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Biology

क्रोमाग्नोन का उपयोग करके सुपर-रिज़ॉल्यूशन बायोलॉजिकल इमेजिंग के युग में 3डी रंगीन बदलावों का उच्च सटीकता सुधार

Published: June 16, 2020 doi: 10.3791/60800
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 1,2
1Advanced ICT Research Institute Kobe, National Institute of Information and Communications Technology, 2Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 3Micron Advanced Bioimaging Unit, Department of Biochemistry, University of Oxford

Summary

मात्रात्मक डेटा विश्लेषण के लिए त्रि-आयामी (3 डी) बहुरंगी फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों में रंगीन बदलावों का सुधार महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल उपयुक्त संदर्भ छवियों के अधिग्रहण और ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर, क्रोमाग्ननके साथ प्रसंस्करण के माध्यम से जैविक नमूनों में रंगीन बदलावों को मापने और सही करने के लिए विकसित किया गया है।

Abstract

मात्रात्मक मल्टीकलर फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी विभिन्न तरंगदैर्ध्य पर अधिग्रहीत रंग चैनलों के सावधान स्थानिक मिलान पर निर्भर करता है। रंगीन विचलन और कैमरों के अपूर्ण संरेखण के कारण, प्रत्येक चैनल में अधिग्रहीत छवियों को स्थानांतरित किया जा सकता है, और बढ़ाया जा सकता है, साथ ही तीन आयामों में से किसी में एक दूसरे के सापेक्ष घुमाया जा सकता है। शास्त्रीय अंशांकन विधि के साथ, रंगीन बदलाव ों को कवरस्लिप की सतह से जुड़े बहुरंगी मोतियों द्वारा मापा जाता है, और इस तरह के अंशांकन नमूनों से रंगीन बदलावों को मापने के लिए कई सॉफ्टवेयर उपलब्ध हैं। हालांकि, रंगीन विपथन गहराई के साथ भिन्न हो सकता है, अवलोकन स्थितियों के साथ बदल सकता है और जैविक नमूने द्वारा ही प्रेरित किया जा सकता है, इस प्रकार ब्याज के नमूने में और मात्रा में रंगीन बदलाव की सही मात्रा के निर्धारण में बाधा डालता है। उच्च सटीकता पर रंगीन बदलाव को ठीक करना सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है जहां केवल मामूली रंगीन बदलाव मात्रात्मक विश्लेषणों को प्रभावित कर सकते हैं और बहुरंगी छवियों की व्याख्या को बदल सकते हैं। हमने जैविक नमूनों में 3डी रंगीन बदलावों को मापने और सही करने के लिए एक ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर क्रोमाग्नोन और साथ के तरीके विकसित किए हैं। यहां हम एक विस्तृत आवेदन प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जिसमें ब्याज के जैविक नमूनों में रंगीन बदलाव को मापने के लिए नमूना तैयार करने, डेटा अधिग्रहण और सॉफ्टवेयर प्रसंस्करण के लिए विशेष आवश्यकताएं शामिल हैं।

Introduction

मल्टीकलर इमेजिंग जैविक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के मूलभूत पहलुओं में से एक है, ऐसे मामलों में जहां विभिन्न अणुओं या संरचनाओं का स्थानिक संबंध प्रमुख रुचि का है। रंगीन विपथन, फैलाव के कारण पॉलीक्रोमैटिक प्रकाश का एक ऑप्टिकल विपथन, ब्याज की रंगीन वस्तुओं की स्पष्ट स्थिति को बदलता है। इसी तरह, प्रत्येक रंग प्राप्त करने के लिए समर्पित कई कैमरों से लैस माइक्रोस्कोप में ऑप्टिकल तत्वों में अंतर और चैनलों के बीच अपूर्ण संरेखण के कारण अधिक जटिल रंगीन बदलाव होते हैं। इस प्रकार, इस तरह के रंगीन बदलाव एक झूठे निष्कर्ष का कारण बन सकते हैं जब तक कि उपयोगकर्ता द्वारा स्पष्ट रूप से सही न किया जाए। हालांकि रंगीन बदलाव एक बड़ी समस्या के रूप में लंबे समय के रूप में माइक्रोस्कोपी के समाधान शास्त्रीय संकल्प सीमा से सीमित है नहीं किया गया है, सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी1 के हाल के विकास रंगीन बदलाव के अधिक सटीक सुधार के लिए की जरूरत के लिए प्रेरित किया है ।

मल्टीकलर मनका अंशांकन स्लाइड2का उपयोग करके माइक्रोस्कोप प्रणालियों के रंगीन बदलावों को मापना एक आम प्रथा रही है । मनका आधारित अंशांकन विधि कवरस्लिप2की सतह की ओर माइक्रोस्कोप के पूरे प्रकाशिकी से रंगीन बदलाव को मापने के लिए उपयुक्त है। हालांकि, यह विधि ब्याज के जैविक नमूनों में रंगीन बदलावों को मापने में असमर्थ है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कई जैविक नमूने त्रि-आयामी (3 डी) हैं, और ऐसे नमूनों की रंगीन बदलाव कवरस्लिप की सतह पर उन लोगों से अलग हैं। इसके अलावा, रंगीन बदलाव इमेजिंग स्थितियों2, 3,के साथ बदलजातेहैं । हमने 3 डी जैविक नमूनों में रंगीन बदलावों को मापा है और पाया कि शास्त्रीय बहुरंगी-मनका अंशांकन विधि 3 द्वारा रंगीन बदलावों की अनिश्चितता अक्सर350एनएम थी। इसलिए, रंगीन बदलावों को जैविक नमूनों में ब्याज की गहराई पर और इमेजिंग स्थितियों के तहत मापा जाना चाहिए।

यहां, हम जैविक नमूनों में रंगीन बदलाव को मापने और हमारे सॉफ्टवेयर, क्रोमाग्नन3का उपयोग करके इन बदलावों को सही करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। जैविक नमूनों में रंगीन बदलाव को मापने के लिए, हमारी विधि दो प्रकार के डेटा सेट, एक "लक्ष्य" छवि और "संदर्भ" छवि का उपयोग करती है। "लक्ष्य" छवि ब्याज की एक बहुरंगी छवि है, उदाहरण के लिए, डीएनए, परमाणु लिफाफे और माइक्रोट्यूबल्स के लिए दाग वाली छवियां। ऐसी छवि में रंगीन बदलावों को मापना अक्सर असंभव होता है। इसलिए, हमें एक "संदर्भ" छवि की आवश्यकता है जो नमूने में रंगीन बदलावों को मापने के लिए समर्पित है। "संदर्भ" छवि की एकमात्र परिभाषा एक ही वस्तु की बहुरंगी छवि है। इस अर्थ में, एक बहुरंगी मोती छवि भी संदर्भ छवि का एक प्रकार है। यहां, हम तीन अलग-अलग प्रकार की संदर्भ छवि का वर्णन करते हैं जिनका उपयोग जैविक नमूनों में रंगीन बदलावों को मापने के लिए किया जाता है: "क्रॉसटॉक संदर्भ छवियां", "उज्ज्वल क्षेत्र संदर्भ छवियां" और "जैविक अंशांकन संदर्भ छवियां"। संदर्भ छवि का प्रकार माइक्रोस्कोप के प्रकार या तालिका 1में संक्षेप के रूप में आवश्यक सुधार सटीकता पर निर्भर करता है।

क्रॉसटॉक ब्राइट-फील्ड जैविक अंशांकन (एक अलग स्लाइड पर) जैविक अंशांकन (एक ही स्लाइड पर)
सटीकताएक +++ + ++बी +++
सादगी ++ +++ ++ ++
लागू माइक्रोस्कोपी वाइड-फील्ड वाइड-फील्ड सभी सभी
स्थानीय संरेखण की उपलब्धता + + -ग -ग
ए:"+" की संख्या बढ़ती रेटिंग को इंगित करती है। सिंगल प्लस 50 एनएम के बारे में है और थ्री प्लस 3डी में करीब 15 एनएम है।
ख:सटीकता इस बात पर निर्भर करती है कि वेरिएबल इमेजिंग की स्थिति कितनी स्थिर रखी जाती है।
ग:मल्टीकलर मनका नमूनों द्वारा मापा स्थानीय अंशांकन प्रोटोकॉल धारा 4 में वर्णित के रूप में जोड़ा जा सकता है ।

तालिका 1: संदर्भ छवियों के प्रकार का चयन करते समय पैरामीटर।

"क्रॉसटॉक संदर्भ छवियों" में उच्चतम सुधार सटीकता है और3,,4 (तालिका 1)को पूरा करने के लिए अपेक्षाकृत सरल हैं। दोष उत्तेजन पथों में रंगीन बदलाव को मापने की उनकी अक्षमता के कारण माइक्रोस्कोपी अनुप्रयोगों में उनकी सीमा है । इसके अलावा, ऐसी छवियों को प्राप्त करने के लिए, माइक्रोस्कोप को मल्टीबैंड डिक्रोइक दर्पण और उत्सर्जन फिल्टर से लैस किया जाना चाहिए जो स्वतंत्र रूप से उत्तेजन फिल्टर या प्रकाश स्रोतों से नियंत्रित होते हैं। उपयुक्त माइक्रोस्कोपी में पारंपरिक वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी, एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (एसएमएलएम) जैसे फोटो-सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी/स्टोचस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (पाम/स्टॉर्म)5,,6 और विस्तार माइक्रोस्कोपी7 को वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी के साथ मनाया जाता है । लक्ष्य नमूने से ही एक क्रॉसटॉक संदर्भ छवि प्राप्त की जाती है। यह सभी आवश्यक चैनलों में प्राप्त डाई के क्रॉसटॉक (खून के माध्यम से) फ्लोरेसेंस की एक छवि है। फ्लोरेसेंस उत्सर्जन हमेशा लंबी तरंगदैर्ध्य की ओर फैलता है, इसलिए सबसे कम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य वाले रंग लंबे तरंगदैर्ध्य के चैनलों में क्रॉसटॉक फ्लोरेसेंस प्राप्त करने के लिए उत्साहित हैं। उदाहरण के लिए, जब नमूना नीले, हरे और लाल रंग से सना हुआ होता है, तो केवल नीली डाई उत्साहित होती है, और उत्सर्जन प्रकाश नीले, हरे और लाल चैनलों में प्राप्त होता है। इस प्रोटोकॉल में, क्रॉसटॉक फ्लोरेसेंस प्राप्त करने के लिए 4′,6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (डीएपीआई) के साथ डीएनए का उपयोग किया गया था।

"ब्राइट-फील्ड संदर्भ छवियां" "क्रॉसटॉक संदर्भ छवियों" के लिए एक आसान और कम फोटोटॉक्सिक विकल्प हैं, लेकिन कम से कम सटीक3 (तालिका 1)हैं। ये लक्ष्य नमूने की उज्ज्वल क्षेत्र छवियां हैं, जो लक्ष्य छवि में उपयोग किए जाने वाले सभी रंग चैनलों में अधिग्रहीत की गई हैं।

"जैविक अंशांकन संदर्भ छवियों" को उत्तेजन और उत्सर्जन पथ3,,8 (तालिका 1)दोनों में रंगीन बदलावों को मापने की क्षमता के कारण किसी भी प्रकार की माइक्रोस्कोपी पर लागू होने का लाभ होता है। उपयुक्त माइक्रोस्कोपी में वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी शामिल है, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, लाइट शीट माइक्रोस्कोपी, उत्तेजित उत्सर्जन की कमी (एसटीडी)9,संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम)10,एयरिसकन/सोरा11,,12,एसएमएलएम कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) मोड, ओलंपस सुपर रिजॉल्यूशन (ओएसआर)13,और आगे के साथ मनाया गया । एक जैविक अंशांकन संदर्भ छवि एक अंशांकन नमूने से इसी तरह लक्ष्य नमूने के रूप में तैयार से प्राप्त की है, लेकिन कई रंगों के साथ एक ही संरचना के धुंधला के साथ । सुधार सटीकता सबसे सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के संकल्प excels और एक जैविक अंशांकन नमूना तैयार अपेक्षाकृत सरल हो सकता है । एक और लाभ "औसत" कई संदर्भ छवियों की उपलब्धता है। इसलिए, भले ही व्यक्तिगत छवियों में रंगीन बदलावों के माप के लिए खराब जानकारी हो, लेकिन कई छवियों को औसत करके जानकारी सामग्री को बढ़ाया जा सकता है। सटीकता इस बात पर निर्भर करती है कि इमेजिंग की स्थिति कितनी स्थिर रखी जाती है। इस संबंध में, सबसे अच्छा प्रदर्शन तब प्राप्त किया जाता है जब लक्ष्य और संदर्भ दोनों नमूने एक ही स्लाइड पर होते हैं, उदाहरण के लिए, 8-अच्छी तरह से कक्षित कवर चश्मा(टेबल 1,राइट-मोस्ट)। इस प्रोटोकॉल में, एक जैविक अंशांकन के रूप में फालॉइडिन के तीन रंगों के साथ दाग वाले ऐक्टिन का उपयोग किया गया था।

एक बार संदर्भ छवि प्राप्त हो जाने के बाद, फिर रंगीन बदलाव को हमारे सॉफ्टवेयर क्रोमाग्ननद्वारा मापा और सही किया जाता है। चैनलों, जेड वर्गों और समय फ्रेम की संख्या पर कोई सीमा नहीं है कि क्रोमेग्नन रंगीन बदलावों को माप और सही कर सकते हैं। क्रोमेग्नन दो चरणों में रंगीन बदलावों को मापता है। पहला कदम एक्स, वाई, जेड अक्षों, एक्स, वाई, जेड अक्षों के साथ आवर्धन और जेड अक्ष के चारों ओर रोटेशन में अनुवाद के "वैश्विक" या "एफ़िन" संरेखण मापदंडों को प्राप्त करता है। वैश्विक संरेखण की गणना सटीकता 3 डी में ~ 16 एनएम और 2डी में ~ 8 एनएम है। दूसरा कदम एक उच्च सटीकता प्राप्त करने के लिए अनुमानित छवियों पर एक वैकल्पिक 2D पुनरावर्तक "स्थानीय संरेखण" है। स्थानीय संरेखण प्रक्रिया में, छवियों को कई क्षेत्रों में विभाजित किया जाता है और इन स्थानीय क्षेत्रों में रंगीन बदलावों को मापा जाता है। इसके बाद, क्षेत्रों को और विभाजित किया जाता है और उपक्षेत्रों में रंगीन बदलावों को तब तक मापा जाता है जब तक कि क्षेत्र में पिक्सेल की संख्या पिक्सल (आमतौर पर 60 x 60 पिक्सल) की न्यूनतम संख्या तक न पहुंच जाए। परिणामस्वरूप स्थानीय संरेखण मानचित्र को वैश्विक संरेखण पैरामीटर के साथ जोड़ा जाता है और लोचदार परिवर्तन द्वारा लक्ष्य छवि पर लागू किया जाता है। इस चरण के बाद, गणना सटीकता को 3 डी में ~ 14 एनएम और 2डी में ~ 6 एनएम में सुधार किया गया है। स्थानीय संरेखण जैविक अंशांकन संदर्भ छवियों के लिए उपयुक्त नहीं है क्योंकि संदर्भ में जैविक संरचना लक्ष्य(तालिका 1)से अलग है। इसलिए, जैविक अंशांकन संदर्भ छवियों के लिए केवल वैश्विक संरेखण का उपयोग किया जाता है।

स्थानीय रंगीन बदलाव दो स्रोतों से उत्पन्न होते हैं; माइक्रोस्कोप वाद्य स्थानीय विरूपण और जैविक संरचनात्मक इनहोमोजीबिलिटी। क्योंकि माइक्रोस्कोप वाद्य स्थानीय विरूपण स्थिर है, यह बहुरंगी मोती संदर्भ नमूने से मापा जा सकता है और एक निश्चित पैरामीटर के रूप में सही किया जा सकता है। क्रोमाग्नोन माइक्रोस्कोप इंस्ट्रूमेंटल स्थानीय विरूपण मानचित्र और जैविक अंशांकन(तालिका 1)से वैश्विक संरेखण मापदंडों को जोड़ सकता है। इस विधि का उपयोग करके, यह उम्मीद की जाती है कि जैविक अंशांकन की औसत सटीकता में अतिरिक्त 1−2 एनएम द्वारा सुधार किया जाएगा।

यहां, हम अपने सॉफ्टवेयर क्रोमाग्नोनका उपयोग करके 3डी फ्लोरेसेंस छवियों के रंगीन बदलावों को सही करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, सबसे आसान कम अंत से उच्चतम सटीकता तक। हम एक उदाहरण के रूप में हेला कोशिकाओं के इम्यूनोस्टेटिंग का उपयोग करते हैं और उन्हें 3डी वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी और 3डी-सिम का उपयोग करके देखा जाता है। पहले खंड में, हम बताते हैं कि लक्ष्य नमूने और जैविक अंशांकन नमूने कैसे तैयार किए जाएं। प्रोटोकॉल के इस हिस्से को अनुसंधान के विशिष्ट लक्ष्यों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । दूसरे खंड में, हम माइक्रोस्कोप द्वारा तीन प्रकार के संदर्भ छवियों के लिए अधिग्रहण विधियों का वर्णन करते हैं। धारणा नीले, हरे, और लाल चैनल प्राप्त करने के लिए किया गया था, लेकिन चैनल संरचना अनुसंधान के विशिष्ट लक्ष्यों और माइक्रोस्कोप के सेटअप द्वारा संशोधित किया जाना चाहिए । इससे कोई फर्क नहीं पड़ता कि माइक्रोस्कोप एक ही कैमरे या कई कैमरों से लैस है या नहीं। तीसरे खंड में, हम वर्णन करते हैं कि संदर्भ छवियों का उपयोग करके लक्षित छवि के रंगीन बदलावों को मापने और सही करने के लिए हमारे सॉफ़्टवेयर का उपयोग कैसे कर सकते हैं। अंत में, चौथे खंड में, हम माइक्रोस्कोप के वाद्य स्थानीय अंशांकन का उपयोग करके जैविक अंशांकन संदर्भ छवियों को पूरक करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।

Protocol

1. नमूना तैयार करना

  1. एक लक्ष्य नमूना की तैयारी
    1. बीज 2.5 x 105 हेला कोशिकाओं को 35-मिमी ग्लास-बॉटम डिश पर और उन्हें विकास माध्यम के 2 मिलील में विकसित करें (एल-ग्लूटामीन और सोडियम पायरुवेट के साथ दुलबेको का संशोधित ईगल माध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस]] के साथ 37 डिग्री सेल्सियस और 5% की सीओ2 एकाग्रता के साथ पूरक है। वैकल्पिक रूप से, बीज 6 x 104 हेला कोशिकाओं को 8-अच्छी तरह से कक्षित कवरग्लास पर और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर विकास माध्यम के 0.5 एमएल में और 5% की सीओ2 एकाग्रता में विकसित करें। उच्च रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए #1.5 कवरग्लास (0.170 मिमी की मोटाई के साथ) का उपयोग करें।
      नोट: कंटेनर के प्रकार के बावजूद 1.1.5, 1.1.6, 1.1.8, 1.1.11 और 1.2.5 जहां मात्रा 100 माइक्रोन है, को छोड़कर आगे के चरणों के लिए 8-अच्छी तरह से कक्ष कक्षित कवरग्लास के लिए 1/4 वॉल्यूम का उपयोग करें।
    2. लगभग 24 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद, फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 3.7% फॉर्मलडिहाइड के 2 एमएल के साथ समाधान को बदलें। कोमल मिश्रण के बाद, एक रोटेशन मंच पर कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करने के लिए जारी रखें ।
      सावधानी: एक धूम हुड में काम करते हैं।
    3. पीबीएस के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं, एक रोटेशन प्लेटफॉर्म पर 5−10 मिनट के लिए 3x।
      नोट: फॉर्मलडिहाइड कचरे को निपटाने के लिए स्थानीय नियमों का पालन करें।
    4. एक रोटेशन मंच पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स-100 के 2 एमएल के साथ पर्मेबिलाइज कोशिकाओं को, इसके बाद पीबीएस के 2 एमएल के साथ तीन वॉश, प्रत्येक रोटेशन प्लेटफॉर्म पर 5−10 मिनट के लिए।
    5. एक रोटेशन मंच पर आरटी में 1 घंटे के लिए PBS में 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के 100 माइक्रोन में इनक्यूबेट कोशिकाओं।
    6. उचित कमजोर पड़ने पर पीबीएस में 1% बीएसए में प्राथमिक एंटीबॉडी (एंटी-एमेरिन पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी14 और एंटी-ट्यूबलिन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी15)के मिश्रण के 100 माइक्रोन के साथ समाधान को बदलें (एंटी-एमेरिन के लिए 1/500 और एंटी-ट्यूबलिन के लिए 1/100), और रात भर 4 सी पर।
    7. एक रोटेशन मंच पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के 2 एमएल, 3−5x के साथ कोशिकाओं को धोएं।
    8. 1/500 कमजोर पड़ने पर पीबीएस में 1% बीएसए में माध्यमिक एंटीबॉडी (एलेक्सा फ्लोर 488 के साथ एंटी-रैबिट आईजीजी और एलेक्सा फ्लोर 555 के साथ एंटी-माउस आईजीजी) के मिश्रण के 100 माइक्रोन के साथ समाधान को बदलें, और आरटी में 3−4 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
    9. एक रोटेशन मंच पर 5 मिनट के लिए पीबीएस के 2 एमएल, 3−4x के साथ कोशिकाओं को धोएं।
    10. एक रोटेशन मंच पर आरटी में 30 मिनट के लिए डीएनए दाग करने के लिए PBS में 0.5 μg/mL DAPI के 2 ml के साथ समाधान की जगह ।
      नोट: DAPI के बजाय, एक ही एकाग्रता पर Hoechst 33342 भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
    11. समाधान को ~ 100 माइक्रोन के साथ बदलें बढ़ते माध्यम(सामग्री की तालिका)।
  2. जैविक अंशांकन नमूने की तैयारी
    1. चरण 1.1.1−1.1.4 में वर्णित फिक्स्ड सेल तैयार करें।
      नोट: अधिमानतः, नमूने एक कक्ष कवरग्लास पर तैयार किए जाते हैं ताकि लक्ष्य और संदर्भ दोनों नमूनों को एक ही कवरलिप(टेबल 1,राइट-मोस्ट) पर अलग-अलग कक्षों में रखा जा सके। यह तैयारी बेहतर है जब प्रयोग के लिए उच्चतम सुधार सटीकता की आवश्यकता होती है। जब नमूने को नियमित कवरस्लिप पर तैयार करने की आवश्यकता होती है, तो प्रजनन क्षमता का बीमा करने के लिए कम मोटाई भिन्नता ("नंबर 1.5H") के साथ सटीक कवरस्लिप का उपयोग करें।
    2. मेथनॉल के 1.5 एमएल में फ्लोरोसेंट डाई-कंजूज्ड फालॉइडिन का स्टॉक समाधान तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। निम्नलिखित कमजोर पड़ने पर पीबीएस में फालॉइडिन स्टॉक समाधान मिलाएं: एलेक्सा फ्लोर 405 के साथ फालाइडिन के लिए 1/100, एलेक्सा फ्लोर 488 के साथ फालाइडिन के लिए 1/1,000, और एलेक्सा फ्लोर 594 के साथ फालाइडिन के लिए 1/200।
    3. समाधान को चरण 1.2.2 में तैयार फालोइडिन मिश्रण के 1 एमएल के साथ बदलें और रोटेशन प्लेटफॉर्म पर आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. एक रोटेशन मंच पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के 2 एमएल, 3−5x के साथ कोशिकाओं को धोएं।
    5. बढ़ते माध्यम के ~ 100 माइक्रोन के साथ समाधान की जगह।
      नोट: अंशांकन नमूनों को बार-बार उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. संदर्भ छवियों का अधिग्रहण

  1. क्रॉसटॉक संदर्भ छवियां
    1. एक चौड़े क्षेत्र माइक्रोस्कोप पर चरण 1.1 में तैयार लक्ष्य नमूना रखें।
    2. नीले, हरे और लाल चैनलों में लक्ष्य की फ्लोरेसेंस छवि प्राप्त करें।
      नोट: 3D छवियों के लिए, संदर्भ छवि में जेड चरण का आकार लक्ष्य छवि में उससे अलग हो सकता है जब तक कि छवि फ़ाइल में चरण आकार के लिए जानकारी हो। संदर्भ और लक्षित छवियों के लिए जेड चरण का आकार अधिमानतः जेड एक्सिस के ऑप्टिकल रेजोल्यूशन के आधे से भी कम है, जिसकी गणना Equation 1 डिफेक्शन-लिमिटेड माइक्रोस्कोपी के लिए की जाती है, जहां नैनोमीटर में तरंगदैर्ध्य होता है और एनए ऑब्जेक्टिव लेंस का न्यूमेरिकल अपर्चर होता है । NA उदाहरण के लिए, यदि अक्षीय संकल्प 550 एनएम है, तो 275 एनएम से छोटे जेड चरण का उपयोग करें। संदर्भ छवि के लिए कोई समय श्रृंखला की आवश्यकता नहीं है।
    3. इसके बाद, संदर्भ की फ्लोरेसेंस छवि प्राप्त करने के लिए, केवल DAPI के लिए उत्तेजन प्रकाश का चयन करें, और नीले, हरे और लाल चैनलों में प्राप्त करना चुनें। 3 डी स्टैक के मामले में संदर्भ छवि बिल्कुल एक ही चरण की स्थिति और जेड ऊंचाई पर प्राप्त करें।
      नोट: लंबे समय तक उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के लिए, रोशनी की तीव्रता और जोखिम समय में वृद्धि की आवश्यकता होगी।
  2. ब्राइट-फील्ड संदर्भ छवियां
    1. एक चौड़े क्षेत्र माइक्रोस्कोप पर चरण 1.1 में तैयार लक्ष्य नमूना रखें।
    2. नीले, हरे और लाल चैनलों में लक्ष्य की फ्लोरेसेंस छवि प्राप्त करें।
      नोट: जेड चरण आकार अधिमानतः Nyquist कसौटी को पूरा के रूप में कदम 2.1.2 में वर्णित है ।
    3. नीले, हरे और लाल चैनलों में लक्ष्य की एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि प्राप्त करें, जो 2.2.2 में एक ही चरण की स्थिति में है और 3 डी स्टैक के मामले में एक ही जेड ऊंचाई है।
  3. जैविक अंशांकन संदर्भ छवियां
    1. 3डी-सिम माइक्रोस्कोप पर स्टेप 1.1 में तैयार टारगेट सैंपल रखें।
    2. 3डी-सिम द्वारा नीले, हरे और लाल चैनलों में लक्ष्य की फ्लोरेसेंस छवि प्राप्त करें। सुपर-हल छवि का पुनर्निर्माण करें।
      नोट: माइक्रोस्कोप का प्रकार किसी भी प्रकार का हो सकता है जैसे 3डी-सिम, कॉन्फोकल, एसटीईडी आदि। जेड चरण का आकार अधिमानतः 2.1.2 चरण में वर्णित Nyquist कसौटी को पूरा करता है।
    3. 3डी-सिम द्वारा लक्ष्य छवि (चरण 2.3.2) के समान विभिन्न चरण पदों पर चरण 1.2 में तैयार संदर्भ की कई फ्लोरेसेंस छवियों को प्राप्त करें। सुपर-हल छवियों का पुनर्निर्माण करें..
      नोट: XY में पिक्सल की कुल संख्या सभी संदर्भ छवियों में समान होनी चाहिए। जेड में चरण का आकार सभी संदर्भ छवियों में समान होना चाहिए। जेड वर्गों की कुल संख्या को लक्षित छवि में समान होना पसंद किया जाता है, लेकिन यह एक पूर्ण आवश्यकता नहीं है। इन संदर्भ छवियों के लिए मंच पर XY स्थिति कोई फर्क नहीं पड़ता क्योंकि स्थिति या कवरलिप पहले से ही लक्ष्य नमूने की स्थिति से अलग है और इसके अलावा एक ही कवरस्लिप पर रंगीन बदलाव में अंतर 15 एनएम3से कम है । वस्तुनिष्ठ लेंस, अवलोकन तापमान, विसर्जन तेल, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी में पिनहोल आकार, और अत्यधिक इच्छुक रोशनी माइक्रोस्कोपी16में झुकाव कोण सहित इमेजिंग की स्थिति, सभी को सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन के लिए संदर्भ से मेल ना चाहिए। यदि माइक्रोस्कोप एक साथ कई चैनलों को प्राप्त करने के लिए कई कैमरों को सज्जित करता है, तो संदर्भ छवियों को वाद्य बहाव को सही करने के लिए साप्ताहिक रूप से अक्सर प्राप्त किया जाना चाहिए।

3. क्रोमाग्नोन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके रंगीन बदलाव में सुधार

  1. एक वेब ब्राउज़र का उपयोग करना, https://github.com/macronucleus/Chromagnon/releasesपर जाएं, और क्रोमाग्नोनकी नवीनतम बाइनरी रिलीज डाउनलोड करें।
    नोट: बाइनरी रिलीज विंडोज, मैक और कुछ लिनक्स संस्करणों के लिए उपलब्ध हैं।
  2. कार्यक्रम निकालें और एक सुविधाजनक स्थान पर निष्पादन योग्य फ़ाइल डाल दिया। विंडोज या मैक पर इसे खोलने के लिए फ़ाइल पर डबल-क्लिक करें, या फिर लिनक्स सिस्टम पर कमांड लाइन से बाइनरी फ़ाइल को निष्पादित करें।
    नोट: चित्र 1 में ग्राफिकल यूजर इंटरफेस खुलेगा। किसी सुरक्षा कारण के कारण पहली बार डबल क्लिक करके कार्यक्रम को खोलने से रोका जा सकता है। इस मामले में, इंटरनेट से डाउनलोड किए गए कार्यक्रम को खोलने के लिए प्लेटफ़ॉर्म-निर्भर विधि का उपयोग करें।

Figure 1
चित्रा 1: क्रोमाग्नोन ग्राफिकल यूजर इंटरफेस का स्क्रीनशॉट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. एक फ़ाइल चयनकर्ता संवाद खोलने के लिए संदर्भ फ़ाइलों को "संदर्भ बॉक्स"(चित्रा 1)या क्लिक संदर्भ फ़ाइलों (चित्रा 1ए)में खींचें और छोड़ दें। फ़ाइल प्रारूपों के आधार पर, यदि कार्यक्रम जावा डेवलपमेंट किट (जेडीके) स्थापित करने के लिए कहता है, तो हां दबाएं और उपयोगकर्ता को डाउनलोड पृष्ठ पर नेविगेट किया जाएगा। डाउनलोड करें और निर्देश के अनुसार ऑपरेटिंग सिस्टम के लिए जेडीके स्थापित करें। क्रोमाग्नन को कार्यक्रम को फिर से शुरू करने के बाद इमेज फाइल फॉर्मेट को पढ़ने में सक्षम होना चाहिए।
    नोट: क्रोमाग्नन अधिकांश इमेज फाइल प्रारूपों (मल्टीपेज 'टिफ', 'सीजी', 'nd2', 'oib', 'lif', 'dv' आदि) पढ़ सकते हैं। इस चरण में मूल माइक्रोस्कोप छवि प्रारूप को प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि जब किसी इमेज फ़ॉर्मेट को मल्टीपेज टीफ फ़ाइल में परिवर्तित किया जाता है तो मेटाडेटा खो सकता है। यदि चैनल का नाम 528, 609 (चित्रा 2ए,हरे बक्से) जैसे तरंगदैर्ध्य के बजाय 0, 1,2,आदि के रूप में दिखाया गया है, तो क्रोमाग्नॉन छवि में चैनलों की पहचान नहीं जानता है। इस मामले में, यह सुनिश्चित करें कि चैनलों का क्रम और संदर्भ फ़ाइल में पिक्सेल आकार लक्ष्य फ़ाइल में उन लोगों से मेल खाते हैं। उदाहरण के लिए, यदि संदर्भ में चैनलों का क्रम हरा और लाल है, तो लक्ष्य में चैनलों का क्रम भी हरा और लाल होना चाहिए, लेकिन लाल और हरा नहीं।

Figure 2
चित्रा 2: कई फ़ाइलों को लोड करने के लिए उदाहरण स्क्रीनशॉट। (क)एक ऐसा मामला जिसमें सभी संदर्भ छवियों में संबंधित लक्षित छवियां हैं। चैनल नामों को इस उदाहरण में उपयोग की जाने वाली छवि फ़ाइलों में तरंगदैर्ध्य (हरे बॉक्स द्वारा इंगित) द्वारा सही ढंग से पहचाना जाता है। (ख)एक ऐसा मामला जिसमें एक ही संदर्भ छवि का उपयोग कई लक्षित छवियों को सही करने के लिए किया जाता है । (ग)एक ऐसा मामला जिसमें कई संदर्भ छवियों (एक लाल बॉक्स द्वारा इंगित) का औसत होता है, और औसत के बाद परिणामस्वरूप संदर्भ छवि का उपयोग कई लक्षित छवियों को सही करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. फ़ाइल चयनकर्ता संवाद खोलने के लिए लक्ष्य फ़ाइलों को "टारगेट बॉक्स"(चित्रा 1)या क्लिक करें टारगेट फाइल्स (चित्रा 1बी)में खींचें और छोड़ दें।
    नोट: यदि कई लक्षित छवियां हैं और उनमें से प्रत्येक के पास संबंधित संदर्भ छवियां हैं, तो संबंधित संदर्भ छवि और लक्ष्य छवि संबंधित संदर्भ और लक्ष्य बक्से(चित्रा 2ए)में एक ही पंक्ति पर होनी चाहिए। एक एकल संदर्भ छवि का उपयोग कई लक्षित छवियों(चित्रा 2बी)को संरेखित करने के लिए भी किया जा सकता है।
  2. अनियंत्रित(चित्रा 1सी)तो क्रॉप मार्जिन चेकबॉक्स की जांच करें।
    नोट: यदि इस चेकबॉक्स की जांच की जाती है, तो संरेखण के परिणामस्वरूप मार्जिन काटा जाता है। सामान्य उपयोग के लिए इस विकल्प की जांच करें, लेकिन अनियंत्रित अगर संरेखण से पहले और बाद में छवियों के बीच पिक्सेल स्तर की तुलना की आवश्यकता है ।
  3. च्वाइस लिस्ट(चित्रा 1डी)से आउटपुट इमेज फॉर्मेट चुनें।
    नोट: उपलब्ध प्रारूप 'टिफ' (इमेजजे17 प्रारूप), 'डीवी' और 'ome.tif' हैं; जेडीके स्थापित करने के बाद ही 'ome.tif' प्रारूप उपलब्ध है।
  4. आउटपुट फाइलनेम के लिए प्रत्यय को निर्दिष्ट करें(चित्रा 1ई,डिफ़ॉल्ट मूल्य '_ALN' है), जिसे लक्ष्य फ़ाइलनाम में जोड़ा जाता है।
  5. उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात वाली क्रॉसटॉक संदर्भ छवियों के लिए, स्थानीय संरेखण (चित्रा 1एफ)की विकल्प सूची से स्थानीय संरेखण का उपयोग करें, स्थानीय संरेखण का उपयोग करने के लिए प्रक्षेपण चुनें और इसे अक्षम करने के लिए कोई नहीं। 60(चित्रा 1जी)के न्यूनतम विंडो आकार का उपयोग करें।
    नोट: स्थानीय संरेखण का उपयोग करते समय, सभी लक्षित छवियों में संबंधित संदर्भ छवियां(चित्रा 2ए)होनी चाहिए। जैविक अंशांकन संदर्भ छवियों के लिए स्थानीय संरेखण की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि स्थानीय रंगीन बदलाव एक नमूने से दूसरे(तालिका 1)में भिन्न होते हैं। इसी कारण से, कई लक्षित छवियों(चित्रा 2बी)पर एकल स्थानीय संरेखण लागू नहीं किया जा सकता है। अपवाद के रूप में, इसका उपयोग तब किया जा सकता है जब ब्याज का नमूना केवल कवरस्लिप की सतह पर होता है, और देखने का क्षेत्र उज्ज्वल वस्तुओं से भरा होता है, जैसे बहुरंगी फ्लोरोसेंट मनका नमूने।
  6. कई जैविक अंशांकन संदर्भ छवियों के लिए, औसत संदर्भ विकल्प(चित्रा 1एच)की जांच करने के लिए औसत छवि से एक संरेखण पैरामीटर को मापने के लिए, और एकल संरेखण पैरामीटर तो सभी लक्षित छवियों(चित्रा 2सी)पर लागू किया जाता है । स्थानीय संरेखित (चित्रा 1एफ)के लिए कोई नहीं चुनें।
  7. माप शुरू करने के लिए सभी रन(चित्रा 1I)पर क्लिक करें; संरेखण पैरामीटर लक्षित छवियों पर लागू होते हैं।
    नोट: संदर्भ फ़ाइलों से रंगीन बदलाव को मापने के बाद, कार्यक्रम एक्सटेंशन "क्रोमाग्नोन.सीएसवी" या "क्रोमाग्नोन.टिफ" के साथ फ़ाइलें बनाता है। आउटपुट फ़ाइल का प्रकार इस बात पर निर्भर करता है कि स्थानीय संरेखण प्रभावी है यानहीं (चित्रा 1एफ)। यदि संरेखण स्थानीय संरेखण के बिना किया जाता है, तो आउटपुट "क्रोमग्नोन.सीएसवी" है, जबकि यदि स्थानीय संरेखण का उपयोग किया जा रहा है, तो आउटपुट "क्रोमग्नोन.टिफ" है। फ़ाइल के नाम निर्दिष्ट प्रत्यय(चित्रा 1जे,डिफ़ॉल्ट प्रत्यय के बिना है) और विस्तार ("chromagnon.csv" या "chromagnon.tif") के अलावा संदर्भ फ़ाइल के समान हैं। संरेखण प्रक्रिया का एक विस्तृत विवरण एक ही फ़ोल्डर में बनाई गई "Chromagnon.log" फ़ाइल में पाया जा सकता है।
  8. तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सही छवि दर्शक(चित्र 3)में दिखाई न दे।
    नोट: माउस के साथ छवि खींचने छवि चलता है और माउस पहिया चलती ज़ूम बदलता है । डिस्प्ले के लिए जेड (और/या टी लागू होने पर) सेक्शन बदलने के लिए स्लाइडर(चित्रा 3ए)को मूव करें । यदि दर्शक किसी छवि को ताज़ा करने में बहुत धीमा है, तो हार्ड डिस्क पर डेटा तक पहुंचने से रोकने के लिए पूरे डेटा को मेमोरी बटन(चित्रा 3बी)में क्लिक करें। रंग बक्से के बाएं या दाएं किनारे खींचना(चित्रा 3सी)प्रदर्शन के लिए न्यूनतम या अधिकतम मूल्यों को नियंत्रित कर सकता है। प्रत्येक चैनल के लिए बटन पर क्लिक करना(चित्रा 3डी)दर्शक में चयनित चैनल को दिखाने या छिपाने के बीच टॉगल करता है। रंग बॉक्स(चित्रा 3डी)पर सही क्लिक करने से उपयोगकर्ता डिस्प्ले के लिए रंगों का चयन कर सकते हैं, या रंग बार के डिस्प्ले विकल्पों को बदल सकते हैं, और यह उपयोगकर्ताओं को "स्केल टू..." चुनकर डिस्प्ले स्केलिंग के लिए सटीक न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों को निर्दिष्ट करने की अनुमति भी देता है। ऑर्थोगोनल व्यू बटन(चित्रा 3ई)पर क्लिक करने से ZY और XZ दृश्यों की छवियां दिखाई दी हैं। क्रॉस लाइनों को हिलाने से पक्ष के दृश्यों में दिखाने की स्थिति बदल जाता है।

Figure 3
चित्रा 3: छवि दर्शक का एक स्क्रीनशॉट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. यह जांचने के लिए कि माप सही ढंग से किया गया था या नहीं, संदर्भ छवियों को "संदर्भ बॉक्स" और "लक्ष्य बॉक्स" में खींचें और छोड़ दें। कार्यक्रम चलाएं, और देखें कि क्या छवियां पूरी तरह से छा गई हैं।
    नोट: उपलब्ध होने पर, माप को छोड़ने के लिए "क्रोमाग्नोन.सीएसवी" या "क्रोमाग्नोन.टिफ" फ़ाइलों का उपयोग संदर्भ के रूप में किया जा सकता है। यदि छवि में रंगीन बदलाव गलत रहता है, तो तालिका 2में संक्षेप में समाधान ों का प्रयास करें।
  2. नमूने में संरेखण मापदंडों तक पहुंचने के लिए, या जब संरेखण मापदंडों को मैन्युअल रूप से संपादित करने की आवश्यकता होती है, तो किसी भी टेक्स्ट एडिटर या स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर के साथ सीधे "chromagnon.csv" फ़ाइलें खोलें। जब इसे संपादित किया जाता है, तो इसे "सीएसवी" के रूप में सहेजें।
    नोट: मान "tz", "ty", "tx" के लिए पिक्सल में हैं, और "आर" के लिए डिग्री में, और "mz", "मेरे" और "एमएक्स" के लिए आवर्धन कारकों में।
    1. वैकल्पिक रूप से, क्रोमाग्नोन के संदर्भ या लक्ष्य बॉक्स(चित्रा 1)में "क्रोमाग्नोन.सीएसवी" या "क्रोमाग्नोन.टिफ" फ़ाइल लोड करें, फिर संरेखण संपादक(चित्रा 4)को खोलने के लिए इसे डबल-क्लिक करें। Chromagnon
    2. यह देखने के लिए कि जब पैरामीटर संपादित किए जाते हैं, तो संदर्भ छवि फ़ाइल को संपादक में छवि खोलने के लिए नीचे के क्षेत्र(चित्रा 4ए)पर कितना स्थानांतरित किया जाता है। तालिका में मूल्यों को संपादित करनेऔरB एंटर/रिटर्न कुंजी को मारने पर, देखें कि मूल्यों के रूप में संबंधित चैनल की छवि कैसे चलती है। संपादन के बाद, परिवर्तनों को बचाने के लिए सेव आसूक पर क्लिक करें...(चित्रा 4सी)।

Figure 4
चित्रा 4: एक संरेखण पैरामीटर संपादक का स्क्रीनशॉट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. स्थानीय संरेखण मानचित्र की जांच करने के लिए, क्रोमगनन के संदर्भ या लक्ष्य बॉक्स(चित्रा 1)के माध्यम से "क्रोमाग्नोन.टीफ"लोड करें, और संरेखण संपादक(चित्रा 4) खोलनेके लिए इसे डबल-क्लिक करें। क्लिक करें देखें (चित्रा 4डी)उन लाइनों द्वारा इंगित स्थानीय बदलाव को देखने के लिए जिनकी लंबाई आवर्धन विकल्प सूची(चित्रा 4ई)में निर्दिष्ट कारक द्वारा बढ़ाया जाता है ।
    नोट: "मूल छवि फ़ाइल"(चित्रा 4एफ)निर्दिष्ट करके, बदलाव मूल छवि के साथ मैप किए जाते हैं।

4. माइक्रोस्कोप-विशिष्ट स्थानीय संरेखण मानचित्र उत्पन्न करना

  1. इथेनॉल के 18 माइक्रोन में 200 एनएम व्यास के मल्टीकलर फ्लोरोसेंट मोतियों की 2 माइक्रोल पतला करें।
  2. भंवर समाधान और एक गिलास नीचे पकवान के केंद्र में मनका समाधान के 10 μL जगह है । उच्च रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए #1.5 कवरग्लास (0.170 मिमी की मोटाई के साथ) का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
  3. पूरी तरह से सूखने के लिए 1 घंटे के लिए आरटी पर पकवान छोड़ दें।
  4. कैलिब्रेट होने के लिए डिश को माइक्रोस्कोप पर रखें और फ्लोरोसेंट मोतियों पर ध्यान दें।
  5. कैलिब्रेट किए जाने वाले माइक्रोस्कोपी के साथ 2D या 3D इमेज प्राप्त करें। चरण की स्थिति को बदलकर कई छवियां प्राप्त करें।
  6. क्रोमाग्नॉन ग्राफिकल यूजर इंटरफेस खोलें।
  7. फ़ाइल चयनकर्ता संवाद खोलने के लिए "संदर्भ बॉक्स"(चित्रा 1)या क्लिक संदर्भ फ़ाइलों (चित्रा 1ए)पर मनका छवि फ़ाइलों को खींचें और छोड़ दें।
  8. औसत संदर्भ विकल्प(चित्रा 1एच)की जांच करें । स्थानीय संरेखित (चित्रा 1एफ)की विकल्प सूची से, प्रक्षेपणचुनें । 60(चित्रा 1जी)के न्यूनतम विंडो आकार का उपयोग करें। माप शुरू करने के लिए सभी (चित्रा 1I)रन पर क्लिक करें।
    नोट: एक "chromagnon.tif" फ़ाइल बनाई गई है, जिसमें माइक्रोस्कोप का स्थानीय संरेखण नक्शा संग्रहीत किया जाता है।
  9. माप के बाद, अतिरिक्त मापदंडों पर क्लिक करें(चित्रा 1K)। अपने माइक्रोस्कोप इंस्ट्रूमेंट बॉक्स के स्थानीय विरूपण से, विकल्प सूची पर क्लिक करें और एक संवाद खोलने के लिए नया चुनें ... फ़ाइल नाम बॉक्स में चरण 4.8 में उत्पन्न "क्रोमाग्नोन.टिफ" फ़ाइल को खींचें और छोड़ दें या फ़ाइल चयनकर्ता संवाद खोलने के लिए फ़ाइल बटन चुनें पर क्लिक करें। माइक्रोस्कोप का नाम दर्ज करें और ओकेपर क्लिक करें ।
  10. क्रॉसटॉक या जैविक अंशांकन संदर्भ छवियों से रंगीन बदलाव को मापने के दौरान, अतिरिक्त मापदंडों (चित्रा 1K)पर क्लिक करें। अपने माइक्रोस्कोप इंस्ट्रूमेंट बॉक्स के स्थानीय विरूपण से, चरण 4.9 में निर्दिष्ट माइक्रोस्कोप का नाम चुनें। ठीक क्लिककरें ।
    नोट: कार्यक्रम बंद होने के बाद "आपके माइक्रोस्कोप उपकरण की स्थानीय विरूपण" का विकल्प सहेजा नहीं जाता है।
  11. धारा 3 में स्थानीय संरेखण के बिना रंगीन सुधार के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: माइक्रोस्कोप अंशांकन के अलावा स्थानीय संरेखण का उपयोग करना भी संभव है। इस मामले में, स्थानीय संरेखण माइक्रोस्कोप अंशांकन के साथ शुरू होता है।

Representative Results

क्रॉसटॉक संदर्भ छवि का उपयोग करके रंगीन बदलाव सुधार का एक उदाहरण चित्र 5में दिखाया गया है। छवि एक एकल कैमरे से लैस एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया गया था । DAPI से फ्लोरेसेंस उत्सर्जन नीले, हरे और लाल चैनलों को सही करने के लिए एक संदर्भ(चित्रा 5ए, बी)के रूप में इस्तेमाल किया गया था। छवि में 60 जेड स्लाइस के 3 चैनल शामिल हैं, जिनमें से प्रत्येक 256 x 256 पिक्सल से बना है। रंगीन बदलावों को मापने से पहले छवियों को विघटित किया गया था। क्रोमाग्नन का उपयोग करके स्थानीय रंगीन बदलावों को मापने के लिए इंटेल कोर i7 (क्वाड कोर, 8-थ्रेड्स, 2.7 गीगाहर्ट्ज), 16 जीबी रैम और 1 टीबी फ्लैश स्टोरेज के साथ मैक पर 51 एस लिया गया। संरेखण पैरामीटर को लक्ष्य छवि(चित्रा 5सी, डी)पर लागू किया गया था, जिसमें संदर्भ छवि के समान संख्या में स्वर हैं। गठबंधन फाइल तैयार करने में 3 एस लग गए। अलाइनमेंट प्रोसेस (फिगर 1Cमेंक्रॉप मार्जिन चेकबॉक्स) के दौरान एज पिक्सल को ट्रिम करने के परिणामस्वरूप, अलाइनमेंट(चित्रा 5B, 51जेड स्लाइस, 252 x 251 पिक्सल) के बाद वोक्सल की संख्या कम हो गई थी। एनाफेज ब्रिज में डीएनए (एरोहेड द्वारा इंगित) संरेखण से पहले परमाणु लिफाफे के बाहर गलत तरीके सेदेखा जाता है (चित्रा 5C,XZ दृश्य दिखाने वाले नीचे पैनल में स्पष्ट), लेकिन संरेखण के बाद लिफाफे के अंदर की उम्मीद(चित्रा 5D)।

जैविक अंशांकन संदर्भ छवि का उपयोग करके रंगीन बदलाव सुधार का एक उदाहरण चित्र 6में दिखाया गया है । छवियों को तीन कैमरों से लैस एक सिम माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया गया । हेला कोशिकाओं की तीन छवियों को नीले, हरे और लाल रंगों के लिए संयोजित ल्लोइडिन से सना हुआ औसत(चित्रा 6A)किया गया था। संदर्भ छवि में 76 जेड स्लाइस के 3 चैनल शामिल हैं, जिनमें से प्रत्येक 1,024 x 1,024 पिक्सल से बना है। ऊपर वर्णित मैक सिस्टम पर 1 9 4 एस की आवश्यकता वाले स्थानीय संरेखण के बिना क्रोमाग्नन का उपयोग करके रंगीन बदलावों को मापना। पैरामीटर को 73 जेड स्लाइस के 3 चैनलों से मिलकर एक लक्ष्य छवि पर लागू किया गया था, प्रत्येक 1,024 x 1,024 पिक्सल से बना था। गठबंधन फ़ाइल की पीढ़ी 25 एस लिया । XZ दृश्य जेड के साथ गलत चैनल पदों से पता चलता है, और थोड़ा एक्स दिशाओं के साथ(चित्रा 6A, C)लेकिन इस गलत पंजीकरण संरेखण के बाद सही किया गया था(चित्रा 6बी, डी)।

Figure 5
चित्रा 5: क्रॉसटॉक संदर्भ छवि के साथ संरेखण का एक उदाहरण। हेला कोशिकाओं को डीएनए के लिए DAPI से सना हुआ था (मजेंटा में दिखाया गया है), एलेक्सा फ्लोर 488 (पीले रंग में दिखाया गया है) परमाणु लिफाफे के लिए, और एलेक्सा फ्लोर 555 (नीले रंग में दिखाया गया है) माइक्रोट्यूबल्स के लिए। छवियों को एक कैमरे के साथ 3 डी वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत किया गया था और deconvolved । (A,B) क्रोमाग्ननद्वारा संरेखण से पहले और बाद में DAPI उत्सर्जन का उपयोग करके एक प्रतिनिधि क्रॉसटॉक संदर्भ छवि। तीन रंग चैनलों को मढ़ा के रूप में दिखाया गया है। (C,D) संरेखण से पहले और बाद में तीन चैनलों में 3डी स्टैक का एक ऑप्टिकल सेक्शन। अारोहियों द्वारा दिखाए गए एनाफेज पुल पर अक्षीय रंगीन विपथन स्पष्ट है। पैनल ए में स्केल बार सभी पैनलों के लिए 5 माइक्रोन इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: जैविक अंशांकन संदर्भ छवि के साथ संरेखण का एक उदाहरण छवियों को तीन कैमरों से लैस 3डी-सिम के साथ अधिग्रहीत किया गया था । (A,B) एक संदर्भ छवि जो पहले(ए)और बाद(बी)संरेखण से औसतन होती है। हेला कोशिकाओं को एलेक्सा फ्लोर 405, 488 या 594 के साथ संयुग्मित फ्लामोइडिन से सना हुआ था। (C,D) लक्ष्य छवि से पहले(C)और बाद(D)संरेखण । हेला कोशिकाओं को डीएनए के लिए DAPI से सना हुआ था (मजेंटा में दिखाया गया है), एलेक्सा फ्लोर 488 (पीले रंग में दिखाया गया है) परमाणु लिफाफे के लिए, और एलेक्सा फ्लोर 594 (नीले रंग में दिखाया गया है) माइक्रोट्यूबल्स के लिए। पैनल ए में स्केल बार सभी पैनलों के लिए 5 माइक्रोन इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

रंगीन सुधार के लिए प्रक्रिया सटीकता और प्रयास के बीच एक व्यापार बंद है । अनावश्यक प्रयासों को सहेजने के लिए बेहतर होगा कि आप यह जान लें कि आपके अध्ययन के लिए कितनी सटीकता की आवश्यकता है। पारंपरिक वाइड-फील्ड (लाइव) इमेजिंग के लिए उच्चतम सटीकता की आवश्यकता नहीं हो सकती है, और इस प्रकार, उज्ज्वल क्षेत्र संदर्भ छवियां अक्सर रंगीन बदलाव को सही करने के लिए पर्याप्त होती हैं। इसी तरह, जब इमेजिंग स्थिति और पर्यावरण स्थिर होता है, तो जैविक अंशांकन का बार-बार उपयोग समय बचाएगा। दूसरी ओर, यदि एक अत्यधिक सटीक पंजीकरण वांछित है, तो उच्च गुणवत्ता वाले क्रॉसटॉक या जैविक अंशांकन संदर्भ छवियां आवश्यक हैं। सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन के लिए, संदर्भ छवियों को यथासंभव लक्षित छवियों के समान परिस्थितियों और समय के साथ प्राप्त किया जाना चाहिए। जब तक संदर्भ और लक्षित छवियां दोनों एक ही माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त की जाती हैं, तब तक उच्च स्थानिक संकल्प सुधार सटीकता में सुधार करेगा। यदि संदर्भ और लक्षित छवियों दोनों के लिए विण्वता उपलब्ध है, तो सुधार से पहले इसे लागू करने से सुधार सटीकता में सुधार हो सकता है। इसके अलावा, सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन के लिए, ऑप्टिकल (जेड) धुरी के लिए नमूना प्रमेय सटीक उपपिक्सेल इंटरपोलेशन (प्रोटोकॉल चरण 2.1.3) के लिए संदर्भ और लक्ष्य फ़ाइल दोनों में पूरा किया जाना चाहिए।

रंगीन बदलाव को सही करने में विफलता गलत निष्कर्ष की ओर जाता है । इसके अलावा, गलत अंशांकन का उपयोग करने के बजाय उन्हें ठीक करने के रंगीन बदलाव भी खराब हो सकता है, और इसलिए इससे बचने की जरूरत है । हमने तालिका 2में विफलताओं के संभावित कारणों और उनके सामान्य समाधानों का सारांश दिया है । विफलता के कारण की जांच करने के लिए, पहली जगह में, यह नेत्रहीन जांच करना आवश्यक है कि संदर्भ छवि में रंगीन बदलाव ठीक रूप से सही है (प्रोटोकॉल चरण 3.12)। अधिकांश विफलताएं संदर्भ छवियों की गुणवत्ता के कारण होती हैं और तालिका 2 में वर्णनों के अनुसार आसानी से सुधारा जाता है। संदर्भ छवियों की गुणवत्ता के बारे में, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि वैश्विक संरेखण की सटीकता कम हो जाती है यदि देखने का पूरा क्षेत्र नमूना(चित्र 7, तालिका 2)से भरा नहीं है। चित्रा 7Aमें दिखाए गए अच्छे उदाहरण की तुलना में, चित्रा 7B में दिखाए गए बुरे उदाहरण में ऊपरी-बाएं क्षेत्र में केवल तीन परमाणु लिफाफे शामिल हैं, और क्रोमाग्नन इस छवि के एक हिस्से को संरेखित करने में विफल रहे। इसका कारण यह है कि क्रोमाग्नन की वैश्विक संरेखण विधि उच्च सटीकता के साथ रोटेशन और आवर्धन में अंतर को मापने के लिए चार क्षेत्रों(चित्रा 7सी)में देखने के क्षेत्र को विभाजित करती है ।3 यह विधि, यदि सही ढंग से संचालित की जाती है, तो लॉग पोलर ट्रांसफॉर्मेशन और सिंप्लेक्स विधियों जैसे अन्य रैखिक विधियों की तुलना में एक आदेश अधिक सटीक है3। यदि चार क्षेत्रों में से कोई भी अनुपलब्ध है, तो क्रोमाग्नोन कम प्रभावी रैखिक तरीकों पर स्विच करेगा। इसलिए, सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन के लिए, चित्रा 7 बी और चित्रा 7C में दिखाए गए उदाहरण अवांछनीय हैं, और चार क्षेत्रों को वस्तुओं से भरा जाना चाहिए। Figure 7C उपयोगकर्ता यह जांच सकते हैं कि लॉग फ़ाइल ("क्रोमाग्नोन.लॉग"; प्रोटोकॉल चरण 3.10 देखें) को देखकर देखने के क्षेत्र का कोई भी चतुर्भुज क्षेत्र माप के लिए अनुपलब्ध है या नहीं। सौभाग्य से, इस समस्या को कई जैविक अंशांकन छवियों के औसत से या क्रॉसटॉक या उज्ज्वल-क्षेत्र संदर्भ छवियों(तालिका 2)के लिए स्थानीय संरेखण का उपयोग करके आसानी से दूर किया जा सकता है। संदर्भ छवियों को सही करने में विफलता के मामले के विपरीत, लक्षित छवियों को सही करने में विफलता की पहचान करना अधिक कठिन है। क्योंकि इस तरह की विफलताओं फ़ाइल प्रारूपों में मतभेदों के कारण उठता है, इमेजिंग शर्तों, इमेजिंग समय, इमेजिंग/संदर्भ और लक्ष्य छवियों(तालिका 2)के बीच संरेखण तरीकों, उपयोगकर्ताओं को हमेशा सावधान रहना चाहिए जब संदर्भ छवियों है कि विभिंन परिस्थितियों में प्राप्त कर रहे है का उपयोग कर/ कुछ उदाहरण छवियों के परीक्षण के लिए उपलब्ध है(https://github.com/macronucleus/Chromagnon)अच्छे और बुरे उदाहरण छवियों के ठोस विचार प्राप्त करने के लिए।

समस्या कारण समाधान
संदर्भ छवि को सही करने में विफल रहा कम कंट्रास्ट यदि संभव हो तो एक उच्च विपरीत छवि प्राप्त करें। यदि एक उज्ज्वल क्षेत्र संदर्भ छवि का उपयोग किया जाता है, तो कोशिका के उच्च विपरीत प्राप्त करने के लिए पानी आधारित समाधान में छवि को फिर से प्राप्त करें। वैकल्पिक रूप से, कम्प्यूटेशनल शोर में कमी (जैसे गॉसियन फ़िल्टरिंग) लगाने का प्रयास करें। स्थानीय संरेखण बंद करें, जो शोर के प्रति अधिक संवेदनशील है।
असंबंधित छवियों का संदूषण यदि संभव हो तो नमूने में असंबंधित छवियों के स्रोत को हटा दें। क्रॉसटॉक संदर्भ छवियों के लिए, लक्षित छवियों के लिए उपयोग किए जाने वाले रंगों के उत्तेजन स्पेक्ट्रा की जांच करें। यदि क्रॉसटॉक छवि (जैसे एलेक्सा फ्लोर 568 या 594) के अधिग्रहण के दौरान रंग उत्साहित हैं, तो अन्य रंगों (जैसे एलेक्सा फ्लोर 555) पर विचार करें। यदि कैमरा चिप पर धूल एक स्पष्ट चैनल अंतर बनाता है, कैमरा चिप साफ या एक कंप्यूटेशनल फ्लैट क्षेत्ररक्षण विधि का उपयोग करें ।
एक ब्रह्मांडीय किरण द्वारा बनाया गया एक अत्यंत उज्ज्वल स्थान यदि संभव हो तो छवि को फिर से प्राप्त करें। वैकल्पिक रूप से, कम्प्यूटेशनल शोर में कमी (जैसे मीडियन या गॉसियन फ़िल्टरिंग) लगाने का प्रयास करें।
डेकोन्वोल्यूशन कलाकृतियों (अक्षीय और पार्श्व किनारों पर कृत्रिम संकेत) डेकोवोल्यूशन के बाद एज पिक्सल या जेड सेक्शन को ट्रिम करें। यदि एक पक्ष छंटनी की जाती है, तो छवि केंद्र को बनाए रखने के लिए दूसरे पक्ष को भी छंटनी की जानी चाहिए।
जेड चरण का आकार भी विरल प्रोटोकॉल 2.1.3 में लिखे गए Nyquist मापदंड को पूरा करने के लिए एक जेड स्टैक का अधिग्रहण किया जाना चाहिए।
ऑप्टिकल विपथन गोलाकार विचलन उपयोगकर्ताओं की वजह से प्रमुख विचलन है। नमूने के लिए सही उद्देश्य लेंस चुनें और 170 माइक्रोन की कवरलिप मोटाई का उपयोग करें। यदि उद्देश्य लेंस एक सुधार अंगूठी से सुसज्जित है, यह स्थिति है जहां उच्चतम फ्लोरेसेंस गिनती ध्यान से प्राप्त किया जाता है खोजने के लिए समायोजित करें । एक सुधार की अंगूठी के बिना एक तेल विसर्जन उद्देश्य के मामले में, विसर्जन तेल के अपवर्तक सूचकांक को समायोजित करें जो ध्यान में फ्लोरेसेंस गिनती को बढ़ाता है।
देखने का क्षेत्र भरा हुआ है (चित्र 7) जैविक अंशांकन संदर्भ छवियों के मामले में, औसत कई छवियां। क्रॉसटॉक या उज्ज्वल-फ़ील्ड संदर्भ छवियों के मामले में, स्थानीय संरेखण का उपयोग करें।
एक अज्ञात सॉफ्टवेयर बग गिटहब(https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues) के माध्यम से इस मुद्दे की रिपोर्ट करें
लक्ष्य छवि को सही करने में विफल रहा छवि फ़ाइल का मेटाडेटा खो गया है मूल माइक्रोस्कोप फ़ाइल प्रारूप का उपयोग करें जिसमें पूर्ण मेटाडेटा होता है, और प्रसंस्करण से पहले मल्टीपेज टिफ फ़ाइल में परिवर्तित होने से बचें। प्रोटोकॉल 3.3 में लिखे गए चैनलों के समान ऑर्डरिंग का उपयोग करें।
दिए गए माइक्रोस्कोपी के लिए गलत संरेखण विधियां छवियों को लक्षित करने के लिए जैविक अंशांकन संदर्भ छवियों से मापने पर स्थानीय संरेखण विधि लागू न करें। वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी के अलावा क्रॉसटॉक संदर्भ छवियों का उपयोग न करें।
इमेजिंग की स्थिति में अंतर प्रोटोकॉल 2.3.3 में लिखे गए संदर्भ और लक्ष्य छवियों के बीच इमेजिंग स्थितियों को स्थिर रखें।
नमूने में अंतर (कवरस्लिप सहित) हमेशा एक ही बढ़ते माध्यम, कवरलिप (जैसे नंबर 1.5H) और ध्यान की एक समान गहराई का उपयोग करें।
कैलिब्रेशन के बाद से माइक्रोस्कोप बहाव पिछले बनाया गया था हर दो सप्ताह की तरह अक्सर एक अंशांकन करें। तापमान स्थिर रखें, और माइक्रोस्कोप के हार्डवेयर बहाव से बचने के लिए एक फ्लोटिंग टेबल का उपयोग करें।

तालिका 2: रंगीन सुधार के लिए समस्या निवारण।

Figure 7
चित्र 7: संदर्भ छवियों के उदाहरण। विखंडन खमीर कोशिकाओं में परमाणु लिफाफा GFP और mCherry के साथ लेबल । छवियों को पारंपरिक वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी के साथ अधिग्रहीत किया गया था। क्रोमेटिक बदलावों को स्थानीय संरेखण के बिना क्रोमेग्नन का उपयोग करके संदर्भ छवियों के रूप में छवियों का उपयोग करके सही किया गया था। इसके बाद छवियों को विवरण दिखाने के लिए deconvolved किया गया । (क)देखने के क्षेत्र में कई वस्तुओं के साथ एक अच्छा उदाहरण । (ख)केवल शीर्ष-बाएं कोने पर वस्तुओं के साथ एक बुरा उदाहरण । छवि के एक निश्चित क्षेत्र में गलत संरेखण स्पष्ट है। (ग)एक अवांछनीय उदाहरण जहां क्वाड्रिक्शन (बिंदीदार क्रॉस लाइनों से अलग) में से एक खाली है । पैनल ए में स्केल बार पूर्ण क्षेत्र दृश्य के लिए 5 माइक्रोन और बढ़े हुए दृश्य के लिए 1.25 माइक्रोन इंगित करता है और सभी पैनलों पर लागू होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इस प्रोटोकॉल में, हमने तीन अलग-अलग संदर्भ प्रकार(तालिका 1)का वर्णन किया। उनमें से, क्रॉसटॉक संदर्भ छवियों और जैविक अंशांकन संदर्भ छवियों को और अधिक सावधानीपूर्वक चर्चा की आवश्यकता है। क्रॉसटॉक संदर्भ छवियों के लिए, DAPI या Hoechst 33342 के साथ दाग नमूनों, और ग्लाइस्रोल या वाणिज्यिक बढ़ते मीडिया में घुड़सवार कुशलता से नीले, हरे, और लाल चैनलों संरेखित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसी तरह, एलेक्सा फ्लोर 488 का उपयोग हरे और लाल चैनलों को संरेखित करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, क्रॉसटॉक फ्लोरेसेंस प्राप्त करना अक्सर मुश्किल होता है क्योंकि दापी और होचस्ट को छोड़कर कई नीले रंग सबसे हरे और लाल रंगों की तुलना में तेजी से मंद और क्षय होते हैं। इसके अलावा, आधुनिक रंगों का उत्सर्जन स्पेक्ट्रा संकरा होता है, जो इस विधि द्वारा तीन से अधिक चैनलों के संरेखण को चुनौतीपूर्ण बनाता है। ध्यान भी कुछ आम लाल रंगों (जैसे, एलेक्सा आटा 568 और 594, लेकिन नहीं Alexa Fluor 555) है कि बैंगनी प्रकाश है, जो नीले रंगों से उच्च विपरीत क्रॉसटॉक छवियों को प्राप्त करने से रोकने के लिए किया जा सकता है पर भी भुगतान किया जाना चाहिए। एक और दोष यह है कि यह विधि बहुरंगी उत्तेजन में उत्तेजन प्रकाश पथों के रंगीन विचलन को माप नहीं सकती है, क्योंकि उत्तेजन तरंगदैर्ध्य का उपयोग केवल एक ही उत्तेजन तरंगदैर्ध्य(तालिका 1)के लिए किया जाता है। चूंकि सबसे उन्नत माइक्रोस्कोपी परिवर्तित रोशनी प्रकाशिकी का उपयोग करती है, इस विधि का अनुप्रयोग सीमित है। फिर भी, इसकी उच्च सुधार सटीकता इस प्रोटोकॉल में वर्णित होने के लिए पर्याप्त रूप से लाभप्रद है। सामान्य तौर पर, ब्लीचिंग या फोटोटॉक्सिक प्रभावों को रोकने के लिए लक्षित छवि के बाद क्रॉसटॉक छवि ली जानी चाहिए। व्यापक क्षेत्र मोड के साथ मनाया SMLM के लिए, एक संदर्भ छवि के रूप में फ्लोरेसेंस रंगों इमेजिंग जबकि प्रक्षालित किया जा सकता है एक लक्ष्य छवि प्राप्त करने से पहले प्राप्त किया जाना चाहिए ।

जैविक अंशांकन संदर्भ छवियां उपयोगकर्ताओं को अतिरिक्त नमूना तैयारी की कीमत पर चैनलों की किसी भी वांछित संख्या को आसानी से संरेखित करने की अनुमति देती हैं। जैविक अंशांकन संदर्भ छवियों का एक और लाभ "औसत" कई संदर्भों की उपलब्धता है जो सभी क्षेत्रों को भरने में मदद करता है। यदि अंशांकन नमूना एक अलग स्लाइड पर तैयार किया जाता है तो यह विधि इमेजिंग स्थितियों में अंतर से पीड़ित हो सकती है। इस समस्या के अधिकांश वाणिज्यिक कक्षित कवर चश्मा(तालिका 1)का उपयोग करके एक ही स्लाइड पर तैयार किए जाते हैं, और अन्य इमेजिंग शर्तों को प्रोटोकॉल चरण 2.3.3 के रूप में स्थिर रखा जाता है, तो इसका समाधान किया जा सकता है। इस मामले में, क्रॉसटॉक संदर्भ छवियों के समान सुधार सटीकता की उम्मीद की जा सकती है3. यहां दिखाए गए पीएलोइडिन का उपयोग करने का प्रोटोकॉल कई रंगों के साथ एक सेलुलर संरचना को दागने के सबसे आसान तरीकों में से एक है। जैविक अंशांकन नमूने तैयार करने के लिए कई संभावित परिदृश्य हैं। इम्यूनोस्टेटिंग के लिए, एक नमूने को एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जा सकता है जिसके बाद कई रंगों के माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाता है। इस तरह, एक एकल लक्ष्य संरचना को कई रंगों के साथ लेबल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, 5-एथिनाइल-2'-डिऑक्सीयूरिडीन, "क्लिक" रसायन विज्ञान लेबल द्वारा उच्च घनत्व पर कई रंगों में नए संश्लेषित डीएनए का पता चला, जैसा कि पहले विस्तार से वर्णित है8। लाइव कोशिकाओं के लिए, एक ट्रांसजेनिक तनाव तैयार करना उपयोगी है जो एक जीन की दो प्रतियों को शरण देता है जो दो रंगों के साथ एक ही संरचना को लेबल करने के लिए जीएफपी या म्हेरी से जुड़े होते हैं। यदि जीन की प्रतिलिपि संख्या महत्वपूर्ण है जैसा कि अक्सर झिल्ली प्रोटीन के लिए देखा जाता है, तो जीन की एक प्रति को जीएफपी और रीचेरी(चित्र 7)से मिलकर जोड़ा जा सकता है। फोटोवैवर्टिबल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जैसे mEOS218,फोटोकंवर्सन के साथ या बिना दोनों प्रोटीन प्रजातियों को प्राप्त करने के लिए बैंगनी प्रकाश के मध्यम स्तर को रोशन करके भी उपयोग किया जा सकता है। कम ऑक्सीजन की स्थिति में, जीएफपी को हरे से लाल19,,20तक फोटोवर्टिबल प्रोटीन के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है। सही अंशांकन नमूना चुनने से प्रयोग अधिक मजबूत हो जाएगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को जेएसपीएस काकेनही ग्रांट नंबरजे19H03202 से पूर्वाह्न तक समर्थित किया गया था, JP18H05528 और JP17H03636 T.H., और JP17H01444 और JP18H05533 H.Y. एल.एस. द्वारा समर्थन को स्वीकार करता है वेलकम ट्रस्ट स्ट्रैटेजिक अवार्ड्स ०९१९११ और 107457/Z/15/Z फंडिंग माइक्रोन ऑक्सफोर्ड में उन्नत इमेजिंग ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% formaldehyde solution Polyscience 18814-10
35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C
Alexa Fluor 405 phalloidin Thermo Fisher Scientific A30104
Alexa Fluor 488 phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 594 phalloidin Thermo Fisher Scientific A12381
Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16170078
Coverslip Matsunami No. 1S HT
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306
Dulbecco’s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate Nacalai Tesque 08458-16
Mounting medium (VECTASHIELD) Vector Laboratories H-1000
Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1) Described in Ref 15.
Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well) Thermo Fisher Scientific 155409
Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1) A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased.
Secondary antibody with Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11034
Secondary antibody with Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific A-21424
Secondary antibody with Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A-11032
TetraSpeck Microspheres, 0.2 µm Thermo Fisher Scientific T7280

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References

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जीव विज्ञान अंक 160 रंगीन विचलन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग कोलोकैलाइजेशन विश्लेषण सेल बायोलॉजी इमेज प्रोसेसिंग
<em>क्रोमाग्नोन</em> का उपयोग करके सुपर-रिज़ॉल्यूशन बायोलॉजिकल इमेजिंग के युग में 3डी रंगीन बदलावों का उच्च सटीकता सुधार
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Matsuda, A., Koujin, T., Schermelleh, L., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon. J. Vis. Exp. (160), e60800, doi:10.3791/60800 (2020).

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