Summary
I detta protokoll presenterar vi en experimentell design med hjälp av en villkorlig knockdown system och en anpassad sfär bilda analys att studera effekten av clusterin på stemness av patient-härledda GCSCs. Protokollet kan enkelt anpassas för att studera både in vitro- och in vivo-funktion hos stemness-associerade gener i olika typer av CSC.
Abstract
Cancer stamceller (CSCs) är inblandade i tumör initiering, utveckling och återkommande efter behandling, och har blivit i centrum för uppmärksamheten i många studier under de senaste decennierna. Därför är det viktigt att utveckla metoder för att undersöka vilken roll viktiga gener som är involverade i cancercellstamhet. Magsäckscancer (GC) är en av de vanligaste och dödliga typerna av cancer. Gastric cancer stamceller (GCS) tros vara roten till magcancer återfall, metastasering och läkemedelsresistens. Förstå GCSCs biologi behövs för att främja utvecklingen av riktade terapier och så småningom för att minska dödligheten bland patienter. I detta protokoll presenterar vi en experimentell design med hjälp av en villkorlig knockdown system och en anpassad sfär bilda analys att studera effekten av clusterin på stemness av patient-härledda GCSCs. Protokollet kan enkelt anpassas för att studera både in vitro- och in vivo-funktion hos stemness-associerade gener i olika typer av CSC.
Introduction
Magsäckscancer (GC) är en av de vanligaste och dödligaste typerna av cancer1. Trots framsteg inom kombinerad kirurgi, kemoterapi och strålbehandling i GC terapi, prognosen är fortfarande dålig och den femåriga överlevnaden är fortfarande mycket låg2. Återkommande och metastasering är de främsta orsakerna orsaka de efter behandling dödsfall.
Cancer stamceller (CSCs) är en delmängd av cancerceller som har förmågan att själv förnya och generera de olika cell härstamningar som rekonstrueratumören 3. CSCs tros vara ansvarig för cancer återfall och metastasering på grund av deras förmåga att självförnyelse och sådd nya tumörer, liksom deras motståndskraft mot traditionella cellgifter- och radioterapier4. Därför, inriktning CSCs och eliminering av CSCs ger en spännande potential att förbättra behandlingen och minska dödligheten hos cancerpatienter.
CSCs har isolerats från många typer av solida tumörer5. Under 2009, magcancer stamceller (GCS) isolerade från mänskliga magcancer cellinjer beskrevs ursprungligen av Takaishi et al.6. Chen och kollegor först identifierade och renas GCSCs från mänskliga mag adenokarcinom (GAC) tumör vävnader7. Dessa resultat inte bara ger en möjlighet att studera GCSCs biologi men också ge stor klinisk betydelse.
Ett särskilt kännetecken för CSCs är deras kapacitet att bilda en sfär8. Enstaka celler är pläterade i nonadherent förhållanden vid låg densitet, och endast de celler som besatt med självförnyelse kan växa till en solid, sfäriska kluster som kallas en sfär. Således, sfären formation assay har betraktats som den guldmyntfoten analysen och allmänt används för att utvärdera stamceller självförnyelse potential in vitro.
RNA-interferens (RNAi) är ett kraftfullt forskningsverktyg för att studera genfunktionen genom att en specifik gen9slår ned . Men långsiktiga stabila gen knockdown teknik har vissa begränsningar, såsom utmaningen att utforska funktionen av en gen som är avgörande för cellens överlevnad. Villkorliga RNAi-system kan vara användbara för nedreglering av önskade gener på ett tidsmässigt och/eller särskilt kontrollerat sätt genom administrering av ett inducerande medel. De tetracyklin (Tet)-inducible system är en av de mest använda villkorliga RNAi system10. De Tet-inducible systemen kan framkalla målgenen ljuddämpning genom att kontrollera uttrycket av shRNA vid tillsats av en exogen inducerare (företrädesvis doxycyklin, Dox). De Tet-inducerbara systemen kan delas upp i två typer: Tet-On- eller Tet-Off-system. Uttrycket av shRNA kan slås på (Tet-On) eller stängas av (Tet-Off) i närvaro av induceraren. I Tet-ON-systemet utan inducerare binder den constitutively uttryckta Tet repressor (TetR) till Tet-responsive element (TRE) sekvens som innehåller en Tet-lyhörd Pol III-beroende promotor för shRNA-uttryck, vilket förtränger uttrycket av shRNA. Även vid tillägg av Dox, är TetR bindas bort från Tet-lyhörd Pol III-beroende promotorn. Detta underlättar uttrycket av shRNA och leder till gen knockdown.
Det protokoll som beskrivs här använder ett funktionellt tetracyklin-inducerbart shRNA-system och en anpassad sfärbildningsanalys för att studera funktionen av clusterin i patient-derived GCSCs. Clusterin har identifierats som en ny nyckelmolekyl för att upprätthålla STEMCS stemness och överlevnad i en tidigare studie11. Vi använder det beskrivna protokollet för att studera effekterna av clusterin i GCS:er självförnyelse. Denna metod är även tillämplig på andra typer av cancerstamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment med hjälp av patient-derived gastric cancer stamceller som beskrivs häri godkändes av den lokala etiska kommittén7.
1. Magcancer stamcellskultur
- Förberedelse av GCSCs komplett odlingsmedium
- Förbered GCS:er komplett odlingsmedium genom att tillsätta färskt DME/F12-medium med följande väsentliga ingredienser: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% Insulin/Transferrin/Sodium selenit, 0,2% glukos, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% Icke-essentiell aminosyra, 10 μM 2-merkaptoanol, 0,75 mg/mL NaHCO3, 10 μM thioglycerol, 100 IU/mL penicillin och 100 μg/mL streptomycin. Filtrera och sterilisera med hjälp av ett 0,22 μm filter.
OBS: GCSCs komplett odlingsmedium rekommenderas lagras helst inte mer än två veckor vid 4 °C.
- Förbered GCS:er komplett odlingsmedium genom att tillsätta färskt DME/F12-medium med följande väsentliga ingredienser: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% Insulin/Transferrin/Sodium selenit, 0,2% glukos, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% Icke-essentiell aminosyra, 10 μM 2-merkaptoanol, 0,75 mg/mL NaHCO3, 10 μM thioglycerol, 100 IU/mL penicillin och 100 μg/mL streptomycin. Filtrera och sterilisera med hjälp av ett 0,22 μm filter.
- Återvinning av GCSE och kultur
OBS: GCSCs erhölls enligt följande: Tumörprover utsattes för mekanisk och enzymatisk dissociation. Encell suspensioner erhölls genom filtrering med nylon netto från väl utspridda suspension. De resulterande cancercellerna odlades i GCSCs Complete Culture Medium, och vissa celler växte till att bilda sfärer. Dessa sfärer var sedan utsätts för enzymatiska dissociation, och GCSCs kan erhållas genom cytofluormetrisk sortering av cellen befolkningen färgas med CD44/CD54 markörer. Det detaljerade protokollet och funktionella assays av GCSCs har rapporterats7.- Förvarvt GCSCs komplett odlingsmedium vid 37 °C i högst 30 min.
- Avfrostning av GCSE från lagring av flytande kväve och snabbt tina kryoialer i ett 37 °C-vattenbad. Fortsätt att snurra injektionsflaskan tills hela halten smälter helt.
OBS: Tina frusna celler snabbt (<1 min) i ett 37 °C vattenbad. - Överför hela innehållet i kryoialerna till ett 15 mL centrifugrör som innehåller 10 mL GCS komplett odlingsmedium. Centrifugera vid 800 x g i 5 min vid RT.
- Aspirera supernatanten försiktigt och dra in cellpelletsen i 10 mL färska GCSCs komplett medium. Platta cellupphängningen i en 100 mm Petriskål. Inkubera plattan vid 37 °C i en 5% CO2 inkubator och tillsätt 5 mL färskt komplett medium den tredje dagen.
- Subkultur av GCS-tumörsfärer
OBS: GCSCs av tumorspheres centrum har bara tillräckliga näringsämnen innan sfärerna storlek växer upp till 80-100 μm i diameter. När mörka och låga refraktivitetssfärer uppträder (ca 6 dagars kultur), är det nödvändigt att subkultur tumörsfärerna.- Skaka skålen försiktigt och överför GCS tumörsfären kultur medium (mediet och icke-anhängare tumorspheres) i en steril 15 mL centrifug röret. För större mellanvolymer kan större centrifugrör behövas.
- Centrifugera vid 600 x g i 5 min och kassera försiktigt supernatanten. Efter centrifugeringen kommer en off-white pellet att synas.
- Tillsätt 2 mL cell dissociation lösning till resuspend pelleten för mekanisk och enzymatisk dissociation vid 37 °C. Försiktigt pipet upp och ner 10 gånger varje 2-3 min i matsmältningen förfarandet för att bryta sfärerna isär tills tumorspheres är spridda i encells suspension. Denna totala dissociation processen rekommenderas att vara mindre än 15 min.
OBS: Gör en visuell kontroll under mikroskopet för att bekräfta att inga stora sfärer eller cellaggregat finns kvar. - Lägg till 10 mL färsk förvarad GCSCs komplett odlingsmedium (5x volymen av cellens lossnar lösning) för att avsluta matsmältningen förfarande och centrifug vid 800 x g vid RT för 5 min.
- Kassera supernatant och resuspend cellerna med 1 mL av färsk förvärvda GCS komplett odlingsmedium. Utsäde ett lämpligt antal celler i en ny 100 mm Petri-skålen med 10 mL färsk förvrevd GCS komplett odlingsmedium och inkubera vid 37 °C, 5% CO2.
- Refeed tumorspheres kulturer efter 3 dagar genom att lägga till 5 mL av färska förvösa komplett medium. Efter 6 dagar, passageceller när tumorspheres växer upp till 80-100 μm i diameter.
- Kryobevaring av GCS
OBS: Cryopreserve GCS celler genom att lägga medium till tumorspheres direkt. GCSCs tumorspheres bör smältas in i singelceller, så att cellskyddsmedel kunde skriva in varje cell för att se till den långsiktiga stabila lagringen av celler. Se till att cellerna är i hälsosam situation och utan kontaminering.- Harvest GCS tumörsfärer. Centrifug vid 600 x g i 5 min.
- Kassera supernatanten och tillsätt 2 mL av cell dissociation lösning att dissociate GCSCs tumorspheres vid 37 °C. Avsluta digestion proceduren genom att lägga till 10 mL av GCS komplett odlingsmedium.
- Centrifugera i 800 x g i 5 min och samla ihop enstaka GCSE.
- Dra försiktigt in GCSC:er med serumfritt cryopreservativt medium. Den rekommenderade slutliga koncentrationen är 5 x 105 - 5 x 106 celler/mL.
- Dispensera cellen suspension i 1 mL alikvoter i markerade kryogena injektionsflaska.
- Placera omedelbart cryovialsna som innehåller cellerna i en isopropanolkammare och förvara dem vid -80 °C. Överför injektionsflaskan till flytande kväve följande dag för långtidsförvaring.
2. Generering av inducerbara linjer för nedslagning av GCS
VARNING: Rekombinanta lentivirus har utsetts till nivå 2 organismer av National Institute of Health och Center for Disease Control. Arbete som involverar lentivirus kräver underhåll av en biosäkerhetsnivå 2-anläggning, med tanke på att de virala supernatanter som produceras av dessa lentiviralsystem kan innehålla potentiellt riskfyllt rekombinant virus.
- Generering av lentiviruspartiklar
- Synthesize 2 lentiviral vektorer som bär inducerbara shRNA inriktning mänskliga clusterin och en icke-inriktning kontroll lentiviral vektor (GV307) från GeneChem baserat på utformningen av tabell 1 (GV307 vektor innehåller: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin).
- Frö 4 x 106 293T lenti-viral förpackning celler i en 100 mm Petriskål med 10 mL DMEM kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum.
- Inkubera 293T-celler över natten vid 37 °C, 5%CO 2. Se till att 293T celltäthet är ca 50-80% konfluent dagen för transfection.
- För det reducerade serummediet till rumstemperatur och förbered tub A och rör B enligt beskrivningen i tabell 2.
- Överför Rör A till rör B, blanda väl, och inkubera komplexen i 20 min vid rumstemperatur för att förbereda lipid-DNA-komplex.
- Ta bort 5 mL medium, innan du lägger lipid-DNA-komplex, lämnar totalt 5 mL.
- Tillsätt 5 mL lipid-DNA-komplex i kultur skålen dropwise och försiktigt snurra skålen för att fördela komplexet.
OBS: Dosera försiktigt vätska mot diskväggen för att undvika störande 293T-celler. - Inkubera odlingsfatet i 24 h vid 37 °C, 5% CO2.
- Efter 24 timmar efter transfection, försiktigt ta bort transfection mediet och försiktigt ersätta med 10 mL förv ärd DMEM kompletteras med 10% FBS. Inkubera i 24 h vid 37 °C, 5% CO2.
OBS: Alla supernatant och tips ska behandlas med 10% blekmedel före kassering. - Ungefär efter 48 timmar efter transfection, skörd 10 mL av lentivirus-innehållande supernatanter.
OBS: Alla cellodlingskärl och tips ska behandlas med 10 % blekmedel före kassering. - Filtrera lentiviralsuptanten med hjälp av ett 0,45 μm-porfilter för att avlägsna cellulärt skräp.
OBS: Alla filter och sprutor ska behandlas med 10 % blekmedel före kassering. - Överför förtydligad supernatant till en steril behållare, tillsätt Lenti-X Concentrator (1/3 volym av förtydligad supernatant) för att blanda genom mild inversion.
- Inkubera blandning vid 4 °C över natten.
- Centrifugeraxpelsem vid 1 500 x g i 45 min vid 4 °C. Efter centrifugeringen, och off-white pellet kommer att vara synlig. Ta försiktigt bort supernatant, var noga med att inte störa pelleten.
OBS: Alla supernatant och tips ska behandlas med 10% blekmedel före kassering. - Försiktigt resuspend pelleten i 1 mL av DMEM kompletteras med 10% FBS som virus lager, lagra vid -80 °C.
- Generering av stabila transfekterade cellinjer
- Frö 6 x 106 GCSCs till en 100 mm Petriskål med 10 mL DMEM kompletteras med 10% FBS för 24 h vid 37 °C, 5% CO2 (70-80% sammanflödet före infektion).
- Aspirera mediet i skålen, tillsätt de koncentrerade lentiviral partiklarna utspädda med 4 mL komplett DMEM-medium som innehåller polybrene reagens (5 μg/mL) i skålen. Inkubera i 18 h vid 37 °C, 5% CO2.
OBS: Den optimala koncentrationen av polybrene beror på celltyp och kan behöva testas i olika koncentrationer för att bestämma de effektiva koncentrationerna. Annars kan det vara empiriskt bestämt, vanligtvis i intervallet 2-10 μg/mL. Alla rör och tips ska behandlas med 10% blekmedel före bortskaffande. - Byt medium, ersätt med 10 mL DMEM med 10% FBS medium och inkubera i 24 h vid 37 °C, 5% CO2.
OBS: Allt medium och spetsarna ska behandlas med 10 % blekmedel före kassering. - Aspirera supernatanten med cellskräp, ersätt med färskt DMEM kompletterat med 10% FBS medium som innehåller puromycin (2,5 μg/mL) och inkubera i 24 h vid 37 °C, 5% CO2. Byt sedan ut färsk DMEM kompletterad med 10% FBS medium som innehåller puromycin (5 μg/mL) och inkubera vid 37 °C, 5%CO 2 för ytterligare 24 h.
- Skölj de vidhäftande GCS två gånger med 5 mL DPBS utan kalcium och magnesium.
- Dissociate GCSCs med 1 mL för-värmd cell dissociation lösning och inkubera 2-3 min vid 37 °C.
- Lägg till 5 mL färska förvärvda GCS komplett odlingsmedium till cellen suspension.
- Dispensera 3 mL i ett centrifugalrör på 15 mL (rör A) för kryokonservering av cellerna, och de övriga 3 mL till ett centrifugalrör på 15 mL (rör B) för inducering genom doxycyklin.
- Centrifugeringsrör A och tub B vid 800 x g i 5 min.
- Resuspend pelleten av röret A med 1 mL serumfritt kryokonserverande medium, överför injektionsflaskan till -80 °C över natten, och avlägsna den till lagring av flytande kväve.
- Aspirera supernatanten och resuspend cellerna av röret B i 1 mL av färsk förvösas GCS komplett odlingsmedium. Utsäde ett lämpligt antal celler i en ny 100 mm Petriskål av 10 mL färska förvättade GCS komplett odlingsmedium med doxycyklin (Dox) (2,5 μg/mL) och inkubera i 48 h vid 37 °C, 5% CO2.
OBS: Den optimala koncentrationen av Dox kan variera mellan cellinjerna. Varje cellinje ska testas i olika Dox-koncentrationer för att bestämma de effektiva koncentrationerna för KD och för toxicitet på cellerna. - Bekräfta stabilt förtryck av clusterin i GCSCs av västra blotting.
3. Analys av sfärbildning
- Tina de frysta inducerbara linjerna för nedslagsbara GCS(se steg 1.2).
- Bestäm viabla celltätheten hos ett 10 μL-prov med hjälp av en Automated Cell Counter.
- Justera volymen med färdigvarma GCS-komplett odlingsmedium för att få en koncentration på 2 x 104 livskraftiga celler/mL.
- Dispensera i 3 nya 96-väl ultra-låg-fastsättning kultur plattan brunnar (0,1 mL / well) varje grupp.
- Inkubera cellerna i en inkubator vid 37 °C med 5% CO2. Sfärbildning bör ske inom 3-10 dagar. Övervaka och registrera visualisering av tumorspheres bildning var 2 dagar.
OBS: Mediet rekommenderas inte att ändras vid någon störning av tumörsfärernas bildning. Dessa tumorspheres bör lätt skiljas från singel och aggregerade celler. - Bestäm tumorsphere bildning resultat genom att utvärdera storleken på de bildade tumorspheres med hjälp av bildbehandling programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Magcancer stamceller från primära mänskliga mag adenocarcinom odlades i serum-fri kultur medium. Efter 6 dagar expanderade celler från den encelliga fenotypen (bild 1A) för att bilda stora sfärer (Bild 1B).
För att bedöma funktionen av clusterin i GCS, shRNA sekvenser mot clusterin och förvrängd var klonade till Tet-GV307-RFP-Puro vektor efter det protokoll som beskrivs ovan. GCSCs har blivit stably transfekterade med en tetracyklin-reglerad shRNA-clusterin uttryck vektor genererades och sedan behandlas med doxycyklin för 48 h (Figur 2) (och shRNA kodade som en kontroll). Uttrycksnivån för clusterin verifierades av Western blot och därefter kvantifieras av densitometri (Figur 3).
Analysen av sfärbildningen användes för att testa GCS:s självförnyelsepotential. Vi hypotetiska att clusterin främjar självförnyelse potential av GCS, och därför färre sfärer bör observeras när clusterin är nedreglerad genom tillsats av doxycyklin. Vi visade att förekomsten av doxycyklin och knockdown av clusterin i GCSCs hämmade tumörsfärbildning (Figur 4). Cell-/sfärstorlekarna på GCS:er ökade inte när clusterin minskades i GCSC (Bild 5). Ingen hämning av tumörsfärbildning observerades med GCS:er som transduceds med de förvrängda shRNA-kontrollerna, vilket indikerar att doxycyklin inte hade någon hämmande effekt på tumörsfärbildningen (Figur 5). Dessa resultat föreslog att efter clusterin ljuddämpning, GCSS växa långsamt och kan inte bilda tumorspheres. Baserat på in vitro-data, spelar clusterin en avgörande roll för att främja självförnyelse aktivitet GCS, vilket tyder på att clusterin kan vara ett lovande läkemedel mål i undertrycka CSCs i GC patienter.
Figur 1: Cellkulturer av magcancerstamceller. Single cell kulturer av magcancer stamceller odlades i 6 dagar. Faskontrast mikroskopiska bilder av dessa celler/sfärer togs på dag 0 (A) och dag 6 (B). Original förstoring: 10x. Bar storlek: 20 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: VillkorligT KD av clusterin-uttryck i gastrisk cancer stamceller. GCS-linjer etablerades genom att angripa lentiviral inducerad shRNA-kontroll (shCtrl) eller inducerbara shRNA-inriktning på clusterin (shClu1, shClu2). Dessa cellinjer behandlades med (Dox+) eller utan Dox (2,5 μg/mL) (Dox-) i 48 h enligt vad som noterats. Faskontrast observation av dessa celler visades i topppanelen. Immunofluorescerande observation (röd) av dessa celler visades i botten panel. Original förstoring: 10x. Bar storlek: 20 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Clusterins uttryck i inducerbara linjer för nedslagsfört nedslag gcs med eller utan Dox- behandling. Western blotting analys av clusterin uttryck i cellinjer stably transfected med tetracyklin-reglerad shRNA-clusterin (shClu1, shClu2) och förvrängd (shCtrl) uttryck vektor efter 2 dagar av doxycyklin behandling. Det relativa uttrycksnivån för clusterin kvantifierades av densitometri och normaliserades mot β-aktin, då angavs under körfälten i Western blots. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Faskontrast mikroskopiska bilder av inducerbara knockdown GCS celler/sfärer. Encell av inducible knockdown GCS linjer inkuberades och behandlas utan Dox (topppanelen) eller med Dox (botten panel) i 6 dagar. Faskontrast mikroskopiska bilder av dessa celler/sfärer togs på dag 6 som anges. Original förstoring: 10x. Skala bar, 20 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Inducerbar knockdown av Clusterin hämmar GCSC självförnyelse kapacitet. Sfärbildning assays utfördes i den inducerbara knockdown GCS linjer. Faskontrast mikroskopiska bilder av dessa celler/sfärer togs vid den angivna dagen, och cellen/sfären storlekar av GCS mättes. n>30, ± standardfel av medelvärde (SEM). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Namn på Gene | Arter | Gen-ID | Inriktningssekvens |
| CLU-1 | Mänskliga | 1191 | TGAAACAGACCTGCATGAA |
| CLU-2 | Mänskliga | 1191 | GGGAAGTAAGTACGTCAAT |
Tabell 1: Två inriktningssekvenser för SHRNA mot clusterin.
| Komponent | Volym |
| Rör A | |
| Minskat Serum Medium | 1,5 mL |
| Reagens för transfection | 41 μL |
| Rör B | |
| Minskat Serum Medium | 1,5 mL |
| P3000 Enhancer Reagent | 35 μL |
| pHelper 1,0 (gag/ pol komponent) | 9 μg |
| pHelper 2.0 (VSVG-komponent) | 6 μg |
| shCLU 1/2 eller kontroll plasmid | 12 μg |
Tabell 2: Skala av viral produktion med hjälp av transfection.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GC är den tredje vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i världen. GCSCs är kritiska i magcancer återfall, metastasering och läkemedelsresistens. Använda GCSE från magcancerpatienter kommer att tillåta oss att utforska deras svaga punkt och utveckla inriktning läkemedel för behandling av GC patienter.
Den sfärbildningsanalys är en användbar metod för att undersöka cancerstamcell självförnyelse potential in vitro. Resultat kan presenteras som andelen sfärer som bildas dividerat med det ursprungliga antalet enstaka celler sådd. Vi anpassade den ursprungliga metoden för att beräkna medelstorlekarna för alla celler/sfärer vid flera tidpunkter för att förbättra resultaten av denna analys och för att underlätta dess reproducerbarhet för andra typer av cancerstamceller. Vi intygade att resultatet i denna analys är mycket beroende av antalet av de ursprungliga seedade cellerna. Detta är en kritisk punkt i denna analys för att upprätthålla inledande cellisolering och göra en noggrann mätning av antalet sfäriska kolonier (exklusive cellulära aggregeringar). Dessutom är det viktigt att optimera räknetiden för att tydligt skilja sfärerna från cellulära aggregeringar och enstaka celler.
Tet-inducerbara system är till hjälp för att studera funktionen av gener som är avgörande för cellernas överlevnad in vitro, precis som clusterin i detta protokoll. De är också användbara för funktionell utforskning av gener in vivo; detta kan göras genom att lägga doxycyklin i djurens dricksvatten. Men, läckande i det oinducerade tillstånd är ett ofta rapporterat problem av de Tet-inducerbarasystemen 12. I det presenterade experimentet observeras också en låg nivå av läckage med shClu2, som visas i figur 3. I detta fall kan vi noggrant jämföra förändringarna av målprotein i KD eller scrambled kontroll detekteras i närvaro och avsaknad av doxycyklin för att bedöma denna effekt. En annan viktig punkt är mängden doxycyklin tillämpas i kulturen. Eftersom mängden Dox kan variera mellan cellinjerna, bör varje cellinje testas med olika Dox doseringar för att bestämma de effektiva koncentrationerna för KD och för toxicitet på cellerna.
Det protokoll som presenteras här ger en effektiv teknik för att dechiffrera stemness-relaterade gener CSCs och studera CSCs biologi. Protokollet kan enkelt anpassas för att studera andra kritiska geners funktioner i cancerstamceller, såsom stemness och överlevnad. Dessutom är den villkorliga knockdown av genuttryck i CSCs genomförbart att studera de biologiska funktionerna i målgener inte bara in vitro utan också in vivo. Men bara vissa CSCs får inte bilda fasta, typiska tumorspheres, detta protokoll bör anpassas genom att använda andra metoder för att undersöka cancer stamceller självförnyande potential in vitro, till exempel undersöka uttryck för stamhet-relaterade markörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklarerade.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Nature Science Foundation i Guangdong-provinsen (2018A030310586, 2020A1515010989), den medicinska vetenskapliga forskningsstiftelsen i Provinsen Guangdong (A2019405), Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (81772957), vetenskapsstiftelsen och teknikprogram i Guangdong-provinsen i Kina (2017B030301016), och Industry and Information Technology Foundation of Shenzhen (20180309100135860).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (1), 7-30 (2016).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Pützer, B. M., Solanki, M., Herchenröder, O. Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).
- Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope. Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).
- Takaishi, S., et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44. Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).
- Chen, T., et al. Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients. Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Hannon, G. J., Rossi, J. J. Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).
- Seibler, J., et al. Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system. Nucleic Acids Research. 35 (7), e54 (2007).
- Xiong, J., et al. Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function. International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).
- Ohkawa, J., Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).
