Summary
Этот протокол описывает метод для монтажа личинок Дрозофилы для достижения более длительного времени, чем 10 ч непрерывного промежуток времени изображения в нетронутых живых животных. Этот метод может быть использован для изображения многих биологических процессов вблизи стенки личиночного тела.
Abstract
Live изображений является ценным подходом для изучения вопросов клеточной биологии. Личка Drosophila особенно подходит для in vivo живой визуализации, потому что личиночной стенки тела и большинство внутренних органов прозрачны. Тем не менее, непрерывное живое изображение нетронутых личинок дрозофилы в течение более 30 минут было сложной задачей, потому что трудно неинвазивно иммобилизовать личинок в течение длительного времени. Здесь мы представляем метод личинки крепления называется LarvaSPA, что позволяет непрерывное изображение живых личинок Дрозофилы с высоким височной и пространственного разрешения в течение более 10 часов. Этот метод включает в себя частичное присоединение личинок к крышке с помощью УФ-реактивного клея и дополнительно сдерживающих личиночного движения с помощью полидиметилсилоксана (PDMS) блока. Этот метод совместим с личинками на стадиях развития от второго instar к блуждающим третий instar. Мы демонстрируем применение этого метода при изучении динамических процессов соматосенсорных нейронов Дрозофилы, включая рост дендрита и дегенерацию дендритов, вызванную травмами. Этот метод также может быть применен для изучения многих других клеточных процессов, которые происходят вблизи стенки личиночного тела.
Introduction
Замедленное живое изображение является мощным методом изучения динамических клеточных процессов. Пространственная и временная информация, предоставляемая замедленной кино, может выявить важные детали для ответа на вопросы клеточной биологии. Larva Drosophila была популярной моделью in vivo для исследований с использованием живой визуализации, потому что ее прозрачная стенка тела позволяет неинвазивную визуализацию внутренних структур1,2. Кроме того, многочисленные генетические инструменты доступны в Drosophila флуоресцентно этикетки анатомических структур и макромолекулы3. Тем не менее, долгосрочные замедленной визуализации личинки Дрозофилы является сложной задачей. В отличие от стационарных ранних эмбрионов или кусков, личинки Дрозофилы постоянно двигаются, что требует иммобилизации для живой визуализации. Эффективные способы иммобилизации живых личинок Drosophila включают монтаж в галоуглеродном масле с хлороформом4,анестезию с использованием изофларана или раствора Dichlorvos5,и сжатие между крышкой и микроскопом слайд6. Хотя некоторые из этих методов были использованы для микроскопии, ни один из них не эффективен для долгосрочной живой визуализации. Другие методы были разработаны для визуализации нейронов стенки тела в ползающих личинок с помощью обычной конфокальной микроскопии или световой микроскопии7,8,9. Однако эти методы не являются идеальными для мониторинга клеточной динамики из-за движения личинок.
Разработаны новые методы для получения долгосрочной замедленной визуализации личинок Дрозофилы. Используя polydimemesiloxane (PDMS) "личинки" личинки drosophila могут быть эффективно обездвижены через вакуумгенерационного всасывания в специализированной микрокамере без анестезии. Тем не менее, этот метод не предлагает высокое временное разрешение для исследований клеточной биологии и имеет строгие ограничения на размер животного10. Другой метод с помощью анестезии устройство достигло живой визуализации личинок Дрозофилы в нескольких точках времени и был применен для изучения нервно-мышечныхсоединений 11,12,13,14,15,16. Тем не менее, этот метод также не позволяет непрерывной визуализации дольше, чем 30 мин и требует использования desflurane неоднократно, что может препятствовать нервной активности и повлиять на биологический процесс изучены17,18. Недавно, новый метод, который сочетает в себе микрофлюидное устройство и криоанестезия была использована для обездвиживания личинок различных размеров в течение коротких периодов времени (минуты)19. Однако этот метод требует специализированных устройств, таких как система охлаждения и более длительные периоды иммобилизации требуют повторного охлаждения личинок.
Здесь мы представляем универсальный метод иммобилизации личинок Дрозофилы, который совместим с непрерывной визуализацией замедленного времени дольше 10 ч. Этот метод, который мы называем "Larva Стабилизация частичным креплением" (LarvaSPA), включает в себя присоединение личинки кутикулы к крышке для визуализации в специально построенной камеры изображения. Этот протокол описывает, как сделать камеру изображения и как смонтировать личинки на различных стадиях развития. В методе LarvaSPA нужные сегменты тела прикрепляются к крышке с помощью УЛЬТРАактивного клея. Кубид PDMS дополнительно применяет давление на личинки, предотвращая побег. Воздух и влага в камере визуализации обеспечивают выживание частично обездвиженых личинок во время визуализации. Преимущества LarvaSPA по сравнению с другими методами включают в себя следующее: (1) Это первый метод, который позволяет непрерывной живой визуализации нетронутых личинок Дрозофилы в течение нескольких часов с высоким временным и пространственным разрешением; (2) Метод имеет меньше ограничений на размер личинки; (3) Камера изображений и кубоиды PDMS могут быть изготовлены при минимальных затратах и многоразовые.
В дополнение к описанию метода монтажа личинок, мы предоставляем несколько примеров его применения для изучения развития дендритов и дегенерации дендритов дендритной дендритной беседки Drosophila (da) нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Создание камеры визуализации
- Металлическая рама может быть построена из алюминиевого блока в типичном машинном цехе. Характеристики кадра иллюстрируются на рисунке 1A.
- Чтобы построить камеру изображения, уплотнение нижней части металлической рамы с помощью длинного покрытия (22 мм х 50 мм) и УФ-клей(рисунок 1А). Лечить ультрафиолетовый клей с помощью ручной ультрафиолетовой лампы.
2. Изготовление кубоидов PDMS
- Подготовка формы для CUBoids PDMS.
- Прикрепите слои упаковочной ленты к внутренней поверхности прямоугольной (80 мм х 55 мм) чашке Петри или круглой пластине культуры клеток. Используйте один слой (0,063 мм толщиной) для вторых личинок instar, 2 слоя (0,126 мм толщиной) для ранних третьих личинок instar, или три слоя (0,189 мм толщиной) для поздних третьих личинок instar(рисунок 1B).
- Нарежьте ленту полосками определенной ширины лезвием: 1,5 мм для 1-слойной ленты и 2 мм для 2-слойной или 3-слойной ленты. Ширина и толщина полосы определят размер личинок, которые может вместить конечный кубоид PDMS. Оставьте по крайней мере 5 мм пространство между двумя полосами. Удалите ленточные слои, покрывающие пространство(рисунок 1B).
- Удалите пыль с внутренней поверхности пластины с помощью липкой ленты. Плесень готова к использованию.
- Подготовка смеси PDMS.
- Тщательно смешайте 7 г основания PDMS и 0,7 г лечебного средства (коэффициент 10:1) в небольшом контейнере.
- Поместите контейнер в вакуумный обезвреженку в течение по крайней мере 15 минут, чтобы удалить воздух из смеси.
- Медленно залить около 5,5 г смеси PDMS на плесень, чтобы достичь 1-2 мм толщины(рисунок 1B).
- Поместите смесь PDMS в вакуумный desiccator снова, по крайней мере 15 минут, чтобы удалить оставшиеся пузырьки воздуха из смеси. Разбейте последние несколько пузырей с кончиком пипетки.
- Лечить PDMS на плоской поверхности в тепловом инкубаторе при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 2 ч.
- Используйте лезвие бритвы, чтобы ослабить вылечить PDMS вдоль края формы и отделить его от формы. Храните PDMS между двумя кусками большой липкой ленты при комнатной температуре.
- Для ранних и поздних третьих личинок instar, разрезать PDMS на 8 мм х 2 мм х 1 мм кубоидов (вдоль пунктирных линий на рисунке 1B) путем позиционирования паз создан ленты полосы (шаг 2.1.2) в центре длинной стороны кубоида(Рисунок 1B, C). Для второго личинок instar, вырезать кубоид до 8 мм х 1 мм х 1 мм.
3. Монтаж личинок для долгосрочного замедленного изображения
- Подготовьте верхний покрывало для монтажа.
- Выберите шесть кубоидов PDMS с канавками, соответствующими размерам личинок. Следуйте рекомендуемому пазу и размеру PDMS на основе шагов 2.1.1, 2.1.2 и 2.2.7.
- Удалите пыль с поверхности PDMS с помощью липкой ленты.
- Прикрепите четыре части двусторонней ленты (12 мм х 5 мм) на длинном обкрытии (22 мм х 50 мм) для крепления кубодов PDMS позже. Пространства между двумя кусками двусторонней ленты должны быть такими же, как ширина паз PDMS.
- Нанесите небольшую каплю (1,2 евро) УФ-клея в паз каждого кубида PDMS и добавьте шесть небольших капель УФ-клея в пространство между двусторонней лентой на крышке.
- Подготовьте личинки для монтажа.
- Используя пару щиптем, очистить личинки в воде, чтобы удалить пищу с поверхности тела.
- Поместите чистые личинки на небольшой кусочек увлажненной бумаги в небольшой (35 мм) чашку Петри без крышки. Поместите небольшое блюдо Петри в большое (60 мм) чашку Петри, содержащую кусок сухой бумаги ткани. В химическом капюшоне нанесите 8-12 капель (160-240 л) изофлюрани на бумагу изофруран с помощью пластиковой передаваемой пипетки и закройте крышку большой чашки Петри.
- Подождите 2-3 мин при мониторинге личинок. Выняйте личинки из большой чашки Петри, как только их крючки рот перестают двигаться.
- Смонтировать животных.
- Для изображения структур на стороне вдовы животного, поместите обездвиженными личинок на УЛЬТРАВ-клей между двусторонней лентой на крышке с нижней кутикулы, обращенной к крышке.
- Обложка каждой личинки с блоком PDMS и поместить ствол личинки в паз PDMS. Оставьте голову и хвост личинки за пределами канавки PDMS. Избегайте блокирования брызг личинок клеем.
- Нажмите на концах блока PDMS на двусторонню ленту, не применяя силы на паз. Аккуратно потяните на хвост личинки, чтобы сгладить кутикулу под PDMS.
- Вылечить ультрафиолетовый клей в течение 4 минут с помощью ручной ультрафиолетовой лампы на высокой установке (при 0,07 мВт/мм2).
ВНИМАНИЕ: Защитите глаза с помощью защитных очков при использовании УФ-лампы. - Переверните coverslip вверх дном и повторите шаг 3.3.4.
- Смочите небольшой кусок бумаги объектива (15 мм х 30 мм) с 20 л-30 л воды. Поместите увлажненную бумагу объектива в нижней части камеры изображения(Рисунок 1A,D).
- Поместите крышку на камеру так, чтобы личинки сталкиваются с внутренней стороны камеры. Придерживайтесь обоих концов крышки к металлической поверхности с помощью УФ-клея(рисунок 1A,D). Дорсальная сторона личинок готова для визуализации под конфокальным микроскопом(рисунок 1E).
4. Визуализация
- Личинки изображений с соответствующим микроскопом. Все результаты, показанные в этом протоколе(Рисунок 2, Рисунок 3, Видео S2, Видео S3, и видео S4) были приобретены с помощью конфокальной системы с 40x (1.30 NA) нефтяной цели.
5. Восстановление камеры изображения и кубоидов PDMS
- После изображения, удалить масло на верхней крышкой с помощью бумаги объектива. Отсоедините верхний покрывало от металлического рамы, разрезая в пространство между крышкой и металлическим каркасом с лезвием бритвы. Камера изображения готова к повторному использованию.
- Отсоедините кубоиды PDMS от верхнего покрывала щипками. Roll PDMS кубоидов на липкой ленте, чтобы удалить остатки клея и пыли. Кубоиды PDMS готовы к повторному использованию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Камера личинок построена путем склеивания ручной металлической рамы и двух обложек вместе. Конструкция металлического каркаса указана на рисунке 1А. Личинки дрозофилы внутри камеры прилипают к верхнему облику с помощью УФ-клея и кубоидов PDMS. Паз на кубидоиде PDMS и двусторонняя лента кубоид прилагается для создания пространства для хранения личинок(Рисунок 1B, C). PDMS также применяет мягкое давление, чтобы сгладить стенку личиночного тела и физически ограничить личиночное движение. Наконец, небольшой кусочек влажной бумаги объектив помещается в нижней части камеры, чтобы обеспечить влагу. Эта установка может обездвижить личинки Drosophila для более чем 10 ч для непрерывного изображения. Большинство животных живы после 10 ч и могут быть восстановлены, чтобы вырасти в стадии pupal. Камера изображения может вместить до девяти личинок одновременно. На рисунке 1D изображены шесть поздних третьих личинок, установленных в камере. Стволы личинок фиксируются, в то время как их головы и хвосты свободно перемещаются(рисунок 1E и Видео S1). Этот метод был успешно использован для изображения второй instar к блуждающим третьим икрах личинок с непрерывным высоким разрешением изображения до 15 ч. Камера предназначена для визуализации с использованием вертикально микроскопов, но установка также работает для перевернутых микроскопов, просто переворачивая камеру.
Здесь мы демонстрируем применение LarvaSPA в изучении динамики нейронов дендритов и дегенерации дендритов с использованием iv класса да (C4 da) нейронов в качестве модели(Рисунок 2, Рисунок 3, Видео S2-S4). C4 да нейроны соматосенсорные ноцицепторы, расположенные на стене личиночного тела, чьи дендриты иннервировать личиночной эпидермис1,20,21,22. C4 да дендриты обладают высокодинамическим поведением роста на протяжении всего развития личинок, в результате чего полное покрытие поверхности тела или заполнения пространства23. C4 да нейроны также успешно используются для изучения дегенерации дендритов и регенерации после физической травмы24,25,26,27.
Для визуализации дендрит динамики, личинки в диапазоне от 48 ч после откладки яиц (AEL) на второй instar до 120 ч AEL на блуждающих третий instar были установлены в камере визуализации для замедленного изображения с помощью точечного сканирования конфокальной микроскопии. Замедленное кино было принято с интервалом 3 мин, чтобы захватить рост поведения C4 да дендритов помечены ppk-CD4-tdTom или UAS-CD4-tdTom управляется ppk-Gal46. На протяжении всего периода визуализации (до 12 ч), высокой порядка дендритных ветвей C4 да нейронов выставлены сложные поведения роста, в том числе расширение, опровержение, формирование ветви, и ветвь ликвидации (Рисунок 2A-2F), что свидетельствует о здоровье нейронов. Наши фильмы также захватили гомотипические дендро-дендритные отталкивания, в которых советы дендрита убраны после контакта с другими дендритами(рисунок 2F). В целом, эти результаты показывают, что замедленное изображение с использованием LarvaSPA является эффективным для изучения нейроразвития.
Для изображения дегенерации дендритов мы использовали лазер MaiTai для разрыва первичных дендритов вблизи тел клеток C4 da нейрональных клеток. Личинки были восстановлены и установлены в камере для визуализации, начиная с 1,5 ч после травмы (AI)(Рисунок 3, Видео S4). Фильмы записали ключевые события во время дегенерации дендритов, в том числе отек дендритов, фрагментации дендритов и очистки дендритов. В том же эксперименте, личиночного жира тело было также разработано, чтобы выделять Annexin V-GFP (AV-GFP), датчик, который этикетки экстернализованных фосфатидилсериин (PS) на поверхности клетки27. Мы наблюдали конкретную маркировку вырождающихся дендритов AV-GFP(Рисунок 3), предполагая, что PS был выставлен на поверхности вырождающихся дендритов, чтобы служить в качестве сигнала есть-я для последующего очистки от фагоцитоза27.
Рисунок 1: Камера изображения для монтажа LarvaSPA. (A) Диаграммы камеры изображения с подробными спецификациями, показывающими как вид верхнего, так и вид сбоку. Светло-голубое затенение в верхнем виде указывает на увлажненный объектив бумаги. Камера запечатана верхним покрытием и нижним покрытием. Показано положение смонтированной личинки. (B) Диаграммы формы PDMS (вид верхнего вида) и формы после заполнения смесью PDMS (вид стороны). Полосы в сером цвете указывают на две 1-слойные, две 2-слойные и две 3-слойные полосы ленты соответственно. Желтое затенение в боковом представлении указывает на смесь PDMS в плесени. Пунктирные линии указывают, где сократить вылечить PDMS. Вид сбоку диаграммы не нарисован в масштабе. (C) Фотографии, показывающие вид сверху и вид сбоку кубоида PDMS. Шкала бар 1 мм. (D) Фотографии, показывающие камеры изображения перед монтажом, и визуализации камеры с шестью обездвиженных конце третьего instar Drosophila личинок установлен дорсальной стороной вверх. Шкала бар No 10 мм. (E) Более близкий вид личинки в (D). Шкала бар 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Покадровая визуализация динамики дендритов. (A-F) Выбранные кадры из замедленного кино класса IV да нейронных дендритов в определенные моменты времени после начала визуализации. Изображения личинок были приняты 48 h AEL(A и F), 72 ч AEL (B), 96 h AEL (C, и 120 h AEL(D). Нейроны помечены ppk'gt;CD4-tdTom ( A, D, E, и F) или ppk Синие стрелки указывают на опровержения дендритов по сравнению с предыдущей точкой времени. Желтые стрелки указывают на расширения дендрита по сравнению с предыдущей точкой времени. (E) Дендрит морфологии в конце 12 ч изображений. (F) Последовательные кадры с интервалами 3 мин в фильме, иллюстрирующем, как дендритная ветвь во второй личинке instar расширена (желтые стрелки) и впоследствии убирается (синие стрелки) после того, как она вступила в контакт с другим дендритом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Промежуток времени изображения дегенерации дендритов и воздействия сигнала есть-я. Выбранные кадры из замедленного фильма о вырождающихся дендритов класса IV да нейрон после лазерной травмы. Дендриты были помечены ppk'gt;CD4-tdTom. Съедать меня сигнал PS на вырождающихся дендритов был обнаружен Annexin-GFP (AV-GFP), который выделяется жира тела. Желтые стрелки указывают на ветви, показывающие маркировку AV-GFP. Синие стрелки указывают на дендриты, подвергаясь фрагментации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Видео S1: Третья личинка в звезде обездвижена в выемке кубоида PDMS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Видео S2: Дендриты расширяются и динамически убирают во второй личинке instar. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Видео S3: Дендриты расширяются и динамически втягиваются в блуждающую третью личинку instar. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Видео S4: Дендриты вырождаются и подвергают фосфатидилсерину после лазерной травмы в третьей личинке instar. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем LarvaSPA, универсальный метод монтажа живых личинок Дрозофилы для долгосрочного замедленного изображения. Этот метод не требует восстановления или монтажа личинок, что позволяет непрерывно ею. Поэтому он идеально подходит для отслеживания биологических процессов, которые занимают несколько часов, таких как дегенерация дендритов и регенерация. Этот метод может также использоваться для визуализации внутриклеточной динамики кальция и субклеточных событий, таких как рост микротрубок. Поскольку стенка личиночного тела стабильна во время визуализации, пространственное и временное разрешение может быть скорректировано в соответствии с приложением для визуализации (например, для отслеживания быстрого субклеточного движения везикулили или для мониторинга медленных глобальных изменений нейрональных ветвей). Кроме того, этот метод совместим с личинками на различных стадиях развития и не требует специального оборудования. Таким образом, LarvaSPA потенциально может быть использован многими лабораториями Drosophila для решения различных вопросов.
Факторы, влияющие на успех метода, в том числе характер кубоида PDMS и стадии развития личинок
Размер кубида PDMS и глубина канавки должны соответствовать размеру личинок. Кубоид PDMS слишком широк для личинок может покрыть голову и хвост и вызвать гипоксию. Тем не менее, узкий кубоид PDMS не может быть эффективным в предотвращении личинок от перемещения. Слишком глубокий паз аналогичным образом не будет генерировать достаточное давление, чтобы сдержать движение личинок. Слишком мелкий паз не будет держать достаточно клея, чтобы придерживаться личинок к крышке. Исходя из нашего опыта, для различных стадий личинок рекомендуются следующие размеры PDMS и канавки: 8 мм х 1 мм х 1 мм кубоиды PDMS с 1,5 мм х 1 мм х 0,063 мм для вторых личинок instar (48 г AEL); 8 мм х 2 мм х 1 мм PDMS кубоидов с 2 мм х 2 мм х 0,126 мм канавки для ранних третьих личинок instar (72 ч AEL); 8 мм х 2 мм х 1 мм PDMS кубоидов с 2 мм х 2 мм х 0,189 мм канавки для конца третьего instar личинок (96 h AEL или старше).
Блуждающие третьи личинки instar (на уровне или старше 120 л. AEL) перемещаются меньше по сравнению с младшими и требуют меньше влаги, чтобы выжить после установки в камере. Они также имеют толще кутикулы и может выдержать больше физического стресса. Таким образом, эксперименты с использованием блуждающих третьих личинок звезд ы имеют самый высокий показатель успеха. В наших руках более 80% блуждающих третьих личинок в звезде выжили и остались неподвижными 12 ч после монтажа. Для предотвращения окунения личинок во время визуализации, мы рекомендуем монтаж личинок между 96 ч до 120 ч AEL. Младшие третьи личинки instar имеют больше шансов на побег или смерть во время визуализации. Как правило, по крайней мере 2 из 6 молодых третьих личинок звезды, установленные в той же камере, выживут и останутся неподвижными 10 ч после монтажа. Наш опыт со вторыми личинками instar ограничен, и выживаемость трудно оценить. Тем не менее, мы успешно изображения второй instar личинок для 7 ч с помощью этого метода.
Потенциальные проблемы долгосрочной визуализации
Хотя LarvaSPA был очень полезен для визуализации динамики роста дендритов и дегенерации, есть несколько потенциальных оговорок, чтобы рассмотреть. Во-первых, в нашем нынешнем методе, личинки лишены пищи в течение всего срока изображения, что может привести к голоду индуцированных реакций во многих тканях. Мы наблюдали образование гранулированных структур в эпидермальных клетках около 10 ч после монтажа, которое может возникнуть в результате аутофагии. Поэтому результаты, полученные в первые несколько часов визуализации, должны быть более физиологически актуальными. Результаты в течение более длительных временных масштабов требуют более осторожного толкования. Чтобы свести к минимуму эту озабоченность, наша процедура потенциально может быть адаптирована для обеспечения личинок кормления. Во-вторых, наш метод может помешать быстрому росту молодых личинок из-за физических ограничений и отсутствия питательных веществ. Однако, эта забота не может приложить к более старым животным. Например, блуждающие третьи личинки в звезде могут превратиться в куколки даже после 12 ч непрерывной визуализации, что делает этот метод идеальным для исследования ранних метаморфоз. В-третьих, визуализация более глубоких структур, таких как жировое тело и кишечник, представляет некоторые проблемы. Основная причина заключается в том, что более глубокие ткани часто перемещаются во время визуализации и поэтому требуют коррекции движения в постобработке. Кроме того, несоответствия рефракционных индексов в светлом пути могут вызвать сферическую аберрацию при визуализации более глубоких тканей. В то время как нефтяные цели подходят для визуализации да нейронов, потому что их дендриты находятся в пределах 15 мкм от поверхности тела, цели погружения воды могут быть лучшим выбором для исправления несоответствий рефракционно-индекса для визуализации глубже внутри личинок. В-четвертых, поскольку нейроны C4 da могут быть активированы ультрафиолетовым светом28,использование УЛЬТРАВ-свет во время монтажа личинок потенциально может изменить физиологию C4 da neuron. Хотя интенсивность света мы рекомендуем намного ниже уровней, которые надежно активировать C4da нейронов28, результаты, связанные с C4da нейронной активности должны быть осторожно интерпретированы. УФ-клей был использован для визуализации широкого спектра биологических образцов29,30,31 и не вызывает очевидной токсичности для личинок в наших руках. Наконец, следует рассмотреть вопрос о надлежащей установки микроскопа для in vivo живой визуализации. Например, резонансные сканеры и вращающиеся дисковые конфокальные микроскопы являются лучшими вариантами для долгосрочной живой визуализации, поскольку они вызывают меньше фототоксичности и фотоотбирования; мультифотон микроскопия более эффективна для визуализации более глубоких внутренних структур в личинках; долгосрочная визуализация может быть склонна к выборке или фокусу дрейфующих, которые потенциально могут быть исправлены путем пост-изображения обработки.
Наиболее распространенные причины сбоя для LarvaSPA и рекомендуемые решения для их устранения
- Larvae двигаться слишком много или бежать: Две общие причины могут способствовать этой проблеме. Во-первых, паз PDMS может быть слишком мелким или слишком глубоким для личинок. Попытка другого CUBoid PDMS с другой глубиной паз может решить эту проблему. Вторая причина заключается в том, что в камере слишком много влаги, ослабляя ультрафиолетовый клей. Уменьшение объема воды, добавленной в бумагу объектива в камере, может помочь обездвижить личинок. Кроме того, попробуйте изображение только сегменты, покрытые PDMS кубоид, потому что голова и хвост свободно двигаться.
- Личинки умирают во время визуализации: Если личинка умирает вскоре после изображения, вполне вероятно, что она подверглась слишком много анестезии. Правильно анестезированных личинок должны проснуться после монтажа и показать движения, включая расширение крюк рот и опровержение и сокращение сосуда. Чтобы решить эту проблему, меньше изолюран может быть использовано для анестезии личинок. Перенесите личинку из анестезии Петри блюдо сразу после того, как рот крючок перестает двигаться. Если личинка умирает примерно через час после изображения, это, как правило, из-за обезвоживания. Не забудьте поместить кусок увлажненной бумаги объектива в камеру изображения перед уплотнением. Еще одной распространенной причиной летальности является то, что УФ-клей блокирует спираки. Старайтесь ограничить ультрафиолетовый клей средними сегментами личинки и не покрывайте голову и хвост. Слишком широкий cuboid PDMS также может легко вызвать ультрафиолетовый клей, чтобы блокировать spiracles.
- Складки на стенке тела мешают визуализации: чтобы избежать генерации складок во время монтажа, важно полностью обездвижить личинки во время анестезии шага. Когда личинка парализована, легче выпрямить и растянуть тело. Для животных старше 96 г AEL, мягко перетаскивая хвосты, прежде чем лечить УФ-клей может эффективно уменьшить образование складок. Перетаскивание хвостов молодых личинок не рекомендуется, так как стенки их тела хрупкие.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах.
Acknowledgments
Мы благодарим Lingfeng Tang за создание более ранней версии метода LarvaSPA; Гленн Лебедь в корнелл Олин Зал машинный цейт для изготовления более ранних прототипов камеры изображений; Филипп Исерман нон за изготовление металлических каркасов и предоставление предложений по изготовлению кубоидов PDMS; Cornell BRC Imaging для доступа к микроскопам (финансируется грантом NIH S10OD018516); Мария Сапар для критического прочтения рукописи. Эта работа была поддержана Корнелл стипендий присуждается HJ; Корнелл стартовый фонд и гранты NIH (R01NS099125 и R21OD023824), присужденные C.H. H.J. и C.H., задумали проект и разработали эксперименты. Х.Джей проводил эксперименты. Х.Джей и К.Х. написали рукопись.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, Pt 2 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
