Summary
In diesem Protokoll präsentieren wir ein experimentelles Design mit einem bedingten Knockdown-System und einem angepassten Kugelbildungstest, um die Wirkung von Clusterin auf die Stängel von patientenabgeleiteten GCSCs zu untersuchen. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um sowohl die In-vitro- als auch die In-vivo-Funktion von Stammgenen in verschiedenen CSCs-Typen zu untersuchen.
Abstract
Krebsstammzellen (CSCs) sind in tumorinititoriöse, Entwicklung und Rezidiv nach der Behandlung involviert und sind in den letzten Jahrzehnten zum Mittelpunkt vieler Studien geworden. Daher ist es wichtig, Methoden zu entwickeln, um die Rolle der Schlüsselgene zu untersuchen, die an der Vorstämmung von Krebszellen beteiligt sind. Magenkrebs (GC) ist eine der häufigsten und tödlichsten Krebsarten. Magenkrebs-Stammzellen (GCSCs) gelten als die Wurzel von Magenkrebsrückfall, Metastasierung und Medikamentenresistenz. Das Verständnis der GCSCs-Biologie ist notwendig, um die Entwicklung zielgerichteter Therapien voranzutreiben und schließlich die Sterblichkeit bei Patienten zu senken. In diesem Protokoll präsentieren wir ein experimentelles Design mit einem bedingten Knockdown-System und einem angepassten Kugelbildungstest, um die Wirkung von Clusterin auf die Stängel von patientenabgeleiteten GCSCs zu untersuchen. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um sowohl die In-vitro- als auch die In-vivo-Funktion von Stammgenen in verschiedenen CSCs-Typen zu untersuchen.
Introduction
Magenkrebs (GC) ist eine der häufigsten und tödlichsten Krebsarten1. Trotz Fortschritten in der kombinierten Chirurgie, Chemotherapie und Strahlentherapie in der GC-Therapie, Prognose bleibt schlecht und die Fünf-Jahres-Überlebensrate ist immer noch sehr niedrig2. Rezidivundundundundien sind die Hauptgründe für die Todesfälle nach der Behandlung.
Krebsstammzellen (CSCs) sind eine Teilmenge von Krebszellen, die die Fähigkeit besitzen, sich selbst zu erneuern und die verschiedenen Zelllinien zu erzeugen, die den Tumor rekonstituieren3. CSCs werden geglaubt, um für KrebsRückfall und Metastasierung verantwortlich zu sein, wegen ihrer Fähigkeiten der Selbsterneuerung und Aussaat neuer Tumoren, sowie ihre Resistenz gegen traditionelle Chemo- und Radiotherapien4. Daher bieten die ausrichtung auf CSCs und die Eliminierung von CSCs ein spannendes Potenzial, um die Behandlung zu verbessern und die Sterblichkeit von Krebspatienten zu senken.
CSCs wurden von vielen Arten von soliden Tumoren isoliert5. Im Jahr 2009 wurden Magenkrebsstammzellen (GCSCs), die aus menschlichen Magenkrebszelllinien isoliert wurden, ursprünglich von Takaishi et al.6beschrieben. Chen und Kollegen identifizierten und reinigten zunächst GCSCs aus tumorgeweben des menschlichen Magenadenokarzinoms (GAC)7. Diese Ergebnisse bieten nicht nur die Möglichkeit, GCSCs Biologie zu studieren, sondern bieten auch eine große klinische Bedeutung.
Ein besonderes Merkmal der CSCs ist ihre Fähigkeit, eine Kugel8zu bilden. Einzelne Zellen werden unter nicht haftenden Bedingungen bei geringer Dichte plattiert, und nur die Zellen, die mit Selbsterneuerung besessen sind, können zu einem festen, kugelförmigen Cluster, einer Kugel, der Kugel genannt wird, heranwachsen. So wurde der Kugelbildungstest als Goldstandard-Assay betrachtet und weit verbreitet eingesetzt, um das Potenzial der Stammzellselbsterneuerung in vitro zu bewerten.
RNA-Interferenz (RNAi) ist ein leistungsfähiges Forschungswerkzeug, um die Genfunktion durch den Knockdown eines bestimmten Gens zu untersuchen9. Langfristige stabile Gen-Knockdown-Technologien haben jedoch gewisse Einschränkungen, wie die Herausforderung, die Funktion eines Gens zu erforschen, das für das Überleben der Zelle unerlässlich ist. Bedingte RNAi-Systeme können für die Abregulierung der gewünschten Gene in zeitlicher und/oder speziell kontrollierter Weise durch die Verabreichung eines induzierenden Mittels nützlich sein. Die Tetracyclin (Tet)-induzierbaren Systeme sind eines der am häufigsten verwendeten bedingten RNAi-Systeme10. Die Tet-induzierbaren Systeme können Zielgen-Silencing induzieren, indem sie die Expression von shRNA nach Zugabe eines exogenen Induktors (vorzugsweise Doxycyclin, Dox) steuern. Die Tet-induzierbaren Systeme lassen sich in zwei Typen unterteilen: Tet-On- oder Tet-Off-Systeme. Die Expression von shRNA kann in Gegenwart des Induktors aktiviert (Tet-On) oder ausgeschaltet werden (Tet-Off). Im Tet-ON-System ohne Induktor bindet der konstitutiv exprimiv exprimiv exprimierte Tet-Repressor (TetR) an die Tet-responsive Element (TRE)-Sequenz, die einen Tet-responsivepolischen Pol III-abhängigen Promotor für die shRNA-Expression enthält, wodurch die Expression der shRNA unterdrückt wird. Während die TetR nach Zugabe von Dox vom Tet-responsivepol III-abhängigen Promoter entfernt wird. Dies erleichtert die Expression der shRNA und führt zu einem Genknockdown.
Das hier beschriebene Protokoll verwendet ein funktionelles Tetracyclin-induzierbares shRNA-System und einen angepassten Kugelbildungstest, um die Funktion von Clusterin in patientenabgeleiteten GCSCs zu untersuchen. Clusterin wurde in einer früheren Studie11als neuartiges Schlüsselmolekül zur Aufrechterhaltung der Stammheit und des Überlebens von GCSCs identifiziert. Wir verwenden das beschriebene Protokoll, um die Auswirkungen von Clusterin bei der Selbsterneuerung von GCSCs zu untersuchen. Diese Methode gilt auch für andere Arten von Krebsstammzellen.
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Protocol
Alle Hier beschriebenen Experimente mit patientenabgeleiteten Magenkrebsstammzellen wurden von der lokalen Ethikkommission7genehmigt.
1. Magenkrebs Stammzellkultur
- Vorbereitung von GCSCs komplettes Kulturmedium
- Bereiten Sie GCSCs komplette Kulturmedium durch Zugabe von frischen DME / F12 Medium mit den folgenden wesentlichen Zutaten: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% Insulin/Transferrin/Natriumselenit, 0,2% Glukose, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% Nicht-essentielle Aminosäure, 10 m 2-Mercaptoethanol, 0,75 mg/mL NaHCO3, 10 m Thioglycerol, 100 I.E./ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin. Filtern und sterilisieren Sie mit einem 0,22 m-Filter.
HINWEIS: GCSCs komplettes Kulturmedium wird empfohlen, vorzugsweise nicht mehr als zwei Wochen bei 4 °C gelagert.
- Bereiten Sie GCSCs komplette Kulturmedium durch Zugabe von frischen DME / F12 Medium mit den folgenden wesentlichen Zutaten: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% Insulin/Transferrin/Natriumselenit, 0,2% Glukose, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% Nicht-essentielle Aminosäure, 10 m 2-Mercaptoethanol, 0,75 mg/mL NaHCO3, 10 m Thioglycerol, 100 I.E./ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin. Filtern und sterilisieren Sie mit einem 0,22 m-Filter.
- Wiederherstellung von GCSCs und Kultur
HINWEIS: GCSCs wurden wie folgt erhalten: Tumorproben wurden einer mechanischen und enzymatischen Dissoziation unterzogen. Einzelzellsuspensionen wurden durch Filtern mit Nylonnetz aus gut verstreuter Suspension gewonnen. Die resultierenden Krebszellen wurden in GCSCs Complete Culture Medium kultiviert, und einige Zellen wuchsen zu Sphären heran. Diese Sphären wurden dann enzymatischer Dissoziation unterzogen, und GCSCs können durch zytofluorometrische Sortierung der Zellpopulation erhalten werden, die mit CD44/CD54-Markern gefärbt ist. Das detaillierte Protokoll und die Funktionsassays der GCSCs wurden7berichtet.- Vorwarme GCSCs komplettieren Kulturmedium bei 37 °C für nicht mehr als 30 min.
- Abtauen Sie GCSCs aus der Flüssigkeitsstickstoffspeicherung und tauen Sie in einem 37 °C-Wasserbad schnell Kryovials auf. Wirbeln Sie die Fläschchen so lange, bis der gesamte Inhalt vollständig schmilzt.
HINWEIS: Gefrorene Zellen in einem 37 °C-Wasserbad schnell auftauen (<1 min). - Übertragen Sie den gesamten Inhalt der Kryovials in ein 15 ml Zentrifugenrohr mit 10 ml GCSCs komplettem Kulturmedium. Zentrifuge bei 800 x g für 5 min bei RT.
- Aspirieren Sie den Überstand sorgfältig und hängen Sie das Zellpellet in 10 ml frischen GCSCs komplettes Medium auf. Die Zellsuspension in einer 100 mm Petrischale verkisten. Inkubieren Sie die Platte bei 372 °C in einem 5% CO2-Inkubator und fügen Sie 5 ml frisches komplettes Medium am dritten Tag hinzu.
- Subkultur von GCSCs Tumorsphären
HINWEIS: GCSCs des Tumorsphärenzentrums haben nur genügend Nährstoffe, bevor die Kugeln bis zu 80-100 m im Durchmesser wachsen. Sobald dunkle und geringe Refraktivitätssphären erscheinen (ca. 6 Tage Kultur), ist es notwendig, die Tumorsphären subkulturieren.- Schütteln Sie die Schale vorsichtig und übertragen Sie das GCSCs Tumorsphärenkulturmedium (das Medium und die nicht haftenden Tumorsphären) in ein steriles 15 ml Zentrifugenrohr. Bei größeren mittleren Volumina können größere Zentrifugenrohre benötigt werden.
- Zentrifugieren Sie bei 600 x g für 5 min und entsorgen Sie den Überstand sorgfältig. Nach der Zentrifugation wird ein nicht-weißes Pellet sichtbar.
- Fügen Sie 2 ml Zelldissoziationslösung hinzu, um das Pellet für die mechanische und enzymatische Dissoziation bei 37 °C wieder aufzuhängen. 10 Mal alle 2-3 min im Verdauungsverfahren sanft auf und ab pfeifen, um die Kugeln auseinander zu brechen, bis die Tumorsphären in einzellige Suspension enpertiert werden. Dieser gesamte Dissoziationsprozess wird empfohlen, weniger als 15 min zu sein.
HINWEIS: Führen Sie eine visuelle Überprüfung unter dem Mikroskop durch, um zu bestätigen, dass keine großen Kugeln oder Zellaggregate übrig bleiben. - Fügen Sie 10 ml frische vorgewärmte GCSCs komplettes Kulturmedium (5x das Volumen der Zellablösung) hinzu, um den Verdauungsvorgang und die Zentrifuge bei 800 x g bei RT für 5 min zu beenden.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit 1 ml frisch erwärmenden GCSCs als komplettes Kulturmedium wieder aus. Säen Sie eine angemessene Anzahl von Zellen in eine neue 100 mm Petrischale mit 10 ml frisch vorgewärmten GCSCs komplettes Kulturmedium und brüten bei 37 °C, 5%CO2.
- Refeed Tumorsphären Kulturen nach 3 Tagen durch Zugabe von 5 ml frische vorgewärmte komplette Medium. Nach 6 Tagen, Durchgangszellen, wenn Tumorsphären wachsen bis zu 80-100 m im Durchmesser.
- Kryokonservierung von GCSCs
HINWEIS: Cryopreserve GCSCs-Zellen nicht durch direkte Zugabe von Medium zu Tumorsphären. GCSCs-Tumorsphären sollten in Einzelzellen verdaut werden, damit Zellschutzmittel in jede Zelle eindringen können, um eine langfristig stabile Lagerung von Zellen zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass sich die Zellen in einer gesunden Situation und ohne Kontamination befinden.- Ernte GCSCs Tumorsphären. Zentrifuge bei 600 x g für 5 min.
- Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 2 ml Zelldissoziationslösung hinzu, um GCSCs-Tumorsphären bei 37 °C zu dissoziieren. Beenden Sie den Verdauungsvorgang, indem Sie 10 ml GCSCs als vollständiges Kulturmedium hinzufügen.
- Zentrifuge bei 800 x g für 5 min und sammeln einzelne GCSCs.
- GCSCs mit serumfreiem kryokonservierungsmittelförmigem Medium vorsichtig aussetzen. Die empfohlene Endkonzentration beträgt 5 x 105 - 5 x 106 Zellen/ml.
- Geben Sie die Zellsuspension in 1 ml Aliquots in markierte kryogene Fläschchen.
- Die Kryovials, die die Zellen enthalten, sofort in eine Isopropanolkammer geben und bei -80 °C aufbewahren. Übertragen Sie die Durchstechflaschen am nächsten Tag zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff.
2. Generierung von induzierbaren Knockdown GCSCs-Linien
VORSICHT: Rekombinante Lentiviren wurden vom National Institute of Health and Center for Disease Control als Level-2-Organismen eingestuft. Die Arbeit mit dem Lentivirus erfordert die Aufrechterhaltung einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe 2, da die von diesen lentiviralen Systemen erzeugten viralen Überstoffe potenziell gefährliche rekombinante Viren enthalten könnten.
- Generierung von Lentivirus-Partikeln
- Synthesize 2 lentivirale Vektoren mit induzierbarer shRNA, die auf menschliches Clusterin abzielen, und einen nicht zielgerichteten lentiviralen Vektor (GV307) von GeneChem basierend auf dem Design von Tabelle 1 (GV307-Vektor enthält: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin).
- Samen 4 x 106 293T lenti-virale Verpackungszellen in eine 100 mm Petrischale mit 10 ml DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum.
- 293T-Zellen über Nacht bei 37 °C, 5%CO2inkubieren. Stellen Sie sicher, dass 293T Zelldichte ist etwa 50-80% konfluent am Tag der Transfektion.
- Bringen Sie das reduzierte Serummedium auf Raumtemperatur und bereiten Sie Tube A und Tube B wie in Tabelle 2beschrieben vor.
- Übertragen Sie Tube A in Tube B, mischen Sie sie gut und inkubieren Sie die Komplexe 20 min bei Raumtemperatur, um Lipid-DNA-Komplexe vorzubereiten.
- Entfernen Sie 5 ml Medium, bevor Sie Lipid-DNA-Komplex hinzufügen, so dass insgesamt 5 ml.
- Fügen Sie 5 ml Lipid-DNA-Komplex in die Kulturschale tropfenweise und sanft wirbeln die Schale, um den Komplex zu verteilen.
HINWEIS: Geben Sie vorsichtig Flüssigkeit an die Tellerwand, um störende 293T-Zellen zu vermeiden. - Inkubationskulturgericht für 24 h bei 37 °C, 5%CO2.
- Nach 24 Stunden nach der Transfektion das Transfektionsmedium vorsichtig entfernen und vorsichtig durch 10 ml vorgewärmtes DMEM ersetzen, ergänzt durch 10% FBS. Inkubieren für 24 h bei 37 °C, 5%CO2.
HINWEIS: Alle Überstandundungen und Spitzen sollten vor der Entsorgung mit 10% Bleichmittel behandelt werden. - Etwa nach 48 Stunden nach der Transfektion 10 ml Lentivirus-haltige Überstände ernten.
HINWEIS: Alle Zellkulturgefäße und -spitzen sollten vor der Entsorgung mit 10% Bleichmittel behandelt werden. - Filtern Sie den lentiviralen Überstand mit einem 0,45 m Porenfilter, um zellulären Schmutz zu entfernen.
HINWEIS: Alle Filter und Spritzen sollten vor der Entsorgung mit 10% Bleichmittel behandelt werden. - Überdeutlichung geklärter Überstand in einen sterilen Behälter geben, Lenti-X Konzentrator (1/3 Volumen geklärter Überstand) hinzufügen, um durch sanfte Inversion zu mischen.
- Inkubationsmischung bei 4 °C über Nacht.
- Zentrifugenproben bei 1.500 x g für 45 min bei 4 °C. Nach der Zentrifugation, und off-white Pellet wird sichtbar sein. Entfernen Sie vorsichtig Überstand, achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
HINWEIS: Alle Überstandundungen und Spitzen sollten vor der Entsorgung mit 10% Bleichmittel behandelt werden. - Das Pellet in 1 ml DMEM, ergänzt mit 10% FBS als Virusbestand, vorsichtig wieder aufhängen, bei -80 °C lagern.
- Erzeugung stabiler transfizierter Zelllinien
- Samen 6 x 106 GCSCs in eine 100 mm Petrischale mit 10 ml DMEM ergänzt mit 10% FBS für 24 h bei 37 °C, 5%CO2 (70-80% Zusammenfluss vor der Infektion).
- Das Medium in der Schale ansaugen, die konzentrierten lentiviralen Partikel mit 4 ml komplettem DMEM-Medium verdünnt, das Polybrenereagenz (5 g/ml) enthält, in die Schale geben. 18 h bei 37 °C, 5%CO2inkubieren.
HINWEIS: Die optimale Konzentration von Polybrene hängt vom Zelltyp ab und muss möglicherweise in verschiedenen Konzentrationen getestet werden, um die effektiven Konzentrationen zu bestimmen. Andernfalls kann es empirisch bestimmt werden, in der Regel im Bereich von 2-10 g/ml. Alle Schläuche und Spitzen sollten vor der Entsorgung mit 10% Bleichmittel behandelt werden. - Das Medium wechseln, mit 10 ml DMEM durch 10% FBS-Medium ersetzen und 24 h bei 37 °C, 5%CO2inkubieren.
HINWEIS: Alle Mittel und Spitzen sollten vor der Entsorgung mit 10% Bleichmittel behandelt werden. - Den Überstand mit Zellablagerungen aspirieren, durch frisches DMEM ersetzen, ergänzt durch 10% FBS-Medium, das Puromycin enthält (2,5 g/ml) und 24 h bei 37 °C, 5%CO2inkubieren. Dann ersetzen Sie frisches DMEM, das durch 10% FBS-Medium mit Puromycin (5 g/ml) ergänzt wird, und brüten bei 37 °C, 5%CO2 für zusätzliche 24 h.
- Spülen Sie die anhaftenden GCSCs zweimal mit 5 ml DPBS ohne Kalzium und Magnesium.
- Dissoziieren Sie GCSCs mit 1 ml vorgewärmter Zelldissoziationslösung und inkubieren Sie 2-3 min bei 37 °C.
- Fügen Sie der Zellsuspension 5 ml frische vorgewärmte GCSCs als komplettes Kulturmedium hinzu.
- Geben Sie 3 ml in ein 15 ml Zentrifugalrohr (Rohr A) zur Kryokonservierung der Zellen und die anderen 3 ml in ein 15 ml Zentrifugalrohr (Rohr B) zur Induktion durch Doxycyclin.
- Zentrifugenrohr A und Rohr B bei 800 x g für 5 min.
- Das Pellet von Rohr A mit 1 ml serumfreiem kryokonservierungsmittelhaltigen Medium aufheben, die Durchstechflasche über Nacht auf -80 °C übertragen und in flüssige Stickstoffspeicher entfernen.
- Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen von Tube B in 1 ml frisch erwärmenden GCSCs vollständigEr Kulturmedium aus. Säen Sie eine angemessene Anzahl von Zellen in eine neue 100 mm Petrischale von 10 ml frisch vorgewärmten GCSCs komplettes Kulturmedium mit Doxycyclin (Dox) (2,5 g/ml) und inkubieren sie für 48 h bei 37 °C, 5%CO2.
HINWEIS: Die optimale Konzentration von Dox kann zwischen den Zelllinien variieren. Jede Zelllinie sollte in verschiedenen Dox-Konzentrationen getestet werden, um die effektiven Konzentrationen für KD und die Toxizität auf den Zellen zu bestimmen. - Bestätigen Sie die stabile Unterdrückung von Clusterin in GCSCs durch Western Blotting.
3. Kugelformationstest
- Tauen Sie die eingefrorenen induzierbaren Knockdown GCSCs-Linien (siehe Schritt 1.2).
- Bestimmen Sie die lebensfähige Zelldichte einer 10-L-Probe mithilfe eines automatisierten Zellzählers.
- Passen Sie das Volumen mit vorgewärmten GCSCs als komplettes Kulturmedium an, um eine Konzentration von 2 x 104 lebensfähigen Zellen/ml zu erhalten.
- Geben Sie in 3 neue 96-Well Ultra-Low-Attachment-Kulturplattenbrunnen (0,1 ml/well) pro Gruppe ein.
- Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2. Die Kugelbildung sollte innerhalb von 3-10 Tagen erfolgen. Überwachen und zeichnen Sie die Visualisierung der Tumorsphärenbildung alle 2 Tage auf.
HINWEIS: Es wird nicht empfohlen, das Medium im Falle einer Störung der Tumorsphärenbildung zu ändern. Diese Tumorsphären sollten leicht von einzelnen und aggregierten Zellen unterschieden werden. - Bestimmen Sie die Ergebnisse der Tumorsphärenbildung, indem Sie die Größe der gebildeten Tumorsphären mithilfe von Bildgebungssoftware auswerten.
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Representative Results
Magenkrebs-Stammzellen aus primären menschlichen Magenadenokarzinom wurden in serumfreiem Kulturmedium kultiviert. Nach 6 Tagen dehnten sich zellenweise aus dem einzelzellähnlichen Phänotyp (Abbildung 1A) zu großen Kugeln aus (Abbildung 1B).
Um die Funktion von Clusterin in GCSCs zu bewerten, wurden shRNA-Sequenzen gegen Clusterin und Scrambled nach dem oben beschriebenen Protokoll in den Tet-GV307-RFP-Puro-Vektor geklont. GCSCs, die stabil mit einem tetracyclinregulierten shRNA-Clusterin-Expressionsvektor transfiziert wurden, wurden erzeugt und dann 48 h lang mit Doxycyclin behandelt (Abbildung 2) (und shRNA als Kontrolle gewürfelt). Die Expressionsebene von Clusterin wurde durch Western Blot überprüft und anschließend durch Densitometrie quantifiziert (Abbildung 3).
Der Kugelbildungstest wurde verwendet, um das Selbsterneuerungspotenzial von GCSCs zu testen. Wir vermuteten, dass Clusterin das Selbsterneuerungspotenzial von GCSCs fördert, und daher sollten weniger Sphären beobachtet werden, wenn Clusterin durch die Zugabe von Doxycyclin nach unten reguliert wird. Wir haben gezeigt, dass das Vorhandensein von Doxycyclin und Knockdown von Clusterin in GCSCs die Tumorsphärenbildung hemmten (Abbildung 4). Die Zellen-/Kugelgrößen von GCSCs nahmen nicht zu, als Clusterin in GCSCs reduziert wurde (Abbildung 5). Es wurde keine Hemmung der Tumorsphärenbildung mit GCSCs beobachtet, die mit den scrambled shRNA-Kontrollen transduziert wurden, was darauf hindeutet, dass Doxycyclin keine hemmende Wirkung auf die Tumorsphärenbildung hatte (Abbildung 5). Diese Ergebnisse legten nahe, dass GCSCs nach Demin-Silencing langsam wachsen und keine Tumorsphären bilden können. Basierend auf den In-vitro-Daten spielt Clusterin eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Selbsterneuerungsaktivität von GCSCs, was darauf hindeutet, dass Clusterin ein vielversprechendes Arzneimittelziel bei der Unterdrückung von CSCs bei GC-Patienten sein könnte.
Abbildung 1: Zellkulturen von Magenkrebsstammzellen. Einzelzellkulturen von Magenkrebsstammzellen wurden 6 Tage lang kultiviert. Phasenkontrastmikroskopische Bilder dieser Zellen/Kugeln wurden an Tag 0 (A) und Tag 6 (B) aufgenommen. Ursprüngliche Vergrößerung: 10x. Balkengröße: 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bedingte KD der Clusterin-Expression in Magenkrebs-Stammzellen. GCSCs-Linien wurden durch infizierende lentivirale induzierbare shRNA-Kontrolle (shCtrl) oder induzierbares shRNA-Targeting-Clusterin (shClu1, shClu2) etabliert. Diese Zelllinien wurden wie angegeben mit (Dox+) oder ohne Dox (2,5 g/ml) (Dox-) behandelt. Die Phasenkontrastbeobachtung dieser Zellen wurde im oberen Panel gezeigt. Immunfluoreszierende Beobachtung (rot) dieser Zellen wurden im unteren Panel gezeigt. Ursprüngliche Vergrößerung: 10x. Balkengröße: 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Expression von Clusterin in induzierbaren Knockdown-GCSCs-Linien mit oder ohne Dox-Behandlung. Western Blotting Analyse der Clusterin-Expression in Zelllinien stabil transfiziert mit Tetracyclin-regulierten shRNA-Clusterin (shClu1, shClu2) und scrambled (shCtrl) Expressionsvektor nach 2 Tagen doxycyclin-Behandlung. Die relative Expressionsebene von Clusterin wurde durch Densitometrie quantifiziert und gegen β-Actin normalisiert, dann wurde unterhalb der Bahnen der westlichen Flecken angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Phasenkontrast mikroskopische Bilder von induzierbaren Knockdown-GCSCs-Zellen/-Kugeln. Einzelne Zellen von induzierbaren Knockdown GCSCs Linien wurden inkubiert und behandelt ohne Dox (obere Platte) oder mit Dox (untere Platte) für 6 Tage. Phasenkontrastmikroskopische Bilder dieser Zellen/Kugeln wurden wie angegeben an Tag 6 aufgenommen. Ursprüngliche Vergrößerung: 10x. Maßstabsleiste, 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Induzierbarer Knockdown von Clusterin hemmt die GCSC-Selbsterneuerungskapazität. Kugelformationstests wurden in den induzierbaren Knockdown GCSCs-Linien durchgeführt. Phasenkontrastmikroskopische Bilder dieser Zellen/Kugeln wurden am angegebenen Tag aufgenommen und die Zell-/Kugelgrößen von GCSCs gemessen. n>30, ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Name des Gens | Spezies | Gen-ID | Targeting-Sequenz |
| CLU-1 | Menschlichen | 1191 | TGAAACAGACCTGCATGAA |
| CLU-2 | Menschlichen | 1191 | GGGAAGTAAGTACGTCAAT |
Tabelle 1: Zwei shRNA-Targeting-Sequenzen gegen Clusterin.
| Komponente | Volumen |
| Tube A | |
| Reduziertes Serummedium | 1,5 ml |
| Transfektionsreagenz | 41 l |
| Rohr B | |
| Reduziertes Serummedium | 1,5 ml |
| P3000 Enhancer Reagenz | 35 l |
| pHelper 1.0 (gag/pol komponente) | 9 g |
| pHelper 2.0 (VSVG-Komponente) | 6 g |
| shCLU 1/2 oder Kontrollplasmid | 12 g |
Tabelle 2: Skala der viralen Produktion mittels Transfektion.
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Discussion
GC ist die dritthäufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle weltweit. GCSCs sind entscheidend bei Magenkrebsrückfällen, Metastasen und Medikamentenresistenzen. Mit GCSCs von Magenkrebspatienten können wir ihre Schwachstelle erforschen und die Targeting-Medikamente zur Behandlung von GC-Patienten entwickeln.
Der Sphärenbildungstest ist eine nützliche Methode, um das Selbsterneuerungspotenzial von Krebsstammzellen in vitro zu untersuchen. Die Ergebnisse können als Prozentsatz der gebildeten Kugeln dargestellt werden, geteilt durch die ursprüngliche Anzahl der einzelnen Zellen, die gesät wurden. Wir haben die ursprüngliche Methode angepasst, um die mittleren Größen aller Zellen/Kugeln an mehreren Zeitpunkten zu berechnen, um die Ergebnisse dieses Assays zu verbessern und seine Reproduzierbarkeit für andere Arten von Krebsstammzellen zu erleichtern. Wir bescheinigten, dass das Ergebnis in diesem Test in hohem Maße von der Anzahl der ursprünglichen Samenzellen abhängt. Dies ist ein kritischer Punkt dieses Assays, um die anfängliche Zellisolation aufrechtzuerhalten und eine genaue Messung der Anzahl der kugelförmigen Kolonien (ohne zelluläre Aggregationen) vorzunehmen. Darüber hinaus ist es wichtig, die Zählzeit zu optimieren, um die Kugeln klar von zellulären Aggregationen und einzelnen Zellen zu unterscheiden.
Tet-induzierbare Systeme sind hilfreich, um die Funktion von Genen zu untersuchen, die für das Zellüberleben in vitro entscheidend sind, genau wie Clusterin in diesem Protokoll. Sie sind auch nützlich für die funktionelle Erforschung von Genen in vivo; dies kann durch Zugabe von Doxycyclin in das Trinkwasser der Tiere erfolgen. Jedoch, Leckunigkeit im uninduzierten Zustand ist ein oft gemeldetes Problem der Tet-induzierbaren Systeme12. Im vorgestellten Experiment wird auch mit shClu2 ein geringer Grad an Leckagen beobachtet, wie in Abbildung 3dargestellt. In diesem Fall können wir die Veränderungen des Zielproteins in KD oder der Rührkontrolle, die in Gegenwart und Abwesenheit von Doxycyclin festgestellt wurden, sorgfältig vergleichen, um diesen Effekt zu bewerten. Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Menge an Doxycyclin, die in der Kultur angewendet wird. Da die Menge an Dox zwischen den Zelllinien variieren kann, sollte jede Zelllinie mit verschiedenen Dox-Dosierungen getestet werden, um die effektiven Konzentrationen für KD und die Toxizität auf den Zellen zu bestimmen.
Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine effiziente Technik zur Entschlüsselung der stammbedingten Gene von CSCs und zum Studium der CSCs-Biologie. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um die Funktionen anderer kritischer Gene in Krebsstammzellen wie Stammundund und Überleben zu untersuchen. Darüber hinaus ist der bedingte Abbau der Genexpression in CSCs möglich, um die biologischen Funktionen von Zielgenen nicht nur in vitro, sondern auch in vivo zu untersuchen. Jedoch, nur einige CSCs möglicherweise nicht bilden solide, typische Tumorsphären, sollte dieses Protokoll mit anderen Methoden zur Untersuchung krebsstammezell selbsterneuerungpotenzial in vitro angepasst werden, zum Beispiel, die Untersuchung der Expression von Stammtherit-bezogenen Markern.
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Disclosures
Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Nature Science Foundation der Provinz Guangdong (2018A030310586, 2020A1515010989), die Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province (A2019405), die National Natural Science Foundation of China (81772957), das Science and Technology Program der Provinz Guangdong in China (2017B030301016) und die Industry and Information Technology Foundation of Shenzhen (201803091000135860).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
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