Summary
Коррекция хроматических сдвигов в трехмерных (3D) многоцветных флуоресценции микроскопических изображений имеет решающее значение для количественного анализа данных. Этот протокол разработан для измерения и коррекции хроматических сдвигов в биологических образцах путем приобретения подходящих справочных изображений и обработки с открытым исходным кодом программного обеспечения, Chromagnon.
Abstract
Количественная многоцветная флуоресценция микроскопия опирается на тщательное пространственное сопоставление цветных каналов, приобретенных на разных длинах волн. Из-за хроматической аберрации и несовершенного выравнивания камер изображения, полученные в каждом канале, могут быть сдвинуты и увеличены, а также повернуты по отношению друг к другу в любом из трех измерений. С помощью классического метода калибровки хроматические сдвиги измеряются многоцветными бусинками, прикрепленными к поверхности крышки, и имеется ряд программ для измерения хроматических сдвигов от таких образцов калибровки. Тем не менее, хроматической аберрации может варьироваться с глубиной, изменения с условиями наблюдения и быть вызваны биологическим образцом себя, тем самым препятствуя определению истинного количества хроматических сдвиг в образце интереса и по объему. Исправление хроматических сдвигов с более высокой точностью особенно актуально для микроскопии супер-разрешения, где только незначительные хроматические сдвиги могут повлиять на количественный анализ и изменить интерпретацию многоцветных изображений. Мы разработали программное обеспечение с открытым исходным кодом Chromagnon и сопутствующие методы для измерения и коррекции 3D хроматических сдвигов в биологических образцах. Здесь мы предоставляем подробный протокол применения, который включает в себя специальные требования для подготовки образца, получения данных и обработки программного обеспечения для измерения хроматических сдвигов в биологических образцах, представляющих интерес.
Introduction
Многоцветная визуализация является одним из основных аспектов биологической флуоресценции микроскопии, в тех случаях, когда пространственные отношения различных молекул или структур представляет большой интерес. Хроматическая аберрация, оптическая аберрация полихроматического света, вызванного дисперсией, изменяет очевидное положение цветных объектов, представляющих интерес. Аналогичным образом, микроскопы, оснащенные несколькими камерами, предназначенными для приобретения каждого цвета, имеют более сложные хроматические сдвиги из-за различий в оптических элементах и несовершенном выравнивании между каналами. Таким образом, такие хроматические сдвиги могут привести к ложному выводу, если они не будут явно исправлены пользователем. Хотя хроматические сдвиги не были серьезной проблемой до тех пор, пока разрешение микроскопии ограничено классическим ограничением разрешения, недавняя разработка микроскопии супер-разрешения1 вызвала необходимость более точной коррекции хроматических сдвигов.
Это была обычная практика для измерения хроматических сдвигов микроскопических систем с помощью многоцветной шариковой калибровки слайд2. Метод калибровки на основе бисера подходит для измерения хроматических сдвигов от всей оптики микроскопа к поверхности крышки2. Этот метод, однако, не в состоянии измерить хроматические сдвиги в биологических образцах, представляющих интерес. Важно отметить, что многие биологические образцы являются трехмерными (3D), а хроматические сдвиги таких образцов отличаются от образцов на поверхности крышки. Кроме того, хроматические сдвиги меняются с условиями визуализации2,,3. Мы измерили хроматические сдвиги в 3D биологических образцах и обнаружили, что неопределенность хроматических сдвигов часто составляла 350 нм классическим методом калибровки многоцветного шарика3. Поэтому хроматические сдвиги должны измеряться в биологических образцах на глубине интереса и в условиях визуализации, используемых.
Здесь мы описываем процедуры для измерения хроматических сдвигов в биологических образцах и коррекции этих сдвигов с помощью нашего программного обеспечения, Chromagnon3. Для измерения хроматических сдвигов в биологических образцах наш метод использует два вида наборов данных: "целевое" изображение и "справочное" изображение. Изображение "цель" представляет собой многоцветное изображение, представляющий интерес, например, изображения, окрашенные для ДНК, ядерного конверта и микротрубочек. Часто невозможно измерить хроматические сдвиги в таком изображении. Поэтому нам нужен «справочное» изображение, предназначенное для измерения хроматических сдвигов в образце. Единственным определением «справочного» изображения является многоцветное изображение одного и того же объекта. В этом смысле, многоцветное изображение бисера также является одним из видов эталонного изображения. Здесь мы описываем три различных типа эталонного изображения, которые используются для измерения хроматических сдвигов в биологических образцах: "перекрестные справочные изображения", "ярко-полевые справочные изображения" и "биологические калибровочные справочные изображения". Тип эталонного изображения зависит от типа используемого микроскопа или требуемой точности коррекции, как кратко изложено в таблице 1.
| Перекрестный разговор | Яркое поле | Биологическая калибровка (на другом слайде) | Биологическая калибровка (на том же слайде) | |
| Точностьa | +++ | + | Вб | +++ |
| Простота | ++ | +++ | ++ | ++ |
| Применимая микроскопия | Широкое поле | Широкое поле | Все | Все |
| Наличие локального выравнивания | + | + | -c | -c |
|
a: Количество "я" указывает на повышение рейтинга. Одноместный плюс составляет около 50 нм и три плюс составляет около 15 Нм в 3D. b: Точность зависит от того, насколько переменные условия визуализации остаются неизменными. c: Локальная калибровка, измеряемая образцами разноцветных шариков, может быть объединена, как описано в разделе протокола 4. |
||||
Таблица 1: Параметры при выборе типа эталонных изображений.
"Crosstalk справочные изображения" имеют самую высокую точность коррекции и относительно просты для выполнения3,4 (Таблица 1). Недостатком является их ограничение в приложениях микроскопии из-за их неспособность измерения хроматических сдвигов в путях возбуждения. Кроме того, для получения таких изображений, микроскоп должен быть оснащен мультиполосными дихроическими зеркалами и фильтрами выбросов, которые независимо контролируются фильтрами возбуждения или источниками света. Подходящая микроскопия включает в себя обычную широкополую микроскопию, однополую локализацию микроскопии (SMLM), такую как фотоактивная локализация микроскопии/стохастической оптической реконструкции микроскопии (PALM/STORM)5,6 и микроскопия расширения7 наблюдается с широкополой микроскопией. Справочное изображение crosstalk приобретается из самого целевого образца. Это изображение перекрестного разговора (кровотечения через) флуоресценции красителя, полученные во всех необходимых каналов. Выбросы флуоресценции всегда расширяется в сторону более длинных длин волн, поэтому красители с кратчайшей длиной волны выбросов возбуждаются, чтобы получить флуоресценцию поперечного запаха в каналах более длинных длин волн. Например, когда образец окрашен синим, зеленым и красным цветом, только синий краситель возбуждается, а свет излучения получается в синем, зеленом и красном каналах. В этом протоколе, ДНК окрашенных с 4 , 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) был использован для получения перекрестного флуоресценции.
"Яркие-поле справочные изображения" являются проще и менее фототоксичной альтернативой "перекрестный ссылка изображения", но наименее точные3 (Таблица 1). Это яркие полевые изображения целевого образца, приобретенные во всех цветных каналах, используемых в целевом изображении.
"Биологические калибровочные справочные изображения" имеют то преимущество, что применимы к любому типу микроскопии из-за их способности измерять хроматические сдвиги как в возбуждении, так и в путях излучения3,,8 (Таблица 1). Подходящая микроскопия включает широкополую микроскопию, конфокальную микроскопию, микроскопию светового листа, стимулируемое истощение выбросов (STED)9,структурированную микроскопию освещения (SIM)10, Airyscan/SORA11,12, SMLM наблюдается с общим внутренним отражением флуоресценции (TIRF) режим, Olympus супер разрешение (OSR)13, и так. Биологическое калибровочное справочное изображение получено из образца калибровки, аналогично подготовленного в качестве целевого образца, но с окрашиванием одной структуры с несколькими цветами. Точность коррекции превосходит разрешение большинства микроскопии супер-разрешения и подготовка образца биологической калибровки может быть относительно простым. Другим преимуществом является наличие "средних" нескольких справочных изображений. Поэтому, несмотря на то, что отдельные изображения содержат плохую информацию для измерения хроматических сдвигов, содержание информации может быть увеличено за счет усреднения нескольких изображений. Точность зависит от того, насколько условия визуализации остаются неизменными. В этой связи наилучшие показатели получаются, когда образцы цели и ссылки находятся на одном слайде, используя, например, 8-хорошо камерные очки покрытия(Таблица 1, право-большинство). В этом протоколе в качестве биологической калибровки использовался актин, окрашенный тремя цветами фаллоидинов.
Как только эталонное изображение получено, то хроматический сдвиг измеряется и корректируется нашим программным обеспечением Chromagnon. Существует никаких ограничений на количество каналов, разделов и временных рамок, что Chromagnon может измерить и исправить хроматические сдвиги для. Chromagnon измеряет хроматические сдвиги в два шага. Первый шаг приобретает параметры выравнивания «глобального» или «аффина» в x, Y, оси, увеличение вдоль оси X, Y, и вращение вокруг оси « з». Точность расчета глобального выравнивания составляет 16 нм в 3D и 8 нм в 2D. Вторым шагом является факультативное 2D итеративное "локальное выравнивание" на проецируемых изображениях для получения более высокой точности. В процессе локального выравнивания изображения подразделяются на несколько областей и измеряются хроматические сдвиги в этих локальных регионах. Впоследствии регионы еще больше разделены, и хроматические сдвиги в субрегионах измеряются итеративно до тех пор, пока количество пикселей в регионе не достигнет минимального количества пикселей (обычно 60 х 60 пикселей). Полученная локальная карта выравнивания сочетается с глобальным параметром выравнивания и применяется к целевому изображению путем упругой трансформации. После этого шага точность расчета повышается до 14 нм в 3D и 6 нм в 2D. Локальное выравнивание не подходит для биологических калибровочных справочных изображений, поскольку биологическая структура в справке отличается от той, которая есть в целевом (Таблица 1). Поэтому для биологических калибровочных эталонных изображений используется только глобальное выравнивание.
Местные хроматические сдвиги происходят из двух источников; микроскоп инструментальные локальные искажения и биологические структурные inhomogeneity. Поскольку микроскоп инструментальных локальных искажений является постоянным, это может быть измерено из многоцветных бусин эталонных образцов и исправлено в качестве фиксированного параметра. Chromagnon может объединить микроскоп инструментальные локальные искажения карты и глобальные параметры выравнивания от биологических калибровки (Таблица 1). С помощью этого метода ожидается, что средняя точность биологической калибровки будет улучшена еще на 1–2 нм.
Здесь мы описываем протокол для коррекции хроматических сдвигов 3D флуоресценции изображений с помощью нашего программного обеспечения Chromagnon, от самого простого низкого конца до самой высокой точности. В качестве примера мы используем иммуносхуалирование клеток HeLa и наблюдаем их с помощью 3D широкополой микроскопии и 3D-SIM. В первом разделе мы описываем, как подготовить образцы мишеней и образцы биологической калибровки. Эта часть протокола должна быть оптимизирована для конкретных целей исследования. Во втором разделе мы описываем методы приобретения трех видов эталонных изображений с помощью микроскопов. Предполагалось получить синий, зеленый и красный каналы, но состав канала должен быть изменен конкретными целями исследования и установками микроскопа. Это не имеет значения, если микроскоп оснащен одной камерой или несколькими камерами. В третьем разделе мы описываем, как можно использовать наше программное обеспечение для измерения и коррекции хроматических сдвигов целевого изображения с помощью эталонных изображений. Наконец, в четвертом разделе мы описываем метод, дополняя биологические калибровочные справочные изображения с помощью инструментальной локальной калибровки микроскопа.
Protocol
1. Пример подготовки
- Подготовка целевого образца
- Семя 2.5 x 105 HeLa клетки на 35-мм стеклянно-нижней блюдо и вырастить их в 2 мл среды роста (Dulbecco модифицированный орлиный носитель с L-глютамин и пируват натрия дополнен 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота "FBS") на 37 градусов по Цельсию и концентрации CO2 5%. Кроме того, семена 6 х 104 HeLa клетки на 8-хорошо камерных coverglass и растут их в 0,5 мл среды роста при 37 градусов по Цельсию и CO2 концентрации 5%. Используйте #1,5 крышки (толщиной 0,170 мм) для микроскопии высокого разрешения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 1/4 тома для 8-хорошо камерной крышкой для дальнейших шагов, за исключением шагов 1.1.5, 1.1.6, 1.1.8, 1.1.11 и 1.2.5, где объем составляет 100 мл независимо от типа контейнера. - После примерно 24 ч инкубации замените раствор 2 мЛ 3,7% формальдегида в фосфатно-буферизированном солевом растворе (PBS). После нежного смешивания, продолжать фиксировать клетки в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) на платформе вращения.
ВНИМАНИЕ: Работа в дымовой капюшон. - Вымойте ячейки с 2 мЛ PBS, по 3x каждый в течение 5–10 минут на платформе вращения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте местным правилам утилизации формальдегидных отходов. - Permeabilize клетки с 2 мЛ 0,1% Тритон X-100 в PBS в течение 5 минут на платформе вращения, а затем три моет с 2 мл PBS, каждый в течение 5-10 мин на платформе вращения.
- Инкубировать клетки в 100 мл 1% крупного рогатого скота сывороточных альбумин (BSA) в PBS за 1 ч на RT на платформе вращения.
- Замените раствор 100 мл смеси первичных антител (антиэмериновые поликлональные антитела14 и антитубулиновые моноклональные антитела15)в 1% BSA в PBS при соответствующем разбавлении (1/500 для анти-эмерина и 1/100 для анти-тубулина), и инкубировать на ночь на 4 С.
- Вымойте ячейки с 2 мЛ PBS, 3х5x каждый в течение 10 минут на платформе вращения.
- Замените раствор 100 мл смеси вторичных антител (анти-кролик IgG с Alexa Fluor 488 и анти-мышеловка IgG с Alexa Fluor 555) в 1% BSA в PBS при разбавлении 1/500 и инкубировать за 3х4 ч на RT.
- Вымойте ячейки с 2 мЛ PBS, 3'4x каждый в течение 5 минут на платформе вращения.
- Замените раствор 2 мл 0,5 мкг/мл DAPI в PBS, чтобы запятнать ДНК в течение 30 минут на RT на платформе вращения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо DAPI, Hoechst 33342 в той же концентрации также может быть использован. - Замените раствор на 100 мл монтажнойсреды (Таблица материалов).
- Семя 2.5 x 105 HeLa клетки на 35-мм стеклянно-нижней блюдо и вырастить их в 2 мл среды роста (Dulbecco модифицированный орлиный носитель с L-глютамин и пируват натрия дополнен 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота "FBS") на 37 градусов по Цельсию и концентрации CO2 5%. Кроме того, семена 6 х 104 HeLa клетки на 8-хорошо камерных coverglass и растут их в 0,5 мл среды роста при 37 градусов по Цельсию и CO2 концентрации 5%. Используйте #1,5 крышки (толщиной 0,170 мм) для микроскопии высокого разрешения.
- Подготовка образца биологической калибровки
- Подготовка фиксированных клеток, описанных в шагах 1.1.1'1.1.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно, образцы подготовлены на камерном coverglass для того чтобы установить и образцы цели и справки в отдельно камерах на таком же coverlip(таблица 1, right-most). Этот препарат предпочтительнее, когда эксперимент требует высокой точности коррекции. Когда образец должен быть подготовлен на регулярной крышке, используйте точность охватывает с низкой толщиной изменения ("No 1.5H"), чтобы обеспечить воспроизводимость. - Подготовьте фондовый раствор флуоресцентного красителя-конъюгированного фаллоидина в 1,5 мл метанола и храните при -20 градусов по Цельсию. Смешайте фаллоидиновый стоковый раствор в PBS при следующем разбавлении: 1/100 для фаллоидинов с Alexa Fluor 405, 1/1,000 для фаллоидина с Alexa Fluor 488 и 1/200 для фаллоидина с Alexa Fluor 594.
- Замените раствор 1 мл фаллоидиновой смеси, приготовленной в шаге 1.2.2 и инкубировать в течение 30 минут на RT на платформе вращения.
- Вымойте ячейки с 2 мЛ PBS, 3х5x каждый в течение 10 минут на платформе вращения.
- Замените раствор на 100 мл монтажной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровочные образцы могут храниться при 4 градусах или -20 градусов по Цельсию для повторного использования.
- Подготовка фиксированных клеток, описанных в шагах 1.1.1'1.1.4.
2. Приобретение справочных изображений
- Ссылки на изображения Crosstalk
- Поместите целевой образец, подготовленный в шаге 1.1, на широкоугольный микроскоп.
- Приобретите флуоресценцию изображения цели синим, зеленым и красным каналам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для 3D-изображений размер шага в эталонном изображении может отличаться от размера целевого изображения до тех пор, пока файл изображения содержит информацию о размере шага. Размер шага для эталонных и целевых изображений предпочтительно составляет менее половины оптического разрешения оси , которая рассчитывается
для микроскопии с ограниченным дифракции, где —является длина волны в наномеметров, а NA — численная диафрагма объективного объектива. Например, если осевое разрешение составляет 550 нм, то используйте шаг меньше 275 нм. Для эталонного изображения не требуется временных рядов. - Впоследствии, чтобы получить флуоресценцию изображения ссылки, выберите возбуждение света только для DAPI, и выбрать для приобретения в синий, зеленый и красный каналы. Приобретите эталонное изображение точно на том же положении сцены и высоте, в случае 3D-стека.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для более длинных длин волн излучения потребуется повышенная интенсивность освещения и время экспозиции.
- Яркие-полевые справочные изображения
- Поместите целевой образец, подготовленный в шаге 1.1, на широкоугольный микроскоп.
- Приобретите флуоресценцию изображения цели синим, зеленым и красным каналам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер шага предпочтительно выполняет критерий Nyquist как описано в шаге 2.1.2. - Приобретите яркое поле изображения цели синим, зеленым и красным каналам точно на той же стадии позиции, что и в 2.2.2 и той же высоте в случае 3D-стека.
- Биологические калибровочные справочные изображения
- Поместите целевой образец, подготовленный в шаге 1.1, на 3D-SIM-микроскоп.
- Приобретите флуоресценцию изображения цели синим, зеленым и красным каналами 3D-SIM. Реконструкция супер-решенного изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тип микроскопа может быть любого типа, таких как 3D-SIM, confocal, STED и т.д. Размер шага предпочтительно выполняет критерий Nyquist, как описано в шаге 2.1.2. - Приобретайте несколько флуоресценций изображений ссылки, подготовленной в шаге 1.2 на различных позициях, аналогичных целевому изображению (шаг 2.3.2) 3D-SIM. Реконструкция супер-решенных изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество пикселей в XY должно быть одинаковым во всех эталонных изображениях. Размер шага в q должен быть одинаковым во всех справочных изображениях. Общее количество разделов q предпочтительнее быть таким же, как и на целевом изображении, но это не является абсолютным требованием. Позиция XY на сцене для этих эталонных изображений не имеет значения, потому что положение или крышка уже отличается от позиции целевого образца и, кроме того, разница в хроматической сдвиг на одном крышке менее 15 нм3. Условия визуализации, включая объективную линзу, температуру наблюдения, масло погружения, размер пинхола в конфокальной микроскопии и угол наклона в микроскопии высоко наклонной подсветки16,должны соответствовать ссылке на лучшую производительность. Если микроскоп оснащает несколько камер для приобретения нескольких каналов одновременно, эталонные изображения должны приобретаться так часто, как еженедельно, чтобы исправить инструментальный дрейф.
для микроскопии с ограниченным дифракции, где —является длина волны в наномеметров, а NA — численная диафрагма объективного объектива. Например, если осевое разрешение составляет 550 нм, то используйте шаг меньше 275 нм. Для эталонного изображения не требуется временных рядов.3. Коррекция хроматической смены с использованием программного обеспечения Chromagnon
- Используя веб-браузер, перейдите на https://github.com/macronucleus/Chromagnon/releases,и скачать новейший бинарный релиз Chromagnon.
ПРИМЕЧАНИЕ: Двоичные релизы доступны для Windows, Mac и некоторых версий Linux. - Извлеките программу и поместите исполняемый файл в удобное место. На Windows или Mac дважды щелкните файл, чтобы открыть его, или же выполнить двоичный файл из командной строки на системе Linux.
ПРИМЕЧАНИЕ: Графический пользовательский интерфейс, как на рисунке 1 откроется. Программа может быть запрещена от открытия двойным нажатием в первый раз по соображениям безопасности. В этом случае используйте платформозависимый метод, чтобы открыть программу, загруженную из Интернета.
Рисунок 1: Скриншот графического пользовательского интерфейса Chromagnon. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
- Перетащите и падение справочных файлов в "Справочное поле"(Рисунок 1) или нажмите Справочные файлы (Рисунок 1A), чтобы открыть диалог селектора файла. В зависимости от форматов файла, если программа попросит установить набор Java Development Kit (JDK), нажмите "да" и пользователь будет перемещаться на странице загрузки. Скачать и установить JDK для операционной системы в соответствии с инструкциями. Chromagnon должен быть в состоянии прочитать формат файла изображения после перезагрузки программы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Chromagnon может читать большинство форматов файлов изображений (многостраничный 'tif', 'czi', 'nd2', 'oib', 'lif', 'dv', и т.д.). Исходный формат изображения микроскопа предпочтительнее на этом этапе, потому что метаданные могут быть потеряны, когда формат изображения преобразуется в многостраничный файл tif. Если название канала отображается как 0, 1, 2 и т.д. вместо длин волн, таких как 528, 609(рисунок 2A,зеленые коробки), то Chromagnon не знает идентичности каналов на изображении. В этом случае убедитесь, что порядок каналов и размер пикселя в справочном файле совпадают с тем, что в целевом файле. Например, если порядок каналов в ссылке зеленый и красный, то порядок каналов в мишени также должен быть зеленым и красным, но не красным и зеленым.
Рисунок 2: Пример скриншота для загрузки нескольких файлов. (A) Случай, в котором все справочные изображения имеют соответствующие целевые изображения. Имена каналов правильно идентифицируются по длинам волн (указанным зеленой коробкой) в файлах изображений, используемых в этом примере. (B) Случай, в котором одно эталонное изображение используется для коррекции нескольких целевых изображений. (C) Случай, в котором несколько эталонных изображений (указанные красным ящиком) усредняются, а полученное эталонное изображение после усреднения используется для коррекции нескольких целевых изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
- Перетащите и упадите целевые файлы в "Целевой ящик"(Рисунок 1) или нажмите Целевые файлы (Рисунок 1B), чтобы открыть диалог селектора файла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть несколько целевых изображений и каждый из них имеет соответствующие справочные изображения, соответствующее эталонное изображение и целевое изображение должны быть на том же ряду в соответствующих ссылках и целевых коробках(Рисунок 2A). Одно эталонное изображение также может быть использовано для выравнивания нескольких целевых изображений(рисунок 2B). - Проверьте флажок маржи урожая, если не проверено(рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если этот флажок проверен, поля, полученные в результате выравнивания, обрезаются. Проверьте этот параметр для общего использования, но неу контроля, если пиксель уровня сравнения требуется между изображениями до и после выравнивания. - Выберите формат вывода изображения из списка выбора(Рисунок 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Доступные форматы: 'tif' (формат ImageJ17), 'dv' и 'ome.tif'; формат 'ome.tif' доступен только после установки JDK. - Укажите суффикс для выемки(рисунок 1E,значение по умолчанию "_ALN"), которое добавляется к целевому имя файла.
- Для перекрестных эталонных изображений с высоким соотношением сигнала к шуму используйте локальное выравнивание из списка выбора локального выравнивания (рисунок 1F),выберите Проекцию для использования локального выравнивания и ни одного, чтобы отключить его. Используйте минимальный размер окна 60 (Рисунок 1G).
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании локального выравнивания все целевые изображения должны иметь соответствующие справочные изображения(рисунок 2A). Локальное выравнивание не рекомендуется для биологических калибровочных справочных изображений, так как локальные хроматические сдвиги варьируются от одного образца к другому(Таблица 1). По той же причине одно локальное выравнивание не может быть применено ко многим целевым изображениям(рисунок 2B). В качестве исключения он может быть использован, когда образец интереса находится только на поверхности крышки, а поле зрения заполнено яркими предметами, как и разноцветные флуоресцентные образцы бисера. - Для нескольких биологических калибровочных справочных изображений проверьте средний вариант ссылок (Рисунок 1H)для измерения одного параметра выравнивания от усреднического изображения, и один параметр выравнивания затем применяется ко всем целевым изображениям(Рисунок 2C). Выберите Нет для локального выравнивания (Рисунок 1F).
- Нажмите Выполнить все (Рисунок 1I), чтобы начать измерения; параметры выравнивания применяются к целевым изображениям.
ПРИМЕЧАНИЕ: После измерения хроматических сдвигов из справочных файлов, программа делает файлы с расширением "chromagnon.csv" или "chromagnon.tif". Тип вывода файла зависит от того, действует ли локальное выравнивание(рисунок 1F). Если выравнивание осуществляется без локального выравнивания, выходом является "chromagnon.csv", в то время как при использовании локального выравнивания выход "chromagnon.tif". Имена файлов такие же, как и справочный файл, за исключением указанного суффикса(рисунок 1J,по умолчанию без суффикса) и расширения ("chromagnon.csv" или "chromagnon.tif"). Подробное описание процесса выравнивания можно найти в файле "Chromagnon.log", созданном в той же папке. - Подождите, пока исправленное изображение появится в зрителе(рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Перетаскивание изображения с помощью мыши перемещает изображение, а перемещение колеса мыши меняет зум. Переместите ползунок(рисунок 3A),чтобы изменить раздел q (and/or T, когда это применимо) для отображения. Если зритель слишком медленно обновляет изображение, нажмите на кнопку загрузить все данные в кнопку памяти(рисунок 3B),чтобы остановить доступ к данным на жестком диске. Перетаскивание левого или правого края цветных коробок(рисунок 3C)может управлять минимальными или максимальными значениями для отображения. Нажатие кнопки для каждого канала(Рисунок 3D) переключается между отображением или сокрытием выбранного канала в зрителе. Правое нажатие на цветную коробку(Рисунок 3D) позволяет пользователям выбирать цвета для отображения, или изменить параметры отображения цветовой панели, а также позволяет пользователям указать точные минимальные и максимальные значения для масштабирования дисплея, выбрав "масштаб ...". Нажав кнопку Ортональная точка зрения (рисунок 3E) показывает изображения просмотров Y и X. Перемещение поперечных линий изменяет положение для показа в боковых видах.
Рисунок 3: Скриншот изображения зрителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
- Чтобы проверить, правильно ли выполнено измерение, перетащите и уроните справочные изображения в "Справочную коробку" и "Целевую коробку". Запустите программу и проверьте, идеально ли перекрываются изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии файлов "chromagnon.csv" или "chromagnon.tif" файлы могут быть использованы в качестве ссылки для того, чтобы пропустить измерения. Если хроматический сдвиг в изображении остается неисправленным, попробуйте решения, обобщенные в таблице 2. - Чтобы получить доступ к параметрам выравнивания в образце или когда параметры выравнивания необходимо редактировать вручную, откройте файлы "chromagnon.csv" непосредственно с любым текстовым редактором или программным обеспечением электронной таблицы. Когда он редактируется, сохраните его как "csv".
ПРИМЕЧАНИЕ: Значения в пикселях для "tz", "ty", "tx", и в градусах для "r", и в факторах увеличения для "mz", "мой", и "mx".- Кроме того, загрузить "chromagnon.csv" или "chromagnon.tif" файл в Chromagnon's Справочник или Целевой поле (Рисунок 1), а затем дважды нажмите его, чтобы открыть выравнивание редактор (Рисунок 4).
- Чтобы увидеть, сколько канал смещается при редактировании параметров, перетащите и уронайте файл эталонного изображения на нижнюю область(рисунок 4A),чтобы открыть изображение в редакторе. При редактировании значений в таблице(рисунок 4B)и нажав на ключ входа/возврата, наблюдайте, как перемещается изображение соответствующего канала по мере изменения значений. После редактирования, нажмите сохранить как... (Рисунок 4C), чтобы сохранить изменения.
Рисунок 4: Скриншот редактора параметров выравнивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
- Чтобы проверить локальную карту выравнивания, загрузите "chromagnon.tif" через Chromagnon's Reference или Target box(Рисунок 1),и дважды щелкните его, чтобы открыть редактор выравнивания (Рисунок 4). Нажмите на просмотр (рисунок 4D)для просмотра локального сдвига, указанного линиями, длина которых увеличена фактором, указанным в списке выбора увеличения (рисунок 4E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Указывая "оригинальный файл изображения"(рисунок 4F),сдвиги отображаются вместе с исходным изображением.
4. Создание локальной карты выравнивания, специфичной для микроскопа
- Разбавить 2 л разноцветных флуоресцентных бусин диаметром 200 нм в 18 мл этанола.
- Vortex раствор и место 10 мл шарика решение в центре стеклянного дна блюдо. Обязательно используйте #1,5 крышки (с толщиной 0,170 мм) для микроскопии высокого разрешения.
- Оставьте блюдо на RT на 1 ч, чтобы полностью высохнуть.
- Поместите блюдо на микроскоп, чтобы быть откалиброваны и сосредоточиться на флуоресцентные бусы.
- Получите 2D или 3D-изображения с микроскопом для калибровки. Получить несколько изображений, изменив положение сцены.
- Открыть графический пользовательский интерфейс Chromagnon.
- Перетащите и падение шарик изображения файлов на "Справочная коробка" (Рисунок 1) или нажмите Справочные файлы (Рисунок 1), чтобы открыть диалог селектор файла.
- Проверьте средний вариант ссылок(Рисунок 1H). Из списка выбора локального выравнивания (рисунок 1F),выберите Проекцию. Используйте минимальный размер окна 60 (Рисунок 1G). Нажмите Выполнить все (Рисунок 1I), чтобы начать измерения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Создается файл ".chromagnon.tif", в котором хранится локальная карта выравнивания микроскопа. - После измерения нажмите Дополнительные параметры (рисунок 1K). От местного искажения вашего микроскопа инструмент поле, нажмите на список выбора и выбрать новый ... Перетащите и упадите файл "chromagnon.tif", созданный в шаге 4.8, в поле имен файла или нажмите кнопку выбора файла, чтобы открыть диалог селектора файлов. Введите название микроскопа и нажмите OK.
- При измерении хроматических сдвигов от перекрестных или биологических калибровочных справочных изображений нажмите Дополнительные параметры (Рисунок 1K). Из локального искажения вашего микроскопа инструмент поле, выбрать имя микроскопа, указанного в шаге 4.9. Нажмите OK.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор "Местное искажение вашего микроскопа инструмент" не сохраняется после того, как программа закрыта. - Приступаем к хроматической коррекции без локального выравнивания, как в разделе 3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно использовать локальное выравнивание в дополнение к калибровке микроскопа. В этом случае локальное выравнивание начинается с калибровки микроскопа.
Representative Results
Пример коррекции хроматической смены с помощью эталонного изображения crosstalk показан на рисунке 5. Изображение было получено с помощью широкоугольного микроскопа, оснащенного одной камерой. Флуоресценция излучения от DAPI была использована в качестве эталона(рисунок 5A,B)для коррекции синего, зеленого и красного каналов. Изображение состоит из 3 каналов по 60 ломтиков, каждый из которых состоит из 256 х 256 пикселей. Изображения были деконвольвинг перед измерением хроматических сдвигов. Измерение локальных хроматических сдвигов с помощью Chromagnon заняло 51 с на Mac с Intel Core i7 (четырехъядерный ядро, 8-ниток, 2,7 ГГц), 16 ГБ оперативной памяти и 1 ТБ флэш-памяти. Параметр выравнивания был применен к целевому изображению(рисунок 5C,D),которое имеет точно такое же количество вокселей, что и эталонное изображение. Подготовка выровненного файла заняла 3 с. В результате обрезки пикселей края в процессе выравнивания (контрольный ящикмаржи культуры на рисунке 1С),количество вокселей было уменьшено после выравнивания(рисунок 5B, 51 ломтиков, 252 x 251 пикселей). ДНК в анафазном мосту (показанная наконечниками стрел) видна неправильно за пределами ядерной оболочки перед выравниванием(Рисунок 5C, очевидный в нижней панели, показывающей вид X'), но, как и ожидалось внутри конверта после выравнивания (Рисунок 5D).
Пример коррекции хроматической смены с использованием биологического калибровочного эталонного изображения показан на рисунке 6. Изображения были получены с помощью сим-микроскопа, оснащенного тремя камерами. Три изображения heLa клетки окрашенных фаллоиоитинами спряжены на синий, зеленый и красный красители были усреднены (Рисунок 6A). Справочное изображение состоит из 3 каналов по 76 срезов, каждый из которых состоит из 1024 х 1024 пикселей. Измерение хроматических сдвигов с использованием Chromagnon без локального выравнивания требуется 194 с на системе Mac описано выше. Параметр был применен к целевому изображению, состоящему из 3 каналов из 73 ломтиков, каждый из которых состоит из 1024 х 1024 пикселей. Поколение выровненного файла заняло 25 с. Вид X' показывает неправильные позиции канала вдоль q, и немного вдоль X направлений(Рисунок 6A,C), но это неправильное регулирование было исправлено после выравнивания (Рисунок 6B, D).
Рисунок 5: Пример выравнивания с перекрестным эталонным изображением. Клетки HeLa были окрашены DAPI для ДНК (показано в пурпурном), Alexa Fluor 488 (показано желтым цветом) для ядерного конверта, и Alexa Fluor 555 (показано синим цветом) для микротрубочек. Изображения были приобретены 3D широкоугольной микроскопией с одной камерой и дезконволвированными. (A,B) Репрезентативное справочное изображение с использованием излучения DAPI до и после выравнивания Chromagnon. Три цветных канала отображаются как накладные. (C,D) Оптический раздел 3D стека в трех каналах до и после выравнивания. Осевая хроматическая аберрация очевидна на анафазном мосту, показанном наконечниками стрел. Масштабная планка в панели А указывает на 5 мкм для всех панелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Пример выравнивания с биологическим калибровкой эталонного изображения Изображения были приобретены с 3D-SIM оснащены тремя камерами. (A,B) Справочное изображение усредных от трехизображенийдо ( A ) и после (B) выравнивание. HeLa клетки были окрашены фаллоидином сопряжены с Alexa Fluor 405, 488 или 594. (C,D) Целевое изображение до(C)и после(D)выравнивания. Клетки HeLa были окрашены DAPI для ДНК (показано в пурпурном), Alexa Fluor 488 (показано желтым цветом) для ядерного конверта, и Alexa Fluor 594 (показано синим цветом) для микротрубочек. Масштабная планка в панели А указывает на 5 мкм для всех панелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Процедура хроматической коррекции является компромиссом между точностью и усилием. Чтобы сэкономить ненужные усилия, лучше знать, сколько точности требуется для вашего исследования. Для обычной широкоугольной (живой) визуализации может не потребоваться высокая точность, и, таким образом, ярких полевых справочных изображений часто достаточно для коррекции хроматического сдвига. Аналогичным образом, когда состояние изображения и окружающая среда постоянна, повторное использование биологической калибровки сэкономит время. С другой стороны, при желаемой высокоточной регистрации необходимы высококачественные перекрестные или биологические калибровочные справочные изображения. Для наилучшей производительности, справочные изображения должны быть получены с такими же условиями и таймингами, как целевые изображения, как это возможно. До тех пор, пока и эталонные, и целевые изображения получаются с помощью одной микроскопии, более высокое пространственное разрешение повысит точность коррекции. Если деконволюция доступна как для эталонных, так и для целевых изображений, то реализация этого перед коррекцией может повысить точность коррекции. Кроме того, для наилучшей производительности теорема выборки для оптической оси (я) должна быть выполнена как в справочном, так и в целевом файле для точной субпиксельной интерполяции (протокол шаг 2.1.3).
Неспособность исправить хроматический сдвиг приводит к неправильным выводам. Кроме того, использование неправильной калибровки может даже ухудшить хроматические сдвиги, а не исправление их, и поэтому этого следует избегать. Мы обобщили возможные причины сбоев и их общие решения в таблице 2. Чтобы изучить причину сбоя, в первую очередь, необходимо визуально проверить, точно ли исправлена хроматическая сдвиг в эталонном изображении (протокол шаг 3.12). Большинство сбоев обусловлены качеством справочных изображений и легко устраняются в соответствии с описаниями в таблице 2. Что касается качества справочных изображений, важно отметить, что точность глобального выравнивания уменьшается, если все поле зрения не заполнено образцом(рисунок 7, Таблица 2). По сравнению с хорошим примером, показанным на рисунке 7A,плохой пример, показанный на рисунке 7B, содержит только три ядерных оболочки в верхнем левом регионе, и Chromagnon не удалось выровнять часть этого изображения. Это потому, что глобальный метод выравнивания Chromagnon делит поле зрения на четыре региона(рисунок 7C) для того, чтобы измерить различия в вращении и увеличении с высокой точностью3. Этот метод, при правильном управлении, является одним заказом более точным, чем другие линейные методы, такие как преобразование полярная журнал и методы простого3. Если какой-либо из четырех регионов недоступен, то Chromagnon перейдет на менее эффективные линейные методы. Поэтому для наилучшей производительности примеры, приведенные на рисунке 7B и рисунке 7C, являются нежелательными, а четыре области должны быть заполнены объектами. Пользователи могут проверить, недоступна ли какая-либо квадратная область поля зрения для измерения, посмотрев на файл журнала ("Chromagnon.log"; см. протокол шаг 3.10). К счастью, эту проблему можно легко преодолеть, усредняя несколько изображений биологической калибровки или используя локальное выравнивание для перекрестных или ярких изображений ссылки (Таблица 2). В отличие от неспособности исправить справочные изображения, неспособность исправить целевые изображения труднее определить. Поскольку такие сбои возникают из-за различий в форматах файлов, условиях визуализации, сроках визуализации, методах визуализации/выравнивания между эталонными и целевыми изображениями(Таблица 2),пользователи должны всегда быть осторожными при использовании эталонных изображений, полученных в различных условиях/таймингах от целевых изображений. Некоторые примеры изображения доступны для тестирования(https://github.com/macronucleus/Chromagnon), чтобы получить конкретное представление о хороших и плохих изображений примера.
| Проблема | Вызвать | Решение |
| Не удалось исправить эталонное изображение | Низкий контраст | По возможности приобретите более высокое контрастное изображение. При использовании эталонного изображения яркого поля, повторное использование изображения в водном растворе для получения более высокого контраста ячейки. Кроме того, попробуйте применить вычислительное снижение шума (например, гауссианская фильтрация). Выключите локальное выравнивание, которое более чувствительно к шуму. |
| Загрязнение несвязанных изображений | Удалите источник не связанных изображений в образце, если это возможно. Для перекрестных эталонных изображений проверьте спектры возбуждения красителей, используемых для целевых изображений. Если красители взволнованы во время приобретения изображения crosstalk (например, Alexa Fluor 568 или 594), рассмотрим другие красители (например, Alexa Fluor 555). Если пыль на чипе камеры создает очевидную разницу в канале, очистите чип камеры или используйте вычислительный метод плоского поля. | |
| Чрезвычайно яркое пятно, сделанное космическим лучом | Приобретите изображение снова, если это возможно. Кроме того, попробуйте применить вычислительное снижение шума (например, медианная или гауссиальная фильтрация). | |
| Артефакты деконволюции (искусственные сигналы на осевом и боковом краях) | Обрезать пиксели края или разделы после деконволюции. Если одна сторона обрезана, другая сторона также должна быть обрезана для поддержания центра изображения. | |
| Размер шага слишком разреженный | Для выполнения критерия Nyquist, написанного в протоколе 2.1.3, должен быть приобретен стек q. | |
| Оптическая аберрация | Сферическая аберрация является основной аберрации, вызванной пользователями. Выберите правильный объектив для образца и используйте толщину крышки 170 мкм. Если объектив оснащен кольцом коррекции, отрегулируйте его, чтобы найти положение, в котором наибольшее количество флуоресценции получено из фокуса. В случае масляного погружения цели без коррекции кольца, отрегулируйте рефракционный индекс масла погружения, что увеличивает количество флуоресценции в фокусе. | |
| Поле зрения незаполнее (рис. 7) | В случае биологической калибровки справочные изображения, в среднем много изображений. В случае перекрестного разговора или ярко-полевых эталонных изображений используйте локальное выравнивание. | |
| Неопознанная ошибка программного обеспечения | Сообщите о проблеме через GitHub(https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues) | |
| Не удалось исправить целевое изображение | Метаданные файла изображения потеряны | Используйте исходный формат файла микроскопа, содержащий полные метаданные, и избегайте преобразования в многостраничный файл tiff перед обработкой. Используйте тот же заказ каналов, что и в протоколе 3.3. |
| Неправильные методы выравнивания для данной микроскопии | Не применять локальный метод выравнивания при измерении от биологической калибровки эталонных изображений к целевым изображениям. Не используйте перекрестные справочные изображения, кроме широкоугольной микроскопии. | |
| Различия в условиях визуализации | Поддерживайте постоянную работу между ссылкой и целевыми изображениями, как написано в протоколе 2.3.3. | |
| Различия в выборке (включая обложку) | Всегда используйте ту же среду крепления, крышку (например, No 1.5H) и аналогичную глубину фокусировки. | |
| Микроскоп дрейф с момента калибровки в последний раз сделал | Сделать калибровку так же часто, как каждые две недели. Держите температуру постоянной, и использовать плавающий стол, чтобы избежать аппаратного дрейфа микроскопа. |
Таблица 2: Устранение неполадок для хроматической коррекции.
Рисунок 7: Примеры эталонных изображений. Ядерный конверт в дрожжевых клетках деления, помеченных GFP и mCherry. Изображения были приобретены с помощью обычной широкополой микроскопии. Хроматические сдвиги были исправлены с помощью Chromagnon без локального выравнивания, используя сами изображения в качестве эталонных изображений. Изображения были затем deconvolved, чтобы показать детали. (A) Хороший пример со многими объектами в поле зрения. (B)Плохой пример с объектами только в верхнем левом углу. Несоответствие очевидно в определенном регионе изображения. (C) Нежелательный пример, когда один из четырех ризек (разделенных пунктирными линиями) пуст. Масштабная планка в панели А указывает 5 мкм для полного представления поля и 1,25 мкм для увеличенного представления и применима ко всем панелям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
В этом протоколе мы описали три различных типа ссылок (Таблица 1). Среди них, перекрестные справочные изображения и биологические калибровочные справочные изображения нуждаются в дальнейшем тщательном обсуждении. Для перекрестных эталонных изображений образцы, окрашенные DAPI или Hoechst 33342, и установленные в глицероле или коммерческих монтажных носителях, могут быть эффективно использованы для выравнивания синих, зеленых и красных каналов. Аналогичным образом, Alexa Fluor 488 может быть использован для выравнивания зеленых и красных каналов. Тем не менее, получение перекрестного флуоресценции часто трудно, поскольку многие синие красители, за исключением DAPI и Hoechst тусклым и распадаются быстрее, чем большинство зеленых и красных красителей. Кроме того, спектры выбросов современных красителей более узки, что делает выравнивание более чем трех каналов этим методом сложным. Следует также обратить внимание на некоторые общие красные красители (например, Alexa Flour 568 и 594, но не Alexa Fluor 555), которые могут быть возбуждены фиолетовый свет, которые предотвращают получение высокой контрастной перекрестного изображения от синих красителей. Другим недостатком является то, что этот метод не может измерить хроматическое аберрация возбудителей световых путей в многоцветном возбуждении, потому что только одна длина волны возбуждения используется для возбуждения (Таблица 1). Поскольку самая передовая микроскопия использует измененную оптику освещения, применение этого метода ограничено. Тем не менее, его более высокая точность коррекции достаточно выгодна для того, чтобы быть описанным в этом протоколе. Как правило, изображение перекрестного разговора должно быть принято после целевого изображения для предотвращения отбеливания или фототоксичных эффектов. Для SMLM наблюдается с широкополым режимом, эталонное изображение должно быть приобретено, прежде чем приобретать целевое изображение, как флуоресценции красители могут быть отбелены во время визуализации.
Биологические калибровочные справочные изображения позволяют пользователям легко выравнивать любое желаемое количество каналов за счет дополнительной подготовки образца. Еще одним преимуществом биологических калибровочных справочных изображений является наличие "усреднения" нескольких ссылок, которые помогают заполнить все поля зрения. Этот метод может страдать от различий в условиях визуализации, если образец калибровки подготовлен на другом слайде. Большая часть этой проблемы может быть решена, если как цели, так и ссылки готовятся на одном слайде с помощью коммерческих камерных крышки(Таблица 1),а другие условия визуализации остаются неизменными, как в протоколе шаг 2.3.3. В этом случае можноожидатьточность коррекции, аналогичную точности перекрестных ссылок. Протокол для использования фаллоидин, как показано здесь является одним из самых простых способов окрашивания одной клеточной структуры с несколькими цветами. Существует множество возможных сценариев подготовки образцов биологической калибровки. Для иммуносеивления, образец может быть помечен одним первичным антителом с последующим окрашивание с вторичными антителами нескольких цветов. Таким образом, единая целевая структура может быть помечена несколькими цветами. Кроме того, 5-этинилл-2'-дезоксюиринин, обнаруженный "нажмите" химии этикетки вновь синтезированных ДНК в нескольких цветах при высокой плотности, как описано подробно ранее8. Для живых клеток полезно подготовить трансгенный штамм, укрывающий две копии гена, которые сливаются с GFP или mCherry, чтобы обозначить одну и ту же структуру двумя цветами. Если число копий гена имеет решающее значение, как часто наблюдается для мембранных белков, одна копия гена может быть тандемно слиты gFP и mCherry (Рисунок 7). Фотоконвертируемые флуоресцентные белки, такие как mEOS218, также могут быть использованы при освещении умеренного уровня фиолетового света для получения обоих видов белка с или без фотоконверсии. При условиях низкого уровня кислорода, GFP также может быть использован в качестве фотоопровержимого белка от зеленого до красного19,,20. Таким образом, выбор правильного образца калибровки сделает эксперимент более надежным.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано JSPS KAKENHI Грант номера JP19H03202 до A.M., JP18H05528 и JP17H03636 до T.H., и JP17H01444 и JP18H05533 до H.Y. L.S. признают поддержку Добро пожаловать Целевой Стратегические награды 091911 и 107457 / / 15 / » финансирование передовых изображений в Micron Оксфорд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% formaldehyde solution | Polyscience | 18814-10 | |
| 35 mm glass-bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Alexa Fluor 405 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A30104 | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16170078 | |
| Coverslip | Matsunami | No. 1S HT | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate | Nacalai Tesque | 08458-16 | |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1) | Described in Ref 15. | ||
| Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well) | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
| Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1) | A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased. | ||
| Secondary antibody with Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | |
| Secondary antibody with Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21424 | |
| Secondary antibody with Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| TetraSpeck Microspheres, 0.2 µm | Thermo Fisher Scientific | T7280 |
References
- Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
- Manders, E. M. M. Chromatic shift in multicolour confocal microscopy. Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).
- Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 7583 (2018).
- Grünwald, D., Singer, R. H. In vivo imaging of labelled endogenous β-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport. Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Schulz, O., et al. Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).
- Müller, C. B., Enderlein, J. Image Scanning Microscopy. Physical Review Letters. 104 (19), 198101 (1981).
- Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
- Yorifuji, H., et al. Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane. Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).
- Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies. Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Sawin, K. E., Nurse, P. Photoactivation of green fluorescent protein. Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).
- Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. Photoactivation turns green fluorescent protein red. Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).
