Summary
Burada, faringeal kemer arterlerin 3, 4 ve 6'sını tam montaj lı immünororesans, doku temizleme, konfokal mikroskopi ve 3Boyutlu rekonstrüksiyon kullanarak görselleştirmek ve analiz etmek için bir protokol uyguluyoruz.
Abstract
Faringeal kemer arterlerin (PAAs) 3, 4 ve 6'nın yanlış oluşumu veya yeniden biçimlendirilmesi konjenital kalp hastalığının en şiddetli formlarından bazılarına katkıda bulunur. PAAs oluşumunu incelemek için, benil alkol /benzil benzoat (BABB) doku temizleme ve konfokal mikroskopi ile birleştiğinde tam montaj immünororesans kullanarak bir protokol geliştirdik. Bu ince bir hücresel çözünürlükte faringeal kemer endotel görselleştirme yanı sıra vaskülatür 3D bağlantısı sağlar. Yazılımı kullanarak, PAAs endotel hücrelerinin (ECs) sayısını ölçmek için bir protokol kurduk, yanı sıra faringeal kemerler içinde PAAs çevreleyen vasküler pleksus içinde ECs sayısı 3, 4, ve 6. Tüm embriyouygulandığında, bu metodoloji embriyonik vaskülatür kapsamlı bir görselleştirme ve kantitatif analiz sağlar.
Introduction
Fare embriyogenezi sırasında, faringeal arch arterler (PAAs) dorsal aort ile kalp bağlamak arterlerin simetrik, çift taraflı çiftleri olarak ortaya çıkar1. Embriyo geliştikçe, PAAs ilk ve ikinci çiftleri regress, süre 3,4th, ve6 PAAs aort kemer arterler oluşturmak için asimetrik remodeling olaylar bir dizi geçmesi2.
PAAs 3, 4 ve 6 vaskülogenez yoluyla gelişir, hangi kan damarlarının de novo oluşumudur3. Bu kemer arterlerin oluşumu veya remodeling kusurları çeşitli konjenital kalp defektleri yol açar, DiGeorge Sendromu olan hastalarda görülen gibi4,5. Bu nedenle PAA'ların gelişimini düzenleyen mekanizmaların anlaşılması konjenital kalp hastalığı (KH) etiyolojisinin daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.
PAA gelişimini görselleştirmek ve analiz etmek için güncel yaklaşımlar arasında doku kesitlerinin immünororesansı, vasküler dökümler, Hindistan mürekkep enjeksiyonu, yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskopi ve/veya tam montajlı immünohistokimya1,4,5,,6,7sayılabilir. Burada, hacimsel verileri, vasküler bağlanabilirliği ve hücre kimliğini toplamak, analiz etmek ve ölçmek için tam bir immünofofloresans, konfokal mikroskopi ve 3Boyutlu görüntü oluşturmayı birleştiren bir protokol tanımlıyoruz. Ayrıca, faringeal kemer vasküler pleksus oluşumu nu incelemek ve PAAs içine remodeling bir araç olarak her faringeal kemer EC'lerin sayısını bölümlere ayırmak ve ölçmek için bir yöntem detay. Bu protokol PAA gelişimini analiz etmek için tasarlanmış olsa da, diğer gelişmekte olan vasküler ağları analiz etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan kullanımı ve prosedürleri Rutgers Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Çözümlerin hazırlanması
- %0,1 Triton-X-100 (PBST) ile 1 L fosfat tamponlu tuzlu su hazırlayın ve sterilize edin. Bu çözelti en az bir yıl oda sıcaklığında (RT) saklanabilir.
- PBST'de normal eşek serumunun %10'undan oluşan 600 μL bloke tamponhazırlayın. Bu çözümü her seferinde taze yapın.
- Bir akış kaputunda aşağıdaki metanol (MeOH) seyreltmelerinin 50 mL'sini hazırlayın: Deiyonize suda %25 MeOH (dH2O), dH2O'da %50 MeOH ve dH2O. Vortex'te %75 MeOH karıştırın. RT'de saklayın.
- 50 mL konik tüplerde aşağıdaki benzyl alkol-benzil benzoat (BABB) çözeltilerinin 50 mL'sini hazırlayın.
- %100 BABB için, 16 mL benzil alkole 32 mL benzoat ekleyin (hacim başına 2:1 hacim oranı).
- %50 BABB için, MeOH'un 24 mL'sine 16 mL benzil benzoat ve 8 mL benzyl alkol ekleyin.
- Işıktan korumak için alüminyum folyo konik tüpleri kapatın. Bu çözümler rt'de bir yıla kadar saklanabilir.
DİkKAT: BABB zehirli ve aşındırıcıdır. MSDS'ye göre ele alınıp imha edilmelidir.
2. Embriyo diseksiyon ve fiksasyon
NOT: Bu protokol, herhangi bir fare türünden izole edilmiş E9.5 ve E10.5 fare embriyoları (erkek veya kadın) için uygundur. Genç ve yaşlı embriyolar için kuluçka süreleri deneysel olarak floresan sinyalinin gürültü oranına olan sinyali en üst düzeye çıkarmak için belirlenmelidir.
- Bir adet 35 mm ve 60 mm Petri tabaklarını 1x PBS ile doldurun ve gerekli olana kadar buz üzerine yerleştirin.
- CO2 inhalasyon yoluyla hamile bir fare ötenazi. Ötanazinin ikincil bir ölçütü olarak servikal çıkığı gerçekleştirin.
- Barajın karın bölgesini %70 etanol ile temizleyin. Forceps kullanarak karın bölgesi pinch ve orta hatta karın duvarının tabanından başlayarak cerrahi makas kullanarak V benzeri bir kesi yapmak; torasik boşluğu açmaya devam edin. Karın dokusukaldırın ve rahim boynuzları ortaya çıkarmak için yan bağırsakhareket.
- Vajinal kanalın tabanında bir kesik yapın ve forceps ile, baraj uzak rahim çekin. Rahim serbest etmek için her yumurtalık ek bir kesim olun. Rahmi soğuk 1x PBS içeren 60 mm Petri kabından birine aktarın.
- Düz makas kullanarak, her implantasyon sitesi arasında rahim duvarı kesti. Bir cam boru ile bir yaprak almak ve 1x PBS ile 35 mm Petri kabına aktarın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, yaprak ve rahim duvarı arasındaki boşluğa düz makas yerleştirin. Rahim duvarını kesin ve çıkarın.
- İnce pratisyen ler ile, doku boyunca enine kesiler yaparak ve dokuyu yumurta kesesi nden uzaklaştırarak karar verici ve Reichert zarlarını embriyodan çıkarın. Yumurta kesesi ve amniyotik kese yi dikkatlice embriyodan uzaklaştırArak ve allantois ve göbek damarında kesikler yaparak çıkarın.
NOT: Yumurta keseleri genotipleme embriyoları için kullanılabilir. - Her embriyoyu cam pipetle 1 mL 1x PBS ile doldurulmuş 2 mL tüplere aktarın. Her tüpü benzersiz bir tanımlayıcıyla etiketlayın.
- Embriyoları onarmak için, 1x PBS'yi dikkatlice çıkarın ve 1x PBS'ye %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi ekleyin. Bir gecede hafif ajitasyon ile 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: %4 PfA fiksasyonu bu protokolde belirtilen antikorlar için uygundur. Ancak, fiksasyon prosedürleri ek antikorlar için optimize edilmelidir.
3. Embriyo boyama
NOT: Bu bölümde embriyolar permeabilize edilir ve primer ve sekonder antikorlarla lekelenir. PAA gelişimi hızla ilerlerken, embriyonik evredeki farklılıklar analizin aşağı akışını büyük ölçüde etkileyecektir. Bu nedenle, embriyolar daha fazla manipülasyon önce kontrol ve mutant çiftleri maç için dikkatle somites sayma tarafından yaş eşleştirilmiş olmalıdır.
- Embriyo(lar yıkamak için), dikkatle% 4 PFA kaldırmak ve 1x PBS ekleyin. Tüpü (ler) birkaç kez hafifçe ters çevirin. Tüpü(ler) sağ tarafa yerleştirin ve embriyonun batmasını bekleyin. 3 kez tekrarlayın. Tüp(ler) ile embriyo(lar) buz üzerine yerleştirin.
NOT: (İsteğe bağlı durma noktası) Yıkarsonra, embriyolar bölüm 1.3'te olduğu gibi seyreltme başına 30 dakika boyunca 30 dakika boyunca dereceli MeOH serisinde susuz kalınabilir ve %100 MeOH'da %100'de -20 °C'de depolanabilir ve daha sonra 6 aya kadar kullanım için kullanılabilir. - E10.5 embriyoları için, bir embriyoyu soğutulmuş 1x PBS ile dolu 35 mm Petri kabına aktarmak için cam pipet kullanın. Dikkatle ince forceps ile arka ekstremite hemen üzerinde embriyo çimdik ve embriyonun arka yarısını kaldırmak için bir enine kesim yapmak. Bu embriyo adım 4.2 için bir sagittal pozisyonda düz yatıyordu sağlar. Embriyoyu taze 1x PBS ile 2 mL tüpe geri yerleştirin.
NOT: Bir kontrol ve mutant embriyo eşlenebilir ve bir tüp aynı antikor solüsyonu ile boyanmış, adımlar için 3.3 için 3.8.- İki embriyoyu birbirine boyamak için, bir embriyonun kafasını ilk faringeal kemerin üzerinde enine bir kesim yapmak için ince keçelerle sıkıştırarak kesin. Bu her tüp içinde iki farklı genotip embriyoları ayırt edecektir.
- Embriyo(lar) permeabilize etmek için, tüpten 1x PBS dışarı boru, embriyo (lar dokunmak için dikkatli olmak). 1 mL PBST ekleyin. Tüpü bir gecede hafif bir ajitasyonla 4 °C'ye yerleştirin.
NOT: (İsteğe bağlı durma noktası) Embriyolar PBST çözeltisinde 4 °C'de birkaç gün tutulabilir. - Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için, önce pbst'yi tüpten çıkarın, embriyoya (lar) dokunmamaya dikkat edin. Embriyo(lar) için tampon çözeltisi engelleme 600 μL ekleyin. Embriyo(lar) 4 °C'de bir gecede nazik ajitasyon ile engelleyin.
NOT: Engelleme çözeltisi, enkazı kaldırmak için kullanılmadan hemen önce tezgah üstü bir santrifüjde en yüksek hızda döndürülmesi gerekir. - EC'leri boyamak ve ölçmek için VEGFR2 ve ERG'ye karşı antikor kullanın. Antikor çözeltileri engelleme tamponu yapılır. Anti-VEGFR2 antikor 1:200 ve ERG antikor 1:1000 seyreltilir.
NOT: Antikor solüsyonlarının partikülleri gidermek için kullanılmadan hemen önce bir tezgah üstü santrifüjüzerinde en yüksek hızda döndürülmesi gerekir.- Birincil antikorlar ile embriyo(lar) inkübasyon için, tüpten bloke tampon çözeltisi kaldırmak, embriyo (lar dokunmak için dikkatli olmak). Her tüpe 600 μL primer antikor çözeltisi ekleyin. 4 °C'de 4-5 gün boyunca nazik ajitasyon ile embriyo(lar) inkübasyon.
- Antikor çözeltisinin embriyo(lar) yıkamak için, ilk tüp ten birincil antikor solüsyonu kaldırın. Embriyo(lar) her saat 1 mL PBST ile oda sıcaklığında (RT) nazik ajitasyon ile yıkayın. Embriyoyu gün içinde 4-5 kez yıkayın ve bir gecede hafif ajitasyonla 4 °C'de kuluçkaya yatırın. Tekrar ertesi gün yıkıyor.
- Anti-keçi Alexa Fluor 488 ve anti-fare Alexa Fluor 555 1:300 engelleme tampon seyrelterek ikincil antikor çözümleri olun. Engelleme tamponunda stok DAPI 1:1000 seyreltin.
NOT: Antikor çözeltileri partikülleri çıkarmak için kullanılmadan hemen önce bir tezgah üstü santrifüj üzerinde en yüksek hızda döndürülmelidir. Buna ek olarak, diğer Alexa Fluor boyalar yerine kullanılabilir 488 veya 555.- Embriyo(lar) ikincil antikorlar ile kuluçka için, tüp Ten PBST kaldırın. Her tüpe 600 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. 4 °C'de 4-5 gün boyunca nazik ajitasyon ile embriyo(lar) inkübasyon.
- Antikor çözeltisinin embriyo(lar) yıkamak için, ilk tüp ikincil antikor çözeltisi kaldırın. Embriyo(lar) rt de PBST 1 mL ile her saat yıkama nazik ajitasyon ile. Embriyoyu gün içinde 4-5 kez yıkayın ve bir gecede hafif ajitasyonla 4 °C'de kuluçkaya yatırın. Tekrar ertesi gün yıkıyor.
4. Agarose embriyogömme
NOT: Bölüm 4'te embriyo(lar) agarose'a gömülü olacaktır. Bu gömme işlemi iki amaca hizmet eder: embriyoyu görüntülemeden önce düzgün bir şekilde yönlendirmek ve BABB'de temizlendikten sonra embriyonun yerinin bulunmasına yardımcı olmak (5.2.2 - 5.3.2. adımlar).
- 200 mL%1 agarose çözeltisi hazırlayın, 2g agarose 200 mL dH2O. Mikrodalga ya da tüm agarose eriyene kadar ilave edin.
NOT: Kalan agarose 4 °C'de depolanabilir ve daha sonraki kullanımlar için yeniden ısıtılabilir. - Plastik bir parafin kalıp ve cam pipet kullanarak, yavaşça kalıp bir embriyo transfer. PBST'yi dikkatlice embriyodan çıkarın. Embriyoyu sagital bir pozisyonda yerleştirin. Hızlı bir şekilde, kalıbına yaklaşık 0,5 mL sıcak agarose ekleyin - sadece embriyo kapsayacak ve kalıp doldurmak için yeterli. Embriyoyu çevreleyen hava kabarcıklarının olmadığından emin olun.
- Agarose katılaşmış kadar buz ve alüminyum folyo ile kaplayın kalıp yerleştirin.
NOT: PBST'nin çıkarılmasından sonra embriyonun kurumasını izin vermeyin. Agarose çözeltisi embriyoya eklenirken sıvı kalacak kadar sıcak olmalıdır. Embriyo kapsayacak kadar agarose ekleyin, ama çok fazla değil, aksi takdirde görüntü zor olacak. Görüntü derinliği kısmen hedefin çalışma mesafesi ile belirlenir.
5. Dehidratasyon ve doku temizleme
NOT: Bu bölümde, embriyo(lar) metanol serisi kullanılarak susuz, daha sonra organik çözücü, BABB temizlenir ve bir kauçuk spacer tarafından ayrılmış iki kapak arasında monte edilir; Bu protokolde Hızlı Kuyu kauçuk spacer'lar kullanılmaktadır. Fast Well tamponçift taraflı yapışkan yüzeye sahiptir. Spacer bir kuyu oluşturmak için gereklidir, hangi embriyo yerleştirilir ve iki kapak arasında tutulan.
-
Metanol dehidratasyon
- Etiket yeni 2 mL tüpler, embriyo başına bir. Tüp başına %25 MeOH 1 mL ekleyin.
- Temiz bir neşter kullanarak, yavaşça embriyo etrafında agarose kesilmiş, böylece forceps tarafından alınabilir embriyo etrafında yeterli bırakarak. Yavaşça gömülü embriyo ile agarose kapmak ve% 25 MeOH ile etiketli tüp içine yerleştirmek için ince forceps kullanın. Forceps embriyo dokunmak için izin vermez.
- Karanlıkta 1 saat boyunca nazik ajitasyon ile RT'de embriyo(lar) inkübasyon.
- Embriyoya dokunmamaya dikkat edin, tüpten %25 MeOH çıkarın. Tüp başına %50 MeOH 1 mL ekleyin. Karanlıkta 1 saat boyunca nazik ajitasyon ile RT'de kuluçka.
- Embriyoya dokunmamaya dikkat edin, tüpten %50 MeOH çıkarın. Tüp başına %75 MeOH 1 mL ekleyin. Karanlıkta 1 saat boyunca nazik ajitasyon ile RT'de kuluçka.
- Embriyoya (lar) dokunmamaya dikkat edin, tüpten %75 MeOH çıkarın. Tüp başına %100 MeOH 1 mL ekleyin. Karanlıkta 1 saat boyunca nazik ajitasyon ile RT'de kuluçka. %100 MeOH yıkamayı iki kez tekrarlayın.
-
BABB ile Takas
- Embriyoya dokunmamaya dikkat edin, tüpten %100 MeOH çıkarın. Tüp başına %50 BABB 1 mL ekleyin. Karanlıkta 1 saat boyunca nazik ajitasyon ile RT'de kuluçka.
- Embriyoya dokunmamaya dikkat edin, tüpten %50 BABB çıkarın. Tüp başına %100 BABB 1 mL ekleyin. Karanlıkta 1 saat boyunca nazik ajitasyon ile RT'de kuluçka. %100 BABB yıkamayı iki kez tekrarlayın.
NOT: (İsteğe bağlı durma noktası) Embriyolar tüplerde yaklaşık bir hafta boyunca %100 BABB'de kalabilirler. Daha uzun depolama BABB tüplerin plastik çözülmesine neden olacaktır.
-
Görüntüleme için montaj embriyoları
- 24 mm x 60 mm #1,5 cam kapak lı bir Fast Well tamponu, plastik yapıştırıcıyı bir taraftan sökerek yerleştirin. Kauçuk tamponun üzerine plastik yapıştırıcıya hafif basınç uygulayarak kapak ve tampon arasında hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Kapak kapağını embriyo numarasına, genotip ve boyamaiçin kullanılan antikorlara göre etiketlendirin.
NOT: Herhangi bir boşluk, bir embriyonun ezilmesini veya ezilmesini önleyecek kadar kalın olduğu sürece kapaklar arasına yerleştirilebilir. Biz kalınlık ve kolaylık nedeniyle Fast Well spacers kullanın, kapakları için güvenli için boşluk her iki tarafında yapışkan yüzeyler içerir. - Dikkatlice dışarı boru ve tüp% 100 BABB atın. Tüpte agarose gömülü embriyo görselleştirdikten sonra, agarose almak ve dikkatle Fast Well içinde coverslip üzerine embriyo transfer ince forceps kullanın - forceps embriyo dokunmak için izin vermez.
- Tampondan ikinci plastik yapıştırıcıyı çıkarın ve ikinci kapak kaymasını üste yerleştirin. Kapak kapağına hafifçe bastırarak hava kabarcıklarını çıkarın. Camı kırmamaya dikkat et.
NOT: Mührü sıkı ise numuneler rt karanlıkta bir slayt tutucusunda bir yıla kadar düz olarak saklanabilir.
- 24 mm x 60 mm #1,5 cam kapak lı bir Fast Well tamponu, plastik yapıştırıcıyı bir taraftan sökerek yerleştirin. Kauçuk tamponun üzerine plastik yapıştırıcıya hafif basınç uygulayarak kapak ve tampon arasında hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Kapak kapağını embriyo numarasına, genotip ve boyamaiçin kullanılan antikorlara göre etiketlendirin.
6. Verilerin elde edilmesi
NOT: Aşağıdaki adımlarda, farengeal kemerlerin endotel 3, 4 ve 6 konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenecektir.
-
Slaytların mikroskop aşamasında konumlandırılması
- Embriyoları görüntülemek için, 20x su daldırma hedefi, sayısal diyafram 0,95, çalışma mesafesi 0,95 mm ve NIS-Elements AR 5.11.01 64-bit yazılımı ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanın.
- Geniş alan floresankullanarak, görsel olarak faringeal kemerleri bulun. 4PAA etrafında alan görünümü orta.
- Hedefin görüş alanı tüm faringeal kemer alanını yakalayamazsa, %1 örtüşme ile büyük bir görüntü paneli alın ve dikin. Büyük görüntünün elde edilmesi sırasında numunenin hareketini önlemek için, kalıbı kalıba kullanarak kapak tertibatını sahneye doğru hafifçe sabitleyin.
-
Edinme parametrelerinin ayarlanması
- İğne deliği boyutunu 1,0 olarak ayarlayın.
- ND Edinme sekmesi altında, kaba ayarlamayı kullanarak görüntülemenin üst ve alt sınırlarını ayarlayın. Yazılım özelliklerine göre Z adım boyutunu ayarlayın. Hedefin çalışma mesafesi ve numunenin netliği ile görüntülenebilen kalınlığı belirleyin.
- Embriyo kalınlığı nedeniyle, Z-yığını boyunca kazanç ayarlayın. Her kanal için (405, 488 ve 555) Z-yığınının ortasında lazer yoğunluğunu ve kazancını ayarlayın ve Z Yoğunluk Düzeltme sekmesinin altına değerleri atayın.
- Floresan sinyalleri daha sönük görünmeye başlayana kadar embriyo arasında ilerleyin. Sinyal yoğunluğu önceki segmente benzer görünene kadar her kanalın kazancını artırın. Z Yoğunluk Düzeltme sekmesi nin altındaki yeni değeri atayın. Z yığını tamamlanana kadar yineleyin. Ayarları ND Edinme'yegeri alma.
- Koş Z Düzeltme seçeneğini kullanarak tarama çalıştırın.
7. Imaris yazılımını kullanarak analiz
NOT: Bu adımlarda konfokal görüntüler mikroskopi görüntü analiz yazılımı olan Imaris sürüm 9.2.0 kullanılarak analiz edilecektir. Bu analiz sırasında öncelikle yüzeyler oluşturarak analiz edilecek ilgi bölgelerini seçeceğiz. Daha sonra, bu bölgeleri görsel olarak ayırmak için Maske işlevini kullanacağız. Son olarak, ilgi çeken her bölgedeki EC sayısını ölçmek için Spot işlevini kullanacağız.
- Adım 6'da kullanılan görüntüleme yazılımına bağlı olarak, Görüntüleri Imaris File Converterkullanarak .ims'e dönüştürün.
- .ims dosyalarını açın. Kamera/Etiketler altında görüntüyü Ortogonal olarak ayarlama | Kamera Tipi panel.
- PAAs'ı bulun ve görüntüyü yüzeye çıkmak için yönlendirin.
NOT: Dosyalar ilk açıldığında, görüntülenen tüm dilimlerin 3B derlemesi olarak görünürler. Bu adımda, PAAs bir 2D görüntü içine 3D görüntü yaparak yer olacaktır. 2B görüntü daha sonra PAAs düzgün analiz için odaklı olmasını sağlar.- Özellikler panelinin altında, Ses Seviyesinikapatın. Özellikler panelinin altında, Yeni Ortho Dilimleyici Ekle'yetıklayın. Dilim Yönünü XY Düzlemineayarlayın. PAA'ları bulana kadar görüntüde gezinmek için Dilim Konumunu kullanın.
- PAA'lar görüntünün üst ve alt kısmıyla paralel değilse, fare imlecini kullanarak görüntüyü serbestçe döndürün, böylece PAA'lar ekranda soldan sağa doğru çalışır. Görüntü İşleme açılır menüsünün altında, Serbest Döndür'u seçin ve Tamam'ıtıklatın.
- 3. Faringeal Kemer'in Yüzeyi (Şekil 2A, B - B")
NOT: Bu adımlarda, faringeal kemerler ve PAAs ilgi bir 'yüzeyli' bölge oluşturmak için Yüzey aracı kullanılarak izlenir. Bu ilgi her bölge için görsel olarak çevreleyen doku izole edilmesine olanak sağlayacaktır. Burada3. Faringeal kemerler 4 ve 6 benzer şekilde analiz edilir.- 3. faringeal kemerin tamamında endotel yüzeyini kaplamak için Özellikler panelinin altında bulunan Yeni Yüzey Ekle düğmesine tıklayın.rd Surface 1'e çift tıklayın ve yeni yüzeyi"3.
- Otomatik oluşturmayı atla'yı seçin, el ile edin. Yüzey Yönünü YZ Düzlemine (koronal oryantasyon) ayarlayın. 3. faringeal kemer yüzey düzlemini3' üncü PAA ve Dorsal Aort'un bağlandığı yere yerleştirmek için Dilim Pozisyonunu kullanın.
- Görüntüyü,3. Ortho Slicer 1'i kapatın.
- Beraberlik Altında | Kontur | Mod sekmesi, Mesafe Çizim Modu işlevini seçin. Gerekirse parametre ayarlarını ayarlayın. Örnekler arasında tutarlı yüzey parametrelerini koruyun. Bu örnekte, Vertex aralığı 10 μm'dir.
- Yüzeye çıkmaya başlamak için Esc tuşuna basın ve ardından Çiz düğmesine tıklayın. Fare imleci ile3. 10-25 dilimi taşımak için Dilim Konumunu kullanın. Faringeal kemerin çevresini takip et. Faringeal kemer tamamen izlenene kadar tekrarlayın.
- İzlenecek bölgenin yüzeyini oluşturmak için Özellikler panelinde Yüzey Oluştur düğmesini seçin.
- 3 PAA Yüzey (Şekil 2C -C")
- 3. PAA'nın endotelrd yüzeyini yüzeye çıkarmak için, önceyüzeydeki bölgeyi 7.4. Ardından, Yeni Yüzey Ekle düğmesine tekrar tıklayın. Surface 1'e çift tıklayın ve yeni yüzeyi"3.
- Otomatik oluşturmayı atla'yı seçin, el ile edin. Yüzey Yönünü YZ Düzlemine (koronal oryantasyon) ayarlayın. 3. PAA yüzeyrd düzlemini3' üncü PAA ve Dorsal Aort'un bağlandığı yere yerleştirmek için Dilim Konumunu kullanın, ardından 7.4 adımlarını tekrarlayın.
- Yüzeyli yapıların maskelemi
NOT: Aşağıdaki adımlarda, her su yüzüne çıkan bölge Maskeli olacaktır. Maskeleme, ilgi alanının görüntülenmiş dokunun geri kalanından görsel olarak farklı olmasını sağlar ve bu farklı ilgi yapılarının sayısallaştırılmasına olanak tanır. Aşağıda, Imaris'teki adımları PAA endotellerini ve pleksusları görselleştirmek ve analiz etmek için tanımlıyoruz - faringeal kemerler içindeki PAA'ları çevreleyen küçük vaskülatür. Bu adımlarda, Bölüm 7.7'de açıklanan Spot fonksiyonu kullanılarak sadece PAA'larda görselleştirmek ve analiz yapmak için3.- Tüm maskeli kanalları görselleştirmek için Ses Düzeyi'ni seçin. Görüntüyü döndürmek ve görüntüyü XY konumuna konumlandırmak için Esc tuşuna basın.
- Edit sekmesinin altında,3. Mask Selection DAPI kanalını seçin ve Tamam'ıtıklatın. Kalan kanallar için tekrarlayın.
- Klavyede Ekran Ayarlamaları panelini görüntülemek için Ctrl + D tuşuna basın. Her yeni kanalı seçin ve her kanalın ne gösterdiğini net bir şekilde belirtmek için bunları yeniden adlandırın. Örneğin, bu üç yeni kanala yol açacaktır: "3PAA DAPI", "3rd PAA ERG", ve"3.
NOT: 7.6.4-7.6.7 adımlarında sadece faringeal arch pleksus için kanallar oluşturacağız. - Endotel pleksusunun PAA'dan ayrı olarak görselleştirilmesi için öncelikle3. DAPI kanalını seçin. KontrolÜnü aç dış yüzeyvoxels ve kontrol etmek için yüzey içinde voxels düğmelere, sıfır akadar yüzey içinde voxels seçin. Tamam'ıtıklatın.
- Kalan kanallar için tekrarlayın. Bu işlem, PAA içeren bölgeyi yeni maskeli kanallardan dışlayacaktır. Her kanalın ne gösterdiğini net bir şekilde belirtmek için kanalları yeniden adlandırın. Örneğin, bu üç yeni kanala yol açacaktır: "PAA OLMAYAN DAPI", "PAA OLMAYAN ERG", ve "PAA OLMAYAN VEGFR2".
- 3. faringeal kemer içinde endotel pleksus görselleştirmek için, 3 Faringealrd Arch yüzeyi için, Edit sekmesi altında Maske Seçimi seçin. PAA Olmayan DAPI kanalını seçin. Tamam'ıtıklatın.
- Kalan PAA dışı kanallar için tekrarlayın. Her kanalın ne gösterdiğini net bir şekilde belirtmek için kanalları yeniden adlandırın. Örneğin, bu üç yeni kanala yol açacaktır: "Plexus DAPI", "Plexus ERG", ve "Pleksus VEGFR2".
- AT sayılarının sayısallaştırılması
NOT: ERG'nin ekspresyonu endotel çekirdeklerini işaret ederek EC sayılarını ölçmeyi uygun hale getirir. Bu adımlarda, AB sayısı, PAA ve pleksus erg ifadesi ile işaretlenmiş her BIR EC için bir nokta oluşturmak için Spot işlevi kullanılarak ölçülecektir. Bölüm 7.7'de, maskeli PAA'daki her ERG-pozitif hücre için lekeler oluşturulacak ve ardından ERG-pozitif, VEGFR2-negatif hücrelerdeki lekelerin seçimi yapılacaktır.- Klavyede Ekran Ayarlamaları panelini görüntülemek için Ctrl + D tuşuna basın. PAA ERG hariç tüm kanalları kapatın.
- Özellikler sekmesinin altında Yeni Noktalar Ekle düğmesini tıklatın. Noktalar 1'e tıklayın ve "PAA Toplam EK Sayısı" olarak yeniden adlandırın. Mavi ok düğmesine tıklayın. Kaynak Kanaliçin PAA ERG kanalını seçin. Tahmini XY Çapını 4 μm'ye ayarlayın. Mavi ok düğmesine tıklayarak bir sonraki panele devam edin.
- Her EC çekirdeğinin (ERG ifadesi ile işaretlenmiş) tek bir noktayla temsil edilmesini sağlamak için kayar ölçek kullanılarak görülen nokta sayısını ayarlayın. Yeşil çift ok düğmesine tıklayın.
- Ekran Ayarı'ndaki PAA ERG kanalını kapatın. PAA endotel görselleştirmek için PAA VEGFR2 kanal açın.
- EC sayısını doğru bir şekilde ölçmek için, her noktanın hem AT işaretçisini, HEM ERG'yi hem de VEGFR2'yi ifade etmesini sağlıyoruz. Bunu yapmak için, Edit sekmesi altında Nesnenin Yüzeyi'ni seçin | Panel ekle/sil. Esc tuşuna basın ve shift basılı tutarak ve nokta seçerek, VEGFR2 pozitif olmayan herhangi bir nokta silin.
NOT: Aşağıdaki adımda, maskeli pleksustaki her ERG pozitif hücre için lekeler oluşturulacak ve ardından ERG-pozitif, VEGFR2-negatif hücrelerdeki lekelerin seçimi yapılacaktır. - Özellikler sekmesinin altında Yeni Noktalar Ekle düğmesini tıklatın. Noktalar 1'i seçin ve "Pleksus Toplam EK Sayısı" olarak yeniden adlandırın. Mavi ok düğmesine tıklayın. Kaynak Kanal için Plexus ERG kanalını seçin. Tahmini XY Çapını 4 μm'ye ayarlayın. Plexus toplam EK sayısı için 7.7.1 - 7.7.5 adımlarını tekrarlayın.
- 3. PAA ve faringeal arch pleksusundakird toplam EC sayısını belirlemek için her nokta fonksiyonunun İstatistikler sekmesine tıklayın.
- Kalan PAAs ve faringeal arch pleksus için tekrar adımları 7.7.1 - 7.7.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan tüm montaj immünofloresan protokolü net ve temiz sonuçlar üretir, faringeal kemer endotel 3D rekonstrüksiyonu için izin, Şekil 1Agörüldüğü gibi . Her antikor çözeltisinde yeterli miktarda embriyo kuluçkaya yatırılması ve antikor kuluçka sonrası embriyoların iyice yıkanması önemlidir. Şekil 1B'debüyük, parlak nokta, antikorveya engelleme tampon çözeltilerinde partikül sonucu ortaya çıkar. Her antikor kuluçka bu sorunu giderir sonra PBST yıkama uzun süre ve kullanımdan önce her çözüm santrifüj bulduk.
Şekil 2, protokolün bölüm 7'de açıklandığı gibi, bir faringeal kemer ve analiz için bir PAA yüzey için kullanılan süreci göstermektedir. Maskeli işlevi kullanarak, Imaris yazılımı yüzeyli bölgelerin görsel olarak ayrılmasını ve bağımsız olarak analiz edilmesine olanak tanır.
Şekil 3 faringeal kemerlerde farklı vasküler bölmelerin ayrı ayrı maskelemesini gösterir: PAA (Şekil 3A, B, C) ve pleksus ( Şekil3A', B', C'). Maskeleme, her yapıdaki AT sayılarının ayrı ayrı analiz ve nicelemesini sağlar. Şekil 3C-C'de,Spot özelliği, ERG'yi ifade eden her çekirdek için tek bir nokta atayarak, hem PAA hem de pleksustaki toplam EK sayısını ölçmek için kullanılır. Spot işlevi için kullanılan algoritmanın belirli bir boyuttaki herhangi bir piksel için bir nokta oluşturmak üzere tasarlanmış olduğunu unutmayın. Burada EC çekirdeklerinin bir belirteci olarak kullanılan ERG, nöral kresthücrelerindede 8; nöral krest hücreleri VEGFR2 ifade etmez. Şekil 3D, Imaris Spot fonksiyonu tarafından oluşturulan ERG-pozitif (yeşil), VEGFR2-negatif (pembe) bir nokta örneğini göstermektedir. Sonuç olarak, her noktanın tek bir AT'yi temsil ettiğini ve hem ERG hem de VEGFR2 ile etiketlendiğini doğrulamak önemlidir.
| Adım | Zaman | Sıcaklık | |
| 1 | PBST Yıkama/Permeabilizasyon | 24 saat veya O/N | 4 °C |
| 2 | Arabelleği Engelleme | 25 saat veya O/N | 4 °C |
| 3 | Primer Antikor | 4-5 gün | 4 °C |
| 4 | PBST Yıkama | 2 gün boyunca günde 4-5 kez | RT (veya O/N ise 4 °C) |
| 5 | İkincil Antikor | 4-5 gün | 4 °C |
| 6 | PBST Yıkama | 2 gün boyunca günde 4-5 kez | RT (veya O/N ise 4 °C) |
| 7 | Katıştır | Yok | Rt |
| 8 | Metanol Dehidratasyon ve BABB | Adım başına 1 saat | Rt |
Tablo 1: Tüm montaj immünofloresan protokolüne genel bakış. O/N - bir gecede; RT - oda sıcaklığında.
Şekil 1: Tam monte immünofloresan sonra temiz ve kirli görüntülerin karşılaştırılması. E10.5 embriyosundaki sagittal görünümler PAA endotellerini görselleştirmek için anti-VEGFR2 antikor (beyaz) kullanımını göstermektedir. PBST sonrası antikor kuluçkaları ile iyice yıkanmış embriyolar(A)daha yüksek bir sinyal-gürültü oranına sahiptir ve iyice yıkanmamış embriyolarla karşılaştırıldığında daha temiz bir görüntü oluştururlar(B). B'deki oklar, embriyo iyice yıkanmamış veya antikor çözeltisi santrifüj edilmemişken görüntüde beliren gürültü/kir alanlarını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Faringeal kemer (PA) ve PAA yüzey. 2B sagittal görünüm(A)konfokal görüntüdeki PAA'ların yerini belirlemek için kullanılır. Bir koronal ortho dilimleyici(A, sarı çizgi)PAAs ile yer. Faringeal kemer (B) ve PAA (C)daha sonra Imaris'teki Mesafe Çizim aracı kullanılarak koronal oryantasyonda su yüzüne çıkar. 10 μm'ye ayarlanmış Mesafe Çizim aracı,3. BC Anahatlar tüm kemer(B', C') boyunca her 10-25 dilim çizilir. Anahatlar faringeal kemer(B") veya PAA(C)bir 3D yüzey oluşturmak için birleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: BIR PAA ve pleksus daki AT sayılarının sayısallaştırılması. 3D rekonstrüksiyonlar, bir PAA'da veya bir EC pleksusta damar yapısını ve AT belirteçlerinin ekspresyonunu ayrı ayrı görselleştirmek için kullanılır. Paneller A-A' PAA ve pleksus(A', pembe)ve VEGFR2 ifadesini göstermektedir.A, yellow Panel A" PAA ve pleksus VEGFR2 ifadesinin birleştiğini göstermektedir. Paneller B-B' PAA(B, kırmızı)ve pleksus(B', yeşil)ERG ifadesini göstermektedir. Panel B" PAA ve pleksus birliğini göstermektedir. C-C'. Imaris'teki Spot fonksiyonu, PAA veya pleksustaki EC sayısını ölçmek için kullanılır. PAA'daki her ERG-pozitif hücreye(C, kırmızı)veya pleksus(C', yeşil)tek bir AT'ı işaretlemek için tek bir nokta atanır. C'-D'deki ok, Imaris Spot fonksiyonu tarafından oluşturulan pleksusta ERG-pozitif, VEGFR2-negatif bir nokta gösterir. Bu nokta nicelik dışıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D fare embriyolarında endotel görselleştirmek için yeteneği onların gelişimi içine yeni anlayışlar sağlamıştır3. Burada embriyoların yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme, vasküler bağlantı nın görselleştirilmesi ve PAA oluşumunun kantitatif analizleri için izin veren bir protokol sıyoruz. Bu protokol, genetik değişikliklerin veya çevresel hakaretlerin PAA gelişimini nasıl etkilediğini görmek için kullanılabilir. Burada bildirilen prosedür, PAA oluşumunu görselleştirmek ve EC sayısını ölçmek için VEGFR2 ve ERG'ye karşı antikorlar kullanır; ancak, ek antikorlar görselleştirmek ve arch arter gelişiminin diğer yönlerini analiz etmek için kullanılabilir, nöral krest işe alma veya düz kas hücresi farklılaşması gibi. Bu işlem embriyogenezin daha erken evrelerinde kullanılacaksa, bu protokolde tespit edilen bazı antijenlerin (örneğin, ERG) henüz ifade edilmeyebileceğini belirtmek önemlidir. DAPI veya DRAQ5 gibi diğer nükleer lekeler veya nükleer etiketli izleyiciler ile soy etiketleme AT sayısını ölçmek için kullanılabilir.
Protokol içinde birkaç kritik adım vardır: 1) embriyoların çözüm değişiklikleri arasında kurumaması; 2) embriyolar iyice antikor kuluçka sonra yıkanır; ve 3) embriyolar tamamen BABB ile doku temizleme önce MeOH ile susuz olduğunu.
Doku temizleme den önce metanol yıkar iki amac hizmet: floresan proteinlerin ekspresyonu nedeniyle floresan ortadan kaldırmak için (örneğin EGFP veya tdTomato soyu izleme için kullanılan ekspresyonu) embriyo, ve doku dehidrate. Floresan proteinlerden floresan ortadan kaldırılması görüntüleme için floresan herhangi bir kombinasyonun kullanılmasına olanak sağlar. EGFP ve TdTomato (kiraz) karşı antikorlar bu floresan proteinlerin ekspresyonunu görselleştirmek için kullanılabilir. Alternatif olarak, MeOH floresan proteinlerin floresan korumak için tetrahidrofuran ile değiştirilebilir9.
BABB açıklığı öncesinde düzgün bir şekilde susuz kaltılmayan embriyoların ışık saçılımı nedeniyle görüntülenmenin zor olduğunu bulduk. BABB opak doku temizlemek için organik bir çözücü tam dehidratasyon gerektiren bir hidrofobik bir çözümdür. Tam takas embriyo içinde mümkün olan en derin düzeyde görüntü elde etmek için yeteneği sağlar10,11. Bu protokolde, uzun çalışma mesafesi ve deneylerimiz sırasındaki kullanılabilirliği nedeniyle 20 x su daldırma hedefi kullandık. BABB ve petrol su ve BABB'den daha yakın kırılma endekslerine sahip olduğundan, petrol daldırma hedefleri bu protokol için daha uygundur. Ancak, kırılma indisi farkı rağmen, bu protokolde kullanılan su daldırma amacı mükemmel görüntü kalitesi sağladı.
Bu protokolün birkaç sınırlaması vardır. BURADA kullanılan BABB takas toksik ve aşındırıcı11,12,13. BABB tutkal ve plastik çözer. Örnekler görüntüleme sırasında düzgün bir şekilde ele alınmazsa, mikroskop objektif lensi, kapak kaymasındaki çatlaklar veya Fast Well tamponu ile coverslip arasındaki kırık bir mühür le örnekten kaçabilecek BABB tarafından zarar görebilir. CLARITY gibi organik çözücüler kullanmayan temizleme yöntemleri10,11,,14alternatif olarak kullanılabilir. CLARITY'nin kırılma indisi eşleştirme çözümü, su daldırma amacı kullanılarak uygun bir temizleme yöntemi haline getiren, suya benzer bir kırılma indisi vardır. Bu protokolün ek bir sınırlama sadece cansız dokular üzerinde yapılabilir, böylece canlı görüntüleme için uygulanmasını engelleyen olmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Brianna Alexander, Caolan O'Donnell ve Michael Warkala'ya bu el yazmasının dikkatli okumaları ve düzenlenmesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 SA tarafından finanse edildi; AJR NHLBI HL103920-08S1 ve Ulusal Artrit Enstitüsü ve Kas-Iskelet ve Cilt Hastalıkları Eğitimi hibe T32052283-11 tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
- Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
- Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
- Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).
- Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
- Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
