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
  27. Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
  28. Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
  29. Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
  30. Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
  31. Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).

Tags

Biologi Utgave 156 langvarig time-lapse imaging live imaging in vivo imaging larvaSPA confocal mikroskopi Drosophila larve kroppsvegg dendrittisk arborisering da nevroner nevrodegenerasjon nevroutvikling cellebiologi
LarvaSPA, en metode for montering <em>drosophila</em> larve for langsiktig time-lapse imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ji, H., Han, C. LarvaSPA, A Method… More

Ji, H., Han, C. LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging. J. Vis. Exp. (156), e60792, doi:10.3791/60792 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter