Summary
Her beskriver vi en protokoll for å visualisere og analysere de faryngeale buearteriene 3, 4 og 6 av museembryoer ved hjelp av hele mount immunofluorescens, vevsydding, konfokal mikroskopi og 3D-rekonstruksjon.
Abstract
Feil dannelse eller ombygging av farynleskearteriene (PAAer) 3, 4 og 6 bidrar til noen av de mest alvorlige formene for medfødt hjertesykdom. For å studere dannelsen av PAAer utviklet vi en protokoll ved hjelp av hele mount immunofluorescens kombinert med benzylalkohol/benzylbenzoat (BABB) vevsrydding og konfokal mikroskopi. Dette gjør det mulig for visualisering av faryngitteret i enfin cellulær oppløsning samt 3D-tilkoblingen til vaskulaturen. Ved hjelp av programvare har vi etablert en protokoll for å kvantifisere antall endotelceller (ECer) i PAAer, samt antall ECer i vaskulær plexus rundt PAAer innenfor farynlesbuer 3, 4 og 6. Når den brukes på hele embryoet, gir denne metodikken en omfattende visualisering og kvantitativ analyse av embryonalvaskulatur.
Introduction
Under museembryogenese oppstår faryngeal erkearterier (PAAer) som symmetriske, tosidige par arterier som forbinder hjertet med den dorsal aortae1. Som embryoet utvikler seg, gjennomgår de første og andre parpaene av PAAs regress, mens 3rd, 4th, og 6th PAAs gjennomgår en rekke asymmetriske remodeling hendelser for å danne aortaerinarteriene2.
PaAs 3, 4 og 6 utvikler seg via vaskuogenese, som er de novo-dannelsen av blodkar3. Defekter i dannelsen eller ombygging av disse erkearteriene gir opphav til ulike medfødte hjertefeil, slik som de som er sett hos pasienter med DiGeorge syndrom4,5. Derfor kan forståelse av mekanismer som regulerer utviklingen av PAAer føre til en bedre forståelse av medfødt hjertesykdom (CHD) etiologi.
Nåværende tilnærminger for visualisering og analyse av PAA-utvikling inkluderer immunfluorescens av vevsseksjoner, vaskulære støperier, India blekkinjeksjon, høy oppløsning episkopisk mikroskopi, og / eller helmontert immunohistochemistry1,4,5,6,7. Her beskriver vi en protokoll som kombinerer hele mount immunofluorescens, konfokal mikroskopi og 3D-bildegjengivelse for å samle inn, analysere og kvantifisere volumetriske data, vaskulær tilkobling og celleidentitet. Videre beskriver vi en metode for å compartmentalize og kvantifisere antall ECer i hver faryngeal bue som et middel til å studere dannelsen av faryngeal bue vaskulær plexus og dens ombygging i PAAs. Mens denne protokollen er designet for å analysere PAA-utvikling, kan den brukes til å analysere andre utviklende vaskulære nettverk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrebruk og prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Rutgers University.
1. Utarbeidelse av løsninger
- Forbered 1 L fosfatbufret saltvann med 0,1% Triton-X-100 (PBST) og filtersteriliser. Denne løsningen kan lagres ved romtemperatur (RT) i minst et år.
- Forbered 600 μL blokkeringsbuffer bestående av 10 % av det normale eselserumet i PBST. Gjør denne løsningen frisk hver gang.
- Forbered 50 ml av følgende metanol (MeOH) fortynninger i en strømningshette: 25% MeOH i deionisert vann (dH2O), 50% MeOH i dH2O og 75% MeOH i dH2O. Vortex å blande. Lagre på RT.
- Forbered 50 ml av følgende benzylalkoholbenzoat (BABB) oppløsninger i 50 ml koniske rør.
- For 100 % BABB tilsett 32 ml benzylbenzoat til 16 ml benzylalkohol (2:1 volum per volumforhold).
- For 50% BABB, tilsett 16 ml benzylbenzoat og 8 ml benzylalkohol til 24 ml MeOH.
- Dekk koniske rør i aluminiumsfolie for å beskytte mot lys. Disse løsningene kan lagres på RT i opptil et år.
FORSIKTIG: BABB er giftig og korroderende. Det skal håndteres og avhendes i henhold til MSDS.
2. Embryodisseksjon og fiksering
MERK: Denne protokollen er egnet for E9.5 og E10.5 museembryoer (mann eller kvinne) isolert fra enhver musstamme. For yngre og eldre embryoer bør inkubasjoner ganger være eksperimentelt fastslått for å maksimere signal til støyforhold av fluorescenssignal.
- Fyll en 35 mm og en 60 mm Petri retter med 1x PBS og legg på is til nødvendig.
- Euthanize en gravid mus via CO2 innånding. Utfør cervical dislokasjon som et sekundært mål på eutanasi.
- Rengjør bukområdet av demningen med 70% etanol. Klyp bukområdet ved hjelp av tang og gjør et V-lignende snitt ved hjelp av kirurgisk saks som starter fra bunnen av bukveggen ved midtlinjen; fortsette å åpne opp thoraxhulen. Løft bukvevet og flytt tarmene til siden for å eksponere livmorhornene.
- Lag et kutt ved foten av vaginalkanalen, og med tang, trekk livmoren bort fra demningen. Gjør et ekstra kutt på hver eggstokk for å frigjøre livmoren. Overfør livmoren til en av de 60 mm Petri-rettene som inneholder kald 1x PBS.
- Ved hjelp av rett saks, kutt livmorveggen mellom hvert implantasjonssted. Plukk opp en decidua med et glassrør og overfør til 35 mm Petriskål med 1x PBS. Under et disseksjonsmikroskop setter du rett saks inn i rommet mellom avgjørende og livmorveggen. Klipp og fjern livmorveggen.
- Med fine tang, fjern decidua og Reicherts membraner fra embryoet ved å nøye lage tverrgående snitt langs vevet og trekke vevet bort fra eggeplommesekken. Fjern eggeplommesekk og fostervannsac ved å forsiktig trekke vevet bort fra embryoet og gjøre kutt på allantois og navlestreng.
MERK: Eggeplommesekker kan brukes til genotyping embryoer. - Overfør hvert embryo med et glassrør til individuelle 2 ml rør fylt med 1 ml 1x PBS. Merk hvert rør med en unik identifikator.
- For å fikse embryoer, fjern forsiktig 1x PBS og tilsett 4% paraformaldehyd (PFA) løsning i 1x PBS. Inkuber ved 4 °C med lett agitasjon over natten.
MERK: 4 % PFA-fiksering er egnet for antistoffene som er nevnt i denne protokollen. Fikseringsprosedyrer bør imidlertid optimaliseres for ytterligere antistoffer.
3. Embryo farging
MERK: I denne delen er embryoer permeabilisert og farget med primære og sekundære antistoffer. Fordi PAA-utviklingen fortsetter raskt, vil forskjeller i embryonale stadium i stor grad påvirke analysen nedstrøms. Derfor må embryoer være alderstilpasset ved å nøye telle somites for å matche kontroll og muterte par før ytterligere manipulasjoner.
- For å vaske embryo(er), fjern forsiktig 4% PFA og tilsett 1x PBS. Vend forsiktig røret(e) flere ganger. Plasser røret(e) høyre side opp og la embryoet(e) synke. Gjenta vask 3 ganger. Plasser røret(e) med embryo(er) på is.
MERK: (Valgfritt stoppested) Etter vasken kan embryoer dehydreres i gradert serie meoh i 30 min per fortynning, som i avsnitt 1.3, og oppbevares ved -20 °C i 100 % MeOH for senere bruk i opptil 6 måneder. - For E10.5 embryoer, bruk et glassrør for å overføre ett embryo til en 35 mm Petriskål fylt med kjølt 1x PBS. Klem forsiktig embryoet like over bakbenet med fine tang og gjør et tverrgående kutt for å fjerne den bakre halvdelen av embryoet. Dette gjør at embryoet kan ligge flatt i sagittal stilling for trinn 4.2. Plasser embryoet tilbake i 2 ml røret med frisk 1x PBS.
MERK: Et kontroll- og mutert embryo kan pares og merkes med samme antistoffløsning i ett rør, for trinn 3,3 til 3,8.- Hvis du ser to embryoer sammen, kutt hodet av ett embryo over den første faryngealbuen ved å klemme med fine tang for å gjøre et tverrgående kutt. Dette vil skille embryoer av to forskjellige genotyper i hvert rør.
- For å permeabilize embryoet(e), rør ut 1x PBS fra røret, vær forsiktig så du ikke berører embryoet(e). Tilsett 1 ml PBST. Plasser røret ved 4 °C med lett agitasjon over natten.
MERK: Embryoer (valgfritt stoppested) Embryoer kan oppbevares i PBST-oppløsning ved 4 °C i flere dager. - For å forhindre ikke-spesifikk binding av antistoffer, fjern først PBST fra røret, vær forsiktig så du ikke berører embryoet(e). Tilsett 600 μL blokkeringsbufferløsning til embryoet(e). Blokker embryoet(e) ved 4 °C med mild agitasjon over natten.
MERK: Blokkeringsløsningen må spunnet med topphastighet på en sentrifuge på benkeplaten umiddelbart før bruk for å fjerne rusk. - Bruk antistoffer mot VEGFR2 og ERG for å beise og kvantifisere ECer. Antistoffløsninger er laget i blokkeringsbufferen. Anti-VEGFR2 antistoff fortynnes 1:200 og ERG antistoff fortynnes 1:1000.
MERK: Antistoffløsninger må spunnet med topphastighet på en sentrifuge på benken umiddelbart før bruk for å fjerne partikler.- For å inkubere embryo(er) med primære antistoffer, fjern blokkeringsbufferløsning fra røret, vær forsiktig så du ikke berører embryoet(e). Tilsett 600 μL primær antistoffoppløsning til hvert rør. Inkuber embryo(er) ved 4 °C med mild agitasjon i 4-5 dager.
- For å vaske embryoet(e) av antistoffoppløsningen, fjern først den primære antistoffoppløsningen fra røret. Vask embryo(er) hver time med 1 ml PBST ved romtemperatur (RT) med mild agitasjon. Vask embryo(er) 4-5 ganger i løpet av dagen og inkuber deretter ved 4 °C med mild agitasjon over natten. Gjenta vasker neste dag.
- Lag sekundære antistoffløsninger ved å fortynne antigeitalexafluor 488 og anti-mus Alexa Fluor 555 1:300 i blokkeringsbuffer. Fortynn lager DAPI 1:1000 i blokkeringsbufferen.
MERK: Antistoffløsninger må spunnet med topphastighet på en sentrifuge på benken umiddelbart før bruk for å fjerne partikler. I tillegg kan andre Alexa Fluor fargestoffer brukes i stedet for 488 eller 555.- For å inkubere embryoet(e) med sekundære antistoffer, fjern PBST fra røret. Tilsett 600 μL sekundær antistoffoppløsning til hvert rør. Inkuber embryo(er) ved 4 °C med mild agitasjon i 4-5 dager.
- For å vaske embryoet(e) av antistoffoppløsningen, fjern først den sekundære antistoffoppløsningen fra røret. Vask embryoet(e) hver time med 1 ml PBST ved RT med mild agitasjon. Vask embryo(er) 4-5 ganger i løpet av dagen og inkuber deretter ved 4 °C med mild agitasjon over natten. Gjenta vasker neste dag.
4. Innebygging av embryoer i agarose
MERK: I avsnitt 4 vil embryoet(e) bli innebygd i agarose. Denne innebyggingsprosessen tjener to formål: å orientere embryoet riktig før bildebehandling, og for å hjelpe til med å lokalisere embryoet etter at det er ryddet i BABB (trinn 5.2.2 - 5.3.2).
- Forbered 200 ml 1% agaroseoppløsning ved å tilsette 2 g agarose til 200 ml dH2O. Mikrobølgeovn til alle agarose er oppløst.
MERK: Gjenværende agarose kan oppbevares ved 4 °C og varmes opp igjen for senere bruk. - Ved hjelp av en plastparafinmugg og glassrør overfører du forsiktig ett embryo til formen. Fjern forsiktig PBST fra embryoet. Plasser embryoet i sagittalstilling. Raskt, legg til ca 0,5 ml varm agarose til formen - akkurat nok til å dekke embryoet og fylle formen. Sørg for at ingen luftbobler omgir embryoet.
- Legg formen på is og dekk med aluminiumsfolie til agarose har størknet.
MERK: Ikke la embryoet tørke etter fjerning av PBST. Agarose-løsningen må være varm nok til å forbli flytende når den legges til embryoet. Legg akkurat nok agarose til å dekke embryoet, men ikke for mye, ellers vil det være vanskelig å bilde. Bildedybde bestemmes delvis av arbeidsavstanden til målet.
5. Dehydrering og vevsrydding
MERK: I denne delen er embryo(er) dehydrert ved hjelp av metanolserie, deretter ryddet i det organiske løsningsmidlet, BABB, og montert mellom to dekklepper atskilt av en gummiavstandsavstandsavstandsavstandsavstandstegn; i denne protokollen brukes Hurtigbrønngummiavstandsavstandsrommer. Fast Well støtfanger har en dobbeltsidig klebende overflate. Spacer er nødvendig for å skape en brønn, der embryoet vil bli plassert og holdt mellom to coverslips.
-
Metanol dehydrering
- Merk nye 2 ml rør, ett per embryo. Tilsett 1 ml 25% MeOH per rør.
- Ved hjelp av en ren skalpell, kutt forsiktig agarose rundt embryoet, og etterlot nok rundt embryoet slik at det kan plukkes opp av tang. Bruk fine tang for å forsiktig ta tak i agarose med det innebygde embryoet og legg det i det merkede røret med 25% MeOH. Ikke la pinsettene berøre embryoet.
- Inkuber embryo(er) ved RT med mild agitasjon i 1 time i mørket.
- Fjern 25% MeOH fra røret, vær forsiktig så du ikke berører embryoet. Tilsett 1 ml 50% MeOH per rør. Inkuber ved RT med mild agitasjon i 1 time i mørket.
- Fjern 50% MeOH fra røret, vær forsiktig så du ikke berører embryoet. Tilsett 1 ml 75% MeOH per rør. Inkuber ved RT med mild agitasjon i 1 time i mørket.
- Fjern 75% MeOH fra røret, vær forsiktig så du ikke berører embryoet(e). Tilsett 1 ml 100% MeOH per rør. Inkuber ved RT med mild agitasjon i 1 time i mørket. Gjenta 100% MeOH vaske to ganger.
-
Rydde med BABB
- Fjern 100% MeOH fra røret, vær forsiktig så du ikke berører embryoet. Tilsett 1 ml 50% BABB per rør. Inkuber ved RT med mild agitasjon i 1 time i mørket.
- Fjern 50% BABB fra røret, vær forsiktig så du ikke berører embryoet. Tilsett 1 ml 100% BABB per rør. Inkuber ved RT med mild agitasjon i 1 time i mørket. Gjenta 100% BABB vask to ganger.
MERK: Embryoer kan forbli i 100% BABB i rør i omtrent en uke. Lengre lagring vil føre til at BABB oppløses plasten av rør.
-
Monteringsembryoer for bildebehandling
- Plasser en fast brønnstøtfanger på en 24 mm x 60 mm #1,5 glassdeksel, ved å flasse av plastlimet fra den ene siden. Pass på at det ikke er luftbobler mellom dekkslip og støtfanger ved å påføre forsiktig trykk på plastlimet på toppen av gummistøtfangeren. Merk dekkseddelen i henhold til embryonummer, genotype og antistoffer som brukes til farging.
MERK: Enhver avstandsmåler kan plasseres mellom dekksleppene så lenge den er tykk nok til å forhindre knusing eller squishing et embryo. Vi bruker Fast Well spacers på grunn av deres tykkelse og bekvemmelighet, som inkluderer klebende overflater på hver side av spacer for å sikre den til coverslips. - Rør forsiktig ut og kast 100% BABB fra røret. Etter å ha visualisert det agarose-innebygde embryoet i røret, bruk fine tang for å plukke opp agarose og nøye overføre embryoet til dekkslip inne i Fast Well - ikke la pinene berøre embryoet.
- Fjern det andre plastlimet fra støtfangeren og plasser den andre dekksdelen på toppen. Fjern luftbobler ved å trykke forsiktig på trekkslipen. Vær forsiktig så du ikke knuser glasset.
MERK: Prøvene kan lagres flatt i en glideholder i mørket ved RT i opptil et år hvis forseglingen er stram.
- Plasser en fast brønnstøtfanger på en 24 mm x 60 mm #1,5 glassdeksel, ved å flasse av plastlimet fra den ene siden. Pass på at det ikke er luftbobler mellom dekkslip og støtfanger ved å påføre forsiktig trykk på plastlimet på toppen av gummistøtfangeren. Merk dekkseddelen i henhold til embryonummer, genotype og antistoffer som brukes til farging.
6. Innhenting av data
MERK: I følgende trinn vil endotelet av farynske buer 3, 4 og 6 bli avbildet ved hjelp av konfokal mikroskopi.
-
Plassering av lysbilder på mikroskopstadiet
- For å bilde embryoer, bruk et konfokalmikroskop utstyrt med et 20x vannnedsenking mål, numerisk blenderåpning 0,95, arbeidsavstand 0,95 mm, og NIS-Elements AR 5.11.01 64-bit programvare.
- Bruk fluorescens med bredfelt, visuelt å finne de sløve buene visuelt. Midtstill feltvisningen rundt4 th PAA.
- Hvis målets synsfelt ikke fanger hele det farynleske bueområdet, ta og sy et stort panel med bilder med 1% overlapping. For å forhindre bevegelse av prøven under oppkjøpet av det store bildet, fest forsiktig dekselet slip montering til scenen ved hjelp av molding leire.
-
Definere anskaffelsesparametere
- Sett størrelsen på pinhole til 1,0.
- Under kategorien ND-anskaffelse angir du topp- og bunngrensene for bildebehandling ved hjelp av grovjusteringen. Angi Z-trinnsstørrelse i henhold til programvarespesifikasjoner. Bestem tykkelsen som kan avbildes av arbeidsavstanden til målet og klarheten i prøven.
- På grunn av tykkelsen på embryoet, juster gevinsten gjennom Z-stabelen. Angi laserintensiteten og forsterkningen midt i Z-stakken for hver kanal (405, 488 og 555), og tilordne verdier under kategorien Z Intensitetskorrigering. Angi de samme verdiene for den nederste delen.
- Bla gjennom embryoet til fluorescenssignaler begynner å virke dimmer. Øk gevinsten for hver kanal til signalintensiteten ligner på det forrige segmentet. Tilordne den nye verdien under kategorien Z Intensitetskorrigering. Gjenta til z-stakken er fullført. Importer innstillinger tilbake til ND Acquisition.
- Kjør skanning ved hjelp av Kjør Z-korrigering.Run scan using Run Z Correction option.
7. Analyse ved hjelp av Imaris-programvaren
MERK: I disse trinnene vil konfokale bilder bli analysert ved hjelp av mikroskopibildeanalyseprogramvaren, Imaris versjon 9.2.0. Under denne analysen vil vi først velge områder av interesse som skal analyseres ved å lage overflater. Deretter vil vi bruke Maske-funksjonen til å skille disse områdene visuelt. Til slutt vil vi bruke Spot-funksjonen til å kvantifisere antall ECer innenfor hver interesseregion.
- Avhengig av bildeprogramvaren som brukes i trinn 6, konvertere bilder til .ims ved hjelp av Imaris File Converter.
- Åpne ims-filene. Sett bildet til Orthogonal under Kamera/etiketter | Kameratype-panelet.
- Finn PAAene og orienter bildet for overflatebehandling.
MERK: Når filene åpnes for første gang, vises de som en 3D-samling av alle skiver avbildet. I dette trinnet vil PAAene bli plassert ved å gjøre 3D-bildet til et 2D-bilde. 2D-bildet gjør det mulig for PAAene å være riktig orientert for analyse.- Slå av Volumunder Egenskaper-panelet. Klikk legg til ny ortoslicerunder Egenskaper-panelet. Angi slice-retning til XY-planet. Bruk Slice-posisjonen til å bla gjennom bildet til du finner PAAene.
- Hvis PAAene ikke er parallelle til toppen og bunnen av bildet, roterer du bildet fritt ved hjelp av musepekeren slik at PAAer løper fra venstre til høyre over skjermen. Velg Fri rotering under rullegardinmenyen Bildebehandling, og klikk OK.
- Overflatepøying av 3 rd Pharyngeal Arch (Figur 2A, B - B")
MERK: I disse trinnene vil de farynske buene og PAAene spores ved hjelp av Surface-verktøyet for å generere en "overflate" interesseregion. Dette vil gjøre det mulig for hver region av interesse å bli visuelt isolert fra det omkringliggende vevet. Her beskriver vi trinnene for å overflate og analysere endotelkomponentene i 3rd faryngeal buen. Svelgende buer 4 og 6 analyseres på samme måte.- For å overflatee endotelet i hele 3rd faryngeal bue, klikk på Legg til ny overflate-knappen som ligger under Egenskaper-panelet. Dobbeltklikk på Surface 1 og gi nytt navn til den nye overflaten til "3rd Pharyngeal Arch".
- Velg Hopp over automatisk oppretting, rediger manuelt. Sett Surface Orientation til YZ-planet (koronarretning). Bruk sliceposisjonen til å plassere 3rd faryngeal bueoverflateplanet til der 3rd PAA og Dorsal Aorta kobles til.
- Roter bildet slik at 3rd faryngeal bue overflateplanet er i sikte. Slå av Ortho Slicer 1.
- Under Trekningen | Kontur | Modus-fanen, velger du funksjonen Avstandstegningsmodus. Juster parameterinnstillingene om nødvendig. Oppretthold konsekvente overflateparametere mellom prøver. I dette eksemplet er Vertex-avstanden 10 μm.
- For å begynne å overflatevise, trykk esc-tasten og klikk deretter på Tegne-knappen. Spor omkretsen av 3rd faryngeal bue med musepekeren. Bruk Slice-posisjonen til å flytte 10-25 skiver. Spor omkretsen av faryngittbuen. Gjenta til faryngittbuen er fullstendig sporet.
- Hvis du vil generere overflaten av det sporede området, velger du Opprett surface-knappen i Egenskaper-panelet.
- Overflatebehandling av 3 rd PAA (Figur 2C- C")
- For å overflatee prikkete av 3rd PAA, først slå av den overflateede regionen fra trinn 7.4, ved å velge bort 3rd Faryngeal Arch overflateboks. Deretter klikker du på Legg til ny overflate-knappen igjen. Dobbeltklikk på Surface 1 og gi nytt navn til den nye overflaten til "3rd PAA".
- Velg Hopp over automatisk oppretting, rediger manuelt. Sett Surface Orientation til YZ-planet (koronarretning). Bruk sliceposisjonen til å plassere 3rd PAA overflateplanet til der 3rd PAA og Dorsal Aorta koble, og gjenta deretter trinn 7.4.
- Maskering av overflatestrukturer
MERK: I følgende trinn vil hver overflateregion av interesse bli maskert. Maskering gjør at regionen av interesse kan være visuelt forskjellig fra resten av det avbildede vevet og gjør det mulig å kvantifisere disse distinkte strukturene av interesse. Nedenfor beskriver vi trinnene i Imaris for å visualisere og analysere PAA-endotelet, samt plexus - den mindre vaskulaturen rundt PAAene i de farynske buene. I disse trinnene vil 3rd PAA-overflaten bli maskert for å visualisere og utføre analyse bare på PAA-ene ved hjelp av Spot-funksjonen som er beskrevet i avsnitt 7.7.- Velg Volum for å visualisere alle maskerte kanaler. Trykk esc-tasten for å rotere bildet og plassere bildet i en XY-posisjon.
- Velg Maskevalg for 3rd PAA under Rediger-fanen. Velg DAPI-kanalen, og klikk OK. Gjenta for de gjenværende kanalene.
- Trykk Ctrl + D på tastaturet for å vise Skjermjusteringer-panelet. Velg hver ny kanal, og gi dem nytt navn for å gjøre det klart hva hver kanal viser. Dette vil for eksempel føre til tre nye kanaler: "3rd PAA DAPI", "3rd PAA ERG" og "3rd PAA VEGFR2".
MERK: I trinn 7.6.4-7.6.7 vil vi bare lage kanaler for faryngitt bue plexus. - For å visualisere endotelplexus separat fra PAA, vil vi først velge Maskevalg for 3rd PAA-overflaten. Velg DAPI-kanalen. Fjern merket for Velg voxels utenfor overflaten for å kontrollere Velg voxels inne i overflaten til knapper, sett Velg voxels inne i overflaten til null. Klikk OK.
- Gjenta for de gjenværende kanalene. Denne operasjonen vil ekskludere regionen som inneholder PAA fra de nye maskerte kanalene. Gi nytt navn til kanaler for å gjøre det klart hva hver kanal viser. Dette vil for eksempel føre til tre nye kanaler: "Ikke-PAA DAPI", "Ikke-PAA ERG" og "Ikke-PAA VEGFR2".
- Hvis du vil visualisere endotelplexus i 3rd faryngealbuen, velger du Maskevalg under Rediger-fanen, for 3rd Pharyngeal Arch-overflaten. Velg ikke-PAA DAPI-kanalen. Klikk OK.
- Gjenta for de gjenværende ikke-PAA-kanalene. Gi nytt navn til kanaler for å gjøre det klart hva hver kanal viser. For eksempel vil dette føre til tre nye kanaler: "Plexus DAPI", "Plexus ERG", og "Plexus VEGFR2".
- Kvantifisering av EC-tall
MERK: Uttrykket av ERG markerer endotelkjerner som gjør det praktisk å kvantifisere EC-tall. I disse trinnene vil antall ECer kvantifiseres ved hjelp av Spot-funksjonen for å generere et sted for hver EF som er merket med ERG-uttrykk i PAA og plexus. I pkt. 7.7 genereres flekker for hver ERG-positive celle i den maskerte PAA, etterfulgt av deselection av flekker i ERG-positive, VEGFR2-negative celler.- Trykk Ctrl + D på tastaturet for å vise Skjermjusteringer-panelet. Slå av alle kanaler unntatt PAA ERG.
- Klikk på Legg til nye flekker-knappen under kategorien Egenskaper. Klikk på Flekker 1 og endre navn på den til "PAA Totalt antall ECer". Klikk på den blå pilknappen. For Kildekanalvelger du PAA ERG-kanalen. Juster estimert XY Diameter til 4 μm. Gå til neste panel ved å klikke på den blå pilknappen.
- Juster antall flekker sett ved hjelp av glideskalaen, for å sikre at hver EC-kjerne (merket med ERG-uttrykk) er representert med ett sted. Klikk på den grønne doble pilknappen.
- Slå av PAA ERG-kanalen i skjermjusteringen. Slå på PAA VEGFR2-kanalen for å visualisere PAA-endotelet.
- For å kvantifisere antall ECer nøyaktig, sikrer vi at hvert punkt uttrykker både EC-markører, ERG og VEGFR2. Hvis du vil gjøre dette, velger du Surface of Object under Rediger-fanen | Legg til/slett-panelet. Trykk esc-tasten og slett eventuelle flekker som ikke er VEGFR2-positive, ved å holde nede skift og velge stedet.
MERK: I følgende trinn vil det bli generert flekker for hver ERG-positive celle i den maskerte plexus, etterfulgt av deselection av flekker i ERG-positive, VEGFR2-negative celler. - Klikk på Legg til nye flekker-knappen under kategorien Egenskaper. Velg Flekker 1 og gi nytt navn til "Plexus Totalt antall ECer". Klikk på den blå pilknappen. For Kildekanal velger du Plexus ERG-kanalen. Juster estimert XY Diameter til 4 μm. Gjenta trinn 7.7.1 - 7.7.5 for Plexus totalt antall ECer.
- Klikk på Statistikk-fanen for hver spotfunksjon for å bestemme det totale antallet ECer i 3rd PAA og faryngeal bue plexus.
- Gjenta trinn 7.7.1 - 7.7.6 for de gjenværende PAAene og faryngitteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den helmonterte immunofluorescensprotokollen som presenteres her, gir klare og rene resultater, noe som åpner for 3D-rekonstruksjon av farynleerendotel, som sett i figur 1A. Det er viktig å inkubere embryoer i tilstrekkelig tid i hver antistoffløsning for å sikre fullstendig penetrasjon gjennom prøven, samt grundig vasking av embryoer etter antistoffinkubasjon. I figur 1Bvises store, lyse prikker som følge av partikler i enten antistoffet eller blokkeringsbufferløsningene. Vi har funnet ut at sentrifuging hver løsning før bruk og lengre perioder med PBST vasker etter hver antistoffinkubasjon løser dette problemet.
Figur 2 illustrerer prosessen som brukes til å overflate en farynlesbue og en PAA for analyse som beskrevet i avsnitt 7 i protokollen. Ved hjelp av den maskerte funksjonen gjør Imaris-programvaren at overflateområder kan skilles visuelt og analyseres uavhengig.
Figur 3 viser individuell maskering av forskjellige vaskulære rom i faryngittbuene: PAA (figur 3A, B, C) og plexus ( Figur3A', B', C'). Maskering gir mulighet for analyse og kvantifisering av EC-tall i hver struktur separat. I figur 3C-C brukesSpot-funksjonentil å kvantifisere det totale antallet ECer i både PAA og plexus, ved å tilordne ett enkelt sted for hver kjerne som uttrykker ERG. Det er viktig å merke seg at algoritmen som brukes for Spot-funksjonen er utformet for å generere en prikk for en hvilken som helst piksel av en angitt størrelse. ERG, som brukes her som en markør for EC-kjerner, uttrykkes også i neural crest celler8; neural crest celler ikke uttrykke VEGFR2. Figur 3D illustrerer et eksempel på et ERG-positivt (grønt), VEGFR2-negativt (rosa) sted som er generert av Imaris Spot-funksjonen. Som et resultat er det viktig å verifisere at hver prikk representerer en enkelt EC og er merket med både ERG og VEGFR2.
| Trinn | Tid | Temperatur | |
| 1 | PBST Vask/Permeabilization | 24 timer eller O/N | 4 °C (4 °C) |
| 2 | Blokkere buffer | 25 t eller O/N | 4 °C (4 °C) |
| 3 | Primær antistoff | 4-5 dager | 4 °C (4 °C) |
| 4 | PBST Vask | 4-5 ganger om dagen i 2 dager | RT (eller 4 °C hvis O/N) |
| 5 | Sekundært antistoff | 4-5 dager | 4 °C (4 °C) |
| 6 | PBST Vask | 4-5 ganger om dagen i 2 dager | RT (eller 4 °C hvis O/N) |
| 7 | Embed | N/a | Rt |
| 8 | Metanol Dehydrering og BABB | 1 time per trinn | Rt |
Tabell 1: Oversikt over hele mount immunofluorescensprotokollen. O / N - over natten; RT - romtemperatur.
Figur 1: Sammenligning av rene og skitne bilder etter hele mount immunofluorescens. Sagittal visninger av E10.5 embryo viser bruk av anti-VEGFR2 antistoff (hvit) for å visualisere PAA-endotelet. Embryoer grundig vasket med PBST post antistoffinkubasjoner (A) har et høyere signal-til-støy-forhold og produserer et renere bilde, sammenlignet med embryoer som ikke vaskes grundig (B). Piler i B viser områder med støy/smuss som har dukket opp i bildet når et embryo ikke vaskes grundig eller antistoffoppløsningen ikke er sentrifugert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Overflatebehandling av faryngittbue (PA) og PAA. En 2D sagittal visning (A) brukes til å identifisere plasseringen av PAAer i konfokal bildet. En koronar ortoslicer (A, gul linje) er plassert gjennom PAAene. Faryngittbuen (B) og PAA (C) blir deretter overflaten i koronal orientering ved hjelp av avstandstegningsverktøyet i Imaris. Avstandstegningsverktøyet, satt til 10 μm, brukes til å spore omkretsen av 3rd faryngeal buen (B) eller PAA (C). Konturer tegnes hver 10-25 skiver gjennom hele buen (B', C'). Konturene kombineres for å generere en 3D-overflate av faryngittbuen (B") eller PAA (C"). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvantifisering av EC-tall i en PAA og en plexus. 3D rekonstruksjoner brukes til å visualisere fartøystruktur og uttrykk for EC-markører i en PAA eller i en EC plexus separat. Paneler A-A' viser uttrykket av VEGFR2 i PAA (A, gul) og i plexus (A', rosa). Panel A" illustrerer en sammenslåing av PAA- og plexus VEGFR2-uttrykket. Paneler B-B' viser uttrykket av ERG i PAA (B, rød) og i plexus (B', grønn). Panel B" illustrerer sammenslåingen av PAA og plexus. C-C'. Spot-funksjonen i Imaris brukes til å kvantifisere antall ECer i enten PAA eller plexus. Hver ERG-positive celle i PAA (C, rød) eller plexus (C', grønn) er tildelt et enkelt sted for å markere en enkelt EC. Pilen i C'-D viser et eksempel ERG-positivt, VEGFR2-negativt sted i plexus som har blitt generert av Imaris Spot-funksjonen. Dette stedet er utelukket fra kvantifisering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til å visualisere endotelet i museembryoer i 3D har gitt ny innsikt i deres utvikling3. Her presenterer vi en protokoll som muliggjør høyoppløselig 3D-avbildning av embryoer, visualisering av vaskulær tilkobling og kvantitative analyser av PAA-dannelse. Denne protokollen kan brukes for å se hvordan genetiske endringer eller miljøfornærmelser påvirker PAA-utviklingen. Prosedyren som rapporteres her bruker antistoffer mot VEGFR2 og ERG for å visualisere PAA-dannelse og kvantifisere EC-nummer; Imidlertid kan ytterligere antistoffer brukes til å visualisere og analysere andre aspekter ved erkearterieutvikling, for eksempel neural crest rekruttering eller glatt muskelcelledifferensiering. Hvis denne prosedyren skal brukes på tidligere stadier av embryogenese, er det viktig å merke seg at noen antigener (f.eks. ERG) som oppdages i denne protokollen, ennå ikke kan uttrykkes. Andre kjernefysiske flekker som DAPI eller DRAQ5 eller avstamning merking med kjernefysisk-merket tracers kan brukes til å kvantifisere EC nummer.
Det er flere kritiske trinn i protokollen: å sikre at 1) embryoer ikke blir uttørket mellom løsningsendringer; 2) embryoer vaskes grundig etter antistoffinkubasjoner; og 3) at embryoer er helt dehydrert med MeOH før vevsrydding med BABB.
Metanolvask før vevsrydding tjener to formål: å eliminere fluorescens på grunn av uttrykk for fluorescerende proteiner (f.eks. uttrykket av EGFP eller tdTomato som brukes til avstamningssporing) i embryoet, og for å dehydrere vevet. Eliminering av fluorescens fra fluorescerende proteiner gjør det mulig å bruke en kombinasjon av fluoroforer for avbildning. Antistoffer mot EGFP og TdTomato (kirsebær) kan brukes til å visualisere uttrykk for disse fluorescerende proteinene. Alternativt kan MeOH erstattes av tetrahydrofuran for å bevare fluorescensen av fluorescerende proteiner9.
Vi har funnet ut at embryoer som ikke har blitt riktig dehydrert før BABB-rydding er vanskelig å bilde på grunn av lysspredning. BABB er en hydrofobe løsning som krever fullstendig dehydrering i et organisk løsningsmiddel for å fjerne det ugjennomsiktige vevet. Fullstendig rydding sikrer evnen til å få bilder på de dypeste mulige nivåene i embryoet10,11. I denne protokollen brukte vi et 20x vannnedsenking mål, på grunn av sin lange arbeidsavstand og tilgjengelighet på tidspunktet for våre eksperimenter. Oljenedsenking mål er bedre egnet for denne protokollen, som BABB og olje har nærmere brytningindekser enn vann og BABB. Men til tross for forskjellen i brytningsindeks, ga vannnedsenking mål som brukes i denne protokollen utmerket bildekvalitet.
Det er noen begrensninger i denne protokollen. BABB clearing benyttet her er giftig og korroderende11,12,13. BABB løser opp lim og plast. Hvis prøver ikke håndteres riktig under bildebehandling, kan mikroskopobjektivobjektivet bli skadet av BABB som kan unnslippe fra prøven via sprekker i dekkslipen eller en ødelagt forsegling mellom Fast Well støtfanger og coverslip. Ryddemetoder som ikke bruker organiske løsemidler, for eksempel CLARITY, kan brukes som alternativer10,,11,14. CLARITY's brytningsindeksmatchingsløsning har en brytningsindeks som ligner på vann, noe som gjør den til en egnet clearingmetode hvis du bruker et vannnedsenkingmål. En ekstra begrensning av denne protokollen er at den bare kan utføres på ikke-levende vev, og dermed hindre sin søknad om live imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Brianna Alexander, Caolan O'Donnell og Michael Warkala for nøye lesing og redigering av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av finansieringen fra National Heart, Lung and Blood Institute of nih R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 til SA; AJR støttes av NHLBI HL103920-08S1 og National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases Training grant T32052283-11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
- Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
- Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
- Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).
- Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
- Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
