Summary
عرض هنا هو وسيلة آمنة وفعالة لتصيب يرقات حمار وحشي مع اللاهوائية الفلورية C. difficile عن طريق الحقن المجهري وmicrogavage غير الباضعة.
Abstract
تعتبر عدوى كلوستريديديس difficile (CDI) واحدة من أكثر التهابات الجهاز الهضمي المرتبطة بالرعاية الصحية شيوعًا في الولايات المتحدة. وقد وصفت الاستجابة المناعية الفطرية ضد C. difficile، ولكن الأدوار الدقيقة للالعدلات والضامة في CDI هي أقل فهما. في الدراسة الحالية ، يتم استخدام يرقات Danio rerio (حمار وحشي) لإنشاء نموذج عدوى C. difficile لتصوير سلوك وتعاون هذه الخلايا المناعية الفطرية في الجسم الحي. لمراقبة C. difficile، تم إنشاء بروتوكول وضع العلامات باستخدام صبغة الفلورسنت. يتم تحقيق عدوى موضعية عن طريق الحقن الدقيق المسمى C. difficile ، الذي ينمو بنشاط في الأمعاء حمار وحشي ويحاكي الضرر الظهاري المعوي في CDI. ومع ذلك ، فإن بروتوكول العدوى المباشرة هذا غازي ويسبب جروحًا مجهرية ، والتي يمكن أن تؤثر على النتائج التجريبية. وبالتالي ، يتم وصف بروتوكول microgavage أكثر غير الغازية هنا. تتضمن الطريقة تسليم خلايا C. difficile مباشرة إلى الأمعاء من يرقات حمار وحشي عن طريق التنبيب من خلال الفم المفتوح. هذه الطريقة العدوى تحاكي عن كثب مسار العدوى الطبيعية من C. difficile.
Introduction
C. difficile هو الغرام إيجابية, بوغ تشكيل, اللاهوائية, والسموم المنتجة للعصية التي هي السبب الرئيسي للالتهابات الشديدة في الجهاز الهضمي1. وتشمل الأعراض النموذجية لـ CDI الإسهال وآلام البطن والتهاب القولون الزائف القاتل ، ويمكن أن يؤدي في بعض الأحيان إلى الموت1،2. وقد أظهرت الأدلة أن الاستجابات المناعية المضيفة تلعب دورا حاسما في كل من تطور ونتائج هذا المرض3. بالإضافة إلى الاستجابة المناعية ، فإن ميكروبيوتا الأمعاء الأصلية أمر بالغ الأهمية لبداية وإمراض CDI4. في العقد الماضي، زاد كل من عدد الحالات ومعدل الوفيات من CDI بشكل ملحوظ بسبب ظهور سلالة مفرطة من C. difficile (BI/NAP1/027)5،6. ومن شأن الفهم الأفضل لآليات المناعة الكامنة ودور الكائنات الحية المجهرية خلال مبادرة التنمية المجتمعية أن يساعد على النهوض بتطورات وتطورات علاجية جديدة، مما يتيح السيطرة على هذا الوباء بشكل أفضل.
وقد وضعت العديد من النماذج الحيوانية، مثل الهامستر والفأر، لتوفير نظرة ثاقبة في الدفاع المناعي ضد C. difficile7،8. ومع ذلك ، فإن دور الخلايا المناعية الفطرية لا يزال غير مفهوم بشكل جيد ، خاصة وأن سلوك الخلايا المناعية الفطرية مستمد بشكل رئيسي من التحليل النسيجي أو الخلايا المستزرعة في المختبر. ولذلك ، فإن إنشاء نموذج حمار وحشي شفاف للكشف عن الاستجابة المناعية الفطرية لC. difficile داخل كائن فقري حي سيسهل مثل هذه الدراسات. تحتوي يرقات حمار وحشي على نظام مناعة فطري وظيفي ، ولكنها تفتقر إلى الجهاز المناعي التكيفي حتى 4-6 أسابيع بعد الإخصاب9. هذه الميزة الفريدة تجعل يرقات سمك الحمار الوحشي نموذجًا ممتازًا لدراسة الاستجابة المعزولة ووظيفة الخلايا المناعية الفطرية في CDI.
يصف هذا التقرير طرقًا جديدة باستخدام يرقات سمك الحمار الوحشي لدراسة التفاعلات بين الخلايا المناعية المفحلة والفطرية، مثل الضامة والالعدلات. أولاً، يتم تقديم بروتوكول حقن دقيق موضعي يتضمن C. inoculum وتلطيخ. باستخدام في التصوير الفاصل بين الوقت في الجسم الحي ، يتم تسجيل استجابة العدلات والضامة تجاه موقع العدوى ، ويلاحظ البلعوم من البكتيريا عن طريق العدلات والضامة. ومع ذلك ، فقد أفيد أن الحقن نفسه يسبب تلف الأنسجة ويؤدي إلى تجنيد الكريات البيض مستقلة عن البكتيريا10. لذلك ، يتم وصف بروتوكول microgavage غير الباضع لتسليم C. difficile إلى الأمعاء من يرقات حمار وحشي في وقت لاحق. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن الميكروبات المعدية المعوية الأصلية حماية مضيف ضد استعمار C. difficile11. لذلك ، تستخدم يرقات حمار وحشي gnotobiotic أيضًا لتهيئ ة سمك الحمار الوحشي المصاب 12. بعد ذلك ، يتم إجراء تشريح الأمعاء لاستعادة قابلة للحياة C. difficile والتحقق من مدة وجودها في المسالك المعوية حمار وحشي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الأعمال الحيوانية الموصوفة هنا وفقًا للأنظمة القانونية (EU-Directive 2010/63 ، الترخيص AZ 325.1.53/56.1-TUBS والترخيص AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. إعداد أغروس ذوبان منخفضة، لوحة جل، والحقن المجهري / إبر Microgavage
- حل 0.08 غرام من أغروس منخفض الانصهار(جدول المواد، agarose A2576) في 10 مل من 30 ٪ دانيو المتوسطة (0.12 mM MgSO4، 0.18 mM Ca [NO3]2) ، 0.21 mM KCl ، 1.5 mM HEPES (درجة الحموضة = 7.2)، و 17.4 mM NaCl، المخزنة في درجة حرارة الغرفة (RT) للحصول على حل 0.8٪.
ملاحظة: يمكن استخدام تركيزات أعلى أو أقل من أغاروز. ومع ذلك ، فإن الوقت المطلوب لترسيخ يختلف عن العلامات التجارية المختلفة من agarose ، حتى في نفس التركيز. - إعداد الحقن المجهري وإبر microgavage من الشعيرات الدموية الزجاجية(جدول المواد).
- استخدام السطاط micropipette مع الإعدادات التالية (لاحظ أن وحدات محددة إلى السلاط المستخدمة هنا؛ انظر جدول المواد):إبر الحقن المجهري (ضغط الهواء = 500؛ الحرارة = 400؛ سحب = 125؛ السرعة = 75؛ الوقت = 150)؛ وإبر الميكروغافاج (ضغط الهواء = 500؛ الحرارة = 400؛ سحب = 100؛ السرعة = 75؛ الوقت = 150). استخدام تلميح microloader لتحميل 3 ميكرولتر من nuclease خالية H2O في الإبرة سحبت.
- إدخال الإبرة في حاقن وربطها بشكل صحيح. ضبط الإبرة إلى زاوية مناسبة للحقن. ضبط ضغط الحقن بين 600-900 hPa لإبرة الحقن المجهري و 200-300 hPa لإبرة gavage.
- ضع قطرة من الزيت المعدني على الدائرة السوداء لشريحة المعايرة. استخدام ملقط غرامة لقص غيض من الإبرة. حقن قطرة واحدة في الزيت المعدني لقياس حجم قطرات.
- بالنسبة للحقن المجهري، قم بضبط وقت الحقن للحصول على قطرة قطرها 0.10-0.12 مم، والتي تساوي حجم ًا قدره 0.5-1.0 لتر. بالنسبة للميكروغافاج، احصل على قطرة قطرها 0.18-0.20 مم، والتي تساوي حجم3-5 لتر.
- إعداد 1.5 ٪ صفيحة agarose مع agarose(جدول المواد، 8050) في 10 سم بيتري طبق في 30 ٪ دانيو المتوسطة باستخدام قالب من البلاستيك والعفن microgavage. تخزينها في 4 درجة مئوية لمنع الجفاف حتى الحاجة. دافئ إلى RT أو 28 درجة مئوية قبل التجربة.
2. إعداد ووضع العلامات من C. difficile والجراثيم مع صبغ الفلورسنت
- إعداد حل مخزون 1 mM من صبغة الفلورسنت(جدول المواد). لأن الصبغة تباع في 50 ميكروغرام aliquots من مسحوق، إضافة 69 ميكرولتر من DMSO إلى القارورة للحصول على تركيز المخزون 1 mM.
- إعداد حل عمل 100 ميكرومتر من صبغة الفلورسنت عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من محلول مخزون 1 mM إلى 18 ميكرولتر من DMSO في أنبوب الطرد المركزي ، وتخلط جيدًا.
- الثقافة C. difficile (R20291، سلالة ribotype 027) عن طريق تلقيح 10 مل من وسط السائل BHIS مع اثنين إلى ثلاثة مستعمرات من لوحة في غطاء لاهوائي دون اهتزاز بين عشية وضحاها. BHIS هو BHI تستكمل مع 0.5٪ (ث / v) استخراج الخميرة و 0.1٪ (ث / v) L-السيستين. حل 1 غرام من L-السيستين في 10 مل من ddH2O وتعقيم عن طريق الترشيح، ثم تضاف إلى وسيلة أوتوكلاف للحصول على تركيز نهائي من 1 ز / لتر يتم إعداد لوحات عن طريق إضافة 15 غ / لتر أغار أغار إلى الوسط قبل التعقيم. ويتم التهيئة انتقائية من C. difficile باستخدام لوحات chromID C. difficile (جدول المواد).
- تلطيخ C. difficile مع صبغة الفلورسنت
- حصاد C. difficile في OD600 من 1.0-1.2 وغسل 1x مع 1 مل من 1x PBS (5000 × ز لمدة 3 دقيقة في RT). إعادة تعليق في 1 مل من 1 × PBS.
- إضافة 3 ميكرولتر من حل العمل من صبغة الفلورسنت إلى 1 مل من تعليق البكتيريا. احتضان العينة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام. غسل الملطخة C. difficile مرة واحدة مع 1 مل PBS لإزالة الصبغة المتبقية وإعادة تعليق في 1x PBS إلىOD 600 من 1.0 (1.0 OD600 ما يعادل تقريبا 108 cfu/mL).
3. حقن الملون C. difficile في يرقات حمار وحشي
- تهويل 20-30 يرقات حمار وحشي في 5 أيام بعد الإخصاب (المشار إليها هنا باسم 5 dpf) مع 0.02٪ - 0.04٪ tricaine (يذوب مسحوق التريكين في الماء المقطر المزدوج وتعديلها إلى درجة الحموضة = 7 مع 1 M Tris-HCL الحل) في 30٪ دانيو المتوسطة ~ 10 دقيقة قبل حقن. نقل اليرقات المؤكّد إلى طبق بيتري طازج بطول 10 سم وإزالة أي وسط دانيو الزائد بنسبة 30٪.
- ضع انخفاضًا بنسبة 0.8٪ في الذوبان على يرقات سمك الحمار الوحشي لتغطية. ضبط بلطف اليرقات إلى موقف جانبي. ضع طبق بيتري على الثلج لمدة 30-60 s للسماح للأغروز المنخفضة الانصهار لترسيخ. أضف 30% من وسيط دانيو الذي يحتوي على 0.02% -0.04% من التريكين لتغطية الأغاروز.
- إعداد محلول الحقن. أضف 1 ميكرولتر من 0.5٪ أحمر الفينول في محلول PBS إلى 9 ميكرولتر من الإنكولوم C. الملطخ بالصبغة لتصور عملية الحقن.
- قم بتحميل إبرة حقن مجهرية محسوبة باستخدام محلول الحقن باستخدام أداة microloader. قم بتركيب الإبرة المحملة على المتلاعبين الدقيق ووضعها تحت مجهري.
- ضبط ضغط الحقن بين 600-900 hPa. تعيين وقت الحقن إلى 0.1-0.3 s للحصول على 0.5-1.0 nL. تعيين الإبرة في micromanipulator في ~ 45 درجة زاوية مشيرا نحو اليرقات جزءا لا يتجزأ.
- ضع طرف الإبرة فوق الجهاز الهضمي بالقرب من المسام البولية التناسلية. بيرس من خلال agarose ثم العضلات مع طرف إبرة، ثم إدراجه في تجويف الأمعاء وحقن 0.5-1.0 nL من C. difficile. استخدام المجهر الفلوري لرصد اليرقات المحقونة والتقاط اليرقات المحقونة بشكل صحيح للتصوير المعكور.
4. جيل من يرقات حمار وحشي الغنوصي
- استخدام طريقة التربية الطبيعية الراسخة لتوليد أجنة حمار وحشي gnotobiotic، بما في ذلك: الإخصاب في المختبر، والغسيل مع متوسطة تحتوي على المضادات الحيوية (1 ميكروغرام/مل أمفوتيريسين B، 10 ميكروغرام/مل كاناموسين، و 20 ميكروغرام/مل أمبيسيلين)، وغسل مع 0.1٪ من wt/vol البولي فينيل بيرولدون-اليود (PVP-I) الحل، واحتضان الأجنة في غطاء ثقافة الخلية12.
- الحفاظ على جميع يرقات حمار وحشي gnotobiotic تحت الظروف gnotobiotic حتى 5 dpf أو قبل gavage. بعد اليرقات ، سيتم نقل يرقات سمك الحمار الوحشي إلى حاضنة قياسية ولكن مع وسيط Danieau المعقم بنسبة 30٪.
5. Gavage من يرقات حمار وحشي
- معايرة إبرة microgavage كما هو موضح في الخطوة 1.2.
- قياس قطر طرف الإبرة عن طريق وضع الإبرة على شريحة معايرة مع قطرة واحدة من الزيوت المعدنية. تأكد من أن الطرف هو 30-40 ميكرون في القطر، حادة، وعلى نحو سلس. تجاهل الإبر الحادة أو الخشنة.
ملاحظة: يمكن الحد من حواف حادة من الإبر عن طريق المشتعلة سريعة. - إعداد حل gavage كما هو موضح في الخطوة 3.3.
- تحميل وتركيب الإبرة على micromanipulator كما هو موضح في الخطوة 3.4. ضبط micromanipulator لوضع الإبرة في زاوية 45 درجة.
- تهوّر يرقات سمك الحمار الوحشي المشار إليها في الخطوة 3.1. عندما تتوقف اليرقات عن الحركة ، قم بنقلها إلى أخدود قالب ميكروغافج باستخدام ماصة باستور.
- ضع انخفاضًا بنسبة 0.8٪ في الذوبان على يرقات سمك الحمار الوحشي لتغطية. ضبط بلطف اليرقات مع رؤساء تواجه تستقيم في زوايا 45 درجة في الأخدود والذيول ضد جدار الأخدود. تأكد من أن زوايا الرؤوس هي نفسها تقريبا بحيث يتم محاذاتها مع زاوية الإبر gavage. ضع قالب الميكروغافاج على الثلج لمدة 30-60 s ، مما يسمح للأغروز الذوبان المنخفض بترسيخه من أجل تثبيت مواقع اليرقات.
- ضبط ضغط الحقن بين 200-300 hPa. تعيين وقت الحقن إلى 0.1-0.3 s للحصول على حجم حقن من 3-5 nL من C. difficile.
- تعمل بلطف الإبرة من خلال أغاروز ثم في فم يرقات حمار وحشي، من خلال المريء. بمجرد أن يكون طرف الإبرة داخل لمبة الأمعاء الأمامي ، اضغط على دواسة الحقن للإفراج عن البكتيريا. ملء تجويف الأمعاء مع حجم تسليمها. لا تدع ذلك يفيض من المريء أو الكلوأكا. سحب بلطف الإبرة من فم حمار وحشي.
- بعد gavage ، قم بإنقاذ يرقات سمك الحمار الوحشي المصابة من الأغاروز بطرف محمل صغير مرن عن طريق قطع الأروز أولاً بعيدًا ثم عن طريق رفع اليرقات. نقل هذه اليرقات إلى وسط دانيو المعقم بنسبة 30٪. شطف اليرقات في وسط معقم مرتين. نقل اليرقات إلى طبق بيتري الطازج 10 سم. سيتم الحفاظ على اليرقات لمدة تصل إلى 11 dpf.
6. تحليل المجهر كونالبؤر من يرقات حمار وحشي حقن
- اليرقات الهريسوثيرة المشار إليها إلى الخطوة 3.1. قم بإجراء ثقب في الجزء السفلي من طبق بيتري عيار 35 مم مع شريحة زجاجية متصلة بالثقب، يشار إليها باسم غرفة التصوير. نقل الأجنة إلى الجزء السفلي من غرفة التصوير مع كمية كافية من 30٪ من متوسط دانيو.
- أضف 200-300 ميكرولتر من أغاروز منخفض الذوبان بنسبة 1٪ لتغطية اليرقات المُسهّسة. نظرًا لأنه يتم استخدام المجهر المقلوب ، ضع المنطقة المصابة من اليرقات ضد الشريحة الزجاجية بأكبر قدر ممكن.
- اسمحوا agarose تصلب على الجليد لمدة 30-60 s. غمر أغاروز مع 30٪ دانيو تحتوي على 0.02٪ - 0.04٪ tricaine.
- صورة اليرقات مع المجهر المسح الضوئي بالليزر المعالبؤر(جدول المواد).
7. تشريح الأمعاء حمار وحشي اليرقات لاسترداد قابلة للحياة C. difficile
- عزل المسالك الهضمية من اليرقات لتحليل الحمل البكتيري. ابدأ بيرقات سمك الحمار الوحشي الرحيم مع 0.4٪ التريكين.
- شطف حمار وحشي لفترة وجيزة مع 1x مقسم المعقم ونقلها إلى لوحة أغاروز الطازجة.
- تشريح سمك الحمار الوحشي
- أدخل إبرة في الجذع الظهري ليرقات سمك الحمار الوحشي بالقرب من الرأس لشل سمك الحمار الوحشي. إزالة الرأس وراء الخياشيم مع الرمح.
- أدخل الإبرة الثانية في منتصف الجذع الظهري. أدخل الإبرة الثالثة في بطن سمكة الحمار الوحشي وأخرج الأمعاء من تجويف الجسم.
ملاحظة: هناك حاجة إلى العناية القصوى لعزل الأمعاء سليمة. إذا كان من الصعب القيام بذلك، قم بإجراء سحب إضافية لفصل بقية الأمعاء عن الأعضاء الداخلية المتبقية. - استخدم إبرة الحقن المجهري لنقل 10-15 أمعاء إلى أنبوب 1.5 مل يحتوي على 200 ميكرولتر معقم من 1x PBS.
- تجانس الأمعاء مع الحشرات لتعطيل الأنسجة وإعداد التجانس. ضمان وصول الحشرات إلى الجزء السفلي من الأنبوب لتعطيل جميع الأمعاء تمامًا.
- احتضان المتجانسات في C. difficile تربية المتوسطة التي تحتوي على D-cycloserine وسيفوكستين، مع أو بدون taurocholate (TCA، إنبات من الجراثيم C. difficile) في غرفة اللاهوائية.
- احتضان لوحة لاهوائيا لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية.
- استخدام الثقافة البكتيرية ل16S rRNA-PCR.
- إعادة تعليق مستعمرة في 50 ميكرولتر من H2O وغليها في 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بيليه الحطام المنحل عن طريق الطرد المركزي (14000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين في RT) واستخدام 2 ميكرولتر من supernatant كقالب في 25 ميكرولتر من تفاعل PCR باستخدام C. difficile-محددةالتمهيديات (Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TAC AGG 3'؛ Cdiff16Srev: 5 ' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
- عندما يتم استخدام البكتيريا من الثقافة السائلة، حصاد 1 مل من الثقافة وغسل مرة واحدة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني (14،000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة في RT). إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من H2ODD وعلاج كما هو الحال أعلاه. لزيادة توصيف المستعمرات البكتيرية ، تُخطعلى لوحة BHIS أو chromID(جدول المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. difficile هو اللاهوائي تماما، ولكن الكروموفور من البروتينات الفلورية عادة ما يتطلب الأكسجين لتنضج. للتغلب على هذه المشكلة، تم استخدام صبغة الفلورسنت لبقعة يعيش C. الخلايا المتفرقة التي كانت تنمو بنشاط (R20291، سلالة ribotype 027; الشكل 1ألف). باستخدام نظام Gal4/UAS ، تم إنشاء خطوط حمار وحشي معدلة وراثيا مستقرة للتصوير الحي ، حيث قاد مروجو mpeg1.1 أو lyZ التعبير عن بروتين الفلورسنت EGFP في الضامة والالعدلات (على التوالي) بطريقة تعتمد على Gal4.
تم حقن C. difficile الملطخة في الأمعاء حمار وحشي في 5 dpf، والمواقع المصابة تم صورة بعد 1 ساعة من الحضانة. أظهر التصوير الفاصل الزمني أن كل من العدلات والضامة وصلت إلى مواقع العدوى(الشكل 1B)، وزاد عدد هاتين الخلايا المناعية الفطرية حتى تم مسح c. difficile. حدث التطهير عن طريق البلعوم وهضم C. difficile. يظهر الشكل 1C أن البلعوم المنشط اثنين من البكتيريا C. difficile (انظر الفيلم التكميلي 1).
الشكل 1: تلطيخ والعدوى من C. difficile في حمار وحشي. (أ)المسمى الفلورسنت C. البكتيريا difficile داخل حمار وحشي المصابة بعد الحقن المجهري. مقياس شريط = 5 μm.(B)Confocal Z-المكدس الإسقاط تظهر العدلات الفلورية الخضراء في مزدوجة المعدلة وراثيا حمار وحشي Tg (lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 المتراكمة في موقع العدوى C. difficile في 2 ساعة بعد العدوى (hpi). تظهر العدلات باللون الأخضر وC. difficile باللون الأحمر. مقياس شريط = 50 ميكرون.(C)Confocal الوقت الفاصل التصوير تظهر GFP المسمى الضامة البلعوم الحمراء الفلورية الملطخة C. difficile. مقياس شريط = 20 ميكرون. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
على الرغم من أن الحقن المجهري هو الطريقة الأكثر شيوعًا لإصابة يرقات سمك الحمار الوحشي بمسببات الأمراض ، فإن هذه الطريقة تسبب دائمًا تلف الأنسجة ، مما يمكن أن يؤثر على النتائج التجريبية. لتجنب هذه المسألة، تم استخدام microgavage لتقديم الفلورسينس المسمى C. difficile في تجويف الأمعاء من الضامة والعدلات خطوط مراسل في 5 dpf، الذي يحاكي المسار الطبيعي للCDI(الشكل 2A). ومع ذلك ، لم العدلات والضامة لم تظهر هجرة واضحة إلى الجهاز الهضمي لمدة تصل إلى 12 ساعة بعد microgavage(الشكل 2B). في غضون ذلك ، اختفت مضانة C. difficile المسمى بعد حوالي 5 ساعة بعد microgavage ، على الأرجح بسبب إما 1) تدمير أنزيمي ، 2) مستويات درجة الحموضة غير المناسبة في الأمعاء من حمار وحشي ، أو 3) بداية تشكيل بوغ والتغيرات الأغشية المصاحبة في البكتيريا(الشكل 2B). لذلك ، تم إنشاء طريقة تشريح الأمعاء للكشف عن C. difficile.
الشكل 2: Microgavage من يرقات حمار وحشي مع C. difficile. (أ)صورة تمثيلية ليرقات حمار وحشي في 5 dpf gavaged مع الفلورسيسين الملطخة C. difficile. تم تسجيل الصورة حوالي 3 ساعة ما بعد gavage ، مما يدل على أن C. difficile كانت موجودة في الأمعاء الخلفية من حمار وحشي. مقياس شريط = 100 ميكرومتر.(B)التصوير الفاصل الزمني الفاصل بين المنتصف مما يدل على حركية الضامة. مزدوجة اليرقات حمار وحشي المعدلة وراثيا Tg (mpeg1.1: KalTA4)bz16/ Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 في 5 dpf كانت مع الفلورسينس المسمى C. difficile. تم إجراء التصوير الفاصل الزمني لمدة تصل إلى 12 ساعة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر.
لتأكيد ما إذا كان C. difficile كان قادرا على العيش حمار وحشي، تم فصل أمعاء حمار وحشي في نقاط زمنية مختلفة بعد gavage. ثم ، تم تجانس الأمعاء المعزولة مع الآفات البلاستيكية ، وتم احتضان المتجانسات في C. difficile medium التي تحتوي على D-cycloserine و cefoxitin ، مع أو بدون TCA. ومع ذلك، تم الكشف عن الخلايا C. difficile المتنامية بنشاط فقط تصل إلى 24 ساعة بعد العدوى مع وبدون TCA (البيانات غير مبين). ومن التكهنات أن المجتمعات الميكروبية الأصلية في اليرقات التقليدية منعت غزو C. difficile بسبب مقاومتها الاستعمار.
كما استخدمت يرقات حمار وحشي gnotobiotic. تم تشريح عينات الأمعاء 24 حصان يووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووو ومع ذلك ، في وقت لاحق من النقاط الزمنية (أي 48 حصان يى ، 72 حصان ، و 120 حصان) العينات المحتضنة نمت فقط في المتوسط الذي يحتوي على TCA ، مما يشير إلى أن مجموع C. difficile في الأمعاء قد شكلت الجراثيم(الشكل 3B). وهذا يوفر تفسيرا ً محتملاً لفقدان وضع العلامات الفلورية.
16S rDNA PCR ثم استخدم لتحديد البكتيريا نمت كما C. difficile، والتي أنتجت pcR amplicons محددة من حجم يمكن التنبؤ بها (~ 800 bp؛ الشكل 3ج). وتم التحقق من هذه النتيجة من خلال تسلسل منتجات PCR هذه. بعد ذلك ، انتشرت الثقافات البكتيرية على لوحة BHIS. ثم تم نقل العديد من المستعمرات المفردة على لوحة كروميد ، والتي دعمت فقط نمو C. difficile. ظهرت البكتيريا كمستعمرات سوداء نموذجية ، مما يشير كذلك إلى أن البكتيريا من أمعاء حمار وحشي كانت C. difficile (الشكل 3D).
الشكل 3: الكشف عن C. difficile في الأمعاء حمار وحشي بعد العدوى. لكل تجربة من التجارب المستقلة، تم إصابة 15-20 يرقات حمار وحشي gnotobiotic في 5 dpf مع 3-5 مل من 108 CFUs/mL C. difficile أو PBS كسيطرة سلبية من قبل microgavage. (أ)تم استزراع تجانس الأمعاء المنقّحة. نمت البكتيريا في المتوسط الذي يحتوي على TCA 72 ساعة بعد عدوى يرقات حمار وحشي gnotobiotic (1، مجموعة مكافحة غير المصابة؛ 2، R20291 حمار وحشي المصابة؛ ن = 3). (ب)التوضيح التخطيطي لنتائج التجربة الشاملة بعد 24 ساعة و48 ساعة و72 ساعة و120 ساعة بعد الإصابة بـ C. difficile (n= 3)(C)تم اختبار العينات البكتيرية بواسطة 16S rDNA PCR في 72 ساعة بعد الميكروغافاج (1، مجموعة مكافحة غير مصابة؛ 2، R20291 إصابة حمار وحشي؛ n = 3). (د)نمو C. difficile على لوحة chromID؛ لاحظ اللون الأسود من C. difficile، وهو سمة من سمات هذه اللوحات (ن = 3). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم التكميلي 1. الرجاء الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على اليمين للتحميل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأساليب المقدمة تعديل وتوسيع نهج القائمة لتصيب يرقات حمار وحشي عن طريق تنفيذ كل من الحقن وmicrogavage10،14. كما أنه يوضح نهج لدراسة مسببات الأمراض اللاهوائية مع يرقات حمار وحشي22. بالإضافة إلى ذلك ، يسهل البروتوكول تحليل استجابات الخلايا المناعية الفطرية في الجسم الحي على CDI وعند استعمار C. difficile في حمار وحشي. الطريقة قابلة للاستنساخ وسهلة السلوك في المختبر الروتيني أو البيئة السريرية.
لمراقبة البلعوم من C. difficile بواسطة الكريات البيض، تم استخدام اثنين من خطوط حمار وحشي معدلة وراثيا مستقرة (على سبيل المثال، Tg [mpeg1.1: KalTA4]bz16) لتصور الضامة (KalTA4: حمار وحشي الأمثل Gal4-variant) وTg(lyz: lyz: KalTA4)bz17 وتصور العدلات عندما عبرت مع الخلفية المعدلة وراثيا من TG (4xUAS: EGFP)hzm3 نظرًا للبيئة اللاهوائية المطلوبة لنمو C. difficile، فإن الأدوات الوراثية لتتبع C. difficile محدودة. على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن mCherryOpt الأمثل codon لتسمية لهم، يجب أن تكون ثابتة البكتيريا C. difficile قبل عرض الفلورية قبل استخدامه في إعدادات التصوير الحي13. لذلك ، تم استخدام صبغة الفلورسنت هنا لبقعة العيش C. difficile مع الفلورية الحمراء ، والتي يمكن دمجها مع العديد من سلالات حمار وحشي الفلورسنت الفلورية المتاحة. يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة على البكتيريا اللاهوائية المعوية الأخرى ، مثل الهشاشة البكتيرية والكبد Helicobacter. النتائج التمثيلية تثبت أن كل من العدلات والضامة يمكن أن تعترف والبلعوم ة سي difficile في حمار وحشي مصاب.
وقد استخدمت أساليب الغمر والحقن المجهري بانتظام لتصيب حمار وحشي20،21،22. استخدام أساليب الغمر هو واضح، ولكن هذا النهج يجعل من الصعب السيطرة بدقة على وقت غزو البكتيريا في الأمعاء. الحقن المجهري هو الطريقة الأكثر شيوعًا لإصابة أجنة سمك الحمار الوحشي بمسببات الأمراض ، ولكنه يسبب دائمًا تلف الأنسجة. ومن ثم، تم استخدام microgavage لتقليد مسار العدوى الطبيعية.
ومع ذلك، وجد أن الصبغة الملطخة C. difficile أصبح غير قابل للكشف حول 5 ح ما بعد microgavage. أسباب هذا غير واضحة حاليا ولكن قد تكون ذات صلة إما 1) عدم تحمل الفلورفورفيتحت الظروف المعوية أو 2) بدء تشكيل بوغ من الخلايا c. difficile. ووجد كذلك أن C. difficile لم تكن قابلة للكشف في ثقافة المتجانسات اليرقات الكاملة. لذلك ، تم تشريح القناة الهضمية لكل سمكة حمار وحشي مصابة ثم تم استزراعها لتحديد ما إذا كان C. difficile لا يزال يسكن الأنسجة المعوية من حمار وحشي.
بسبب الكائنات الحية المجهرية الأصلية من الفئران التقليدية ، فقط الفئران المعالجة مسبقا مع كوكتيل المضادات الحيوية أو الفئران gnotobiotic عرضة لC. difficile16. وبالمثل، وجد أن C. difficile تم الكشف فقط في الأمعاء من حمار وحشي gnotobiotic ولكن ليس في حمار وحشي من النوع البري التقليدي ة 24 ح بعد العدوى. ومن المثير للاهتمام، عينات معوية من 48 ح، 72 ساعة، و 120 ح حمار وحشي بعد العدوى نمت فقط في وسائل الإعلام التي تحتوي على TCA. كما هو موضح أعلاه، TCA يحفز C. الإنبات بوغ difficile في المختبر. وتشير هذه النتيجة إلى أن الخلايا النشطة C. difficile شكلت بالفعل جراثيم نباتية في الأمعاء حمار وحشي، وتم الكشف عن المستعمرات المشتقة من البوغ باستخدام نهج microgavage.
ومن المثير للاهتمام أن سمك الحمار الوحشي الخالي من الجراثيم لا يزال لا يقدم أي أعراض لـ CDI ، مثل تدفق العدلات المعوية أو حتى موت حمار وحشي. وهذا يدل على أن العدوى عن طريق الحقن قد تنشيط الخلايا المناعية الفطرية عن طريق جرح وأن الضامة المنشطة فقط والعدلات قادرة على الكشف بسرعة C. difficile. بالإضافة إلى ذلك ، يستند التفسير المحتمل لعدم وجود CDI بارز في حمار وحشي على الاختلافات الهيكلية بين الحمار الوحشي والأمعاء الثديية17. الأمعاء حمار وحشي يفتقر إلى سراديب المعوية، حيث تقع في كثير من الأحيان C. difficile 18. جنبا إلى جنب مع انخفاض درجة حرارة الصيانة لسمك الحمار الوحشي بالمقارنة مع ذلك في الثدييات، تم استنتاج أن بداية CDI في حمار وحشي لا يحدث بالسرعة كما هو الحال في نماذج الثدييات. ومع ذلك ، اثنين من البكتيريا اللاهوائية من microbiota الإنسان ، Lactobacillus paracasei وEubacterium ليسوم ، وقد ثبت أن تنمو داخل القناة الهضمية حمار وحشي19. سوف تشجع التطورات التقنية المعروضة هنا تطبيقات هذه الطريقة لدراسة C. difficile والبكتيريا أو مسببات الأمراض الأخرى المشتقة من الأمعاء الثديية في يرقات حمار وحشي قابلة للجزيلافية في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نحن ممتنون لتيمو فريتش لرعاية الحيوانات الممتازة. نشكر أعضاء مختبرات كوستر وستينرت على دعمهم ومناقشاتهم المفيدة. نشكر الدكتور داندان هان على قراءته النقدية للمخطوطة. ونحن نقدر بامتنان التمويل من قبل الدولة الاتحادية من ولاية سكسونيا السفلى، Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
References
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
- Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
- Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
- Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
- Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
- Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
- Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
- Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
- Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
- Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
- Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
- Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
- Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).
