Summary
Presenteras här är en säker och effektiv metod för att infektera zebrafisk larver med fluorescerande märkt anaeroba C. difficile genom mikroinjektion och noninvasive microgavage.
Abstract
Clostridioides difficile infektion (CDI) anses vara en av de vanligaste hälso-associerade gastrointestinala infektioner i USA. Det medfödda immunsvaret mot C. difficile har beskrivits, men de exakta rollerna för neutrofiler och makrofager i CDI är mindre förstådda. I den aktuella studien används Danio rerio (zebrafisk) larver för att upprätta en C. difficile infektionsmodell för att avbilda beteendet och samarbetet hos dessa medfödda immunceller in vivo. För att övervaka C. difficilehar ett märkningsprotokoll med ett fluorescerande färgämne upprättats. En lokaliserad infektion uppnås genom microinjecting märkt C. difficile, som aktivt växer i zebrafisk tarmkanalen och härmar tarmepitelskador i CDI. Detta direkta infektionsprotokoll är dock invasivt och orsakar mikroskopiska sår, vilket kan påverka experimentella resultat. Därför beskrivs ett mer noninvasive microgavage-protokoll här. Metoden innebär leverans av C. difficile celler direkt i tarmen av zebrafisk larver genom intubation genom den öppna munnen. Denna infektion metod nära härmar den naturliga infektionen vägen av C. difficile.
Introduction
C. difficile är ett gram-positiv, spore-bildande, anaeroba, och toxinproducerande bacillus som är den främsta orsaken till allvarliga infektioner i mag-tarmkanalen1. Typiska symtom på CDI inkluderar diarré, buksmärta, och dödlig pseudomembranous kolit, och det kan ibland leda till döden1,2. Bevis har visat att värd immunsvar spelar en avgörande roll i både progression och resultatet av denna sjukdom3. Förutom immunsvaret är den inhemska tarmmikrobiota avgörande för uppkomsten och patogenesen vid CDI4. Under det senaste årtiondet har både antalet fall och dödligheten i CDI ökat avsevärt på grund av uppkomsten av en hypervirulent stam av C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. En bättre förståelse av underliggande immunmekanismer och mikrobiotas roll under CDI kommer att bidra till att leda till ny terapeutisk utveckling och framsteg, vilket möjliggör bättre kontroll av denna epidemi.
Flera djurmodeller, såsom hamster och mus, har utvecklats för att ge insikt i immunförsvaret mot C. difficile7,8. Emellertid, rollen av medfödda immunceller är fortfarande dåligt förstås, särskilt eftersom medfödda immuncell beteende beror främst från histologisk analys eller odlade celler in vitro. Därför kommer upprättandet av en transparent zebrafisk modell för att avslöja det medfödda immunsvaret mot C. difficile inuti en levande ryggradsdjur organism underlätta sådana studier. Zebrafisk larver har ett funktionellt medfött immunförsvar, men de saknar adaptivt immunförsvar fram till 4-6 veckor efterbefruktning9. Denna unika funktion gör zebrafisklarver till en utmärkt modell för att studera det isolerade svaret och funktionen hos medfödda immunceller i CDI.
Denna rapport beskriver nya metoder med zebrafisk larver för att studera interaktioner mellan C. difficile och medfödda immunceller, såsom makrofager och neutrofiler. Först presenteras ett lokaliserat mikroinjektionsprotokoll som inkluderar C. difficile inoculum och färgning. Med hjälp av in vivo confocal time-lapse imaging, svaret från neutrofiler och makrofager mot infektionsstället registreras, och fagocytos av bakterier av neutrofiler och makrofager observeras. Det har dock rapporterats att själva injektionen orsakar vävnadsskador och leder till rekrytering av leukocyter oberoende av bakterierna10. Därför beskrivs därefter ett noninvasive microgavage-protokoll för att leverera C. difficile i zebrafisklarvernas tarm. Tidigare studier har visat att inhemska gastrointestinala mikrobiota skydda en värd mot kolonisering av C. difficile11. Därför används gnotobiotiska zebrafisklarver också för att predisponera zebrafisken som är infekterade 12. Därefter utförs tarmdissektion för att återställa livskraftig a. difficile och validera varaktigheten av deras närvaro i zebrafisk tarmkanalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allt djurarbete som beskrivs här utfördes i enlighet med rättsliga bestämmelser (EU-direktiv 2010/63, licens AZ 325.1.53/56.1-TUBS och licens AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Beredning av lågsmältning saros, gelplatta och mikroinjektion/mikrogavagenålar
- Lös upp 0,08 g låg smältning smälter (Materialbord, agarose A2576) i 10 ml 30% Danieau s medium (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 m MHEPES (pH = 7,2) och 17,4 mM NaCl, lagras vid rumstemperatur (RT) för att få en 0,8% lösning.
OBS: Högre eller lägre koncentrationer av agarose kan användas. Den tid som krävs för att stelna varierar dock för olika märken av agarose, även vid samma koncentration. - Förbered mikroinjektions- och mikrogavagenålar från glaskapillärer (Materialsbord).
- Använd en micropipettavdragare med följande inställningar (observera att enheterna är specifika för den avdragare som används här; se Materialtabell): mikroinjektionsnålar (lufttryck = 500; värme = 400; dra = 125; hastighet = 75; tid = 150); och mikrogavagenålar (lufttryck = 500; värme = 400; dra = 100; hastighet = 75; tid = 150). Använd en microloader spets för att ladda 3 μL nuclease-fri H2O i den dragna nålen.
- För in nålen i injektorn och fäst den ordentligt. Justera nålen till en lämplig vinkel för injektion. Ställ in injektionstrycket mellan 600–900 hPa för mikroinjektionsnål och 200–300 hPa för sondmatningsnål.
- Placera en droppe mineralolja på kalibreringsbildens svarta cirkel. Använd fina pincett för att klippa nålspetsen. Injicera en droppe i mineraloljan för att mäta dropparnas storlek.
- För mikroinjektion, justera injektionstiden för att få ett dropp med en diameter på 0,10–0,12 mm, vilket motsvarar en volym på 0,5–1,0 nL. För mikrogavage, få ett dropp med en diameter på 0,18–0,20 mm, vilket motsvarar en volym på 3–5 nL.
- Förbered en 1,5% agarose platta med agarose(Table of Materials, 8050) i en 10 cm Petri maträtt i 30% Danieau medium med hjälp av en plast mögel som microgavage mögel. Förvaras vid 4 °C för att förhindra uttorkning tills det behövs. Varm till RT eller 28 °C före experimentet.
2. Beredning och märkning av C. difficile och sporer med fluorescerande färgämne
- Förbered en 1 mM lagerlösning av ett fluorescerande färgämne (Table of Materials). Eftersom färgen säljs i 50 μg alikvoter av pulver, tillsätt 69 μl DMSO till injektionsflaskan för att få en 1 mM lagerkoncentration.
- Förbered en arbetslösning på 100 μM av fluorescerande färgämne genom att tillsätta 2 μL 1 mM-lagerlösning till 18 μL DMSO i ett centrifugrör och blanda väl.
- Kultur C. difficile (R20291, en ribotyp 027 stam) genom att inokulera 10 ml BHIS flytande medium med två till tre kolonier från en platta i en anaerob huva utan att skaka över natten. BHIS är BHI kompletteras med 0,5% (w / v) jäst extrakt och 0,1% (w / v) L-cystein. Lös upp 1 g L-cystein i 10 ml ddH2O och sterilisera genom filtrering, tillsätt sedan till det autokavade mediet för att få en slutlig koncentration av 1 g/L. Plattorna bereds genom att lägga till 15 g/L agar-agar till mediet före autoklaving. Selektiv odling av C. difficile görs med hjälp av krom ID C. difficile plattor(Table of Materials).
- Färgning C. difficile med fluorescerande färgämne
- Skörda C. difficile vid en OD600 av 1,0–1.2 och tvätta 1x med 1 ml 1x PBS (5 000 x g i 3 min på RT). Resuspend i 1 ml av 1 x PBS.
- Tillsätt 3 μl arbetslösning av fluorescerande färgämne i 1 ml bakteriesuspension. Inkubera provet i 15 min på RT i mörkret. Tvätta den färgade C. difficile en gång med 1 ml PBS för att ta bort kvarvarande färgämne och resuspend i 1x PBS till en OD600 av 1,0 (1,0 OD600 är ungefär motsvarar 108 cfu/ml).
3. Injektion av färgade C. difficile i Zebrafish Larver
- Bedövning 20–30 zebrafisklarver vid 5 dagar efter befruktningen (kallas här 5 dpf) med 0,02%–0,04% tricaine (tricainpulver löses upp i dubbeldestillerat vatten och justeras till pH = 7 med 1 M Tris-HCL-lösning) i 30% Danieaus medium ~10 min innan Injektion. Överför de sedteiserade larverna till en ny 10 cm Petri-skål och ta bort eventuellt överskott 30% Danieaus medium.
- Placera en droppe 0,8% låg smältande agarose på zebrafisk larver för att täcka. Justera försiktigt larverna till en lateral position. Placera Petriskålen på is en 30–60 s för att låta den låga smältande agarose att stelna. Lägg till 30% Danieau medium som innehåller 0,02%-0,04% tricaine för att täcka agarose.
- Förbered injektionslösningen. Tillsätt 1 μL 0,5% fenolröd i PBS-lösning i 9 μL av färgfärgat C. difficile inoculum för att visualisera injektionsprocessen.
- Ladda en kalibrerad mikroinjektionsnål med injektionslösningen med hjälp av en mikrolastare. Montera den laddade nålen på en mikromanipulator och placera den under ett stereomikroskop.
- Justera injektionstrycket mellan 600–900 hPa. Ställ in injektionstiden till 0,1–0,3 för att få 0,5–1,0 nL. Ställ nålen i mikromanipulatorn i en ~45°vinkel riktad mot de inbäddade larverna.
- Placera nålspetsen ovanför mag-tarmkanalen nära urogenital por. Pierce genom agarose sedan muskeln med nålspetsen, sedan förina den i tarmlumen och injicera 0,5-1,0 nL av C. difficile. Använd ett fluorescensmikroskop för att övervaka de injicerade larverna och plocka upp de korrekt injicerade larverna för konfokal avbildning.
4. Generering av gnotobiotiska zebrafisklarver
- Använd den väletablerade naturliga avelsmetoden för att generera gnotobiotiska zebrafiskembryon, inklusive: provrörsbefruktning, tvättning med antibiotikuminnehållande medium (1 μg/ml amphotericin B, 10 μg/mL kanamycin och 20 μg/mL ampicillin), tvättning med 0,1% wt/vol polyvinylrolidone-jod (PVP-I) lösning och inkubation av embryona i en cellkulturhuva12.
- Underhåll alla gnotobiotiska zebrafisklarver under gnotobiotiska förhållanden fram till 5 dpf eller strax före sondmatningen. Efter sondmatningen kommer zebrafisklarver att överföras till en vanlig inkubator men med steril30% Danieaus medium.
5. Sondmatning av Zebrafish Larver
- Kalibrera mikrogavagenålen enligt beskrivningen i steg 1.2.
- Mät nålspetsens diameter genom att nålen placeras på en kalibreringsbild med en droppe mineralolja. Se till att spetsen är 30–40 μm i diameter, trubbigoch slät. Kasta de vassa eller grova nålarna.
OBS: Vassa kanter av nålar kan avtrubbas av snabb flammande. - Förbered sondmatningslösningen enligt beskrivningen i steg 3.3.
- Ladda och montera nålen på en mikromanipulator enligt beskrivningen i steg 3.4. Justera mikromanipulatorn för att placera nålen i 45°vinkel.
- Bedövning av zebrafisklarverna som avses i steg 3.1. När larverna slutar röra sig, överför dem till spåret av en mikrogavageform med hjälp av en Pasteur pipett.
- Placera en droppe 0,8% låg smältande agarose på zebrafisk larver för att täcka. Justera försiktigt larverna med huvuden uppåt i 45° vinklar i spåret och svansarna mot spårets vägg. Se till att vinklarna på huvudena är ungefär desamma så att de är i linje med vinkeln på gavagenålarna. Placera mikrogavageformen på is en 30–60 s, så att den låga smältande agarose att stelna för att stabilisera larvernas positioner.
- Justera injektionstrycket mellan 200–300 hPa. Ställ in injektionstiden till 0,1–0,3 s för att få en injektionsvolym på 3–5 nL c. difficile.
- Använd försiktigt nålen genom agarose sedan i munnen på zebrafisk larver, genom matstrupen. När spetsen på nålen är inne i främre tarmlampan trycker du på injektionspedalen för att frigöra bakterierna. Fyll lumen i tarmen med den levererade volymen. Låt den inte svämma över från matstrupen eller cloaca. Dra försiktigt tillbaka nålen från zebrafiskens mynning.
- Efter sondmatning, rädda de infekterade zebrafisklarverna från agarose med en flexibel mikrolastare spets genom att först skära agarose bort sedan genom att lyfta larverna. Överför dessa larver till steril30% Danieau s medium. Skölj larverna i sterilt medium två gånger. Överför larverna till en ny 10 cm Petriskål. Larverna kommer att underhållas i upp till 11 dpf.
6. Confocal Mikroskopi Analys av injicerade Zebrafish Larver
- Bedövningzeorlarver som avses steg 3.1. Gör ett hål i botten av en 35 mm Petri skålen med en glasbild fäst vid hålet, kallad bildkammaren. Överför embryon till botten av bildkammaren med en tillräcklig mängd på 30% Danieau medium.
- Tillsätt 200–300 μl 1% låg smältuppad för att täcka de sövda larverna. Eftersom ett inverterat confosmikroskop används placerar du larvernas infekterade region mot glasbilden så nära som möjligt.
- Låt agarose stelnar på is för 30-60 s. Doppa agarose med 30% Danieau's innehåller 0,02%-0,04% tricaine.
- Bild larverna med ett konfokalt laserscanningsmikroskop (Materialstable).
7. Dissekering av Larval Zebrafish Intestine för att återhämta sig livskraftig C. difficile
- Isolera mag-tarmkanalen från larver för att analysera bakteriell belastning. Börja med att avliva zebrafisklarver med 0,4 % tricaine.
- Skölj zebrafisken kort med steril 1x PBS och överför dem till en färsk agarose platta.
- Dissekering av zebrafiskar
- För in en nål i zebrafisklarvernas dorsala stam nära huvudet för att immobilisera zebrafisken. Ta bort huvudet bakom gälarna med en lansett.
- För in den andra nålen i mitten av dorsala stammen. För in den tredje nålen i zebrafiskens buk och dra ut tarmen ur kroppshålan.
OBS: Extrem vård behövs för att isolera den intakta tarmen. Om det är svårt att göra det, utför ytterligare drag för att skilja resten av tarmen från de återstående inre organen. - Använd en mikroinjektionsnål för att överföra 10–15 tarmar till ett 1,5 ml-rör som innehåller 200 μL sterilt 1x PBS.
- Homogenisera tarmarna med en mortel för att störa vävnaden och förbereda homogenater. Se till att mortel når botten av röret för att störa alla tarmar helt.
- Inkubera homogenaterna i C. difficileuppfödningsmedium som innehåller D-cycloserin och cefoxitin, med eller utan taurocholate (TCA, en grodden av C. difficile sporer) i en anaerob kammare.
- Inkubera plattan anaerobt för 48 h vid 37 °C.
- Använd bakteriekultur för 16S rRNA-PCR.
- Resuspend en koloni i 50 μL h2O och koka den vid 95 °C i 15 min. Pellet det lysed skräp genom centrifugering (14.000 rpm för 2 min på RT) och använd 2 μL av supernatant som en mall i 25 μL PCR-reaktion med C. difficile-specifikaprimers (Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG G AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
- När bakterier från flytande kultur används, skörda 1 ml kultur och tvätta en gång med 1 ml PBS (14.000 rpm för 2 min på RT). Resuspend pelleten i 100 μL av H2Odd och behandla som gjorts ovan. För att ytterligare karakterisera bakteriekolonier, strimma på en BHIS- eller krom-platta (Materialbord).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. difficile är strikt anaerob, men kromofor av fluorescerande proteiner kräver vanligtvis syre att mogna. För att lösa detta problem användes ett fluorescerande färgämne för att fläcka levande C. difficile celler som aktivt växte (R20291, en ribotyp 027 stam; Bild 1A). Med hjälp av Gal4/UAS-systemet genererades stabila transgena zebrafisklinjer för levande avbildning, där mpeg1.1 eller lyZ-initiativtagarna drev uttrycket av EGFP-lysrörsprotein i makrofager och neutrofiler (respektive) på ett Gal4-beroende sätt.
Den färgade C. difficile injicerades i zebrafisk tarmkanalen vid 5 dpf, och de infekterade platserna avbildades efter 1 h av inkubation. Time-lapse imaging visade att både neutrofiler och makrofager nådde infektionsplatserna (figur 1B),och antalet av dessa två medfödda immunceller ökade tills C. difficile rensades. Clearing inträffade av fagocytos och matsmältningen av den märkta C. difficile. Figur 1C visar att en aktiverad makrofag phagocytized två C. difficile bakterier (se Kompletterande Film 1).
Figur 1: Färgning och infektion av C. difficile i zebrafisk. (A)Fluorescerande märkta C. difficile bakterier inom infekterade zebrafiskar efter mikroinjektion. Skala bar = 5 μm. (B) Confocal Z-stack projektion som visar gröna fluorescerande neutrofiler i dubbel transgen zebrafisk Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 ackumuleras vid C. difficile infektionsplats vid 2 h post-infektion (hpi). Neutrofiler visas i grönt och C. difficile i rött. Skala bar = 50 μm. (C) Confocal time-lapse imaging som visar GFP-märkta makrofager phagocytosing röd fluorescerande färgade C. difficile. Skala bar = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Även om mikroinjektion är den vanligaste metoden för att infektera zebrafisklarver med patogener, orsakar denna metod alltid vävnadsskador, vilket kan påverka experimentella resultat. För att undvika detta problem användes mikrogavage för att leverera fluorescensmärkt C. difficile i tarmlumen av makrofag och neutrofila reporter linjer vid 5 dpf, som efterliknar den naturliga vägen för CDI(figur 2A). Men neutrofiler och makrofager visade inte uppenbar migration till mag-tarmkanalen i upp till 12 h efter mikrogavage(figur 2B). Under tiden försvann fluorescens en märkt C. difficile efter cirka 5 h post-microgavage, sannolikt på grund av antingen 1) enzymatisk förstörelse, 2) olämpliga pH-nivåer i zebrafiskens tarm, eller 3) uppkomsten av sporbildning och medföljande membranförändringar i bakterierna(figur 2B). Därför fastställdes en intestinal dissekeringsmetod för att upptäcka C. difficile.
Figur 2: Mikrogavage av zebrafisklarver med C. difficile. (A)Representativ bild av zebrafisklarver vid 5 dpf gavaged med fluorescens-färgade C. difficile. Bilden spelades in runt 3 h efter sondmatning, som visar att C. difficile var närvarande i den bakre tarmen av zebrafiskar. Skalstång = 100 μm. (B) Konfokal timelapse-bildbehandling som visar makrofagmotilitet. Dubbla transgena zebrafisklarver Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 vid 5 dpf var gavaged med fluorescens-märkta C. difficile. Confocal time-lapse imaging utfördes för upp till 12 h. Skala bar = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att bekräfta om C. difficile kunde bebo zebrafisk separerades zebrafisktarmarna vid olika tidpunkter efter gavalen. Därefter homogeniserades de isolerade tarmarna med plastpestler, och homogenates inkuberades i C. difficile medium som innehåller D-cycloserin och cefoxitin, med eller utan TCA. Men aktivt växande C. difficile celler upptäcktes endast upp till 24 h post-infektion både med och utan TCA (data visas inte). Det spekuleras att de inhemska mikrobiella samhällena i konventionella larver förhindrade C. difficile invasion på grund av deras kolonisering motstånd.
Gnotobiotiska zebrafisklarver användes också. Tarmprover 24 hpi dissekerades och visade bakterietillväxt i medium med TCA eller utan TCA, medan inga bakterier växte i kontrollgruppen(figur 3A). Vid senare tidpunkter (dvs. 48 hpi, 72 hpi och 120 hpi) inkuberade prover ökade dock bara i mediet Som innehöll TCA, vilket tydde på att den totala C. difficile i tarmen hade bildat sporer(figur 3B). Detta ger en möjlig förklaring till förlusten av fluorescensmärkning.
16S rDNA PCR användes sedan för att identifiera de odlade bakterierna som C. difficile, som producerade specifika PCR-ampliconer av förutsägbar storlek (~800 bp; Bild 3C). Detta resultat kontrollerades ytterligare genom sekvensering av dessa PCR-produkter. Efteråt spreds bakteriekulturer på en BHIS-platta. Flera singelkolonier överfördes därefter in på en chromID-pläterar, som stöttade endast C. difficile tillväxt. Bakterierna verkade som typiska svarta kolonier, vilket ytterligare indikerade att bakterier från zebrafisktarmarna var C. difficile (Figur 3D).
Figur 3: Detektion av C. difficile i zebrafisk tarmen efter infektion. För vart och ett av de oberoende experimenten smittades 15–20 gnotobiotiska zebrafisklarver vid 5 dpf med 3–5 nL på 108 CFUs/ml C. difficile eller PBS som negativ kontroll genom mikrogavage. (A)Homogenaterna hos dissekerade tarmar odlades. Bakterier växte i mediet som innehåller TCA 72 h efter infektion av gnotobiotiska zebrafisklarver (1, icke-infekterad kontrollgrupp; 2, R20291-infekterade zebrafiskar; n = 3). (B)Schematisk illustration av övergripande experimentresultat efter 24 h, 48 h, 72 h och 120 h postinfektion med C. difficile (n = 3) (C) Bakteriella prover testades av 16S rDNA PCR vid 72 h post-microgavage (1, icke-infekterade kontrollgrupp; 2, R20291-infekterade zebrafiskar; n = 3). D)Tillväxten av C. difficile på krom-plattan. notera den svarta färgen på C. difficile, som är ett inslag i dessa plattor (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande film 1. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De presenterade metoderna ändrar och utökar en befintlig metod för att infektera zebrafisklarver genom att utföra både injektion och mikrogavage10,14. Det visar också en metod för att studera anaeroba patogener med zebrafisk larver22. Dessutom underlättar protokollet analysen av medfödda immuncellsvar in vivo på CDI och vid kolonisering av C. difficile i zebrafisk. Metoden är reproducerbar och lätt att genomföra i ett rutinmässigt laboratorium eller klinisk miljö.
För att övervaka fagocytos av C. difficile av leukocyter, två stabila transgena zebrafisklinjer användes (t.ex. Tg(mpeg1.1: KalTA4]bz16) för att visualisera makrofager (KalTA4: en zebrafiskoptimerad Gal4-variant) och Tg(lyz: KalTA4)bz17 och visualisera neutrofiler när de korsas med transgen bakgrund av Tg(4xUAS: EGFP)hzm3 bärare. På grund av den anaeroba miljö som krävs för tillväxten av C. difficile, genetiska verktyg för att spåra C. difficile är begränsade. Även om en codon-optimerad mCherryOpt har rapporterats märka dem, C. difficile bakterier måste fastställas innan de uppvisar fluorescens innan den används i levande bildbehandling inställningar13. Därför användes ett fluorescerande färgämne här för att fläcka levande C. difficile med röd fluorescens, som kan kombineras med de många tillgängliga gröna fluorescerande transgena zebrafiskstammarna. Denna metod kan enkelt appliceras på andra intestinala anaeroba bakterier, såsom Bacteroides fragilis och Helicobacter hepaticus. De representativa resultaten visar att både neutrofiler och makrofager kan känna igen och fagocytose C. difficile i infekterade zebrafiskar.
Både nedsänkning soch mikroinjektionsmetoder har regelbundet använts för att infektera zebrafisk20,21,22. Använda nedsänkning metoder är enkelt, men detta tillvägagångssätt gör det svårt att exakt kontrollera invasionen tid av bakterier i tarmen. Mikroinjektion är den vanligaste metoden för att infektera zebrafisk embryon med patogener, men det alltid orsakar vävnadsskador. Därför användes microgavage för att efterlikna den naturliga infektionsvägen.
Det konstaterades dock att färgfärgas C. difficile blev omöjlig att upptäcka runt 5 h post-microgavage. Orsakerna till detta är för närvarande oklara men kan vara relaterade till antingen 1) intolerans av fluoroffor under tarmförhållanden eller 2) inledande av sporbildning av C. difficile celler. Det konstaterades vidare att C. difficile inte kunde upptäckas i kulturen av hela larver homogenates. Därför var tarmen av varje infekterad zebrafisk dissekeras sedan odlade för att avgöra om C. difficile fortfarande bebodde tarmvävnaden av zebrafisk.
På grund av den inhemska mikrobiota av konventionella möss, endast möss förbehandlade med ett antibiotikum cocktail eller gnotobiotiska möss är mottagliga för C. difficile16. På samma sätt konstaterades det att C. difficile bara upptäcktes i tarmarna av gnotobiotisk zebrafisk men inte i konventionell vildtyp zebrafisk 24 h efter infektion. Intressant nog växte tarmprover av 48 h, 72 h och 120 h efter infektion zebrafisk bara i media som innehåller TCA. Som beskrivits ovan stimulerar TCA C. difficile spore grobarhet in vitro. Detta resultat tyder på att aktiva C. difficile celler redan bildade vegetativa sporer i zebrafisk tarmen, och spor-härledda kolonier upptäcktes med hjälp av microgavage strategi.
Spännande, bakteriefria zebrafiskar fortfarande inte presentera några symtom på CDI, såsom intestinala neutrofil tillströmning eller ens död zebrafisk. Detta visar att infektion genom injektion kan aktivera medfödda immunceller genom att såra och att endast aktiverade makrofager och neutrofiler kan snabbt upptäcka C. difficile. Dessutom är en trolig förklaring till bristen på framstående CDI i zebrafisk baserad på de strukturella skillnaderna mellan zebrafiskar och däggdjurstarmar17. Zebrafish tarmen saknar tarmkryptar, där C. difficile ofta ligger18. Tillsammans med den lägre underhållstemperaturen hos zebrafiskar jämfört med den hos däggdjur, drogs slutsatsen att uppkomsten av CDI i zebrafisk inte förekommer lika snabbt som i däggdjurmodeller. Emellertid, två anaeroba bakterier av den mänskliga mikrobiota, Lactobacillus paracasei och Eubacterium limosum, har visat sig växa inuti zebrafish gut19. De tekniska framsteg som presenteras här kommer att uppmuntra tillämpningar av denna metod för att studera C. difficile och andra bakterier eller patogener som härrör från däggdjurstarmen i molekylärt tractable zebrafish larver in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Timo Fritsch för utmärkt djurvård. Vi tackar medlemmarna i Köster och Steinert labs för stöd och hjälpsamma diskussioner. Vi tackar dr Dandan Han för att han läste manuskriptet. Vi erkänner tacksamt finansiering av den federala staten Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
References
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
- Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
- Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
- Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
- Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
- Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
- Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
- Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
- Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
- Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
- Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
- Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
- Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).
