Summary
Aquí se presenta un método seguro y eficaz para infectar las larvas de pez cebra con C. difficile anaeróbico etiquetado fluorescentemente por microinyección y microvago no invasivo.
Abstract
Clostridioides difficile infección (CDI) se considera una de las infecciones gastrointestinales más comunes asociadas a la atención médica en los Estados Unidos. Se ha descrito la respuesta inmune innata contra C. difficile, pero se entienden menos los roles exactos de los neutrófilos y los macrófagos en la CDI. En el estudio actual, las larvas de Danio rerio (pez cebra) se utilizan para establecer un modelo de infección por C. difficile para tomar imágenes del comportamiento y la cooperación de estas células inmunitarias innatas in vivo. Para monitorear C. difficile, se ha establecido un protocolo de etiquetado utilizando un tinte fluorescente. Una infección localizada se logra mediante microinyección etiquetada C. difficile, que crece activamente en el tracto intestinal del pez cebra e imita el daño epitelial intestinal en CDI. Sin embargo, este protocolo de infección directa es invasivo y causa heridas microscópicas, que pueden afectar los resultados experimentales. Por lo tanto, aquí se describe un protocolo de microgavage más no invasivo. El método consiste en la entrega de células C. difficile directamente en el intestino de las larvas de peces cebra por intubación a través de la boca abierta. Este método de infección imita de cerca la ruta de infección natural de C. difficile.
Introduction
C. difficile es un bacilo grampositivo, formador de esporas, anaeróbico y productor de toxinas que es la principal causa de infecciones graves en el tracto gastrointestinal1. Los síntomas típicos de la ICD incluyen diarrea, dolor abdominal y colitis pseudomembranosa fatal, y a veces puede llevar a la muerte1,2. La evidencia ha demostrado que las respuestas inmunitarias del huésped desempeñan un papel crítico tanto en la progresión como en el resultado de esta enfermedad3. Además de la respuesta inmunitaria, la microbiota intestinal autóctona es crucial para la aparición y la patogénesis de la CDI4. En la última década, tanto el número de casos como la tasa de mortalidad de la CDI han aumentado significativamente debido a la aparición de una cepa hipervirulenta de C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Una mejor comprensión de los mecanismos inmunitarios subyacentes y el papel de la microbiota durante la CdC ayudará a dar lugar a nuevos desarrollos y avances terapéuticos, lo que permitirá un mejor control de esta epidemia.
Varios modelos animales, como el hámster y el ratón, se han desarrollado para proporcionar una visión de la defensa inmune contra C. difficile7,8. Sin embargo, el papel de las células inmunitarias innatas todavía se entiende mal, particularmente porque el comportamiento innato de las células inmunitarias se deriva principalmente del análisis histológico o de las células cultivadas in vitro. Por lo tanto, el establecimiento de un modelo transparente de pez cebra para revelar la respuesta inmune innata a C. difficile dentro de un organismo vertebrado vivo facilitará tales estudios. Las larvas de peces cebra tienen un sistema inmunitario innato funcional, pero carecen del sistema inmunitario adaptativo hasta 4-6 semanas después de la fertilización9. Esta característica única hace que las larvas de pez cebra sean un excelente modelo para estudiar la respuesta aislada y la función de las células inmunitarias innatas en la ICD.
Este informe describe nuevos métodos que utilizan larvas de peces cebra para estudiar las interacciones entre C. difficile y las células inmunitarias innatas, como macrófagos y neutrófilos. En primer lugar, se presenta un protocolo de microinyección localizado que incluye C. difficile inoculum y tinción. Utilizando imágenes confocales in vivo de lapso de tiempo, se registra la respuesta de neutrófilos y macrófagos hacia el sitio de la infección, y se observa la fagocitosis de bacterias por neutrófilos y macrófagos. Sin embargo, se ha informado de que la inyección en sí causa daño tisular y conduce al reclutamiento de leucocitos independientes de la bacteria10. Por lo tanto, posteriormente se describe un protocolo de microgavage no invasivo para administrar C. difficile en el intestino de las larvas de peces cebra. Estudios anteriores han demostrado que la microbiota gastrointestinal indígena protege a un huésped contra la colonización de C. difficile11. Por lo tanto, las larvas de pez cebra gnotobióticas también se utilizan para predisponer el pez cebra que están infectados 12. Después, la disección intestinal se realiza para recuperar la C. difficile viable y validar la duración de su presencia en los tracto intestinales del pez cebra.
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Protocol
Todo el trabajo animal descrito aquí se realizó de acuerdo con las regulaciones legales (DIRECTIVA UE 2010/63, licencia AZ 325.1.53/56.1-TUBS y licencia AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Preparación de agarosa de baja fusión, placa de gel y agujas de microinyección/microgavage
- Disolver 0,08 g de agarosa de baja fusión(Tabla de materiales, agarosa A2576) en 10 ml del medio de Danieau al 30% (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, HEPES de 1,5 mM (pH a 7,2) y 17,4 mM de NaCl, almacenados a temperatura ambiente (RT) para obtener una solución del 0,8%.
NOTA: Se pueden utilizar concentraciones más altas o más bajas de agarosa. Sin embargo, el tiempo necesario para solidificar varía para diferentes marcas de agarosa, incluso en la misma concentración. - Preparar agujas de microinyección y microvaage a partir de capilares de vidrio(Tabla de materiales).
- Utilice un tirador de micropipetas con los siguientes ajustes (tenga en cuenta que las unidades son específicas del tirador utilizado aquí; véase Tabla de materiales):agujas de microinyección (presión de aire 500; calor a 400; tirar a 125; velocidad a 75; tiempo a 150); y agujas de microvalamiento (presión de aire 500; calor a 400; tirar a 100; velocidad de 75; tiempo a 150). Utilice una punta de microcargador para cargar 3 l de H2O sin nucleasas en la aguja tirada.
- Introducir la aguja en el inyector y fijarla correctamente. Ajuste la aguja a un ángulo adecuado para la inyección. Ajuste la presión de inyección entre 600-900 hPa para la aguja de microinyección y 200–300 hPa para la aguja de gavage.
- Coloque una gota de aceite mineral en el círculo negro de la diapositiva de calibración. Utilice fórceps finos para sujetar la punta de la aguja. Inyecte una gota en el aceite mineral para medir el tamaño de la gota.
- Para la microinyección, ajuste el tiempo de inyección para obtener una gota con un diámetro de 0,10–0,12 mm, lo que equivale a un volumen de 0,5–1,0 nL. Para microvago, obtenga una gota con un diámetro de 0,18–0,20 mm, lo que equivale a un volumen de 3-5 nL.
- Preparar una placa de agarosa del 1,5 % con agarosa(Tabla de materiales,8050) en una placa Petri de 10 cm en un medio de Danieau al 30% utilizando un molde de plástico como molde de microvaage. Conservar a 4oC para evitar la desecación hasta que sea necesario. Caliente a RT o 28 oC antes del experimento.
2. Preparación y etiquetado de C. difficile y esporas con tinte fluorescente
- Preparar una solución de 1 mM de un tinte fluorescente (Tabla de materiales). Debido a que el tinte se vende en alícuotas de 50 g de polvo, añadir 69 ml de DMSO al vial para obtener una concentración de stock de 1 mM.
- Preparar una solución de trabajo de 100 m del tinte fluorescente añadiendo 2 ml de solución de material de 1 mM a 18 ml de DMSO en un tubo de centrífuga, y mezclar bien.
- Cultivo C. difficile (R20291, una cepa ribotipo 027) inoculando 10 ml de medio líquido BHIS con dos a tres colonias de una placa en una campana anaeróbica sin agitar durante la noche. BHIS es BHI complementado con 0.5% (p/v) Extracto de levadura y 0.1% (w/v) L-cisteína. Disolver 1 g de L-cisteína en 10 ml de ddH2O y esterilizar por filtración, luego añadir al medio autoclave para obtener una concentración final de 1 g/L. Las placas se preparan añadiendo 15 g/L agar-agar-agar al medio antes de la autoclave. El cultivo selectivo de C. difficile se realiza mediante el uso de placas cromólicas C. difficile (Tabla de materiales).
- Mancha c. difficile con el tinte fluorescente
- Cosecha C. difficile a una OD600 de 1.0–1.2 y lavar 1x con 1 mL de 1x PBS (5.000 x g durante 3 min a RT). Resuspender en 1 mL de 1 x PBS.
- Añadir 3 ml de solución de trabajo del tinte fluorescente en 1 ml de suspensión bacteriana. Incubar la muestra durante 15 minutos a RT en la oscuridad. Lavar el C. difficile teñido una vez con 1 ml de PBS para eliminar el tinte residual y resuspender en 1x PBS a una DoT600 de 1.0 (1.0 OD600 es aproximadamente equivalente a 108 cfu/ml).
3. Inyección de C. difficile manchado en larvas de pez cebra
- Anestetizar 20–30 larvas de pez cebra a los 5 días posteriores a la fertilización (referido aquí como 5 dpf) con 0.02% –0.04% tricaína (polvo de tricaína se disuelve en agua de doble destilación y se ajusta al pH 7 con 1 M Tris-HCL solución) en 30% medio de Danieau 10 min antes Inyección. Transfiere las larvas anestesiadas a un plato Petri fresco de 10 cm y elimina cualquier exceso del medio de Danieau.
- Coloque una gota de agarosa baja de fusión del 0,8% sobre las larvas del pez cebra para cubrir. Ajuste suavemente las larvas a una posición lateral. Coloque la placa Petri sobre hielo durante 30-60 s para permitir que la baja agarosa de fusión se solidifique. Añadir 30% medio de Danieau que contiene 0.02%–0.04% tricaína para cubrir la agarosa.
- Prepare la solución de inyección. Añadir 1 l de 0,5% de color rojo fenol en solución de PBS en 9 l del inóculo de C. difficile teñido de tinte para visualizar el proceso de inyección.
- Cargue una aguja de microinyección calibrada con la solución de inyección utilizando un microcargador. Monte la aguja cargada en un micromanipulador y colóquela bajo un estereomicroscopio.
- Ajuste la presión de inyección entre 600–900 hPa. Establezca el tiempo de inyección en 0,1–0,3 s para obtener 0,5–1,0 nL. Ajuste la aguja en el micromanipulador en un ángulo de 45o apuntando hacia las larvas incrustadas.
- Coloque la punta de la aguja por encima del tracto gastrointestinal cerca del poro urogenital. Perforar a través de agarosa entonces el músculo con la punta de la aguja, a continuación, insertarlo en el lumen intestinal e inyectar 0.5–1.0 nL de C. difficile. Utilice un microscopio de fluorescencia para monitorear las larvas inyectadas y recoger las larvas inyectadas correctamente para obtener imágenes confocales.
4. Generación de larvas gnotobióticas de pez cebra
- Utilice el método de reproducción natural bien establecido para generar embriones de pez cebra gnotobióticos, incluyendo: fertilización in vitro, lavado con medio que contenga antibióticos (1 g/ml de anfotericina B, kanamicina de 10 g/ml y ampicilina de 20 g/ml), lavado con solución de pirrolidona-yodo de polivinilo de 1,1% wt/vol, e incubación de embriones en un campana de cultivo celular12.
- Mantener todas las larvas de pez cebra gnotobiótico en condiciones gnotobióticas hasta 5 dpf o justo antes del gavage. Después del gavage, las larvas de pez cebra serán transferidas a una incubadora estándar pero con un medio estéril del 30% de Danieau.
5. Gavage de larvas de pez cebra
- Calibre la aguja de microgavage como se describe en el paso 1.2.
- Mida el diámetro de la punta de la aguja colocando la aguja en un portaobjetos de calibración con una gota de aceite mineral. Asegúrese de que la punta tenga un diámetro de 30-40 m, contundente y lisa. Deseche las agujas afiladas o ásperas.
NOTA: Los bordes afilados de las agujas se pueden atenuar mediante llamas rápidas. - Prepare la solución de gavage como se describe en el paso 3.3.
- Cargue y monte la aguja en un micromanipulador como se describe en el paso 3.4. Ajuste el micromanipulador para colocar la aguja en un ángulo de 45o.
- Anestetizar las larvas de pez cebra mencionadas en el paso 3.1. Cuando las larvas dejen de moverse, transfiéralas a la ranura de un molde de microvalaje utilizando una pipeta Pasteur.
- Coloque una gota de agarosa baja de fusión del 0,8% sobre las larvas del pez cebra para cubrir. Ajuste suavemente las larvas con las cabezas orientadas hacia arriba en ángulos de 45o en la ranura y las colas contra la pared de la ranura. Asegúrese de que los ángulos de las cabezas sean aproximadamente los mismos para que estén alineados con el ángulo de las agujas de gavage. Colocar el molde de microgavage sobre hielo durante 30-60 s, permitiendo que la baja agarosa de fusión se solidifique para estabilizar las posiciones de las larvas.
- Ajuste la presión de inyección entre 200–300 hPa. Establezca el tiempo de inyección en 0.1–0.3 s para obtener un volumen de inyección de 3–5 nL de C. difficile.
- Operar suavemente la aguja a través de la agarosa y luego en la boca de larvas de pez cebra, a través del esófago. Una vez que la punta de la aguja está dentro del bulbo intestinal anterior, presione el pedal de inyección para liberar la bacteria. Llene el lumen del intestino con el volumen entregado. No deje que se desborde del esófago o cloaca. Retire suavemente la aguja de la boca del pez cebra.
- Después de la gavage, rescata las larvas de pez cebra infectadas de la agarosa con una punta de microcargador flexible cortando primero la agarosa y luego levantando las larvas. Transfiere estas larvas al medio estéril del 30% de Danieau. Enjuague las larvas en un medio estéril dos veces. Transfiera las larvas a un plato Petri fresco de 10 cm. Las larvas se mantendrán hasta 11 dpf.
6. Análisis de microscopía confocal de larvas de pez cebra inyectadas
- Anestetizar las larvas de pez cebra referida al paso 3.1. Haga un agujero en la parte inferior de una placa Petri de 35 mm con un portaobjetos de vidrio unido al orificio, conocido como la cámara de imágenes. Transfiera embriones a la parte inferior de la cámara de imágenes con una cantidad adecuada del 30% del medio de Danieau.
- Añadir de 200 a 300 l de agarosa de fusión baja al 1% para cubrir las larvas anestesiadas. Puesto que se utiliza un microscopio confocal invertido, coloque la región infectada de las larvas contra el portaobjetos de vidrio lo más cerca posible.
- Deje que la agarosa se solidifique en hielo durante 30-60 s. Sumerja la agarosa con 30% de Danieau que contiene 0.02%–0.04% tricaína.
- Imagen de las larvas con un microscopio de escaneo láser confocal (Tabla de Materiales).
7. Disección del intestino larvario de peces cebra para recuperar Viable C. difficile
- Aislar los tracto gastrointestinales de las larvas para analizar la carga bacteriana. Comience por eutanasia larvas de pez cebra con 0,4 % de tricaína.
- Enjuague brevemente el pez cebra con 1x PBS estéril y transfiéralo a una placa de agarosa fresca.
- Disección de peces cebra
- Inserte una aguja en el tronco dorsal de larvas de pez cebra cerca de la cabeza para inmovilizar al pez cebra. Retire la cabeza detrás de las branquias con una lanceta.
- Inserte la segunda aguja en el centro del tronco dorsal. Inserte la tercera aguja en el abdomen del pez cebra y extraiga el intestino de la cavidad corporal.
NOTA: Se necesita un cuidado extremo para aislar el intestino intacto. Si es difícil hacerlo, realice extracciones adicionales para separar el resto del intestino de los órganos internos restantes. - Utilice una aguja de microinyección para transferir de 10 a 15 intestinos a un tubo de 1,5 ml que contenga 200 ml estériles de 1 x PBS.
- Homogeneizar los intestinos con un pestillo para interrumpir el tejido y preparar homogeneiza. Asegúrese de que el pestillo llegue a la parte inferior del tubo para interrumpir todos los intestinos por completo.
- Incubar los homogenates en C. difficile medio de cría que contiene D-cicloserina y cefoxitina, con o sin taurochola (TCA, un germinante de C. difficile esporas) en una cámara anaeróbica.
- Incubar la placa anaeróbicamente durante 48 h a 37oC.
- Utilice el cultivo bacteriano para 16S rRNA-PCR.
- Resuspender una colonia en 50 oL de H2O y hervirla a 95 oC durante 15 minutos. Pellet los restos de levas por centrifugación (14.000 rpm durante 2 min a RT) y utilizar 2 l del sobrenadante como plantilla en 25 éL de reacción PCR utilizando C. difficile-específico sillas (Cdiff16Sfw: 5' GTG Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
- Cuando se utilizan bacterias de cultivo líquido, cosechar 1 ml de cultivo y lavar una vez con 1 ml de PBS (14.000 rpm durante 2 min en RT). Resuspenda el gránulo en 100 ml de H2Odd y trate como se ha hecho anteriormente. Para caracterizar aún más las colonias bacterianas, raya en una placa BHIS o cromoID(Tabla de Materiales).
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Representative Results
C. difficile es estrictamente anaeróbico, pero el cromóforo de las proteínas fluorescentes generalmente requiere oxígeno para madurar. Para superar este problema, se utilizó un tinte fluorescente para manchar las células vivas de C. difficile que estaban creciendo activamente (R20291, una cepa ribotipo 027; Figura 1A). Utilizando el sistema Gal4/UAS, se generaron líneas estables transgénicas de peces cebra para imágenes en vivo, en las que los promotores mpeg1.1 o lyZ impulsaron la expresión de proteína fluorescente EGFP en macrófagos y neutrófilos (respectivamente) de una manera dependiente de Gal4.
El C. difficile manchado se inyectó en el tracto intestinal del pez cebra a 5 dpf, y los sitios infectados fueron imageados después de 1 h de incubación. Las imágenes de lapso de tiempo mostraron que tanto los neutrófilos como los macrófagos llegaron a los sitios de infección(Figura 1B),y el número de estas dos células inmunitarias innatas aumentó hasta que se aclaró el C. difficile. La limpieza se produjo por fagocitosis y digestión de la etiqueta C. difficile. Figura 1C muestra que un macrófago activado fagocytizó dos bacterias C. difficile (véase la película suplementaria 1).
Figura 1: Manchado e infección de C. difficile en el pez cebra. (A) Bacterias C. difficile con etiqueta fluorescente dentro del pez cebra infectado después de la microinyección. Barra de escala a 5 m.(B) Proyección confocal de la pila Z que muestra neutrófilos fluorescentes verdes en el sitio de infección por el pez cebra transgénico doble Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 acumulado en el sitio de infección por C. difficile a 2 h después de la infección (hpi). Los neutrófilos se muestran en verde y C. difficile en rojo. Barra de escala a 50 m. (C) Imágenes de lapso de tiempo confocales que muestran macrófagos etiquetados con GFP que fagoocitosan la mancha fluorescente roja C. difficile. Barra de escala a 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Aunque la microinyección es el método más común para infectar las larvas de peces cebra con patógenos, este método invariablemente causa daño tisular, que puede influir en los resultados experimentales. Para evitar este problema, se utilizó microvaqueo para suministrar C. difficile etiquetado con fluorescencia en el lumen intestinal de las líneas de reporteros de macrófagos y neutrófilos a 5 dpf, lo que imita el camino natural de CDI(Figura 2A). Sin embargo, los neutrófilos y macrófagos no mostraron una migración obvia al tracto gastrointestinal hasta 12 h después del microvago(Figura 2B). Mientras tanto, la fluorescencia del C. difficile etiquetado desapareció después de alrededor de 5 h de postmicrovago, probablemente debido a 1) destrucción enzimática, 2) niveles inadecuados de pH en el intestino del pez cebra, o 3) el inicio de la formación de esporas y los cambios de membrana que la acompañan en las bacterias(Figura 2B). Por lo tanto, se estableció un método de disección intestinal para detectar C. difficile.
Figura 2: Microgavage de larvas de pez cebra con C. difficile. (A) Imagen representativa de las larvas de pez cebra a 5 dpf gavaged con C. difficilemanchada de fluorescencia . La imagen fue grabada alrededor de 3 h post-gavage, mostrando que C. difficile estaban presentes en el intestino posterior del pez cebra. Barra de escala a 100 m. (B) Imágenes de lapso de tiempo confocalques que demuestran la motilidad de los macrófagos. Larvas de pez cebra transgénicas dobles Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 a 5 dpf fueron gavaged con fluorescencia etiquetada C. difficile. Se realizaron imágenes de lapso de tiempo confocales para un máximo de 12 h. Barra de escala a 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para confirmar si C. difficile era capaz de habitar peces cebra, los intestinos del pez cebra se separaron en varios momentos después del gavage. Luego, los intestinos aislados fueron homogeneizados con pestles plásticos, y los homogeneizados fueron incubados en c. difficile medio que contiene D-cicloserina y cefoxitina, con o sin TCA. Sin embargo, las células C. difficile en crecimiento activo sólo se detectaron hasta 24 horas después de la infección con y sin TCA (datos no mostrados). Se especula que las comunidades microbianas indígenas en las larvas convencionales impidieron la invasión de C. difficile debido a su resistencia a la colonización.
También se utilizaron larvas de pez cebra gnotobióticas. Las muestras intestinales de 24 hpi se diseccionaron y mostraron crecimiento bacteriano en medio con TCA o sin TCA, mientras que ninguna bacteria creció en el grupo de control(Figura 3A). Sin embargo, en momentos posteriores (es decir, 48 hpi, 72 hpi y 120 hpi) las muestras incubadas sólo crecieron en el medio que contiene TCA, lo que sugiere que el C. difficile total en el intestino había formado esporas(Figura 3B). Esto proporciona una posible explicación para la pérdida de etiquetado de fluorescencia.
16S rDNA PCR se utilizó entonces para identificar las bacterias cultivadas como C. difficile, que produjo amplicons pcR específicos de tamaño predecible (800 bp; Figura 3C). Este resultado se verificó aún más mediante la secuenciación de estos productos de ITP. Después, los cultivos bacterianos se extendieron en una placa BHIS. Varias colonias individuales fueron transferidas a una placa cromID, que sólo sostenía el crecimiento de C. difficile. Las bacterias aparecieron como colonias negras típicas, lo que indicaba además que las bacterias de los intestinos del pez cebra eran C. difficile (Figura 3D).
Figura 3: Detección de C. difficile en el intestino del pez cebra después de la infección. Para cada uno de los experimentos independientes, 15–20 larvas gnotobióticas de pez cebra a 5 dpf se infectaron con 3-5 nL de 108 UFC/mL C. difficile o PBS como un control negativo por microvago. (A) Se cultivaron los homogeneizados de los intestinos diseccionados. Las bacterias crecieron en el medio que contiene TCA 72 h después de la infección de larvas de pez cebra gnotobiótica (1, grupo de control no infectado; 2, R20291 pez cebra infectado; n 3). (B) Ilustración esquemática de los resultados generales del experimento después de 24 h, 48 h, 72 h y 120 h después de la infección con C. difficile (n x 3) (C) Las muestras bacterianas fueron analizadas por 16S rDNA PCR a 72 h después del microvaage (1, grupo de control no infectado; 2, Pez cebra infectado por R20291; n a 3). (D) El crecimiento de C. difficile en la placa cromID; tenga en cuenta el color negro de C. difficile, que es una característica de estas placas (n.o 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película complementaria 1. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
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Discussion
Los métodos presentados modifican y amplían un enfoque existente para infectar las larvas de peces cebra mediante la realización de inyección y microvaage10,14. También demuestra un enfoque para estudiar patógenos anaeróbicos con larvas de peces cebra22. Además, el protocolo facilita el análisis de las respuestas innatas de las células inmunitarias in vivo sobre el CDI y sobre la colonización de C. difficile en el pez cebra. El método es reproducible y fácil de llevar a cabo en un laboratorio de rutina o en un entorno clínico.
Para controlar la fagocitosis de C. difficile por leucocitos, se utilizaron dos líneas estables de peces cebra transgénicos (por ejemplo, Tg[mpeg1.1: KalTA4]bz16) para visualizar macrófagos (KalTA4: una gal4-variante optimizada para peces cebra) y Tg(lyz: KalTA4)bz17 y visualizar neutrófilos cuando se cruzan con el fondo transgénico de Tg(4xUAS:hzFP). Debido al entorno anaeróbico que se requiere para el crecimiento de C. difficile,las herramientas genéticas para rastrear C. difficile son limitadas. Aunque se ha informado de que un mCherryOpt optimizado para codon los etiqueta, las bacterias C. difficile deben ser reaparadas antes de exhibir fluorescencia antes de su uso en entornos de imágenes en vivo13. Por lo tanto, un tinte fluorescente se utilizó aquí para manchar vivo C. difficile con fluorescencia roja, que se puede combinar con las numerosas cepas de pez cebra transgénica fluorescente verde disponibles. Este método se puede aplicar fácilmente a otras bacterias anaeróbicas intestinales, como Bacteroides fragilis y Helicobacter hepaticus. Los resultados representativos demuestran que tanto los neutrófilos como los macrófagos pueden reconocer y fagocitoizara C. difficile en peces cebra infectados.
Tanto los métodos de inmersión como los de microinyección se han utilizado regularmente para infectar el pez cebra20,21,22. El uso de métodos de inmersión es sencillo, sin embargo, este enfoque hace que sea difícil controlar con precisión el tiempo de invasión de las bacterias en el intestino. La microinyección es el método más común para infectar embriones de pez cebra con patógenos, pero invariablemente causa daño tisular. Por lo tanto, el microgavage se utilizó para imitar la ruta natural de la infección.
Sin embargo, se encontró que C. difficile teñido de tinte se volvió indetectable alrededor de 5 h después del microvago. Las razones de esto son actualmente poco claras, pero pueden estar relacionadas con la 1) intolerancia del fluoróforo en condiciones intestinales o 2) el inicio de la formación de esporas de células C. difficile. Se descubrió además que C. difficile no eran detectables en el cultivo de homogeneidades de larvas enteras. Por lo tanto, el intestino de cada pez cebra infectado fue diseccionado y luego cultivado para determinar si C. difficile todavía habitaba el tejido intestinal del pez cebra.
Debido a la microbiota autóctona de ratones convencionales, sólo los ratones pretratados con un cóctel antibiótico o ratones gnotobióticos son susceptibles a C. difficile16. Del mismo modo, se encontró que C. difficile sólo se detectó en los intestinos del pez cebra gnotobiótico, pero no en el pez cebra convencional de tipo salvaje 24 h después de la infección. Curiosamente, las muestras intestinales de 48 h, 72 h y 120 h de pez cebra post-infección sólo crecieron en medios que contienen TCA. Como se describió anteriormente, TCA estimula c. difficile espora germinación in vitro. Este resultado sugiere que las células activas de C. difficile ya formaban esporas vegetativas en el intestino del pez cebra, y se detectaron colonias derivadas de esporas utilizando el enfoque de microgavage.
Intrigantemente, el pez cebra libre de gérmenes todavía no presentó ningún síntoma de CDI, como la afluencia intestinal de neutrófilos o incluso la muerte del pez cebra. Esto muestra que la infección por inyección puede activar las células inmunitarias innatas por heridas y que sólo los macrófagos y neutrófilos activados son capaces de detectar rápidamente C. difficile. Además, una explicación probable de la falta de CDI prominente en el pez cebra se basa en las diferencias estructurales entre el pez cebra y los intestinos de mamíferos17. El intestino de pez cebra carece de criptas intestinales, donde C. difficile se encuentran con frecuencia18. Junto con la menor temperatura de mantenimiento del pez cebra en comparación con la de los mamíferos, se dedujo que la aparición de CDI en el pez cebra no se produce tan rápido como en los modelos de mamíferos. Sin embargo, se ha demostrado que dos bacterias anaeróbicas de la microbiota humana, Lactobacillus paracasei y Eubacterium limosum, crecen dentro del intestino de pez cebra19. Los avances técnicos presentados aquí fomentarán las aplicaciones de este método para estudiar C. difficile y otras bacterias o patógenos derivados del intestino mamífero en larvas de pez cebra molecularmente tractables in vivo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Estamos agradecidos a Timo Fritsch por su excelente cuidado animal. Agradecemos a los miembros de los laboratorios de Koster y Steinert el apoyo y las discusiones útiles. Agradecemos al Dr. Dandan Han por leer críticamente el manuscrito. Agradecemos la financiación del Estado Federal de Baja Sajonia, Nieders-chsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
References
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