Summary
Presentert her er en sikker og effektiv metode for å infisere sebrafisk larver med fluorescerende merket anaerob C. vanskelig ved mikroinjeksjon og ikke-invasiv mikrogavage.
Abstract
Clostridioides difficile infeksjon (CDI) anses å være en av de vanligste helse-assosierte gastrointestinale infeksjoner i USA. Den medfødte immunresponsen mot C. difficile er beskrevet, men de eksakte rollene til nøytrofiler og makrofager i CDI er mindre forstått. I den nåværende studien brukes Danio rerio (sebrafisk) larver til å etablere en C. vanskelig infeksjonsmodell for å forestille seg oppførselen og samarbeidet til disse medfødte immuncellene in vivo. For å overvåke C. vanskelig, en merking protokoll ved hjelp av en fluorescerende farge er etablert. En lokalisert infeksjon oppnås ved mikroinsprøyting merket C. difficile, som aktivt vokser i sebrafisk tarmkanalen og etterligner tarmepitelskaden i CDI. Denne direkte infeksjonsprotokollen er imidlertid invasiv og forårsaker mikroskopiske sår, noe som kan påvirke eksperimentelle resultater. Derfor er en mer ikke-invasiv mikrogavage protokoll beskrevet her. Metoden innebærer levering av C. difficile celler direkte inn i tarmen av sebrafisk larver ved intubasjon gjennom åpen munn. Denne infeksjonsmetoden etterligner nøye den naturlige infeksjonsruten til C. vanskelig.
Introduction
C. difficile er en gram-positiv, sporedannende, anaerob og toksinproduserende bacillus som er den ledende årsaken til alvorlige infeksjoner i mage-tarmkanalen1. Typiske symptomer på CDI inkluderer diaré, magesmerter og dødelig pseudomembranøs kolitt, og det kan noen ganger føre til død1,2. Bevis har vist at vertenimmunresponser spiller en kritisk rolle i både progresjonen og utfallet av denne sykdommen3. I tillegg til immunresponsen er urbefolkningens tarmmikrobiota avgjørende for utbruddet og patogenesen til CDI4. I det siste tiåret har både antall tilfeller og dødeligheten av CDI økt betydelig på grunn av fremveksten av en hypervirulent stamme av C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. En bedre forståelse av underliggende immunmekanismer og mikrobiotaens rolle under CDI vil bidra til nye terapeutiske utviklinger og fremskritt, noe som gir bedre kontroll over denne epidemien.
Flere dyremodeller, som hamster og mus, har blitt utviklet for å gi innsikt i immunforsvaret mot C. vanskelig7,8. Imidlertid er rollen til medfødte immunceller fortsatt dårlig forstått, spesielt siden medfødt immuncelleatferd hovedsakelig er avledet fra histologisk analyse eller kultiverte celler in vitro. Derfor vil det å etablere en gjennomsiktig sebrafiskmodell for å avsløre den medfødte immunresponsen mot C. vanskelig inne i en levende virveldyrorganisme legge til rette for slike studier. Sebrafisk larver har et funksjonelt medfødt immunsystem, men de mangler det adaptive immunforsvaret til 4-6 uker etter befruktning9. Denne unike funksjonen gjør sebrafisk larver en utmerket modell for å studere den isolerte responsen og funksjonen til medfødte immunceller i CDI.
Denne rapporten beskriver nye metoder ved hjelp av sebrafisk larver for å studere interaksjonene mellom C. vanskelig og medfødte immunceller, som makrofager og nøytrofiler. For det første presenteres en lokalisert mikroinjeksjonsprotokoll som inkluderer C. difficile inoculum og farging. Ved hjelp av in vivo-konfokal time-lapse-avbildning registreres responsen av nøytrofiler og makrofager mot infeksjonsstedet, og fagocytose av bakterier av nøytrofiler og makrofager observeres. Det har imidlertid blitt rapportert at injeksjonen i seg selv forårsaker vevsskade og fører til rekruttering av leukocytter uavhengig av bakteriene10. Derfor beskrives en ikke-invasiv mikrogavageprotokoll for å levere C. difficile inn i tarmen av sebrafisklarver senere. Tidligere studier har vist at urfolk gastrointestinal mikrobiota beskytte en vert mot kolonisering av C. vanskelig11. Derfor brukes gnotobiotiske sebrafisk larver også til å predisponere sebrafisken som er smittet 12. Etterpå utføres tarmdisseksjon for å gjenopprette levedyktig C. vanskelig og validere varigheten av deres tilstedeværelse i sebrafisk tarmkanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt dyrearbeid som er beskrevet her ble utført i samsvar med lovbestemmelser (EU-direktiv 2010/63, lisens AZ 325.1.53/56.1-TUBS og lisens AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Fremstilling av lav smeltende agarose, gelplate og mikroinjeksjon/mikrogavagenåler
- Oppløs 0,08 g lav smeltende agarose (Materialbord, agarose A2576) i 10 ml 30% Danieaumedium (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7,2) og 17,4 mM NaCl, lagret ved romtemperatur (RT) for å oppnå en 0,8% løsning.
MERK: Høyere eller lavere konsentrasjoner av agarose kan brukes. Men den nødvendige tiden for å stivne varierer for ulike merker av agarose, selv ved samme konsentrasjon. - Forbered mikroinjeksjon og mikrogavage nåler fra glasskapillærer (Materialtabell).
- Bruk en mikropipetteavtrekker med følgende innstillinger (merk at enhetene er spesifikke for avtrekkeren som brukes her; se Materialtabell): mikroinjeksjonsnåler (lufttrykk = 500; varme = 400; trekk = 125; hastighet = 75; tid = 150); og mikrogavage nåler (lufttrykk = 500; varme = 400; trekk = 100; hastighet = 75; tid = 150). Bruk en mikrolasterspiss til å laste 3 μL nuclease-fri H2O inn i den trukket nålen.
- Sett nålen inn i injektoren og fest den riktig. Juster nålen til en passende vinkel for injeksjon. Sett injeksjonstrykket mellom 600–900 hPa til mikroinjeksjonsnål og 200–300 hPa for kanyle av gavage.
- Plasser en dråpe mineralolje på den svarte sirkelen av kalibreringslysbildet. Bruk fine tang til å feste kanylens spiss. Injiser ett fall i mineraloljen for å måle størrelsen på dråpet.
- For mikroinjeksjon justerer du injeksjonstiden for å få en dråpe med en diameter på 0,10–0,12 mm, noe som tilsvarer et volum på 0,5–1,0 nL. For mikrogavage, få en dråpe med en diameter på 0,18–0,20 mm, noe som tilsvarer et volum på 3–5 nL.
- Forbered en 1,5 % agaroseplate med agarose (Materialbord, 8050) i en 10 cm Petri-tallerken i 30 % Danieaus medium ved hjelp av en plastform som mikrogavageform. Oppbevares ved 4 °C for å unngå uttørking til det er nødvendig. Varm til RT eller 28 °C før eksperimentet.
2. Tilberedning og merking av C. difficile og sporer med fluorescerende dye
- Forbered en 1 mM lagerløsning av et fluorescerende dye (Materialtabell). Fordi ye selges i 50 μg aliquots av pulver, tilsett 69 μL DMSO til hetteglasset for å oppnå en 1 mM lagerkonsentrasjon.
- Forbered en 100 μM arbeidsløsning av fluorescerende farger ved å legge til 2 μL på 1 mM lagerløsning til 18 μL DMSO i et sentrifugerør, og bland godt.
- Kultur C. difficile (R20291, en ribotype 027 belastning) ved å inokulere 10 ml BHIS flytende medium med to til tre kolonier fra en tallerken i en anaerob hette uten å riste over natten. BHIS er BHI supplert med 0,5% (w / v) gjær ekstrakt og 0,1% (w / v) L-cysteine. Løs opp 1 g L-cystein i 10 ml ddH2O og steriliser ved filtrering, og legg deretter til det autoklvede mediet for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 g/l plater fremstilles ved å legge til 15 g/l agar-agar til mediet før autoklaving. Selektiv kuling av C. difficile gjøres ved hjelp av chromID C. difficile plater (Materialtabell).
- Farging C. vanskelig med fluorescerende farge
- Høst C. difficile ved en OD600 på 1,0-1,2 og vask 1x med 1 ml 1x PBS (5000 x g i 3 min ved RT). Resuspend i 1 ml av 1 x PBS.
- Tilsett 3 μL arbeidsløsning av fluorescerende dye i 1 ml bakteriesuspensjon. Inkuber prøven i 15 min ved RT i mørket. Vask den fargede C. difficile en gang med 1 ml PBS for å fjerne gjenværende farge og resuspendere i 1x PBS til en OD600 på 1,0 (1,0 OD600 tilsvarer omtrent 108 cfu/ml).
3. Injeksjon av farget C. difficile i Sebrafisk Larver
- Bedøve 20–30 sebrafisk larver ved 5 dager etter befruktning (referert til her som 5 dpf) med 0,02%–0,04% trikain (tricainpulver oppløses i dobbeltdestillert vann og justert til pH = 7 med 1 M Tris-HCL-oppløsning) i 30 % Danieaus medium ~10 min før Injeksjon. Overfør de bedøvede larver til en frisk 10 cm Petri-tallerken og fjern overflødig 30% Danieaus medium.
- Plasser en dråpe på 0,8% lav smeltende agarose på sebrafisk larver for å dekke. Juster larvene forsiktig til en sidestilling. Plasser Petriskålen på is i 30–60 s for at den lave smeltende agarose en størkne. Tilsett 30 % Danieaus medium som inneholder 0,02 %–0,04 % tricaine for å dekke agarose.
- Klargjør injeksjonsoppløsningen. Tilsett 1 μL 0,5% fenolrød i PBS-oppløsning i 9 μL av farget C. vanskelig å visualisere injeksjonsprosessen.
- Legg en kalibrert mikroinjeksjonskanyle med injeksjonsoppløsningen ved hjelp av en mikrolaster. Monter den lastede nålen på en mikromanipulator og plasser den under et stereomikroskop.
- Juster injeksjonstrykket mellom 600–900 hPa. Sett injeksjonstiden til 0,1–0,3 s for å få 0,5–1,0 nL. Sett nålen i mikromanipulatoren i en ~ 45 ° vinkel som peker mot de innebygde larver.
- Plasser nålespissen over mage-tarmkanalen nær den urogenitale poren. Pierce gjennom agarose deretter muskelen med nål spissen, deretter sette den inn i tarmlumen og injisere 0,5-1,0 nL av C. vanskelig. Bruk et fluorescensmikroskop for å overvåke de injiserte larver og plukke opp de riktig injiserte larver for konfokal avbildning.
4. Generasjon av gnotobiotiske sebrafisk larver
- Bruk den veletablerte naturlige avlsmetoden til å generere gnotobiotiske sebrafiskembryoer, inkludert: in vitro befruktning, vasking med antibiotikaholdig medium (1 μg/ml amfotericin B, 10 μg/ml kanamycin og 20 μg/ml ampicillin), vasking med 0,1 % wt/vol polyvinyl pyrrolidon-jod (PVP-I) løsning og inkubasjon av embryoene i en cellekultur hette12.
- Oppretthold alle gnotobiotiske sebrafisklarver under gnotobiotiske forhold til 5 dpf eller like før gavage. Etter gavage vil sebrafisk larver overføres til en standard inkubator, men med steril30% Danieaumedium.
5. Gavage av Sebrafisk Larver
- Kalibrer mikrogavagenålen som beskrevet i trinn 1.2.
- Mål diameteren på kanylens spiss ved å plassere nålen på et kalibreringslysbilde med en dråpe mineralolje. Pass på at spissen er 30–40 μm i diameter, sløv og glatt. Kast de skarpe eller grove nålene.
MERK: Skarpe kanter på nåler kan bli sløvet ved rask flammende. - Klargjør gavageløsningen som beskrevet i trinn 3.3.
- Legg nålen på en mikromanipulator som beskrevet i trinn 3.4. Juster mikromanipulatoren slik at kanylen er i en 45° vinkel.
- Bedøve sebrafisklarver nevnt i trinn 3.1. Når larvene slutter å bevege seg, overfører du dem til sporet av en mikrogavageform ved hjelp av en Pasteurpipette.
- Plasser en dråpe på 0,8% lav smeltende agarose på sebrafisk larver for å dekke. Juster larvene forsiktig med hoder som vender mot oppreist i 45° vinkler i sporet og haler mot sporets vegg. Pass på at vinklene på hodene er omtrent de samme, slik at de er på linje med vinkelen på gavagenålene. Plasser mikrogavageformen på is i 30–60 s, slik at den lave smeltingen oppsto for å stivne for å stabilisere larvernes posisjoner.
- Juster injeksjonstrykket mellom 200–300 hPa. Sett injeksjonstiden til 0,1–0,3 s for å få et injeksjonsvolum på 3–5 nL C. vanskelig.
- Bruk nålen forsiktig gjennom agarose deretter inn i munningen av sebrafisk larver, gjennom spiserøret. Når spissen på nålen er inne i den terioriske tarmpæren, trykker du på injeksjonspedalen for å frigjøre bakteriene. Fyll tarmens lumen med det leverte volumet. Ikke la det flyte over fra spiserøret eller cloaca. Trekk nålen forsiktig ut av munningen av sebrafisken.
- Etter gavage, unnunn å redde de infiserte sebrafisk larver fra agarose med en fleksibel mikroloader tips ved først å kutte agarose bort da ved å løfte larver. Overfør disse larvene til sterile 30% Danieau medium. Skyll larver i sterilt medium to ganger. Overfør larvene til en frisk 10 cm Petri-tallerken. Larvene vil bli opprettholdt i opptil 11 dpf.
6. Konfokal mikroskopianalyse av injiserte sebrafisk larver
- Bedøve sebrafisk larver referert til trinn 3.1. Lag et hull i bunnen av en 35 mm Petri-tallerken med et glasslysbilde festet til hullet, referert som bildekammeret. Overfør embryoer til bunnen av bildekammeret med en tilstrekkelig mengde på 30% Danieaumedium.
- Tilsett 200–300 μL med 1 % lav smeltende agarose for å dekke de bedøvede larver. Siden et omvendt konfokalmikroskop brukes, plasserer du larvernes infiserte område mot glasssklien så nært som mulig.
- La agarose stivne på is i 30–60 s. Nedsenk bakken med 30 % Danieau sin inneholder 0,02%–0,04% tricaine.
- Bilde larver med en confocal laser skanning mikroskop (Table of Materials).
7. Disseksjon av Larval Sebrafisk tarm for å gjenopprette levedyktig C. vanskelig
- Isoler mage-tarmkanalene fra larver for å analysere bakteriell belastning. Start med euthanizing sebrafisk larver med 0,4 % tricaine.
- Skyll sebrafisken kort med steril 1x PBS og overfør dem til en fersk agaroseplate.
- Disseksjon av sebrafisk
- Sett en nål inn i dorsal stammen av sebrafisk larver nær hodet for å immobilisere sebrafisken. Fjern hodet bak gjellene med en lansett.
- Sett den andre nålen inn i midten av dorsalstammen. Sett den tredje nålen inn i magen på sebrafisken og trekk tarmen ut av kroppshulen.
MERK: Ekstrem forsiktighet er nødvendig for å isolere den intakte tarmen. Hvis det er vanskelig å gjøre det, utfør ekstra trekk for å skille resten av tarmen fra de gjenværende indre organene. - Bruk en mikroinjeksjonsnål til å overføre 10–15 tarm til et 1,5 ml rør som inneholder 200 μL sterilt av 1x PBS.
- Homogeniser tarmene med en pestle for å forstyrre vevet og forberede homogenater. Sørg for at pestlenår bunnen av røret for å forstyrre alle tarmene helt.
- Inkuber homogenatene i C. vanskelig å oppdra medium som inneholder D-cycloserin og cefoxitin, med eller uten taurokolater (TCA, en germinant av C. vanskelig sporer) i et anaerob kammer.
- Inkuber platen anaerobt i 48 timer ved 37 °C.
- Bruk bakteriell kultur for 16S rRNA-PCR.
- Resuspender en koloni i 50 μL H2O og kok den ved 95 °C i 15 min. Pellet lysed rusk ved sentrifugering (14,000 rpm for 2 min på RT) og bruke 2 μL av supernatant som en mal i 25 μL av PCR-reaksjon ved hjelp av C. vanskelig-spesifikkeprimere (Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TAC AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
- Når bakterier fra flytende kultur brukes, høst1 ml kultur og vask én gang med 1 ml PBS (14 000 o/min i 2 min ved RT). Resuspender pelleten i 100 μL H2O dd og behandle som det er gjort ovenfor. For ytterligere å karakterisere bakterielle kolonier, strek på en BHIS- eller chromID-plate (Materialtabell).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. difficile er strengt anaerobt, men kromforavfluorescerende proteiner krever vanligvis oksygen for å modnes. For å overvinne dette problemet ble en fluorescerende farge brukt til å flekke levende C. vanskeligceller som vokste aktivt (R20291, en ribotype 027 belastning; Figur 1A). Ved hjelp av Gal4/UAS-systemet ble stabile transgene sebrafisklinjer generert for levende bildebehandling, der mpeg1.1- eller lyZ-arrangørene drev uttrykket av EGFP fluorescerende protein i makrofager og nøytrofiler (henholdsvis) på en Gal4-avhengig måte.
Den fargede C. difficile ble injisert i sebrafisk tarmkanalen ved 5 dpf, og de infiserte stedene ble avbildet etter 1 t inkubasjon. Time-lapse imaging viste at både nøytrofiler og makrofager nådde infeksjonsstedene (figur 1B), og antallet av disse to medfødte immuncellene økte til C. vanskelig ble ryddet. Rydding skjedde ved fagocytose og fordøyelse av merket C. difficile. Figur 1C viser at en aktivert makrofag phagocytized to C. vanskelig bakterier (se Supplerende Film 1).
Figur 1: Farging og infeksjon av C. difficile i sebrafisk. (A) Fluorescerende merket C. vanskelig bakterier i infisert sebrafisk etter mikroinjeksjon. Skala bar = 5 μm. (B) Confocal Z-stabel projeksjon som viser grønn fluorescerende nøytrofiler i dobbel transgene sebrafisk Tg (lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 akkumulert ved C. vanskelig infeksjon ser sted ved 2 t postinfeksjon (hpi). Nøytrofiler er vist i grønt og C. vanskelig i rødt. Skala bar = 50 μm. (C) Confocal time-lapse bildebehandling som viser GFP-merkede makrofager fagocytosing rød fluorescerende farget C. vanskelig. Skala bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Selv om mikroinjeksjon er den vanligste metoden for å infisere sebrafisk larver med patogener, forårsaker denne metoden alltid vevsskade, noe som kan påvirke eksperimentelle resultater. For å unngå dette problemet ble mikrogavage brukt til å levere fluorescensmerket C. difficile inn i tarmlumen av makrofag og nøytrofil reporterlinjer ved 5 dpf, som etterligner den naturlige banen til CDI (Figur 2A). Nøytrofiler og makrofager viste imidlertid ikke åpenbar migrering til mage-tarmkanalen i opptil 12 timer etter mikrogavage (Figur 2B). I mellomtiden forsvant fluorescens en merket C. difficile etter rundt 5 timer postmikrogavage, sannsynligvis på grunn av enten 1) enzymatisk ødeleggelse, 2) upassende pH-nivåer i tarmen av sebrafisk, eller 3) utbruddet av sporedannelse og tilhørende membranøse endringer i bakteriene (Figur 2B). Derfor ble det etablert en tarmdisseksjonsmetode for å oppdage C. vanskelig.
Figur 2: Mikrogavage av sebrafisk larver med C. vanskelig. (A) Representativt bilde av sebrafisk larver ved 5 dpf gavaged med fluorescens-farget C. vanskelig. Bildet ble spilt inn rundt 3 timer post-gavage, som viser at C. vanskelig var til stede i bakre tarm av sebrafisk. Skala bar = 100 μm. (B) Confocal time-lapse imaging demonstrere makrofag motilitet. Doble transgene sebrafisk larver Tg (mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 ved 5 dpf ble gavaged med fluorescensmerket C. difficile. Confocal time-lapse imaging ble utført i opptil 12 timer. Skala bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å bekrefte om C. difficile var i stand til å bo sebrafisk, ble sebrafisktarmen skilt på ulike tidspunkter etter gavage. Deretter ble de isolerte tarmene homogenisert med plastpestler, og homogenater ble inkubert i C. vanskelig medium som inneholder D-cycloserin og cefoxitin, med eller uten TCA. Imidlertid ble aktivt voksende C. difficile celler bare oppdaget opptil 24 h postinfeksjon både med og uten TCA (data ikke vist). Det spekuleres i at de innfødte mikrobielle samfunnene i konvensjonelle larver forhindret C. vanskelig invasjon på grunn av deres koloniseringsmotstand.
Gnotobiotiske sebrafisk larver ble også brukt. Tarmprøver 24 hki ble dissekert og viste bakteriell vekst i medium med TCA eller uten TCA, mens ingen bakterier vokste i kontrollgruppen (figur 3A). Men ved senere tidspunkter (dvs. 48 hki, 72 hki og 120 hki) ruget prøver bare i mediet som inneholder TCA, noe som antydet at total C. vanskelig i tarmen hadde dannet sporer (Figur 3B). Dette gir en mulig forklaring på tap av fluorescensmerking.
16S rDNA PCR ble deretter brukt til å identifisere de voksne bakteriene som C. vanskelig, som produserte spesifikke PCR-ampuller av forutsigbar størrelse (~ 800 bp; Figur 3C). Dette resultatet ble videre bekreftet ved sekvensering av disse PCR-produktene. Etterpå ble bakteriekulturer spredt på en BHIS-tallerken. Flere enkeltkolonier ble deretter overført til en kromosom, som bare støttet C. vanskelig vekst. Bakteriene dukket opp som typiske svarte kolonier, noe som ytterligere indikerte at bakterier fra sebrafisktarmen var C. vanskelig (Figur 3D).
Figur 3: Påvisning av C. difficile i sebrafisktarm etter infeksjon. For hvert av de uavhengige eksperimentene ble 15–20 gnotobiotiske sebrafisklarver ved 5 dpf smittet med 3–5 nL av 108 CFUer/ml C. difficile eller PBS som en negativ kontroll ved mikrogavage. (A) Homogenatene til dissekert tarm ble dyrket. Bakterier vokste i mediet som inneholder TCA 72 timer etter infeksjon av gnotobiotiske sebrafisk larver (1, ikke-infisert kontrollgruppe; 2, R20291-infisert sebrafisk; n = 3). (B) Skjematisk illustrasjon av samlede eksperimentresultater etter 24 timer, 48 timer, 72 timer og 120 t etterinfeksjon med C. difficile (n = 3) (C) Bakterielle prøver ble testet av 16S rDNA PCR ved 72 timer etter mikrogavage (1, ikke-infisert kontrollgruppe; 2, R20291-infisert sebrafisk; n = 3). (D) Veksten av C. difficile på chromID-plate; legg merke til den svarte fargen på C. difficile, som er en funksjon av disse platene (n = 3). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Supplerende Film 1. Vennligst klikk her for å vise denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De presenterte metodene endrer og utvider en eksisterende tilnærming for å infisere sebrafisk larver ved å utføre både injeksjon og mikrogavage10,14. Det demonstrerer også en tilnærming til å studere anaerobe patogener med sebrafisk larver22. I tillegg forenkler protokollen analysen av medfødte immuncelleresponser på CDI og ved kolonisering av C. vanskelig i sebrafisk. Metoden er reproduserbar og lett å gjennomføre i et rutinemessig laboratorium eller klinisk miljø.
For å overvåke fagocytose av C. vanskelig ved leukocytter, to stabile transgene sebrafisklinjer ble brukt (f.eks. Tg[mpeg1.1: KalTA4]bz16) for å visualisere makrofager (KalTA4: en sebrafisk-optimalisert Gal4-variant) og Tg(lyz: KalTA4)bz17 og visualisere nøytrofiler når de krysses med transgen bakgrunn av Tg(4xUAS: EGFP)hzm3 bærere. På grunn av det anaerobe miljøet som kreves for vekst av C. vanskelig, genetiske verktøy for å spore C. vanskelig er begrenset. Selv om en codon-optimalisert mCherryOpt har blitt rapportert å merke dem, C. vanskelig bakterier må fikses før utviser fluorescens før bruk i live imaging innstillinger13. Derfor ble et fluorescerende farge brukt her for å flekke levende C. vanskelig med rød fluorescens, som kan kombineres med de mange tilgjengelige grønne fluorescerende transgene sebrafiskstammene. Denne metoden kan lett brukes på andre intestinalanaerobe bakterier, som Bacteroides fragilis og Helicobacter hepaticus. De representative resultatene viser at både nøytrofiler og makrofager kan gjenkjenne og fagocytose C. vanskelig i infisert sebrafisk.
Både nedsenking og mikroinjeksjonsmetoder har blitt regelmessig brukt til å infisere sebrafisk20,21,22. Bruk av nedsenking metoder er grei, men denne tilnærmingen gjør det vanskelig å nøyaktig kontrollere invasjonstiden av bakterier inn i tarmen. Mikroinjeksjon er den vanligste metoden for å infisere sebrafiskembryoer med patogener, men det forårsaker alltid vevsskade. Derfor ble mikrogavage brukt til å etterligne den naturlige infeksjonsruten.
Det ble imidlertid funnet at farget C. difficile ble umulig å oppdage rundt 5 timer post-mikrogavage. Årsakene til dette er foreløpig uklare, men kan være relatert til enten 1) intoleranse av fluoropforen under tarmforhold eller 2) initiering av sporedannelse av C. vanskelig celler. Det ble videre funnet at C. difficile ikke var påviselig i kulturen av hele larver homogenates. Derfor ble tarmen til hver infisertsebrafisk dissekert og deretter dyrket for å avgjøre om C. vanskelig fortsatt bebodd tarmvevet av sebrafisk.
På grunn av den innfødte mikrobiota av konvensjonelle mus, er bare mus forhåndsbehandlet med en antibiotikacocktail eller gnotobiotiske mus utsatt for C. vanskelig16. På samme måte ble det funnet at C. difficile bare ble oppdaget i tarmene til gnotobiotisk sebrafisk, men ikke i konvensjonell villtype sebrafisk 24 timer etter infeksjon. Interessant, tarmprøver på 48 timer, 72 timer, og 120 h post-infeksjon sebrafisk bare vokste i media som inneholder TCA. Som beskrevet ovenfor stimulerer TCA C. vanskelig spore spiring in vitro. Dette resultatet tyder på at aktive C. difficile celler allerede dannet vegetative sporer i sebrafisktarmen, og spore-avledede kolonier ble oppdaget ved hjelp av mikrogavage tilnærming.
Spennende, bakteriefri sebrafisk fortsatt ikke presentere noen symptomer på CDI, som intestinal nøytrofil tilstrømning eller til og med død av sebrafisk. Dette viser at infeksjon ved injeksjon kan aktivere medfødte immunceller ved å såre og at bare aktiverte makrofager og nøytrofiler er i stand til raskt å oppdage C. vanskelig. I tillegg er en sannsynlig forklaring på mangelen på fremtredende CDI i sebrafisk basert på de strukturelle forskjellene mellom sebrafisk ogpattedyrtar17. Sebrafisktarmen mangler tarmkrypter, hvor C. difficile ofte ligger18. Sammen med den lavere vedlikeholdstemperaturen til sebrafisk sammenlignet med det hos pattedyr, ble det antydet at utbruddet av CDI i sebrafisk ikke forekommer så fort som i pattedyrmodeller. Imidlertid har to anaerobe bakterier av den menneskelige mikrobiota, Lactobacillus paracasei og Eubacterium limosum, vist seg å vokse inne i sebrafisktarmen19. De tekniske fremskrittene som presenteres her vil oppmuntre anvendelser av denne metoden til å studere C. difficile og andre bakterier eller patogener avledet fra pattedyrtarmen i molekylært tractable sebrafisk larver in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Timo Fritsch for utmerket dyrepleie. Vi takker medlemmene av Köster- og Steinert-laboratoriene for støtte og nyttige diskusjoner. Vi takker Dr. Dandan Han for kritisk lesing av manuskriptet. Vi anerkjenner takknemlig finansiering av den føderale delstaten Niedersachsen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
References
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
- Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
- Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
- Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
- Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
- Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
- Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
- Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
- Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
- Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
- Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
- Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
- Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).
