Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम रोगी-व्युत्पन्न जीसीएस के स्टेमनेस पर क्लस्टरिन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सशर्त नॉकडाउन प्रणाली और एक अनुकूलित क्षेत्र गठन परख का उपयोग करके एक प्रयोगात्मक डिजाइन प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार के सीएससी में स्टेमनेस से जुड़े जीन के इन विट्रो और वीवो फंक्शन दोनों का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
Abstract
कैंसर स्टेम सेल (CSCs) ट्यूमर दीक्षा, विकास और उपचार के बाद पुनरावृत्ति में फंसाया जाता है, और पिछले दशकों में कई अध्ययनों के ध्यान का केंद्र बन गए हैं । इसलिए, कैंसर सेल स्टेमनेस में शामिल प्रमुख जीन की भूमिका की जांच करने के तरीकों को विकसित करना महत्वपूर्ण है। गैस्ट्रिक कैंसर (जीसी) कैंसर के सबसे आम और नश्वर प्रकार में से एक है। गैस्ट्रिक कैंसर स्टेम सेल (जीसीएससी) को गैस्ट्रिक कैंसर रिलेप्स, मेटास्टेसिस और ड्रग रेजिस्टेंस की जड़ माना जाता है । लक्षित उपचारों के विकास को आगे बढ़ाने और अंततः रोगियों के बीच मृत्यु दर को कम करने के लिए जीसीएस जीव विज्ञान को समझना आवश्यक है । इस प्रोटोकॉल में, हम रोगी-व्युत्पन्न जीसीएस के स्टेमनेस पर क्लस्टरिन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सशर्त नॉकडाउन प्रणाली और एक अनुकूलित क्षेत्र गठन परख का उपयोग करके एक प्रयोगात्मक डिजाइन प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार के सीएससी में स्टेमनेस से जुड़े जीन के इन विट्रो और वीवो फंक्शन दोनों का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
गैस्ट्रिक कैंसर (जीसी) कैंसर के सबसे आम और नश्वर प्रकार में से एक है1। संयुक्त सर्जरी, कीमोथेरेपी और जीसी थेरेपी में रेडियोथेरेपी में प्रगति के बावजूद, रोग का निदान गरीब रहता है और पांच साल के जीवित रहने की दर अभी भी बहुत कमहै 2। ऑड-ईवन और मेटास्टेसिस उपचार के बाद होने वाली मौतों का मुख्य कारण है।
कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) कैंसर कोशिकाओं का एक सबसेट है जो ट्यूमर3का पुनर्गठन करने वाले विभिन्न सेल वंश को आत्म-नवीनीकृत करने और उत्पन्न करने की क्षमता रखता है। माना जाता है कि सीएससी को कैंसर रिलेप्स और मेटास्टेसिस के लिए जिम्मेदार माना जाता है क्योंकि उनकी क्षमताओं के कारण आत्म-नवीकरण और नए ट्यूमर को सीडिंग किया जाता है, साथ ही पारंपरिक कीमो और रेडियोथेरेपी4के लिए उनका प्रतिरोध भी है । इसलिए, सीएससी को लक्षित करना और सीएससी को समाप्त करना उपचार में सुधार और कैंसर रोगियों की मृत्यु दर को कम करने के लिए एक रोमांचक क्षमता प्रदान करता है ।
सीएससी को कई प्रकार के ठोस ट्यूमर से अलग किया गया है5. 2009 में, मानव गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों से अलग गैस्ट्रिक कैंसर स्टेम सेल (जीसीएस) को मूल रूप से ताकाइची एट अल6द्वारा वर्णित किया गया था। चेन और उनके सहयोगियों ने सबसे पहले मानव गैस्ट्रिक एडेनोकार्सिनोमा (जीएसी) ट्यूमर ऊतकों7से जीसीएस की पहचान और शुद्ध किया । ये निष्कर्ष न केवल जीसीएस जीव विज्ञान का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करते हैं बल्कि महान नैदानिक महत्व भी प्रदान करते हैं ।
सीएससी की एक विशेष विशेषता गोला8बनाने की उनकी क्षमता है . एकल कोशिकाओं को कम घनत्व पर गैर-साक्षर परिस्थितियों में चढ़ाया जाता है, और केवल आत्म-नवीकरण के साथ कोशिकाएं एक ठोस, गोलाकार क्लस्टर में विकसित हो सकती हैं जिन्हें एक गोलाकार कहा जाता है। इस प्रकार, क्षेत्र गठन परख सोने के मानक परख के रूप में माना जाता है और व्यापक रूप से स्टेम सेल आत्म विट्रो में नवीकरण क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया ।
आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) एक विशिष्ट जीन9के नॉकडाउन द्वारा जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण है। हालांकि, दीर्घकालिक स्थिर जीन नॉकडाउन प्रौद्योगिकियों की कुछ सीमाएं होती हैं, जैसे कि कोशिका अस्तित्व के लिए आवश्यक जीन के कार्य की खोज की चुनौती। सशर्त आरएनएआई सिस्टम एक उत्प्रेरण एजेंट के प्रशासन द्वारा एक लौकिक और/या विशेष नियंत्रित तरीके से वांछित जीन के डाउनरेगुलेशन के लिए उपयोगी हो सकता है । टेट्रासाइक्लिन (टीईटी) -अक्षूणीय प्रणालियां सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली सशर्त आरएनएआई प्रणालियों में से एक हैं10। टीईटी-प्रेरक प्रणालियां एक बहिर्जात प्रेरक (अधिमानतः डॉक्सीसाइक्लिन, डॉक्स) के अलावा श्रणाणुओं की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करके लक्षित जीन को प्रेरित कर सकती हैं। टीईटी-इनकक्षीय प्रणालियों को दो प्रकारों में विभाजित किया जा सकता है: टीईटी-ऑन या टीईटी-ऑफ सिस्टम। श्रावक की अभिव्यक्ति को प्रेरक की उपस्थिति में चालू (टीईटी-ऑन) या बंद (टीईटी-ऑफ) किया जा सकता है। एक प्रेरक के बिना टीईटी-ऑन प्रणाली में, संविलियन व्यक्त टीईटी दमन (टेटआर) टीईटी-उत्तरदायी तत्व (टीईए) अनुक्रम से बांधता है जिसमें छर्रा अभिव्यक्ति के लिए टीईटी-उत्तरदायी पोल III-निर्भर प्रमोटर होता है, इस प्रकार श्रणा की अभिव्यक्ति का दमन होता है । जबकि डॉक्स के अलावा, TetR टीईटी-उत्तरदायी पीओएल III-निर्भर प्रमोटर से दूर तनहा है । यह श्र्ना की अभिव्यक्ति को सुविधाजनक बनाता है और जीन नॉकडाउन की ओर जाता है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल रोगी-व्युत्पन्न जीसीएस में क्लस्टरिन के कार्य का अध्ययन करने के लिए एक कार्यात्मक टेट्रासाइक्लिन-अक्षुण्ण श्रावक प्रणाली और एक अनुकूलित क्षेत्र गठन परख को नियोजित करता है । क्लस्टरिन को पिछले अध्ययन11में जीसीएस के स्टेमनेस और अस्तित्व को बनाए रखने के लिए एक उपन्यास कुंजी अणु के रूप में पहचाना गया है । हम जीसीएस स्वयं नवीकरण में क्लस्टरइन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हैं। यह कार्यप्रणाली अन्य प्रकार के कैंसर स्टेम सेल पर भी लागू होती है।
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Protocol
यहां वर्णित रोगी-व्युत्पन्न गैस्ट्रिक कैंसर स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करके सभी प्रयोगों को स्थानीय नैतिक समितिद्वाराअनुमोदित किया गया था ।
1. गैस्ट्रिक कैंसर स्टेम सेल संस्कृति
- जीसीएससी पूर्ण संस्कृति माध्यम की तैयारी
- निम्नलिखित आवश्यक अवयवों के साथ ताजा डीएमई/एफ12 माध्यम जोड़कर जीसीएससी पूर्ण संस्कृति माध्यम तैयार करें: 20 एनजी/एमएल ईजीएफ, 10 एनजी/एमएल बीएमजीएफ, 1% इंसुलिन/ट्रांसफरिन/सोडियम सेलेन्नाइट, ०.२% ग्लूकोज, 0.5% B27, 1% ग्लूटामैक्स, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 10 माइक्रोन 2-मर्केप्टोथेनॉल, 0.75 मिलीग्राम/एमएल एनएएचसीओ3,10 माइक्रोन थियोग्लीसेरोल, 100 आईयू/एमएल पेनिसिलिन और 100 μg/mL streptomycin। 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें और स्टरलाइज करें।
नोट: जीसीएससी पूर्ण संस्कृति माध्यम की सिफारिश की जाती है अधिमानतः 4 डिग्री सेल्सियस पर दो सप्ताह से अधिक नहीं संग्रहीत की जाती है।
- निम्नलिखित आवश्यक अवयवों के साथ ताजा डीएमई/एफ12 माध्यम जोड़कर जीसीएससी पूर्ण संस्कृति माध्यम तैयार करें: 20 एनजी/एमएल ईजीएफ, 10 एनजी/एमएल बीएमजीएफ, 1% इंसुलिन/ट्रांसफरिन/सोडियम सेलेन्नाइट, ०.२% ग्लूकोज, 0.5% B27, 1% ग्लूटामैक्स, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 10 माइक्रोन 2-मर्केप्टोथेनॉल, 0.75 मिलीग्राम/एमएल एनएएचसीओ3,10 माइक्रोन थियोग्लीसेरोल, 100 आईयू/एमएल पेनिसिलिन और 100 μg/mL streptomycin। 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें और स्टरलाइज करें।
- जीसीएस और संस्कृति की वसूली
नोट: जीसीएससी को इस प्रकार प्राप्त किया गया: ट्यूमर के नमूनों को यांत्रिक और एंजाइमेटिक वियोजन के अधीन किया गया था। अच्छी तरह से बिखरे हुए निलंबन से नायलॉन नेट के साथ फ़िल्टर करके एकल सेल निलंबन प्राप्त किए गए थे। परिणामस्वरूप कैंसर कोशिकाओं जीसीएससी पूर्ण संस्कृति माध्यम में सुसंस्कृत थे, और कुछ कोशिकाओं को क्षेत्रों के रूप में वृद्धि हुई । इन क्षेत्रों को तब एंजाइमेटिक वियोजन के अधीन किया गया था, और जीसीएस को सीडी44/सीडी 54 मार्कर के साथ दाग वाली सेल आबादी के साइटोफ्लोर्मेट्रिक छंटाई द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। जीसीएससी के विस्तृत प्रोटोकॉल और कार्यात्मक परखों कीसूचनादी गई है ।- पूर्व गर्म जीसीएस 30 मिनट से अधिक नहीं के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति माध्यम पूरा करें।
- तरल नाइट्रोजन भंडारण से डीफ्रॉस्ट जीसीएस और 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में तेजी से क्रायोवियल गल जाता है। शीशियों को तब तक घूमता रखें जब तक कि पूरी सामग्री पूरी तरह से पिघल न जाए।
नोट: गल जमे हुए कोशिकाओं को तेजी से (<1 मिनट) एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में । - क्रायोवियल्स की पूरी सामग्री को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें जीसीएससी पूर्ण संस्कृति माध्यम का 10 एमएल होता है। आरटी में 5 मिनट के लिए 800 x g पर सेंट्रलाइज।
- सुपरनेट को सावधानी से एएसपिएंट करें और ताजा जीसीएससी पूर्ण माध्यम के 10 एमएल में सेल पेलेट को निलंबित करें। 100 मिमी पेट्री डिश में सेल सस्पेंशन प्लेट करें। प्लेट को 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और तीसरे दिन 5 एमएल फ्रेश कंप्लीट मीडियम डालें।
- जीसीएससी ट्यूमरमंडल की उपसंस्कृति
नोट: ट्यूमरस्फीयर केंद्र के जीसीएस में केवल पर्याप्त पोषक तत्व होते हैं इससे पहले कि क्षेत्रों का आकार व्यास में 80-100 माइक्रोन तक बढ़ जाता है। एक बार जब अंधेरे और कम अपवर्तकता क्षेत्र दिखाई देते हैं (संस्कृति के लगभग 6 दिन), ट्यूमर के दरों को उपसंस्कृति करना आवश्यक है।- डिश को धीरे-धीरे हिलाएं और जीसीएससी ट्यूमरस्फीयर कल्चर मीडियम (मीडियम और नॉन-अनुयायी ट्यूमरस्फीयर) को बाँझ 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में ट्रांसफर करें । बड़े मध्यम मात्रा के लिए, बड़े अपकेंद्रित्र ट्यूबों की आवश्यकता हो सकती है।
- 5 मिनट के लिए 600 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट का सावधानी से निपटान करें। अपकेंद्रित्र के बाद, एक ऑफ-व्हाइट पैलेट दिखाई देगा।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर यांत्रिक और एंजाइमेटिक वियोजन के लिए गोली को फिर से खर्च करने के लिए सेल वियोजन समाधान के 2 एमएल जोड़ें। धीरे-धीरे पाचन प्रक्रिया में हर 2-3 मिनट में 10 बार ऊपर और नीचे पाइप अप करें, जब तक कि ट्यूमरस्फीयर एकल कोशिका निलंबन में फैल नहीं जाते हैं। इस कुल वियोजन प्रक्रिया को 15 मिनट से कम होने की सिफारिश की जाती है।
नोट: माइक्रोस्कोप के नीचे एक दृश्य जांच करें ताकि यह पुष्टि की जा सके कि कोई बड़े क्षेत्र या सेल समुच्चय नहीं रहते हैं। - 5 मिनट के लिए आरटी में 800 एक्स ग्राम पर पाचन प्रक्रिया और अपकेंद्रित्र को समाप्त करने के लिए ताजा पूर्व-गर्म जीसीएस पूर्ण संस्कृति माध्यम (सेल टुकड़ी समाधान की मात्रा 5x) के 10 एमएल जोड़ें।
- सुपरनैंट को त्यागें और कोशिकाओं को ताजा पूर्व-गर्म जीसीसी पूर्ण संस्कृति माध्यम के 1 एमएल के साथ फिर से खर्च करें। एक नए 100 मिमी पेट्री डिश में कोशिकाओं की एक उपयुक्त संख्या बीज ताजा पूर्व गरम जीसीएस पूर्ण संस्कृति माध्यम के 10 मिलील के साथ और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर इनक्यूबेट।
- ताजा पूर्व गरम पूर्ण माध्यम के 5 एमएल जोड़कर 3 दिनों के बाद रिफीड ट्यूमर को अलग करता है। 6 दिनों के बाद, जब ट्यूमर के पार 80-100 माइक्रोन व्यास में बढ़ती है तो मार्ग कोशिकाएं।
- जीसीएससी का क्रायोप्रिजर्वेशन
नोट: सीधे ट्यूमरस्फीयर में माध्यम जोड़कर जीसीएस कोशिकाओं का क्रायोप्रिजर्वेट न करें। जीसीएस ट्यूमरमंडल को एकल कोशिकाओं में पचाया जाना चाहिए ताकि कोशिका सुरक्षाक एजेंट कोशिकाओं के दीर्घकालिक स्थिर भंडारण को सुनिश्चित करने के लिए हर कोशिका में प्रवेश कर सके। सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं स्वस्थ स्थिति में हैं और संदूषण के बिना हैं।- हार्वेस्ट जीसीएस ट्यूमरस्फीयर। 5 मिनट के लिए 600 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
- सुपरनेट को त्यागें और 37 डिग्री सेल्सियस पर जीसीएस ट्यूमरस्फीयर को अलग करने के लिए सेल वियोजन समाधान के 2 एमएल जोड़ें। जीसीएससी पूर्ण संस्कृति माध्यम के 10 एमएल जोड़कर पाचन प्रक्रिया को समाप्त करें।
- 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और एकल जीसीएससी एकत्र करें।
- सीरम-मुक्त क्रायोप्रर्वरेटिव माध्यम के साथ जीसीएस को धीरे-धीरे निलंबित करें। अनुशंसित अंतिम एकाग्रता 5 x 10 5 -5 x 106 कोशिकाएं/
- कक्ष निलंबन को 1 एमएल एलिकोट्स में चिह्नित क्रायोजेनिक शीशियों में बांटें।
- कोशिकाओं वाले क्रायोवियल्स को तुरंत आइसोप्रोपैनॉल कक्ष में रखें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। लंबे समय तक भंडारण के लिए अगले दिन शीशियों को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
2. कठिन नॉकडाउन जीसीएस लाइनों का उत्पादन
सावधानी: राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान और रोग नियंत्रण केंद्र द्वारा रीकॉम्बिनेंट लेंटीवायरस को स्तर 2 जीवों के रूप में नामित किया गया है। लेंटीवायरस को शामिल करने के काम के लिए बायोसेफ्टी लेवल 2 सुविधा के रखरखाव की आवश्यकता होती है, यह देखते हुए कि इन लेंटीवायरल सिस्टम द्वारा उत्पादित वायरल सुपरनेटेंट में संभावित खतरनाक रिकॉम्बिनेंट वायरस हो सकता है।
- लेंटीवायरस कणों का उत्पादन
- सिंथेसाइज 2 लेंटीवायरल वैक्टर मानव क्लस्टरिन को लक्षित करने वाले प्रेरक श्र्ना और टेबल 1 (जीवी 307 वेक्टर के डिजाइन के आधार पर जेनेम से एक गैर-लक्षित नियंत्रण लेंटीवियरल वेक्टर (GV307) शामिल हैं: TetiIP-टर्बोरएफपी-एमसीएस (MIR30)-यूबीआई-टेटआर-आईरेस-प्यूरोमाइसिन)।
- बीज 4 x 106 293T लेंटी-वायरल पैकेजिंग कोशिकाओं को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक डीएमईएम के 10 एमएल के साथ 100 मिमी पेट्री डिश में।
- इनक्यूबेट 293T कोशिकाओं को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर । सुनिश्चित करें कि 293T सेल घनत्व ट्रांसफैक्शन के दिन लगभग 50-80% है।
- कम सीरम माध्यम को कमरे के तापमान में लाएं और टेबल 2में वर्णित ट्यूब ए और ट्यूब बी तैयार करें।
- ट्यूब ए को ट्यूब बी में स्थानांतरित करें, अच्छी तरह से मिलाएं, और लिपिड-डीएनए परिसरों को तैयार करने के लिए कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए परिसरों को इनक्यूबेट करें।
- लिपिड-डीएनए कॉम्प्लेक्स जोड़ने से पहले मीडियम के 5 एमएल निकालें, जिससे कुल 5 एमएल निकलें।
- लिपिड-डीएनए कॉम्प्लेक्स के 5 एमएल को कल्चर डिश ड्रॉपवाइज में जोड़ें और कॉम्प्लेक्स को बांटने के लिए धीरे-धीरे डिश को चक्कर लगाते हैं।
नोट: ध्यान से 293T कोशिकाओं को परेशान करने से बचने के लिए पकवान की दीवार के खिलाफ तरल बांटना । - 37 डिग्री सेल्सियस, 5%सीओ2 पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट कल्चर डिश।
- 24 घंटे के बाद ट्रांसफैक्शन, ध्यान से ट्रांसफैक्शन माध्यम को हटा दें और धीरे-धीरे 10% एफबीएस के साथ पूरक पूर्व-गर्म डीएमईएम के 10 एमएल के साथ बदलें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट, 5% सीओ2.
नोट: निपटान से पहले सभी सुपरनेट और टिप्स को 10% ब्लीच के साथ इलाज किया जाना चाहिए। - लगभग 48 घंटे के बाद ट्रांसफैक्शन, लेंटीवायरस युक्त सुपरनेटेंट की 10 एमएल फसल।
नोट: सभी सेल संस्कृति जहाजों और सुझावों के निपटान से पहले 10% ब्लीच के साथ इलाज किया जाना चाहिए । - सेलुलर मलबे को हटाने के लिए 0.45 माइक्रोन पोर फिल्टर का उपयोग करके लेंटीवायरल सुपरनेटेंट को फ़िल्टर करें।
नोट: सभी फिल्टर और सीरिंज निपटान से पहले 10% ब्लीच के साथ इलाज किया जाना चाहिए । - एक बाँझ कंटेनर में सुपरनिटेंट को स्थानांतरित करें, कोमल उलटा द्वारा मिश्रण करने के लिए लेंटी-एक्स सांसेंटर (स्पष्ट सुपरनैंट की 1/3 मात्रा) जोड़ें।
- रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण इनक्यूबेट करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज नमूने। अपकेंद्रित्र के बाद, और ऑफ-व्हाइट पैलेट दिखाई देगा। सावधानी से सुपरनैंट को हटा दें, इस बात का ध्यान रखें कि गोली परेशान न हो।
नोट: निपटान से पहले सभी सुपरनेट और टिप्स को 10% ब्लीच के साथ इलाज किया जाना चाहिए। - धीरे-धीरे डीएमईएम के 1 मिलील में गोली को फिर से रीस्ब करें, वायरस स्टॉक के रूप में 10% एफबीएस के साथ पूरक हो, -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- स्थिर संक्रमित कोशिका लाइनों का उत्पादन
- बीज 6 x 106 जीसीएस 100 मिमी पेट्री डिश में 10 एमएल डीएमईएम के साथ 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 (संक्रमण से पहले 70-80% संगम) पर24 घंटे के लिए 10% एफबीएस के साथ पूरक है।
- डिश में माध्यम को एस्पिरेट करें, डिश में पॉलीब्रेन रीएजेंट (5 μg/ml) युक्त पूर्ण डीएमईएम माध्यम के 4 एमएल के साथ पतला केंद्रित लेंटिवायरल कणों को जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए इनक्यूबेट, 5% सीओ2।
नोट: पॉलीब्रेन की इष्टतम एकाग्रता सेल प्रकार पर निर्भर करती है और प्रभावी सांद्रता तय करने के लिए विभिन्न सांद्रता में परीक्षण करने की आवश्यकता हो सकती है। अन्यथा, यह अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जा सकता है, आमतौर पर 2-10 μg/mL की सीमा में । निपटान से पहले सभी ट्यूबों और सुझावों को 10% ब्लीच के साथ इलाज किया जाना चाहिए। - माध्यम बदलें, डीएमईएम के 10 मिलीएल के साथ 10% एफबीएस माध्यम और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर इनक्यूबेट के साथ बदलें।
नोट: सभी माध्यम और सुझावों को निपटान से पहले 10% ब्लीच के साथ इलाज किया जाना चाहिए। - सेल मलबे के साथ सुपरनेट को एस्पिरेट करें, ताजा डीएमईएम के साथ 10% एफबीएस माध्यम के साथ पूरक है जिसमें प्यूरोमाइसिन (2.5 माइक्रोग्राम/एमएल) और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर इनक्यूबेट किया गया है। फिर नए डीएमईएम को प्यूरोमाइसिन (5 माइक्रोजी/एमएल) युक्त 10% एफबीएस माध्यम के साथ प्रतिस्थापित करें और अतिरिक्त24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेट करें।
- कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना डीपीबीएस के 5 एमएल के साथ दो बार अनुयायी जीसीएस को कुल्लाएं।
- जीसीएस को पूर्व-गर्म सेल वियोजन समाधान के 1 एमसीएल के साथ अलग करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 मिनट को इनक्यूबेट करें।
- सेल निलंबन के लिए ताजा पूर्व गरम जीसीएस पूर्ण संस्कृति माध्यम के 5 एमएल जोड़ें।
- कोशिकाओं को क्रायोप्रिजर्वेट करने के लिए 3 एमएल को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब (ट्यूब ए) में बांटें, और अन्य 3 एमएल को डॉक्सीसाइक्लिन द्वारा उत्प्रेरण के लिए 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब (ट्यूब बी) में डालें।
- 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज ट्यूब ए और ट्यूब बी।
- सीरम-मुक्त क्रायोप्रर्वरेटिव माध्यम के 1 एमएल के साथ ट्यूब ए के गोली को फिर से रीसल्पेंड करें, शीशी को रातोंरात -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें, और इसे तरल नाइट्रोजन भंडारण में हटा दें।
- सुपरनेट को एस्पिरेट करें और ताजा पूर्व-गर्म जीसीएस पूर्ण संस्कृति माध्यम के 1 एमएल में ट्यूब बी की कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। 10 एमएल ताजा पूर्व गरम जीसीएससी के एक नए १०० मिमी पेट्री डिश में कोशिकाओं की एक उपयुक्त संख्या बीज doxycycline (Dox) (२.५ μg/mL) के साथ संस्कृति माध्यम पूरा और ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर ४८ घंटे के लिए इनक्यूबेट ।
नोट: डॉक्स की इष्टतम एकाग्रता सेल लाइनों के बीच भिन्न हो सकती है। प्रत्येक सेल लाइन का परीक्षण अलग-अलग डॉक्स सांद्रता में किया जाना चाहिए ताकि केडी के लिए प्रभावी सांद्रता तय की जा सके और कोशिकाओं पर विषाक्तता के लिए। - पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा जीसीएस में क्लस्टरइन के स्थिर दमन की पुष्टि करें।
3. गोला निर्माण परख
- जमे हुए कठिन नॉकडाउन जीसीएससी लाइनों गल (चरण 1.2 देखें)।
- स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके 10 माइक्रोल नमूने का व्यवहार्य सेल घनत्व निर्धारित करें।
- 2 x 104 व्यवहार्य कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पूर्व-गरम जीसीएस पूर्ण संस्कृति माध्यम के साथ मात्रा को समायोजित करें।
- 3 नए ९६-अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव संस्कृति प्लेट कुओं (०.१ mL/अच्छी तरह से) प्रत्येक समूह में बांटना ।
- कोशिकाओं को 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। गोला निर्माण 3-10 दिनों के भीतर होना चाहिए। हर 2 दिनों में ट्यूमरस्फीयर गठन के दृश्य की निगरानी और रिकॉर्ड करें।
नोट: ट्यूमर के गठन में किसी भी गड़बड़ी के मामले में माध्यम को बदलने की सिफारिश नहीं की जाती है। इन ट्यूमरमंडलों को एकल और एकत्रित कोशिकाओं से आसानी से प्रतिष्ठित किया जाना चाहिए। - इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके गठित ट्यूमरस्फीयर के आकार का मूल्यांकन करके ट्यूमरस्फीयर गठन परिणाम निर्धारित करें।
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Representative Results
प्राथमिक मानव गैस्ट्रिक एडेनोकार्सिनोमा से गैस्ट्रिक कैंसर स्टेम सेल सीरम मुक्त संस्कृति माध्यम में सुसंस्कृत थे। 6 दिनों के बाद, कोशिकाओं को एकल कोशिका की तरह फेनोटाइप(चित्रा 1ए)से विस्तारित करने के लिए बड़े क्षेत्रों(चित्रा 1B)फार्म ।
जीसीएससी में क्लस्टरइन के कार्य का आकलन करने के लिए, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद क्लस्टरइन और तले हुए के खिलाफ श्ना दृश्यों को टीईटी-GV307-RFP-Puro वेक्टर में क्लोन किया गया था। जीसीएस ने एक टेट्रासाइक्लिन-विनियमित श्राणा-क्लस्टरइन अभिव्यक्ति वेक्टर से संक्रमित किया और फिर 48 एच(चित्रा 2)(और श्र्ना नियंत्रण के रूप में तले हुए) के लिए डॉक्सीसाइक्लिन के साथ इलाज किया गया। क्लस्टरिन के अभिव्यक्ति स्तर को पश्चिमी दाग द्वारा सत्यापित किया गया था और बाद में घनत्व(चित्र 3)द्वारा निर्धारित किया गया था।
जीसीएस की स्व-नवीकरण क्षमता का परीक्षण करने के लिए गोला निर्माण परख का उपयोग किया गया था। हमने परिकल्पना की है कि क्लस्टरिन जीसीएससी की आत्म-नवीकरण क्षमता को बढ़ावा देता है, और इसलिए कम क्षेत्रों को देखा जाना चाहिए जब क्लस्टरिन को डॉक्सीसाइक्लिन के अलावा डाउनरेगुइट किया जाता है। हमने दिखा दिया कि जीसीएस में डॉक्सीसाइक्लिन और क्लस्टर की दस्तक की उपस्थिति ने ट्यूमरस्फीयरगठन (चित्रा 4) कोबाधित किया। जीसीएससी(चित्रा 5)में क्लस्टरइन कम होने पर जीसीएससी के सेल/क्षेत्र आकार में वृद्धि नहीं हो रही थी । ट्यूमरस्फीयर गठन का कोई अवरोध जीसीएस के साथ तले हुए श्र्ना नियंत्रणों के साथ स्थानांतरित नहीं किया गया था, यह दर्शाता है कि डॉक्सीसाइक्लिन का ट्यूमरस्फीयरगठन (चित्रा 5)पर कोई अवरोधक प्रभाव नहीं पड़ा। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि क्लस्टरइन सिलिंग के बाद जीसीएस धीरे-धीरे बढ़ता है और ट्यूमरस्फीयर नहीं बना सकता। इन विट्रो डेटा के आधार पर, क्लस्टरिन जीसीएससी की आत्म-नवीकरण गतिविधि को बढ़ावा देने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, यह दर्शाता है कि जीसी रोगियों में सीएससी को दबाने में क्लस्टरिन एक आशाजनक दवा लक्ष्य हो सकता है ।
चित्रा 1: गैस्ट्रिक कैंसर स्टेम सेल की सेल संस्कृतियों। गैस्ट्रिक कैंसर स्टेम सेल की एकल कोशिका संस्कृतियों को 6 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था। इन कोशिकाओं/क्षेत्रों की चरण-विषम सूक्ष्म छवियां दिन 0(ए)और 6 दिन(बी)में ली गई थीं । मूल आवर्धन: 10x। बार आकार: 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: गैस्ट्रिक कैंसर स्टेम सेल में क्लस्टरइन अभिव्यक्ति की सशर्त केडी। जीसीएस लाइनों को लेंटीवियरल प्रेरक श्राणा नियंत्रण (एससीटीआरएल) या प्रेरक श्राणु को लक्षित करने वाले क्लस्टरिन (एससीएलयू1, एससीएलयू 2) को संक्रमित करके स्थापित किया गया था। इन सेल लाइनों के साथ इलाज किया गया (Dox +) या Dox के बिना (२.५ μg/mL) (Dox-) के लिए ४८ घंटे के रूप में उल्लेख किया । इन कोशिकाओं के चरण विपरीत अवलोकन शीर्ष पैनल में दिखाए गए थे। इन कोशिकाओं के इम्यूनोफ्लोरेसेंट अवलोकन (लाल) को नीचे पैनल में दिखाया गया था। मूल आवर्धन: 10x। बार आकार: 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: डॉक्स उपचार के साथ या बिना अस्पष्ट नॉकडाउन जीसीएस लाइनों में क्लस्टरिन की अभिव्यक्ति। सेल लाइनों में क्लस्टरइन अभिव्यक्ति का पश्चिमी ब्लॉटिंग विश्लेषण 2 दिनों के डॉक्सीसाइक्लिन उपचार के बाद टेट्रासाइक्लिन-विनियमित श्रवण-क्लस्टरिन (shClu1, shClu2) और तले हुए (shCtrl) अभिव्यक्ति वेक्टर से संक्रमित होता है। क्लस्टरिन के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर को घनत्व से निर्धारित किया गया था और β-ऐक्टिन के खिलाफ सामान्यीकृत किया गया था, फिर पश्चिमी ब्लॉट्स की गलियों के नीचे इंगित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: अस्पष्ट नॉकडाउन जीसीएससी कोशिकाओं/क्षेत्रों की चरण-विपरीत सूक्ष्म छवियां । अनुदेया नॉकडाउन जीसीएस लाइनों के एकल सेल को 6 दिनों के लिए डॉक्स (शीर्ष पैनल) या डॉक्स (बॉटम पैनल) के बिना और इलाज किया गया था। इन कोशिकाओं/क्षेत्रों की चरण-विषम सूक्ष्म छवियों को 6 दिन में लिया गया था जैसा कि संकेत दिया गया था । मूल आवर्धन: 10x। स्केल बार, 20 माइक्रोन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: क्लस्टरिन का प्रारंभिक नॉकआउट जीसीएससी आत्म-नवीकरण क्षमता को रोकता है। क्षेत्र गठन परख मोहक नॉकडाउन जीसीएससी लाइनों में किया गया । इन कोशिकाओं/क्षेत्रों की चरण-विषम सूक्ष्म छवियों को निर्धारित दिन में लिया गया था और जीसीएससी के कोशिका/क्षेत्र के आकार को मापा गया था । n>30, ± मानक त्रुटि का मतलब (SEM) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| जीन का नाम | प्रजातियां | जीन आईडी | टारगेटिंग सीक्वेंस |
| सीएलयू-1 | मानव | 1191 | TGAAACAGACCTGCATGAA |
| सीएलयू-2 | मानव | 1191 | GGGAAGTATACGTCAAT |
तालिका 1: क्लस्टरइन के खिलाफ दो एसएचओ टारगेटिंग सीक्वेंस।
| घटक | आयतन |
| ट्यूब ए | |
| कम सीरम माध्यम | 1.5 एमएल |
| ट्रांसफैक्शन रीएजेंट | 41 माइक्रोल |
| ट्यूब बी | |
| कम सीरम माध्यम | 1.5 एमएल |
| P3000 एन्हांसर रिएजेंट | 35 माइक्रोन |
| pHelper 1.0 (चुप/ | 9 माइक्रोन |
| pHelper 2.0 (VSVG घटक) | 6 माइक्रोन |
| एसएचसीएलयू 1/2 या कंट्रोल प्लाज्मिड | 12 माइक्रोग्राम |
तालिका 2: ट्रांसफैक्शन का उपयोग करके वायरल उत्पादन का पैमाना।
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Discussion
जीसी दुनिया भर में कैंसर से संबंधित मौत का तीसरा प्रमुख कारण है । जीसीएस गैस्ट्रिक कैंसर रिलेप्स, मेटास्टेसिस और ड्रग रेजिस्टेंस में महत्वपूर्ण हैं। गैस्ट्रिक कैंसर रोगियों से जीसीएस का उपयोग करने से हमें अपने कमजोर स्थान का पता लगाने और जीसी रोगियों के उपचार के लिए लक्षित दवाओं का विकास करने की अनुमति मिलेगी ।
क्षेत्र गठन परख विट्रो में कैंसर स्टेम सेल स्व-नवीकरण क्षमता की जांच करने के लिए एक उपयोगी तरीका है। परिणाम एकल वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की मूल संख्या से विभाजित क्षेत्रों के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है । हमने इस परख के परिणामों में सुधार करने और अन्य प्रकार के कैंसर स्टेम कोशिकाओं के लिए इसकी प्रजनन क्षमता को सुगम बनाने के लिए कई समय बिंदुओं पर सभी कोशिकाओं/क्षेत्रों के औसत आकारों की गणना करने के लिए मूल विधि को अनुकूलित किया । हमने प्रमाणित किया कि इस परख में परिणाम प्रारंभिक वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या पर अत्यधिक निर्भर है। यह प्रारंभिक सेल अलगाव को बनाए रखने और गोलाकार उपनिवेशों (सेलुलर एकत्रीकरण को छोड़कर) की संख्या का सटीक माप करने के लिए इस परख का एक महत्वपूर्ण बिंदु है। इसके अतिरिक्त, सेलुलर एकत्रीकरण और एकल कोशिकाओं से क्षेत्रों को स्पष्ट रूप से अलग करने के लिए गिनती के समय को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है।
टीईटी-अक्षुण्ण प्रणालियां जीन के कार्य का अध्ययन करने में सहायक होती हैं जो इस प्रोटोकॉल में क्लस्टरिन की तरह विट्रो में सेल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण हैं। वे वीवो में जीन की कार्यात्मक खोज के लिए भी उपयोगी हैं; यह जानवरों के पीने के पानी में डॉक्सीसाइक्लिन जोड़कर किया जा सकता है। हालांकि, असे प्रेरित राज्य में leakiness टीईटी-अकक्षीय प्रणालियों12की एक अक्सर सूचित समस्या है । प्रस्तुत प्रयोग में, shClu2 के साथ रिसाव का एक निम्न स्तर भी मनाया जाता है, जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है। इस मामले में, हम इस प्रभाव का आकलन करने के लिए केडी में लक्षित प्रोटीन के परिवर्तनों या डॉक्सीसाइक्लिन की उपस्थिति और अनुपस्थिति में पाए गए तले हुए नियंत्रण की सावधानीपूर्वक तुलना कर सकते हैं। एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु संस्कृति में लागू डॉक्सीसाइक्लिन की मात्रा है। चूंकि डॉक्स की मात्रा सेल लाइनों के बीच भिन्न हो सकती है, प्रत्येक सेल लाइन का परीक्षण केडी के लिए प्रभावी सांद्रता और कोशिकाओं पर विषाक्तता के लिए अलग-अलग डॉक्स खुराकों के साथ किया जाना चाहिए।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सीएससी के स्टेमनेस से संबंधित जीन को समझने और सीएससी के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक कुशल तकनीक प्रदान करता है । प्रोटोकॉल को कैंसर स्टेम कोशिकाओं में अन्य महत्वपूर्ण जीनों के कार्यों का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे स्टेमनेस और अस्तित्व। इसके अतिरिक्त, सीएससी में जीन अभिव्यक्ति का सशर्त नॉकआउट न केवल विट्रो में बल्कि वीवो में भी लक्षित जीन के जैविक कार्यों का अध्ययन करना व्यवहार्य है । हालांकि, बस कुछ सीएससी ठोस, ठेठ ट्यूमरमंडल नहीं बना सकते हैं, इस प्रोटोकॉल को अन्य तरीकों का उपयोग करके अनुकूलित किया जाना चाहिए ताकि इन विट्रो में कैंसर स्टेम सेल स्व-नवीकरण क्षमता की जांच की जा सके, उदाहरण के लिए, स्टेमनेस से संबंधित मार्कर की अभिव्यक्ति की जांच करना।
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Disclosures
हितों का कोई टकराव घोषित नहीं किया गया ।
Acknowledgments
इस काम को गुआंगदोंग प्रांत के नेचर साइंस फाउंडेशन (2018A030310586) द्वारा समर्थित किया गया था, 2020A1515010989), गुआंगदोंग प्रांत के मेडिकल साइंटिफिक रिसर्च फाउंडेशन (A2019405), नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (८१७७२९५७), विज्ञान और चीन में गुआंगदोंग प्रांत के प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (2017B030301016), और शेनझेन के उद्योग और सूचना प्रौद्योगिकी फाउंडेशन (२०१८०३०९१००१३५८६०) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
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