Summary
Здесь мы описываем протокол для визуализации и анализа фарингиальных арочных артерий 3, 4 и 6 эмбрионов мыши с использованием иммунофлуоресценции, очистки тканей, конфокальной микроскопии и 3D-реконструкции.
Abstract
Неправильное образование или реконструкция фарингиальных архи-артерий (PAAs) 3, 4 и 6 способствуют некоторым из наиболее тяжелых форм врожденных пороков сердца. Для изучения формирования ПАО мы разработали протокол с использованием цельномонтажной иммунофлуоресценции в сочетании с бензиловым спиртом/бензил бензоатом (BABB) очисткой тканей и конфокальной микроскопией. Это позволяет визуализировать фарингиальную арку эндотелия при тонком клеточном разрешении, а также 3D-соединение сосуды. Используя программное обеспечение, мы создали протокол для количественной оценки количества эндотелиальных клеток (ECs) в PAAs, а также количество ЭК в сосудистом сплетении, окружающих PAA в пределах фаринговых арок 3, 4 и 6. При применении ко всему эмбриону, эта методология обеспечивает комплексную визуализацию и количественный анализ эмбриональных сосуд.
Introduction
Во время эмбрионеза мыши, фарингеальные арочные артерии (PAAs) возникают как симметричные, двусторонние пары артерий, которые соединяют сердце с дорсальной аорты1. По мере развития эмбриона, первая и вторая пары PAAs регресс, в то время как3-й,4-й,и6-й PAA проходят серию асимметричных событий реконструкции для формирования аортальных артерий арки2.
PAAs 3, 4 и 6 развиваются через васкулогенез, который является де Ново формирование кровеносных сосудов3. Дефекты в формировании или ремоделирования этих арочных артерий приводят к различным врожденным порокам сердца, таким как те, которые наблюдаются у пациентов с синдромом ДиДжорджа4,5. Таким образом, понимание механизмов, которые регулируют развитие PAAs может привести к лучшему пониманию врожденных пороков сердца (ИГП) этиологии.
Текущие подходы для визуализации и анализа развития PAA включают иммунофлуоресценцию тканей, сосудистых слепков, инъекции чернил Индии, епископальной микроскопии высокого разрешения, и/или цельномонтаж иммуногистохимии1,4,,5,,6,7. В этом мы описываем протокол, сочетающий в себе иммунофлуоресценцию, конфокальные микроскопии и 3D-визуализацию изображений для сбора, анализа и количественной оценки объемных данных, сосудистой связи и клеточной идентичности. Кроме того, мы подробно метод разобщить и количественно номера eCs в каждой фарингиальной арки в качестве средства для изучения формирования фарингеальной арки сосудистого сплетения и его ремоделирования в PAAs. Хотя этот протокол предназначен для анализа развития PAA, он может быть использован для анализа других развивающихся сосудистых сетей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование и процедуры использования животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию при Ратгерском университете.
1. Подготовка решений
- Подготовьте 1 л фосфатного буферного солей с 0,1% Triton-X-100 (PBST) и пронесите фильтр. Это решение может храниться при комнатной температуре (RT) не менее года.
- Подготовьте 600 л блокирующего буфера, состоящего из 10% нормальной сыворотки осла в PBST. Каждый раз сделайте это решение свежим.
- Подготовка 50 мл следующего метанола (MeOH) разбавления в потоке капот: 25% MeOH в деионизированной воде (dH2O), 50% MeOH в dH2O, и 75% MeOH в dH2O. Vortex смешивать. Хранить в RT.
- Приготовьте 50 мл следующих бензиловых спирт-бензил бензоатных бензоатных (BABB) растворов в конических трубках 50 мл.
- Для 100% BABB добавьте 32 мл бензил бензоата к 16 мл бензилового спирта (2:1 объем на коэффициент объема).
- Для 50% BABB, добавить 16 мл бензил бензоата и 8 мл бензилового спирта до 24 мл МЕО.
- Обложка конических труб в алюминиевой фольге для защиты от света. Эти решения могут храниться на RT до года.
ПРЕДЕКТО: BABB является токсичным и коррозионным. Она должна быть обработана и удалена в соответствии с MSDS.
2. Вскрытие эмбрионов и фиксация
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол подходит для эмбрионов e9.5 и E10.5 мыши (мужчины или женщины), изолированных от любого штамма мыши. Для более молодых и старых эмбрионов, инкубационные времена должны быть экспериментально определены, чтобы максимизировать соотношение сигнала к шуму флуоресценции сигнала.
- Заполните один 35 мм и один 60 мм Петри блюда с 1x PBS и место на льду до тех пор, пока это необходимо.
- Эвтаназия беременной мыши с помощью ингаляции CO2. Выполните вывих шейки матки как второстепенную меру эвтаназии.
- Очистите брюшную область плотины с помощью 70% этанола. Pinch брюшной области с помощью щипцы и сделать V-подобный разрез с помощью хирургических ножниц, начиная с основания брюшной стенки в средней линии; продолжают открывать грудную полость. Поднимите брюшной ткани и переместить кишечник в сторону, чтобы разоблачить рога матки.
- Сделайте разрез у основания вагинального канала, и с щипками, вытащить матку от плотины. Сделайте дополнительный разрез на каждом яичников, чтобы освободить матку. Перенесите матку в одну из 60 мм петри блюда, содержащие холодные 1x PBS.
- Используя прямые ножницы, вырежьте стенку матки между каждым местом имплантации. Возьмите decidua со стеклянной трубой и перенесите в 35-мм чашку Петри с 1x PBS. Под микроскопом вскрытия вставьте прямые ножницы в пространство между децвечкой и стенкой матки. Вырезать и удалить стенки матки.
- С помощью тонких щипцов, удалить дефлюации и рейхерта мембраны из эмбриона, тщательно делая поперечные разрезы вдоль ткани и потянув ткани от желточного мешка. Удалить желтковый мешок и амниотический мешок, тщательно потянув ткани от эмбриона и сделать порезы на аллантоа и пупочной вены.
ПРИМЕЧАНИЕ: желтки мешки могут быть использованы для генотипирования эмбрионов. - Перенесите каждый эмбрион со стеклянной трубой в отдельные трубы 2 мл, наполненные 1 мл 1x PBS. Этикетка каждой трубки с уникальным идентификатором.
- Чтобы исправить эмбрионы, тщательно удалить 1x PBS и добавить 4% параформальдегида (PFA) раствор в 1x PBS. Инкубировать при 4 градусах Цельсия с нежным возбуждением на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: 4% фиксации PFA подходит для антител, упомянутых в этом протоколе. Однако процедуры фиксации должны быть оптимизированы для дополнительных антител.
3. Окрашивание эмбрионов
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе эмбрионы пронизаны и окрашены первичными и вторичными антителами. Поскольку развитие PAA идет быстро, различия в эмбриональной стадии значительно повлияют на анализ вниз по течению. Таким образом, эмбрионы должны соответствовать возрасту тщательно отсчитывая сомиты, чтобы соответствовать контрольу и парам мутантов до дальнейших манипуляций.
- Для мытья эмбриона (ы), тщательно удалить 4% PFA и добавить 1x PBS. Аккуратно инвертировать трубку (ы) несколько раз. Поместите трубку (ы) правой стороной вверх и дайте эмбриону (ы) утонуть. Повторите мыть 3 раза. Поместите трубку (ы) с эмбрионом (ы) на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательный остановочный пункт) После стирки, эмбрионы могут быть обезвожены в градуированных серии MeOH в течение 30 минут на разбавление, как в разделе 1.3, и хранится при -20 c в 100% MeOH для последующего использования на срок до 6 месяцев. - Для эмбрионов E10.5 используйте стеклянный трубку для переноса одного эмбриона в 35-мм чашку Петри, наполненную охлажденным 1x PBS. Тщательно ущипните эмбрион чуть выше задней конечности с тонкими щипками и сделать поперечный разрез, чтобы удалить заднюю половину эмбриона. Это позволяет эмбриону лежать в сагиттном положении для шага 4.2. Поместите эмбрион обратно в трубку 2 мл со свежим 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль и мутант эмбрион может быть сопряжен и окрашены с тем же раствором антитела в одной трубке, для шагов 3,3 до 3,8.- Если окрашивание двух эмбрионов вместе, отрезать голову от одного эмбриона выше первой фарингиальной арки, щипать с тонкими щипцами, чтобы сделать поперечный разрез. Это позволит различать эмбрионы двух различных генотипов в каждой трубке.
- Чтобы permeabilize эмбриона (ы), пипетка из 1x PBS из трубки, стараясь не прикасаться к эмбриону (ы). Добавьте 1 мл PBST. Поместите трубку при 4 градусах Цельсия с нежным возбуждением на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательная точка остановки) Эмбрионы могут храниться в решении PBST при 4 градусах по Цельсию в течение нескольких дней. - Для предотвращения неспецифических связывания антител сначала удалите PBST из трубки, стараясь не прикасаться к эмбриону (ы). Добавьте 600 л блокирующего буферного раствора к эмбриону(ы). Блок эмбриона (ы) при 4 градусах Цельсия с нежным возбуждением на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирование решение должно быть вращаться на максимальной скорости на скамейке центрифуги непосредственно перед использованием для удаления мусора. - Для окрашива и количественной оценки ЭК используйте антитела против VEGFR2 и ERG. Антитела решения сделаны в блокирующем буфере. Анти-VEGFR2 антитела разбавляют 1:200 и ERG антитела разбавлены 1:1000.
ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела решения должны быть вращаться на максимальной скорости на скамейке верхней центрифуги непосредственно перед использованием для удаления частиц.- Чтобы инкубировать эмбрион (ы) с первичными антителами, удалить блокирующий буферный раствор из трубки, стараясь не прикасаться к эмбриону (ы). Добавьте 600 л первичного раствора антитела к каждой трубке. Инкубировать эмбрион (ы) при 4 градусах Цельсия с нежным возбуждением в течение 4-5 дней.
- Чтобы вымыть эмбрион (ы) раствора антитела, сначала удалите первичный раствор антитела из трубки. Вымойте эмбрион (ы) каждый час с 1 мл PBST при комнатной температуре (RT) с нежным возбуждением. Вымойте эмбрион (ы) 4-5 раз в течение дня, а затем инкубировать при 4 градусах Цельсия с нежным возбуждением на ночь. Повторите смок на следующий день.
- Сделать вторичные антитела решения путем разбавления анти-козла Alexa Fluor 488 и анти-мышь Alexa Fluor 555 1:300 в блокировании буфера. Разбавить акции DAPI 1:1000 в блокирующем буфере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела решения должны быть вращаться на максимальной скорости на скамейке верхней центрифуги непосредственно перед использованием для удаления частиц. Кроме того, другие красители Alexa Fluor могут быть использованы вместо 488 или 555.- Для инкубации эмбриона (ы) вторичными антителами, удалите PBST из трубки. Добавьте 600 зл вторичного раствора антитела к каждой трубке. Инкубировать эмбрион (ы) при 4 градусах Цельсия с нежным возбуждением в течение 4-5 дней.
- Для мытья эмбриона (ы) раствора антитела сначала удалите вторичный раствор антитела из трубки. Вымойте эмбрион (ы) каждый час с 1 мл PBST на RT с нежным возбуждением. Вымойте эмбрион (ы) 4-5 раз в течение дня, а затем инкубировать при 4 градусах Цельсия с нежным возбуждением на ночь. Повторите смок на следующий день.
4. Встраивание эмбрионов в агарозу
ПРИМЕЧАНИЕ: В разделе 4, эмбрион (ы) будет встроен в агарозу. Этот процесс встраивания служит двум целям: правильно сориентировать эмбрион до визуализации и помочь в обнаружении эмбриона после его очистки в BABB (шаги 5.2.2 - 5.3.2).
- Приготовьте 200 мл 1% агарозного раствора, добавив 2 г агарозы до 200 мл dH2O. Микроволновая печь до тех пор, пока вся агароза не растворится.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшаяся агароза может храниться при 4 градусах Цельсия и нагреваться для последующего использования. - Используя пластиковую парафиновую форму и стеклянную трубку, аккуратно перенесите один эмбрион в форму. Тщательно удалить PBST из эмбриона. Поместите эмбрион в сагиттное положение. Быстро добавьте около 0,5 мл горячей агарозы в форму - достаточно просто покрыть эмбрион и заполнить форму. Убедитесь, что никакие пузырьки воздуха не окружают эмбрион.
- Поместите форму на лед и накройте алюминиевой фольгой до тех пор, пока агарозза не затвердеет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте эмбриону высохнуть после удаления PBST. Раствор агароздолжени должен быть достаточно теплым, чтобы оставаться жидким при добавлении в эмбрион. Добавить достаточно агарозы, чтобы покрыть эмбрион, но не слишком много, в противном случае это будет трудно изображение. Глубина изображения частично определяется рабочим расстоянием цели.
5. Обезвоживание и очистка тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе, эмбрион (ы) обезвоживаются с помощью метанола серии, а затем очищается в органических растворителя, BABB, и установлен между двумя крышками разделены резиновым прокладкой; в этом протоколе Fast Well резиновые прокладки используются. Бампер Fast Well имеет двусторонню клейкую поверхность. Прокладка необходима для создания колодца, в котором эмбрион будет помещен и удерживается между двумя крышками.
-
Обезвоживание метанола
- Этикетка новых 2 мл труб, по одному на эмбрион. Добавить 1 мл 25% MeOH на трубку.
- Используя чистый скальпель, аккуратно разрежьте агарозу вокруг эмбриона, оставив достаточно вокруг эмбриона, чтобы его можно было подобрали щипками. Используйте тонкие щипки, чтобы аккуратно захватить агарозу со встроенным эмбрионом и поместить его в помеченную трубку с 25% MeOH. Не позволяйте щиптем прикасаться к эмбриону.
- Инкубировать эмбрион (ы) на RT с нежным возбуждением в течение 1 часа в темноте.
- Удалить 25% MeOH из трубки, стараясь не прикасаться к эмбриону. Добавить 1 мл 50% MeOH на трубку. Инкубировать на RT с нежным возбуждением в течение 1 часа в темноте.
- Удалить 50% MeOH из трубки, стараясь не прикасаться к эмбриону. Добавить 1 мл 75% MeOH на трубку. Инкубировать на RT с нежным возбуждением в течение 1 часа в темноте.
- Удалить 75% MeOH из трубки, стараясь не прикасаться к эмбриону (ы). Добавить 1 мл 100% MeOH на трубку. Инкубировать на RT с нежным возбуждением в течение 1 часа в темноте. Повторите 100% MeOH мыть дважды.
-
Очистка с ПОМОЩЬю BABB
- Удалить 100% MeOH из трубки, стараясь не прикасаться к эмбриону. Добавьте 1 мл по 50% BABB на трубку. Инкубировать на RT с нежным возбуждением в течение 1 часа в темноте.
- Удалить 50% BABB из трубки, стараясь не прикасаться к эмбриону. Добавьте 1 мл 100% BABB на трубку. Инкубировать на RT с нежным возбуждением в течение 1 часа в темноте. Повторите 100% BABB мыть дважды.
ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательный пункт остановки) Эмбрионы могут оставаться в 100% BABB в трубах в течение недели. Более длительное хранение приведет к BABB растворить пластик труб.
-
Монтаж эмбрионов для визуализации
- Поместите бампер Fast Well на 24 мм х 60 мм #1,5 стеклянной крышкой скольжения, отслаивая пластиковый клей с одной стороны. Убедитесь, что между крышкой и бампером нет пузырьков воздуха, применяя мягкое давление на пластиковый клей на вершине резинового бампера. Этикетка coverslip в зависимости от числа эмбриона, генотипа и антител, используемых для окрашивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любой прокладчик может быть помещен между крышками, пока он достаточно толстый, чтобы предотвратить дробление или хлюпать эмбриона. Мы используем Fast Well прокладки из-за их толщины и удобства, которая включает в себя клеевые поверхности по обе стороны от прокладки для обеспечения его охватывает. - Тщательно пипетка и выбросить 100% BABB из трубки. После визуализации агароз-встроенный эмбрион в трубке, использовать тонкие щипчинки, чтобы забрать агарозу и тщательно перенести эмбрион на крышку внутри Fast Well - не позволяйте щиптем прикоснуться к эмбриону.
- Снимите второй пластиковый клей с бампера и поместите второй покрывало сверху. Удалите пузырьки воздуха, осторожно нажав на крышку. Будьте осторожны, чтобы не разбить стекло.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться в держателе слайда в темноте на RT в течение года, если уплотнение плотно.
- Поместите бампер Fast Well на 24 мм х 60 мм #1,5 стеклянной крышкой скольжения, отслаивая пластиковый клей с одной стороны. Убедитесь, что между крышкой и бампером нет пузырьков воздуха, применяя мягкое давление на пластиковый клей на вершине резинового бампера. Этикетка coverslip в зависимости от числа эмбриона, генотипа и антител, используемых для окрашивания.
6. Приобретение данных
ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих шагах, эндотелий фаринговых арок 3, 4 и 6 будет изображен с помощью конфокальной микроскопии.
-
Позиционирование слайдов на стадии микроскопа
- Для изображения эмбрионов используйте конфокальный микроскоп, оснащенный 20-кратным целью погружения в воду, численной диафрагмой 0,95, рабочим расстоянием 0,95 мм и 64-разрядным программным обеспечением NIS-Elements AR 5.11.01.
- Используя широкополевую флуоресценцию, визуально найдите фарингиальные арки. Центр поле зрения вокруг4-го PAA.
- Если поле зрения цели не захватывает всю область архиерейской арки, возьмите и сшивайте большую панель изображений с перекрытием 1%. Для предотвращения движения образца во время получения большого изображения, аккуратно закрепите крышку скольжения сборки на сцену с помощью литья глины.
-
Настройка параметров приобретения
- Установите размер пинхола до 1,0.
- Под вкладкой ND Приобретение установите верхние и нижние пределы изображения с помощью грубой регулировки. Установите размер шага в соответствии со спецификациями программного обеспечения. Определите толщину, которая может быть изображена рабочей дистанцией цели и четкостью образца.
- Из-за толщины эмбриона, отрегулируйте выигрыш по всему стеку. Установите интенсивность лазера и прирост в середине стека для каждого канала (405, 488 и 555) и присвоите значения под вкладкой «Коррекция интенсивности».
- Прокрутите эмбрион до тех пор, пока сигналы флуоресценции не начнут появляться тусклыми. Увеличьте прирост каждого канала до тех пор, пока интенсивность сигнала не появится на похожем на предыдущий сегмент. Назначайте новое значение под вкладкой «Коррекция интенсивности». Повторите до завершения z-стека. Настройки импорта обратно в ND Приобретение.
- Выполнить сканирование с помощью опции Run и Коррекция.
7. Анализ с использованием программного обеспечения Imaris
ПРИМЕЧАНИЕ: В этих шагах, конфокальные изображения будут проанализированы с помощью программного обеспечения анализа изображений микроскопии, Imaris версия 9.2.0. В ходе этого анализа мы сначала выберем области, представляющие интерес для анализа путем создания поверхностей. Далее мы будем использовать функцию Маска для визуального разделения этих регионов. Наконец, мы будем использовать функцию Spot для количественной оценки количества eCs в каждом интересуемом регионе.
- В зависимости от программного обеспечения для визуализации, используемого в шаге 6, конвертировать изображения в .ims с помощью Imaris File Converter.
- Откройте файлы .ims. Установите изображение на Orthogonal под камерой / этикетки Панель типа камеры.
- Найдите PAA и сориентируйте изображение для покрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда файлы впервые открыты, они будут отображаться как 3D компиляция всех изображений срезов. На этом этапе PAA будут расположены, сделав 3D-изображение в 2D-изображении. 2D-изображение позволяет правильно ориентировать СЯдля для анализа.- Под панелью Свойств, выключите том. Под панелью Свойств, нажмите на Добавить новый Ortho Slicer. Установите ориентацию на фрагмент для плоскости XY. Используйте позицию slice для прокрутки изображения до нахождения PAA.
- Если PAA не параллельны верхней и нижней части изображения, свободно повернуть изображение с помощью курсора мыши так, что PAAs работать слева направо по экрану. В соответствии с обработкой изображений падение вниз меню, выберите Бесплатный поворот и нажмите OK.
- Покрытие 3-й Фарингеальной Арки (рисунок 2А, Б - Б)
ПРИМЕЧАНИЕ: В этих шагах, фарингеальные арки и PAA будут прослежены с помощью инструмента Surface для создания "всплыли" области интереса. Это позволит обеспечить себе изоляцию каждой области от окружающих тканей. Здесь мы описываем шаги к поверхности и анализируем эндотелиальные компоненты3-й фарингиальной арки. Фарингеальные арки 4 и 6 анализируются аналогичным образом.- Чтобы поповерхностьи эндотелия во всей3-й фарингальной арке, нажмите на кнопку Добавить новую поверхность, расположенную под панелью Свойств. Дважды нажмите на Surface 1 и переименуйте новую поверхность в"3-ю Фарингеальную арку".
- Выберите автоматическое создание Skip, отображайте вручную. Установите ориентацию поверхности на плоскость Y ' (корональная ориентация). Используйте slice Position, чтобы разместить3-й фарингиальной арки поверхности плоскости, где3-й PAA и Dorsal Аорта подключиться.
- Поверните изображение так, чтобы3-й фарингиальной арки поверхности плоскости находится в поле зрения. Выключите Ortho Slicer 1.
- В рамках жеребьевки Контур Вкладка режима, выберите функцию режима рисования расстояния. При необходимости отрегулируйте параметры параметров. Поддержание согласованных параметров покрытия между образцами. В этом примере интервал Vertex составляет 10 мкм.
- Чтобы начать всплывающие покрытия, нажмите клавишу Esc, а затем нажмите на кнопку Draw. Проследите периметр3-й фарингеальной арки с помощью курсора мыши. Используйте позицию фрагмента, чтобы переместить 10-25 ломтиков. Проследите периметр фарингиальной арки. Повторяйте до тех пор, пока архигенная арка не будет полностью прослежена.
- Для генерации поверхности прослеживаемого региона выберите кнопку «Создать поверхность» в панели Свойств.
- Покрытие 3 rd PAA (Рисунок 2C - C")
- Чтобы поверхность эндотелия 3rd PAA, сначала выключите поверхность поверхности от шага 7.4, отбрасывая3-й Фарингеальной Арки поверхности коробки. Затем нажмите на кнопку Добавить новую поверхность снова. Дважды нажмите на Surface 1 и переименуйте новую поверхность в "3rd PAA".
- Выберите автоматическое создание Skip, отображайте вручную. Установите ориентацию поверхности на плоскость Y ' (корональная ориентация). Используйте позицию slice, чтобы разместить3-й PAA поверхности плоскости, где 3rd PAA и Dorsal Аорта подключить, а затем повторить шаги 7.4.
- Маскировка поверхностных структур
ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих шагах, каждый всплыл и интересуемый регион будет замаскирован. Маскировка позволяет региону, представляющим интерес, визуально отличиться от остальной части изображенной ткани и позволяет количественно определить эти различные структуры, представляющие интерес. Ниже мы описываем шаги в Imaris визуализировать и анализировать PAA эндотелий, а также сплетение - меньше сосуды вокруг PAAs в пределах фарингеальных арок. В этих шагах поверхность 3rd PAA будет замаскирована для визуализации и выполнения анализа только на PAA с использованием функции Spot, описанной в разделе 7.7.- Выберите Том, чтобы визуализировать все каналы в масках. Нажмите клавишу Esc, чтобы повернуть изображение и расположить изображение в положение XY.
- Под вкладкой Edit выберите Выбор маски для3-го PAA. Выберите канал DAPI и нажмите OK. Повторите для остальных каналов.
- На клавиатуре нажмите Ctrl и D, чтобы просмотреть панель регулировки дисплея. Выберите каждый новый канал и переименовать их, чтобы было понятно, что показывает каждый канал. Например, это приведет к трем новым каналам: "3rd PAA DAPI", "3rd PAA ERG" и "3rd PAA VEGFR2".
ПРИМЕЧАНИЕ: В шагах 7.6.4-7.6.7 мы создадим каналы для фарингиального сплетения арки только. - Чтобы визуализировать эндотелиальное сплетение отдельно от PAA, мы сначала выберем Маску Выбор для3-й поверхности PAA. Выберите канал DAPI. Uncheck Выберите воксели снаружи поверхности и проверить Выберите воксели внутри поверхности к кнопкам, установить Выберите воксели внутри поверхности к нулю. Нажмите OK.
- Повторите для остальных каналов. Эта операция исключит регион, содержащий PAA, из новых каналов в масках. Переименуйте каналы, чтобы было понятно, что показывает каждый канал. Например, это приведет к постройки трех новых каналов: "Non-PAA DAPI", "Non-PAA ERG" и "Non-PAA VEGFR2".
- Чтобы визуализировать эндотелиальное сплетение в3-й фарингальной арке, выберите Маску Выбор под вкладкой Edit, для3-й pharyngeal Arch поверхности. Выберите канал Non-PAA DAPI. Нажмите OK.
- Повторите для остальных каналов Non-PAA. Переименуйте каналы, чтобы было понятно, что показывает каждый канал. Например, это приведет к постройки трех новых каналов: "Plexus DAPI", "Plexus ERG" и "Plexus VEGFR2".
- Количественная оценка числа ЕС
ПРИМЕЧАНИЕ: Выражение ERG знаменует собой эндотелиальные ядра, что делает его удобным для количественной оценки числа ЕС. В этих шагах количество eCs будет количественно с помощью функции Spot для создания пятна для каждого ЕС отмечены ERG выражение в PAA и сплетение. В разделе 7.7, пятна будут созданы для каждой ERG-положительной ячейки в масках PAA, а затем deselection пятен в ERG-положительных, VEGFR2-отрицательных ячеек.- На клавиатуре нажмите Ctrl и D, чтобы просмотреть панель регулировки дисплея. Выключите все каналы, за исключением PAA ERG.
- Под вкладкой «Свойства» нажмите на кнопку «Добавить новые пятна». Нажмите на пятна 1 и переименовать его в "PAA Общее количество eCs". Нажмите на кнопку "Синяя стрелка". Для канала Sourceвыберите канал PAA ERG. Отрегулируйте расчетный диаметр XY до 4 мкм. Перейдите к следующей панели, нажав на кнопку синяя стрелка.
- Отрегулируйте количество пятен, видимых с помощью скользящей шкалы, чтобы убедиться, что каждое ядро EC (отмеченное выражением ERG) представлено одним пятном. Нажмите на зеленую кнопку двойной стрелки.
- Выключите канал PAA ERG в регулировке дисплея. Включите канал PAA VEGFR2, чтобы визуализировать эндотелий PAA.
- Для точной количественной оценки количества eCs, мы гарантируем, что каждое пятно выражает оба маркера EC, ERG и VEGFR2. Для этого выберите Surface of Object под вкладкой «Edit» Добавить/удалить панель. Нажмите клавишу Esc и удалить любые пятна, которые не являются положительными VEGFR2, удерживая сдвиг и выбрав место.
ПРИМЕЧАНИЕ: На следующем этапе для каждой ERG-положительной ячейки в сплетении в масках будут созданы пятна, за которыми последует отбор пятен в ERG-положительных, VEGFR2-отрицательных ячейках. - Под вкладкой «Свойства» нажмите на кнопку «Добавить новые пятна». Выберите пятна 1 и переименовать в "Сплекс Общее количество eCs". Нажмите на кнопку "Синяя стрелка". Для канала Source выберите канал Plexus ERG. Отрегулируйте расчетный диаметр XY до 4 мкм. Повторите шаги 7.7.1 - 7.7.5 для Plexus общее количество ECs.
- Нажмите на вкладку Статистика каждой функции пятна, чтобы определить общее количество eCs в3-й PAA и фарингиальной арки сплетения.
- Повторите шаги 7.7.1 - 7.7.6 для остальных PAA и сплетения архиерейки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленный здесь протокол иммунофлуоресценции в целом устанавливает четкие и чистые результаты, позволяющие 3D-реконструкцию фарингеальной арки эндотелия, как видно на рисунке 1А. Важно инкубировать эмбрионы в течение достаточного количества времени в каждом растворе антител, чтобы обеспечить полное проникновение через образец, а также тщательно мыть эмбрионы после инкубации антител. На рисунке 1Bбольшие яркие точки появляются в результате частиц в антителах или блокирующих буферных растворах. Мы обнаружили, что центрифугирование каждого решения перед использованием и более длительные периоды PBST смягчает после каждого инкубации антител решает эту проблему.
Рисунок 2 иллюстрирует процесс, используемый для поверхности фарингиальной арки и PAA для анализа, как описано в разделе 7 протокола. Используя функцию маски, программное обеспечение Imaris позволяет визуально отделяться и анализировать поверхностные регионы самостоятельно.
На рисунке 3 показана индивидуальная маскировка различных сосудистых отсеков в фарингеальных арках: PAA(рисунок 3A, B, C) и сплетение(рисунок 3A', B', C'). Маскировка позволяет анализировать и количественно измерять числа ЕС в каждой структуре по отдельности. На рисунке 3C-C'функция Spot используется для количественной оценки общего числа ОР как в PAA, так и в сплетении, назначив одно место для каждого ядра, выражающего ERG. Важно отметить, что алгоритм, используемый для функции Spot, предназначен для создания точки для любого пикселя определенного размера. ERG, который используется здесь в качестве маркера ядер EC, также выражается в нервных клетках гребня8; нервные клетки гребня не выражают VEGFR2. Рисунок 3D иллюстрирует пример ERG-положительного (зеленого), VEGFR2-негативного (розового) пятна, которое было создано функцией Imaris Spot. В результате, важно проверить, что каждая точка представляет собой единую EC и помечена как ERG и VEGFR2.
| Шаг | Время | Температура | |
| 1 | PBST Wash/Permeabilization | 24 ч или O/N | 4 кк с |
| 2 | Блокирование буфера | 25 ч или O/N | 4 кк с |
| 3 | Первичные антитела | 4-5 дней | 4 кк с |
| 4 | PBST Уош | 4-5 раз в день в течение 2 дней | RT (или 4 КК, если O/N) |
| 5 | Вторичные антитела | 4-5 дней | 4 кк с |
| 6 | PBST Уош | 4-5 раз в день в течение 2 дней | RT (или 4 КК, если O/N) |
| 7 | Внедрить | N/A | Rt |
| 8 | Обезвоживание метанола и BABB | 1 час на шаг | Rt |
Таблица 1: Обзор всего протокола иммунофлуоресценции. O/N - на ночь; RT - комнатная температура.
Рисунок 1: Сравнение чистых и грязных изображений после целостной иммунофлуоресценции. Сагитальные виды эмбриона E10.5 показывают использование анти-VEGFR2 антитела (белый) для визуализации ЭНДотелия PAA. Эмбрионы тщательно промывают с PBST после антител инкубации (A) имеют более высокое соотношение сигнала к шуму и производят более чистое изображение, по сравнению с эмбрионами, которые не тщательно промывают(B). Стрелки в B показывают области шума/грязи, которые появились на изображении, когда эмбрион не тщательно промывается или раствор антитела не был центрифугирован. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Облицовка фарингиальной арки (PA) и PAA. 2D sagittal зрения (A) используется для определения местоположения PAAs в конфокальный образ. Корональная ортосная срезка(A, желтая линия)находится через PAAs. Фарингиальная арка(B)и PAA (C) затем всплывают в корональной ориентации с помощью инструмента дистанционного рисования в Имарисе. Инструмент дистанционного рисования, установленный на 10 мкм, используется для отслеживания периметра3-й фарингеальной арки(B) или PAA(C). Очертания нарисованы каждые 10-25 ломтиков через всю арку(B', C'). Очертания объединяются для создания 3D-поверхности фарингиальной арки(B)или PAA(C"). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Количественная оценка числа еС в PAA и сплетении. 3D-реконструкции используются для визуализации структуры судна и выражения маркеров EC в PAA или в сплетении EC отдельно. Панели A-A' показывают выражение VEGFR2 в PAA (A, желтый) и в сплетении (A', розовый). Панель А" иллюстрирует слияние выражения PAA и сплетения VEGFR2. Панели B-B' показывают выражение ERG в PAA(B, красный)и в сплетении (B', зеленыйцвет). Панель B" иллюстрирует слияние PAA и сплетения. C-C'. Функция Spot в Imaris используется для количественной оценки количества кондиционеров в PAA или сплетении. Каждой ERG-положительной ячейке в PAA(C, красный)или сплетении (C', зеленый) назначаются одно место, чтобы отметить один EC. Стрелка в C'-D показывает пример ERG-положительного, VEGFR2-негативное пятно в сплетении, которое было создано функцией Imaris Spot. Это место исключено из количественной оценки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Возможность визуализировать эндотелий в эмбрионах мыши в 3D предоставила новые идеи в их развитии3. Здесь мы представляем протокол, который позволяет с высоким разрешением 3D-изображения эмбрионов, визуализации сосудистой связи, а также количественный анализ формирования PAA. Этот протокол может быть использован, чтобы увидеть, как генетические изменения или экологические оскорбления влияют на развитие PAA. Процедура, о которых сообщается здесь, использует антитела против VEGFR2 и ERG для визуализации формирования PAA и количественной оценки номера ЕС; однако, дополнительные антитела могут быть использованы для визуализации и анализа других аспектов развития арки артерии, таких как нейрой набор гребня или гладкой дифференциации мышечных клеток. Если эта процедура должна быть использована на ранних стадиях эмбриогенеза, важно отметить, что некоторые антигены (например, ERG), обнаруженные в этом протоколе, могут еще не быть выражены. Другие ядерные пятна, такие как ДаПИ или ДРАЗ5 или маркировка линий с помощью трассировщиков с ядерными метками, могут быть использованы для количественной оценки номера ЕС.
В протоколе есть несколько важных шагов: обеспечение того, чтобы 1) эмбрионы не высохли между изменениями раствора; 2) эмбрионы тщательно промывают после инкубации антител; и 3) что зародышиты вполне обезвожены с MeOH перед очисткой ткани с BABB.
Метанол омывает до очистки тканей служить двум целям: устранить флуоресценцию из-за выражения флуоресцентных белков (например, выражение EGFP или tdTomato используется для отслеживания линий) в эмбрионе, и для обезвоживания ткани. Устранение флуоресцентности из флуоресцентных белков позволяет использовать любую комбинацию фторофоров для визуализации. Антитела против EGFP и TdTomato (вишня) могут быть использованы для визуализации экспрессии этих флуоресцентных белков. Кроме того, MeOH может быть заменен тетрагидрофуран для сохранения флуоресценции флуоресцентных белков9.
Мы обнаружили, что эмбрионы, которые не были должным образом обезвожены до BABB очистки трудно изображение из-за рассеяния света. BABB является гидрофобным раствором, который требует полного обезвоживания органического растворителя для очистки непрозрачной ткани. Полная очистка обеспечивает возможность получения изображений на самом глубоком уровне в эмбрионе10,11. В этом протоколе мы использовали цель погружения в воду в 20 раз, благодаря ее большой рабочей дистанции и доступности во время наших экспериментов. Цели погружения масла более лучше подходят для этого протокола, так как BABB и масло имеют более близкие рефракционные индексы, чем вода и BABB. Однако, несмотря на разницу в рефракционном индексе, цель погружения воды, используемая в этом протоколе, обеспечила отличное качество изображения.
Есть несколько ограничений этого протокола. BABB очистки используется здесь является токсичным и коррозионных11,12,13. BABB растворяет клей и пластмассы. Если образцы не обрабатываются должным образом во время визуализации, микроскоп объектив может быть поврежден BABB, которые могут уйти из образца через трещины в coverslip или сломанной уплотнения между быстрым бампером и крышкой. Методы очистки, которые не используют органические растворители, такие как CLARITY, могут быть использованы в качестве альтернативы10,11,14. Рефракционный индекс CLARITY, соответствующий решению, имеет рефракционный индекс, аналогичный индексу воды, что делает его подходящим методом очистки при использовании цели погружения в воду. Дополнительным ограничением этого протокола является то, что он может быть выполнен только на неживых тканях, тем самым предотвращая его применение для живой визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Брианну Александр, Каолан О'Доннелл и Майкла Варкалу за тщательное чтение и редактирование этой рукописи. Эта работа была поддержана финансированием из Национального института сердца, легких и крови NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 в SA; AJR поддерживается NHLBI HL103920-08S1 и Национальным институтом артрита и опорно-мостомузыка и кожных заболеваний Учебный грант T32052283-11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
- Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
- Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
- Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).
- Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
- Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
