Summary
تصحيح التحولات اللونية في صور المجهر الفلورية متعددة الأبعاد (3D) ثلاثية الأبعاد أمر بالغ الأهمية لتحليل البيانات الكمية. تم تطوير هذا البروتوكول لقياس وتصحيح التحولات اللونية في العينات البيولوجية من خلال الحصول على الصور المرجعية المناسبة وتجهيزها مع البرمجيات مفتوحة المصدر ، Chromagnon.
Abstract
يعتمد المجهر الفلوري الكمي متعدد الألوان على المطابقة المكانية الدقيقة للقنوات اللونية التي تم الحصول عليها في أطوال موجية مختلفة. بسبب الانحراف لوني والمحاذاة غير الكاملة للكاميرات، قد يتم نقل الصور المكتسبة في كل قناة، وتضخيمها، وكذلك استدارة بالنسبة لبعضها البعض في أي من الأبعاد الثلاثة. مع طريقة المعايرة الكلاسيكية، يتم قياس التحولات اللونية بواسطة الخرز متعدد الألوان المرفقة على سطح غطاء، وعدد من البرامج المتاحة لقياس التحولات لوني من هذه العينات المعايرة. ومع ذلك، يمكن أن يختلف الانحراف اللوني باختلاف العمق، وأن يتغير مع ظروف المراقبة، وأن يستحثه العينة البيولوجية نفسها، مما يعوق تحديد المقدار الحقيقي للتحول اللوني في عينة الاهتمام وعبر الحجم. تصحيح التحولات اللونية بدقة أعلى وثيق الصلة بشكل خاص بالمجهر فائق الدقة حيث قد تؤثر التحولات اللونية الطفيفة فقط على التحليلات الكمية وتغيير تفسير الصور متعددة الألوان. لقد قمنا بتطوير برنامج مفتوح المصدر Chromagnon والطرق المصاحبة لقياس وتصحيح التحولات اللونية ثلاثية الأبعاد في العينات البيولوجية. هنا نقدم بروتوكول تطبيق مفصل يتضمن متطلبات خاصة لإعداد العينات، وحيازة البيانات، ومعالجة البرمجيات لقياس التحولات اللونية في العينات البيولوجية ذات الاهتمام.
Introduction
التصوير متعدد الألوان هو أحد الجوانب الأساسية للمجهر الفلوري البيولوجي، في الحالات التي تكون فيها العلاقة المكانية بين جزيئات أو هياكل مختلفة ذات أهمية كبيرة. انحراف لوني، انحراف بصري للضوء متعدد الألوان الناجم عن التشتت، يغير الموقف الظاهر للكائنات الملونة ذات الأهمية. وبالمثل، فإن المجاهر المجهزة بكاميرات متعددة مكرسة للحصول على كل لون لها تحولات لوني أكثر تعقيدا بسبب الاختلافات في العناصر البصرية والمحاذاة غير الكاملة بين القنوات. وهكذا، قد تؤدي هذه التحولات اللونية إلى استنتاج كاذب ما لم يصححها المستخدم صراحة. على الرغم من أن التحولات اللونية لم تكن مشكلة رئيسية طالما أن حل المجهر محدود بالحد الكلاسيكي من الدقة ، إلا أن التطور الأخير للمجهر فائق الدقة1 قد دفع إلى الحاجة إلى تصحيح أكثر دقة للتحولات اللونية.
وقد كانت ممارسة شائعة لقياس التحولات لوني من أنظمة المجهر باستخدام شريحة معايرة متعددة الألوان حبة2. طريقة المعايرة القائمة على الخرز مناسبة لقياس التحولات اللونية من بصريات المجهر بأكملها نحو سطح الغطاء2. غير أن هذه الطريقة غير قادرة على قياس التحولات اللونية في العينات البيولوجية ذات الأهمية. ومن المهم ملاحظة أن العديد من العينات البيولوجية ثلاثية الأبعاد (3D)، وتختلف التحولات اللونية لهذه العينات عن تلك الموجودة على سطح الغطاء. وعلاوة على ذلك، يتغير التحولات اللونية مع ظروف التصوير2،3. لقد قمنا بقياس التحولات اللونية في العينات البيولوجية ثلاثية الأبعاد ووجدنا أن عدم اليقين في التحولات اللونية كان في كثير من الأحيان 350 نانومتر بواسطة الطريقة الكلاسيكية متعددة الألوان - الخرزة معايرة3. لذلك، يجب قياس التحولات اللونية في العينات البيولوجية في عمق الفائدة وتحت ظروف التصوير المستخدمة.
هنا، ونحن وصف إجراءات لقياس التحولات لوني في العينات البيولوجية وتصحيح هذه التحولات باستخدام برنامجنا، Chromagnon3. لقياس التحولات اللونية في العينات البيولوجية، تستخدم طريقتنا نوعين من مجموعات البيانات، صورة "الهدف" وصورة "مرجعية". صورة "الهدف" هي صورة متعددة الألوان ذات أهمية ، على سبيل المثال ، صور ملطخة للحمض النووي ، والمغلف النووي ، والميكروتوبات. غالباً ما يكون من المستحيل قياس التحولات اللونية في مثل هذه الصورة. لذلك، نحن بحاجة إلى صورة "مرجعية" مخصصة لقياس التحولات اللونية في العينة. التعريف الوحيد لصورة "مرجع" هو صورة متعددة الألوان لنفس الكائن. في هذا المعنى ، فإن صورة حبات متعددة الألوان هي أيضًا نوع من الصور المرجعية. هنا، نحن وصف ثلاثة أنواع مختلفة من الصورة المرجعية التي تستخدم لقياس التحولات لوني في العينات البيولوجية: "الصور المرجعية عبر" و "الصور المرجعية مشرق المجال" و "الصور المرجعية للمعايرة البيولوجية". يعتمد نوع الصورة المرجعية على نوع المجهر المستخدم أو دقة التصحيح المطلوبة كما هو ملخص في الجدول 1.
| عبر الحديث | حقل مشرق | المعايرة البيولوجية (على شريحة مختلفة) | المعايرة البيولوجية (على الشريحة نفسها) | |
| دقةa | +++ | + | ++ب | +++ |
| البساطه | ++ | +++ | ++ | ++ |
| المجهر القابل للتطبيق | مجال واسع | مجال واسع | جميع | جميع |
| توفر المحاذاة المحلية | + | + | -ج | -ج |
|
a:عدد "+" يشير إلى زيادة التصنيف. زائد واحد حوالي 50 نانومتر وثلاثة زائد حوالي 15 نانومتر في 3D. ب: تعتمد الدقة على مدى ثبات ظروف التصوير المتغيرة. ج:يمكن الجمع بين المعايرة المحلية التي تقاس من عينات حبة متعددة الألوان كما هو موضح في القسم 4 من البروتوكول. |
||||
الجدول 1: المعلمات عند اختيار نوع الصور المرجعية.
"الصور المرجعية عبر الحوار" لديها أعلى دقة التصحيح وبسيطة نسبيا لإنجاز3،4 (الجدول 1). العيب هو الحد من تطبيقات المجهر بسبب عدم قدرتهم على قياس التحولات اللونية في مسارات الإثارة. أيضا، للحصول على مثل هذه الصور، ينبغي أن تكون مجهزة المجهر مع مرايا متعددة النطاقات dichroic، ومرشحات الانبعاثات التي يتم التحكم فيها بشكل مستقل من مرشحات الإثارة أو مصادر الضوء. يتضمن المجهر المناسب المجهر التقليدي واسع المجال ، والمجهر توطين جزيء واحد (SMLM) مثل المجهر التعريب تنشيط الصور / العشوائية المجهرية إعادة الإعمار البصرية (بالم / STORM)5،6 والمجهر التوسع7 لوحظ مع المجهر واسعة المجال. يتم الحصول على صورة مرجعية عبرية من العينة الهدف نفسه. بل هو صورة من crosstalk (من خلال نزيف) التألق من صبغة تم الحصول عليها في جميع القنوات المطلوبة. الانبعاثات Fluorescence دائماً يتوسع نحو أطوال موجية أطول، وبالتالي الأصباغ مع أقصر طول موجة الانبعاثات متحمسون للحصول على الفلورين ة عبر الTalk في قنوات أطول أطوال موجية. على سبيل المثال، عندما تكون العينة ملطخة باللون الأزرق والأخضر والأحمر، فإن الصبغة الزرقاء فقط هي المُتحمسة، ويتم الحصول على ضوء الانبعاثات في القنوات الزرقاء والأخضر والأحمر. في هذا البروتوكول، الحمض النووي ملطخة 4′، 6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) تم استخدامها للحصول على التألق عبر.
"مشرق الميدان المرجعي الصور" هي أسهل وأقل phototoxic بديل "عبر الحديث عن الصور المرجعية" ولكن هي أقل دقيقة3 (الجدول 1). هذه هي صور حقل مشرق من العينة المستهدفة، المكتسبة في جميع قنوات اللون المستخدمة في الصورة المستهدفة.
"الصور المرجعية للمعايرة البيولوجية" لها ميزة كونها قابلة للتطبيق على أي نوع من المجهر نظرا لقدرتها على قياس التحولات اللونية سواء في الإثارة ومسارات الانبعاثات3،8 (الجدول 1). المجهر مناسبة تشمل المجهر واسعة المجال، المجهري confocal، المجهر ورقة ضوء، حفز استنفاد الانبعاثات (STED)9، هيكل المجهر الإضاءة (SIM)10، Airyscan / SORA11،12، SMLM لاحظت مع الانعكاس الداخلي الكلي الفلورية (TIRF) الوضع ، أوليمبوس فائقة القرار (OSR)13، وهكذا دواليك. يتم الحصول على صورة مرجعية للمعايرة البيولوجية من عينة معايرة أعدت بنفسها كعينة الهدف، ولكن مع تلطيخ هيكل واحد مع ألوان متعددة. دقة التصحيح تتفوق على قرار معظم المجهر فائقة الدقة وإعداد عينة المعايرة البيولوجية يمكن أن تكون بسيطة نسبيا. ميزة أخرى هي توافر "متوسط" الصور المرجعية المتعددة. ولذلك، على الرغم من أن الصور الفردية تحتوي على معلومات رديئة لقياس التحولات اللونية، يمكن زيادة محتوى المعلومات عن طريق حساب متوسط صور متعددة. تعتمد الدقة على مدى ثبات ظروف التصوير. وفي هذا الصدد، يتم الحصول على أفضل أداء عندما تكون العينات المستهدفة والمرجعية على نفس الشريحة، باستخدام، على سبيل المثال، نظارات غطاء ذات 8 غرف جيدة(الجدول 1، أكثر اليمين). في هذا البروتوكول، actin ملطخة بثلاثة ألوان من phalloidin كان يستخدم كمعايرة بيولوجية.
مرة واحدة يتم الحصول على صورة مرجعية، ثم يتم قياس التحول اللوني وتصحيحها من قبل برنامجنا Chromagnon. لا يوجد أي قيود على عدد القنوات، أقسام Z والأطر الزمنية التي يمكن قياس Chromagnon وتصحيح التحولات لوني ل. يقيس Chromagnon التحولات اللونية في خطوتين. تكتسب الخطوة الأولى معلمات المحاذاة "العمومية" أو "affine" للترجمة في محاور X و Y و Z والتكبير على طول محاور X و Y و Z و الدوران حول محور Z. دقة الحساب من المحاذاة العالمية هو ~ 16 نانومتر في 3D و ~ 8 نانومتر في 2D. الخطوة الثانية هي "محاذاة محلية" اختيارية 2D التكرارية على الصور المتوقعة للحصول على دقة أعلى. في عملية المحاذاة المحلية، يتم تقسيم الصور إلى مناطق متعددة ويتم قياس التحولات اللونية في هذه المناطق المحلية. وبعد ذلك، تُقسَّم المناطق بشكل أكبر وتُقاس التحولات اللونية في المناطق دون الإقليمية بشكل متكرر إلى أن يصل عدد البيكسلات في المنطقة إلى الحد الأدنى لعدد البيكسلات (عادة 60 x 60 بكسل). يتم دمج خريطة المحاذاة المحلية الناتجة مع معلمة المحاذاة العمومية ويتم تطبيقها على الصورة المستهدفة بواسطة تحويل مرن. بعد هذه الخطوة، يتم تحسين دقة الحساب إلى ~ 14 نانومتر في 3D و 6 نانومتر في 2D. لا يناسب المحاذاة المحلية لصور المراجع البيولوجية لأن البنية البيولوجية في المرجع تختلف عن البنية في الهدف(الجدول 1). ولذلك، يتم استخدام المحاذاة العالمية فقط لصور مرجعية المعايرة البيولوجية.
تنشأ التحولات اللونية المحلية من مصدرين؛ مجهر التشويه المحلي مفيدة و عدم فهم البنية البيولوجية. لأن المجهر التشويه المحلي مفيدة ثابت، وهذا يمكن قياسه من عينة مرجعية الخرز متعدد الألوان وتصحيحها كمعلمة ثابتة. يمكن أن يجمع كروماغنون خريطة التشويه المحلية المجهرية والمعلمات المحاذاة العالمية من المعايرات البيولوجية(الجدول 1). وباستخدام هذه الطريقة، من المتوقع أن يتم تحسين متوسط دقة المعايرة البيولوجية بمقدار 1-2 نانومتر إضافي.
هنا، ونحن وصف بروتوكول لتصحيح التحولات لوني من الصور الفلورية 3D باستخدام برنامجنا Chromagnon، من أسهل نهاية منخفضة إلى أعلى دقة. نستخدم الكبت المناعي لخلايا HeLa كمثال على ذلك ولاحظناها باستخدام المجهر ثلاثي الأبعاد الواسع و3D-SIM. في القسم الأول، نحن وصف كيفية إعداد العينات المستهدفة وعينات المعايرة البيولوجية. وينبغي تحسين هذا الجزء من البروتوكول من أجل الأهداف المحددة للبحوث. في القسم الثاني، نحن وصف طرق اقتناء لثلاثة أنواع من الصور المرجعية عن طريق المجاهر. كان الافتراض هو الحصول على قنوات زرقاء وخضراء وحمراء ولكن يجب تعديل تكوين القناة من خلال أهداف محددة للبحث وبإعدادات المجهر. لا يهم إذا كان المجهر مجهزا بكاميرا واحدة أو كاميرات متعددة. في القسم الثالث، نحن وصف كيف يمكن للمرء استخدام برنامجنا لقياس وتصحيح التحولات لوني من الصورة المستهدفة باستخدام الصور المرجعية. وأخيراً، في القسم الرابع، نحن نُصف طريقة لاستكمال الصور المرجعية للمعايرة البيولوجية باستخدام المعايرة المحلية الفعالة للمجهر.
Protocol
1. إعداد العينة
- إعداد عينة مستهدفة
- البذور 2.5 × 105 خلايا هيلا على طبق 35 ملم من القاع الزجاجي وتنمو في 2 مل من متوسط النمو (Dulbecco معدلة النسر المتوسطة مع L-الجلوتامين وبيروفات الصوديوم تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنين [FBS]) في 37 درجة مئوية وتركيز CO2 من 5٪. بدلا من ذلك، البذور 6 × 104 خلايا هيلا على غطاء 8-جيدا غرف وتنميتها في 0.5 مل من متوسط النمو في 37 درجة مئوية وتركيز CO2 من 5٪. استخدم #1.5 غطاء زجاجي (بسماكة 0.170 مم) للمجهر عالي الدقة.
ملاحظة: استخدم 1/4 وحدات تخزين لغطاء 8-جيداً ذات غطاء زجاجي للخطوات الإضافية باستثناء الخطوات 1.1.5 و1.1.6 و1.1.8 و1.1.11 و1.2.5 حيث يكون حجم التخزين 100 ميكرولتر بغض النظر عن نوع الحاوية. - بعد حوالي 24 ساعة من الحضانة، استبدال الحل مع 2 مل من 3.7٪ الفورمالديهايد في المالحة الفوسفات المخزنة (PBS). بعد خلط لطيف، والاستمرار في إصلاح الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) على منصة التناوب.
تنبيه: العمل في غطاء الدخان. - غسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني، 3x لكل لمدة 5−10 دقيقة على منصة دوران.
ملاحظة: اتبع اللوائح المحلية للتخلص من نفايات الفورمالديهايد. - Permeabilize الخلايا مع 2 مل من 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق على منصة التناوب، تليها ثلاثة يغسل مع 2 مل من برنامج تلفزيوني، كل لمدة 5−10 دقيقة على منصة التناوب.
- احتضان الخلايا في 100 ميكرولتر من 1٪ البوم مصل البقر (BSA) في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في RT على منصة التناوب.
- استبدال الحل مع 100 ميكرولتر من خليط من الأجسام المضادة الأولية (المضادة للأجسام المضادة للemerin polyclonal14 ومضادات أحادية النسيلة15 مضادةتوبولين المضادة 15) في 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني في التخفيفات المناسبة (1/500 لمكافحة emerin و 1/100 لمكافحة tubulin)، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- غسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني، 3−5x لكل لمدة 10 دقيقة على منصة دوران.
- استبدل الحل بـ 100 ميكرولتر من خليط من الأجسام المضادة الثانوية (IgG المضادة للأرنب مع أليكسا فلور 488 وIgG المضادة للماوس مع Alexa Fluor 555) في 1% BSA في PBS عند تخفيف 1/500، واحتضان لمدة 3−4 ساعة في RT.
- غسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني، 3−4x لكل لمدة 5 دقائق على منصة دوران.
- استبدل الحل بـ 2 مل من 0.5 ميكروغرام/مل DAPI في برنامج تلفزيوني لطخة الحمض النووي لمدة 30 دقيقة في RT على منصة دوران.
ملاحظة: بدلاً من DAPI، يمكن أيضاً استخدام Hoechst 33342 بنفس التركيز. - استبدال الحل مع ~ 100 ميكرولتر من تركيب المتوسطة(جدول المواد).
- البذور 2.5 × 105 خلايا هيلا على طبق 35 ملم من القاع الزجاجي وتنمو في 2 مل من متوسط النمو (Dulbecco معدلة النسر المتوسطة مع L-الجلوتامين وبيروفات الصوديوم تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنين [FBS]) في 37 درجة مئوية وتركيز CO2 من 5٪. بدلا من ذلك، البذور 6 × 104 خلايا هيلا على غطاء 8-جيدا غرف وتنميتها في 0.5 مل من متوسط النمو في 37 درجة مئوية وتركيز CO2 من 5٪. استخدم #1.5 غطاء زجاجي (بسماكة 0.170 مم) للمجهر عالي الدقة.
- إعداد عينة معايرة بيولوجية
- إعداد الخلايا الثابتة كما هو موضح في الخطوات 1.1.1−1.1.4.
ملاحظة: يفضل أن يتم إعداد العينات على غطاء مسور لوضع كل من العينات المستهدفة والمرجعية في غرف منفصلة على نفس الغطاء(الجدول 1، معظم اليمين). هذا الإعداد هو الأفضل عندما تتطلب التجربة أعلى دقة التصحيح. عندما يحتاج العينة إلى أن تكون مستعدة على غطاء عادي، واستخدام الأغطية الدقيقة مع اختلاف سمك منخفض ("رقم 1.5H") لضمان قابلية التكاثر. - إعداد محلول الأسهم من الفلورسنت صبغ- phalloidin مترافق في 1.5 مل من الميثانول وتخزينها في -20 درجة مئوية. مزيج phalloidin حل الأسهم في برنامج تلفزيوني في التخفيف التالي: 1/100 لphalloidin مع فلور اليكسا 405، 1/1،000 لphalloidin مع اليكسا فلور 488، و 1/200 لphalloidin مع اليكسا فلور 594.
- استبدال الحل مع 1 مل من خليط phalloidin أعدت في الخطوة 1.2.2 واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT على منصة التناوب.
- غسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني، 3−5x لكل لمدة 10 دقيقة على منصة دوران.
- استبدال الحل مع ~ 100 ميكرولتر من المتوسط المتصاعد.
ملاحظة: يمكن تخزين عينات المعايرة عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية للاستخدام المتكرر.
- إعداد الخلايا الثابتة كما هو موضح في الخطوات 1.1.1−1.1.4.
2 - الحصول على الصور المرجعية
- الصور المرجعية عبر التوك
- ضع العينة الهدف المعدة في الخطوة 1-1 على مجهر واسع المجال.
- الحصول على صورة الفلوريس من الهدف في قنوات الأزرق والأخضر والأحمر.
ملاحظة: بالنسبة للصور ثلاثية الأبعاد، يمكن أن يختلف حجم الخطوة Z في الصورة المرجعية عن الصورة المستهدفة طالما أن ملف الصورة يحتوي على معلومات عن حجم الخطوة. ويُفضَّل أن يكون حجم الخطوة Z للصور المرجعية والهدف أقل من نصف الدقة البصرية لمحور Z، الذي يحسب بواسطة
المجهر المحدود الانعراج، حيث يكون λ هو الطول الموجي في نانومترات وNA هو الفتحة العددية للعدسة الموضوعية. على سبيل المثال، إذا كانت دقة محورية 550 نانومتر، ثم استخدام خطوة Z أصغر من 275 نانومتر. لا يلزم وجود سلسلة زمنية للصورة المرجعية. - في وقت لاحق، للحصول على صورة مضيء من المرجع، حدد ضوء الإثارة فقط لDAPI، واختيار للحصول على قنوات الأزرق والأخضر والأحمر. الحصول على الصورة المرجعية بالضبط في نفس الموقف المرحلة وارتفاع Z، في حالة وجود كومة 3D.
ملاحظة: بالنسبة لأطوال الموجات الأطول انبعاثاً، سوف يلزم زيادة كثافة الإضاءة ووقت التعرض.
- صور مرجعية ذات مجال ساطع
- ضع العينة الهدف المعدة في الخطوة 1-1 على مجهر واسع المجال.
- الحصول على صورة الفلوريس من الهدف في قنوات الأزرق والأخضر والأحمر.
ملاحظة: يُفضل أن يفي حجم الخطوة Z بمعيار Nyquist كما هو موضح في الخطوة 2.1.2. - الحصول على صورة حقل مشرق من الهدف في قنوات الأزرق والأخضر والأحمر بالضبط في نفس الموقف المرحلة كما هو الحال في 2.2.2 وارتفاع Z نفسه في حالة وجود كومة 3D.
- صور مرجعية المعايرة البيولوجية
- ضع العينة الهدف المعدة في الخطوة 1.1 على مجهر 3D-SIM.
- الحصول على صورة الفلوريس من الهدف في قنوات الأزرق والأخضر والأحمر من قبل 3D-SIM. إعادة بناء الصورة فائقة حل.
ملاحظة: يمكن أن يكون نوع المجهر من أي نوع مثل 3D-SIM، confocal، STED، الخ. يُفضل أن يفي حجم الخطوة Z بمعيار Nyquist كما هو موضح في الخطوة 2.1.2. - الحصول على صور مفلورة متعددة من المرجع المعد في الخطوة 1.2 في مواضع مختلفة في مرحلة مشابهة للصورة المستهدفة (الخطوة 2.3.2) بواسطة 3D-SIM. إعادة بناء الصور فائقة حل..
ملاحظة: يجب أن يكون إجمالي عدد وحدات البكسل في XY هو نفسه في كافة الصور المرجعية. يجب أن يكون حجم الخطوة في Z هو نفسه في كافة الصور المرجعية. يفضل أن يكون العدد الإجمالي لأقسام Z نفس العدد في الصورة المستهدفة، ولكن هذا ليس مطلبًا مطلقًا. لا يهم موقف XY على المسرح لهذه الصور المرجعية لأن الموضع أو الغطاء يختلف بالفعل عن موضع العينة المستهدفة وعلاوة على ذلك فإن الفرق في التحول اللوني على غطاء واحد أقل من 15 نانومتر3. ظروف التصوير بما في ذلك عدسة الموضوعية، ودرجة حرارة المراقبة، وزيت الغمر، وحجم الثقب في المجهر confocal، وزاوية الميل في المجهر الإضاءة عالية الميل16، ينبغي أن تتطابق مع كل مرجع للحصول على أفضل أداء. إذا كان المجهر يجهز كاميرات متعددة للحصول على قنوات متعددة في وقت واحد، ينبغي الحصول على الصور المرجعية في كثير من الأحيان أسبوعيا لتصحيح الانجراف مفيدة.
المجهر المحدود الانعراج، حيث يكون λ هو الطول الموجي في نانومترات وNA هو الفتحة العددية للعدسة الموضوعية. على سبيل المثال، إذا كانت دقة محورية 550 نانومتر، ثم استخدام خطوة Z أصغر من 275 نانومتر. لا يلزم وجود سلسلة زمنية للصورة المرجعية.3. تصحيح التحول اللوني باستخدام برامج Chromagnon
- باستخدام متصفح ويب، انتقل إلى https://github.com/macronucleus/Chromagnon/releases، وقم بتنزيل أحدث إصدار ثنائي من Chromagnon.
ملاحظة: الإصدارات الثنائية متوفرة لـ Windows و Mac وبعض إصدارات Linux. - استخراج البرنامج ووضع الملف القابل للتنفيذ في موقع مناسب. على Windows أو Mac انقر نقراً مزدوجاً فوق الملف لفتحه، أو آخر تنفيذ الملف الثنائي من سطر الأوامر على نظام Linux.
ملاحظة: سيتم فتح واجهة المستخدم الرسومية كما في الشكل 1. قد يتم منع البرنامج من فتح بالنقر المزدوج للمرة الأولى بسبب سبب أمني. في هذه الحالة، استخدم أسلوب النظام الأساسي لفتح البرنامج الذي تم تنزيله من الإنترنت.
الشكل 1: لقطة شاشة لواجهة المستخدم الرسومية Chromagnon. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- اسحب وأفلت ملفات المراجع في "مربع المرجع"(الشكل 1) أو انقر فوق ملفات المرجع (الشكل 1أ) لفتح مربع حوار محدد الملفات. اعتمادا على تنسيقات الملفات، إذا طلب البرنامج لتثبيت مجموعة تطوير جافا (JDK)، اضغط نعم وسيتم الانتقال إلى صفحة التحميل المستخدم. قم بتنزيل وتثبيت JDK لنظام التشغيل حسب التعليمات. يجب أن يكون Chromagnon قادرا على قراءة تنسيق ملف الصورة بعد إعادة تشغيل البرنامج.
ملاحظة: يمكن أن يقرأ Chromagnon معظم تنسيقات ملفات الصور (متعدد الصفحات 'tif'، 'czi'، 'nd2'، 'oib'، 'lif'، 'dv'، الخ). يفضل تنسيق الصورة المجهر الأصلي في هذه الخطوة لأنه يمكن فقدان بيانات التعريف عند تحويل تنسيق صورة إلى ملف tif متعدد الصفحات. إذا كان اسم القناة هو مبين كما 0، 1، 2، الخ بدلا من الأطوال الموجية مثل 528، 609(الشكل 2أ، مربعات خضراء)، ثم الكروماغنون لا يعرف هوية القنوات في الصورة. في هذه الحالة، تأكد من أن ترتيب القنوات وحجم البيكسل في الملف المرجعي يطابق تلك الموجودة في الملف الهدف. على سبيل المثال، إذا كان ترتيب القنوات في المرجع أخضر وأحمر، ثم يجب أن يكون ترتيب القنوات في الهدف أيضا الأخضر والأحمر، ولكن ليس الأحمر والأخضر.
الشكل 2: لقطة شاشة مثال لتحميل ملفات متعددة. (أ) حالة تحتوي فيها جميع الصور المرجعية على الصور المستهدفة المقابلة. يتم تعريف أسماء القنوات بشكل صحيح بواسطة الأطوال الموجية (المشار إليها بواسطة مربع أخضر) في ملفات الصور المستخدمة في هذا المثال. (B) حالة يتم فيها استخدام صورة مرجعية واحدة لتصحيح صور مستهدفة متعددة. (C) حالة يتم فيها متوسط عدد الصور المرجعية المتعددة (المشار إليها بواسطة مربع أحمر) ، ويتم استخدام الصورة المرجعية الناتجة بعد المتوسط لتصحيح صور مستهدفة متعددة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- اسحب وإفلات الملفات المستهدفة في "مربع الهدف"(الشكل 1) أو انقر فوق ملفات الهدف (الشكل 1B) لفتح مربع حوار محدد الملفات.
ملاحظة: إذا كان هناك العديد من الصور الهدف ولكل منها صور مرجعية المقابلة، يجب أن تكون الصورة المرجعية المقابلة والصورة الهدف على نفس الصف في مربعي المرجع والهدف منهما(الشكل 2أ). يمكن أيضاً استخدام صورة مرجعية واحدة لمحاذاة صور مستهدفة متعددة (الشكل 2B). - تحقق من خانة الاختيار هوامش الاقتصاص إذا لم يتم تحديدها(الشكل 1C).
ملاحظة: إذا تم تحديد خانة الاختيار هذه، يتم اقتصاص الهوامش الناتجة عن المحاذاة. حدد هذا الخيار للاستخدام العام ولكن قم بإلغاء تحديد إذا كان هناك حاجة إلى مقارنة على مستوى البكسل بين الصور قبل المحاذاة وبعدها. - اختيار تنسيق صورة الإخراج من قائمة الاختيار (الشكل 1D).
ملاحظة: التنسيقات المتوفرة هي 'tif' (تنسيق ImageJ17) و 'dv' و 'ome.tif'; تنسيق 'ome.tif' متوفر فقط بعد تثبيت JDK. - حدد اللاحقة لاسم ملف الإخراج (الشكل 1E، القيمة الافتراضية هي '_ALN')، والتي تتم إضافتها إلى اسم الملف الهدف.
- بالنسبة للصور المرجعية في المحادثات المتبادلة ذات نسبة الإشارة إلى الضوضاء، استخدم المحاذاة المحلية من قائمة الاختيار من محاذاة محلية (الشكل 1F)، اختر الإسقاط لاستخدام المحاذاة المحلية و None لتعطيله. استخدام الحد الأدنى لحجم النافذة 60 (الشكل 1G).
ملاحظة: عند استخدام المحاذاة المحلية، يجب أن يكون لدى كافة الصور المستهدفة صور مرجعية مناظرة (الشكل 2أ). لا ينصح بالمحاذاة المحلية للصور المرجعية للمعايرة البيولوجية حيث تختلف التحولات اللونية المحلية من عينة إلى أخرى(الجدول 1). ولنفس السبب، لا يمكن تطبيق المحاذاة المحلية الفردية على العديد من الصور المستهدفة(الشكل 2B). كاستثناء، يمكن استخدامه عندما تكون عينة الاهتمام فقط على سطح الغطاء، ويتم تعبئة مجال الرؤية مع الكائنات مشرق، تماما مثل عينات حبة الفلورسنت متعددة الألوان. - بالنسبة للعديد من الصور المرجعية للمعايرة البيولوجية، تحقق من خيار متوسط المراجع (الشكل 1H) لقياس معلمة محاذاة واحدة من الصورة متوسطة، ثم يتم تطبيق معلمة المحاذاة الفردية على جميع الصور المستهدفة (الشكل 2C). اختر بلا لمحاذاة المحلية (الشكل 1F).
- انقر فوق تشغيل الكل ( الشكل1 1I) لبدء القياسات؛ يتم تطبيق معلمات المحاذاة على الصور الهدف.
ملاحظة: بعد قياس التحولات لوني من الملفات المرجعية، يجعل البرنامج الملفات مع ملحق "chromagnon.csv" أو "chromagnon.tif". يعتمد نوع ملف الإخراج على ما إذا كانت المحاذاة المحلية سارية المفعول (الشكل 1F). إذا تم إجراء المحاذاة دون محاذاة محلية الإخراج هو "chromagnon.csv" ، بينما إذا كان يتم استخدام المحاذاة المحلية الإخراج هو "chromagnon.tif". أسماء الملفات هي نفس الملف المرجعي باستثناء لاحقة المحدد(الشكل 1ي، الافتراضي هو بدون لاحقة) والملحق ("chromagnon.csv" أو "chromagnon.tif"). يمكن العثور على وصف مفصل لعملية المحاذاة في الملف "Chromagnon.log" الذي تم إنشاؤه في نفس المجلد. - انتظر حتى تظهر الصورة المصححة في العارض (الشكل 3).
ملاحظة: سحب الصورة باستخدام الماوس ينقل الصورة وتحريك عجلة الماوس يغير التكبير/ التصغير. حرك شريط التمرير (الشكل 3A) لتغيير القسم Z (و /أو T عند تطبيقه) للعرض. إذا كان العارض بطيئا جدا لتحديث صورة، انقر فوق تحميل البيانات بالكامل في الذاكرة زر ( الشكل3B) لإيقافه الوصول إلى البيانات على القرص الثابت. سحب الحافة اليسرى أو اليمنى من مربعات الألوان (الشكل 3C) يمكن التحكم في القيم الدنيا أو القصوى للعرض. النقر فوق الزر لكل قناة (الشكل 3D) التبديل بين عرض أو إخفاء القناة المحددة في العارض. النقر بزر الماوس الأيمن على مربع اللون(الشكل 3D)يمكّن المستخدمين من اختيار الألوان للعرض، أو تغيير خيارات العرض لشريط الألوان، كما أنه يسمح للمستخدمين بتحديد القيم الدنيا والقصوى بالضبط لتحجيم العرض باختيار "مقياس إلى ...". بالنقر فوق الزر عرض متعامد (الشكل 3E)يظهر الصور من ZY و XZ وجهات النظر. نقل الخطوط المتقاطعة يغير الموضع ليظهر في طرق العرض الجانبية.
الشكل 3: لقطة شاشة من عارض الصور. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- للتحقق مما إذا كان القياس قد تم تنفيذه بشكل صحيح، اسحب الصور المرجعية وإفلاتها في "المربع المرجعي" و"المربع الهدف". تشغيل البرنامج، وتحقق إذا كانت الصور متراكبة تماما.
ملاحظة: عند توفر ملفات "chromagnon.csv" أو "chromagnon.tif" يمكن استخدام كمراجع من أجل تخطي القياسات. إذا ظل التحول اللوني في الصورة غير مصحح، فجرب الحلول الملخصة في الجدول 2. - للوصول إلى معلمات المحاذاة في العينة، أو عندما تحتاج معلمات المحاذاة إلى أن يتم تحريرها يدوياً، افتح الملفات "chromagnon.csv" مباشرة مع أي محرر نص أو برنامج جدول بيانات. عندما يتم تحريرها، حفظه ك "csv".
ملاحظة: القيم في بكسل ل "tz" و "ty" و "tx" وفي درجات ل "r" وفي عوامل تكبير ل "mz" و "my" و "mx".- بدلا من ذلك، تحميل "chromagnon.csv" أو "chromagnon.tif" ملف في Chromagnon'ق مرجع أو الهدف مربع (الشكل 1) ، ثم انقر نقرا مزدوجا فوقه لفتح محرر المحاذاة (الشكل 4).
- لمعرفة مقدار إزاحة القناة عند تحرير المعلمات، اسحب ملف الصورة المرجعية وإفلاتها إلى المنطقة السفلية (الشكل 4أ) لفتح الصورة في المحرر. عند تحرير القيم في الجدول (الشكل 4B) وضرب مفتاح الإدخال / الإرجاع ، لاحظ كيف تتحرك صورة القناة المقابلة مع تغير القيم. بعد التحرير، انقر فوق حفظ باسم... (الشكل 4C) لحفظ التغييرات.
الشكل 4: لقطة شاشة لمحرر معلمة محاذاة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- للتحقق من خريطة المحاذاة المحلية، قم بتحميل "chromagnon.tif" عبر مربع مرجع Chromagnonأو الهدف (الشكل 1) ، وانقر نقرًا مزدوجًا لفتح محرر المحاذاة (الشكل 4). انقر فوق عرض ( الشكل4D) لعرض التحول المحلي المشار إليه بواسطة الخطوط التي يتم تكبير أطوالها بواسطة العامل المحدد في قائمة اختيار التكبير (الشكل 4E).
ملاحظة: عن طريق تحديد "ملف الصورة الأصلية"(الشكل 4F)،يتم تعيين النوبات مع الصورة الأصلية.
4. إنشاء خريطة محاذاة محلية خاصة بالمجهر
- تمييع 2 ميكرولتر من الخرز الفلورسنت متعدد الألوان من 200 نانومتر قطر في 18 ميكرولتر من الإيثانول.
- دوامة الحل ووضع 10 ميكرولتر من محلول حبة في وسط طبق القاع الزجاج. تأكد من استخدام #1.5 غطاء (بسماكة 0.170 مم) للمجهر عالي الدقة.
- اترك الطبق في RT لمدة ساعة لتجف تمامًا.
- ضع الطبق على المجهر ليتم معايرته والتركيز على الخرز الفلورسنت.
- الحصول على صور 2D أو 3D مع المجهر لمعايرة. الحصول على صور متعددة عن طريق تغيير موضع المرحلة.
- فتح Chromagnon واجهة المستخدم الرسومية.
- اسحب وإفلت ملفات الصور الخرزة على "مربع المرجع"(الشكل 1)أو انقر فوق ملفات المرجع (الشكل 1أ) لفتح مربع حوار محدد الملفات.
- تحقق من متوسط خيار المراجع (الشكل 1حاء). من قائمة الاختيار من محاذاة المحلية (الشكل 1F) ، اختر الإسقاط. استخدام الحد الأدنى لحجم النافذة 60 (الشكل 1G). انقر فوق تشغيل الكل (الشكل 1I) لبدء القياسات.
ملاحظة: يتم إنشاء ملف "chromagnon.tif" الذي يتم تخزين خريطة المحاذاة المحلية المجهر. - بعد القياس، انقر فوق معلمات إضافية (الشكل 1K). من مربع تشويه محلي من أداة المجهر الخاص بك، انقر فوق قائمة الاختيار واختر جديد... لفتح مربع حوار. سحب وإسقاط الملف "chromagnon.tif" التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.8 في مربع اسم الملف أو انقر فوق زر اختيار ملف لفتح مربع حوار محدد ملف. أدخل اسم المجهر وانقر فوق موافق.
- عند قياس التحولات اللونية من التوك المشترك أو الصور المرجعية للمعايرة البيولوجية ، انقر فوق معلمات إضافية (الشكل 1K). من تشويه المحلية من مربع أداة المجهر الخاص بك، اختر اسم المجهر المحدد في الخطوة 4.9. انقر فوق موافق.
ملاحظة: لا يتم حفظ اختيار "تشويه المحلية من أداة المجهر الخاص بك" بعد إيقاف تشغيل البرنامج. - تابع إلى التصحيح اللوني دون محاذاة محلية كما هو الحال في القسم 3.
ملاحظة: من الممكن أيضا استخدام المحاذاة المحلية بالإضافة إلى معايرة المجهر. في هذه الحالة، تبدأ المحاذاة المحلية بمعايرة المجهر.
Representative Results
مثال على تصحيح التحول اللوني باستخدام صورة مرجعية عبر التوك معًا موضحًا في الشكل 5. تم الحصول على الصورة مع مجهر حقل واسع مجهز بكاميرا واحدة. تم استخدام انبعاثات الفلوريسنس من DAPI كمرجع(الشكل 5A, B) لتصحيح القنوات الزرقاء والأخضر والأحمر. الصورة تضم 3 قنوات من 60 شرائح Z، كل تتألف من 256 × 256 بكسل. تم تفكيك الصور قبل قياس التحولات اللونية. استغرق قياس التحولات اللونية المحلية باستخدام Chromagnon 51 s على جهاز Mac مع Intel Core i7 (رباعية النواة ، 8 - threads ، 2.7 GHz) ، 16 GB RAM و 1 TB تخزين فلاش. تم تطبيق المعلمة المحاذاة على الصورة المستهدفة (الشكل 5C، D)،الذي يحتوي على نفس العدد من voxels تماماً كصورة مرجعية. استغرق إعداد الملف المحاذى 3 s. نتيجة لتشذيب بيكسلات الحافة أثناء عملية المحاذاة (مربع اختيارهوامش المحاصيل في الشكل 1C)،تم تقليل عدد voxels بعد المحاذاة(الشكل 5B، 51 شرائح Z ، 252 × 251 بكسل). الحمض النووي في جسر anaphase (المشار إليها من قبل رؤوس الأسهم) وينظر بشكل غير صحيح خارج المغلف النووي قبل المحاذاة (الشكل 5C، واضح في لوحة أسفل تظهر عرض XZ)، ولكن كما هو متوقع داخل المغلف بعد المحاذاة (الشكل 5D).
مثال على تصحيح التحول لوني باستخدام صورة مرجعية معايرة البيولوجية هو مبين في الشكل 6. تم الحصول على الصور مع مجهر SIM مجهزة بثلاث كاميرات. تم متوسط ثلاث صور لخلايا HeLa الملطخة بالثوان phalloidins المترافقة إلى الأصباغ الزرقاء والأخضر والأحمر (الشكل 6A). تتألف الصورة المرجعية من 3 قنوات من شرائح 76 Z، تتكون كل منها من 1024 × 1024 بكسل. قياس التحولات اللونية باستخدام Chromagnon دون محاذاة المحلية المطلوبة 194 ق على نظام ماك المذكورة أعلاه. تم تطبيق المعلمة على صورة مستهدفة تتكون من 3 قنوات من شرائح 73 Z، كل منها يتكون من 1024 × 1024 بكسل. استغرق إنشاء ملف محاذاة 25 s. عرض XZ يظهر مواقف قناة غير صحيحة على طول Z، وقليلا على طول الاتجاهات X (الشكل 6A, C) ولكن تم تصحيح هذا التسجيل الخاطئ بعد المحاذاة ( الشكل6B, D).
الشكل 5: مثال على المحاذاة مع صورة مرجعية عبر. كانت خلايا HeLa ملطخة بDAPI للحمض النووي (يظهر باللون الأرجواني) ، وأليكسا فلور 488 (يظهر باللون الأصفر) للمغلف النووي ، وأليكسا فلور 555 (يظهر باللون الأزرق) للخيومات الصغيرة. تم الحصول على الصور عن طريق 3D مجهرية واسعة النطاق مع كاميرا واحدة وdeonvolved. (أ، ب) ممثلة عبر ة إشارة صورة باستخدام DAPI الانبعاثات، قبل وبعد المحاذاة من قبل Chromagnon. وتظهر ثلاث قنوات ملونة على أنها متراكبة. (C, D) مقطع بصري من المكدس ثلاثي الأبعاد في ثلاث قنوات قبل المحاذاة وبعدها. الانحراف اللوني المحوري واضح عند جسر الphase الذي يظهره رؤوس الأسهم. شريط مقياس في اللوحة A يشير إلى 5 ميكرومتر لجميع اللوحات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: مثال على المحاذاة مع صورة مرجعية للمعايرة البيولوجية تم الحصول على الصور مع 3D-SIM مجهزة بثلاث كاميرات. (أ، ب) متوسط صورة مرجعية من ثلاث صور قبل (A) وبعد (B)المحاذاة. كانت خلايا HeLa ملطخة بالفالويدين المترافقة مع أليكسا فلور 405 أو 488 أو 594. (C, D) الصورة الهدف قبل (C) وبعد (D) المحاذاة. كانت خلايا HeLa ملطخة بDAPI للحمض النووي (يظهر باللون الأرجواني) ، وأليكسا فلور 488 (يظهر باللون الأصفر) للمغلف النووي ، وأليكسا فلور 594 (يظهر باللون الأزرق) للصغرى. شريط مقياس في اللوحة A يشير إلى 5 ميكرومتر لجميع اللوحات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
إن إجراء التصحيح اللوني هو مفاضلة بين الدقة والجهد. لتوفير الجهود التي لا داعي لها، من الأفضل أن تعرف مدى الدقة المطلوبة لدراستك. قد لا تكون هناك حاجة إلى أعلى دقة للتصوير التقليدي الواسع المجال (الحي)، وبالتالي، فإن الصور المرجعية الميدانية الساطعة غالباً ما تكون كافية لتصحيح التحول اللوني. وبالمثل، عندما تكون حالة التصوير والبيئة ثابتة، فإن الاستخدام المتكرر للمعايرة البيولوجية سيوفر الوقت. من ناحية أخرى، إذا كان المطلوب تسجيل دقيقة للغاية، وتقاطع عالي الجودة أو الصور المرجعية المعايرة البيولوجية ضرورية. للحصول على أفضل أداء، يجب الحصول على الصور المرجعية مع ظروف وتوقيتات مماثلة مثل الصور المستهدفة قدر الإمكان. طالما يتم الحصول على كل من الصور المرجعية والهدف من قبل نفس المجهر، وارتفاع دقة المكانية تحسين دقة التصحيح. إذا كان deconvolution متاح لكل من الصور المرجعية والهدف، ثم تنفيذ هذا قبل التصحيح قد يحسن دقة التصحيح. أيضا، للحصول على أفضل أداء، ينبغي أن تتحقق نظرية أخذ العينات لمحور (Z) البصرية في كل من الملف المرجعي والمستهدف لالتدبول subpixel دقيقة (البروتوكول الخطوة 2.1.3).
الفشل في تصحيح التحول لوني يؤدي إلى استنتاجات غير صحيحة. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي استخدام المعايرة الخاطئة إلى تفاقم التحولات اللونية بدلاً من تصحيحها، وبالتالي يجب تجنب ذلك. وقد لخصنا الأسباب المحتملة للإخفاقات، وحلولها المشتركة، في الجدول 2. لفحص سبب فشل، في المقام الأول، من الضروري التحقق من صحة إزاحة اللونية في الصورة المرجعية بدقة (الخطوة بروتوكول 3.12). معظم الإخفاقات هي نتيجة لجودة الصور المرجعية ويتم علاجها بسهولة وفقا للأوصاف الواردة في الجدول 2. فيما يتعلق بنوعية الصور المرجعية، من المهم ملاحظة أن دقة المحاذاة العالمية تقل إذا لم يتم ملء مجال الرؤية بأكمله بالعينة(الشكل 7، الجدول 2). بالمقارنة مع المثال الجيد الموضح في الشكل 7A، فإن المثال السيئ الموضح في الشكل 7B يحتوي على ثلاثة مغلفات نووية فقط في المنطقة اليسرى العليا ، وفشل كروماغنون في محاذاة جزء من هذه الصورة. وذلك لأن أسلوب المحاذاة العالمية من Chromagnon يقسم مجال الرؤية إلى أربع مناطق (الشكل 7C) من أجل قياس الاختلافات في التناوب والتكبير مع دقة عالية3. هذه الطريقة، إذا تم تشغيلها بشكل صحيح، هي أمر واحد أكثر دقة من الطرق الخطية الأخرى مثل تحويل السجل القطبي وأساليب بسيطة3. إذا كانت أي من المناطق الأربعة غير متوفرة، ثم سوف Chromagnon التحول إلى أساليب خطية أقل فعالية. لذلك، للحصول على أفضل أداء الأمثلة الموضحة في الشكل 7B الشكل 7C غير مرغوب فيها، ويجب أن تكون المناطق الأربعة مليئة الكائنات. يمكن للمستخدمين التحقق مما إذا كانت أي منطقة تربيعية من حقل الرؤية غير متوفرة للقياس من خلال النظر إلى ملف السجل ("Chromagnon.log"؛ انظر خطوة البروتوكول 3.10). لحسن الحظ، يمكن التغلب على هذه المشكلة بسهولة عن طريق حساب متوسط صور المعايرة البيولوجية متعددة أو باستخدام المحاذاة المحلية لتقاطع أو الصور المرجعية في الميدان الساطع(الجدول 2). على عكس حالة عدم تصحيح الصور المرجعية، يصعب تحديد عدم تصحيح الصور المستهدفة. لأن مثل هذه الإخفاقات تنشأ بسبب الاختلافات في تنسيقات الملفات، وظروف التصوير، وتوقيت التصوير، وأساليب التصوير/المحاذاة بين الصور المرجعية والصور المستهدفة(الجدول 2)،يجب على المستخدمين أن يكونوا حذرين دائمًا عند استخدام الصور المرجعية التي يتم الحصول عليها في ظروف/توقيتات مختلفة من الصور المستهدفة. بعض الصور على سبيل المثال متاحة للاختبار (https://github.com/macronucleus/Chromagnon) للحصول على فكرة ملموسة عن الصور الجيدة والسيئة.
| المشكله | يسبب | حل |
| فشل تصحيح الصورة المرجعية | تباين منخفض | الحصول على صورة التباين العالي إذا كان ذلك ممكناً. إذا تم استخدام صورة مرجعية حقل مشرق، إعادة اكتساب الصورة في حل المياه المستندة إلى الحصول على التباين أعلى من الخلية. بدلا من ذلك، حاول تطبيق الحد من الضوضاء الحسابية (على سبيل المثال، تصفية الغاوسيين). إيقاف تشغيل المحاذاة المحلية، والتي هي أكثر حساسية للضوضاء. |
| تلوث الصور غير ذات الصلة | إزالة مصدر الصور غير ذات الصلة في العينة إذا كان ذلك ممكنا. للحصول على الصور المرجعية عبر، تحقق من أطياف الإثارة من الأصباغ المستخدمة للصور الهدف. إذا كانت الأصباغ متحمسة أثناء الحصول على صورة عبر الحديث (مثل أليكسا فلور 568 أو 594) ، ففكر في الأصباغ الأخرى (مثل أليكسا فلور 555). إذا كان الغبار على رقاقة الكاميرا يخلق اختلاف قناة واضحة، تنظيف رقاقة الكاميرا أو استخدام طريقة مسطحة فيلدينغ الحسابية. | |
| بقعة ساطعة للغاية التي أدلى بها شعاع الكونية | الحصول على الصورة مرة أخرى إذا كان ذلك ممكنا. بدلاً من ذلك، حاول تطبيق الحد من الضوضاء الحسابية (على سبيل المثال، تصفية الوسيط أو الغاوسي). | |
| القطع الأثرية للفك (إشارات اصطناعية عند الحواف المحورية والحافات الجانبية) | تقليم مقاطع بيكسل الحواف أو مقاطع Z بعد إلغاء الفوط. إذا تم تشذيب أحد الجانبين، فيجب أيضًا اقتطاع الجانب الآخر للحفاظ على مركز الصور. | |
| حجم الخطوة Z متفرق جدا | يجب الحصول على رصة Z للوفاء بمعيار Nyquist كما هو مكتوب في البروتوكول 2.1.3. | |
| انحراف بصري | الانحراف الكروي هو الانحراف الرئيسي الذي يسببه المستخدمون. اختيار عدسة الهدف الصحيح للعينة واستخدام سمك غطاء من 170 ميكرومتر. إذا تم تجهيز العدسة الهدف مع حلقة التصحيح، وضبطها للعثور على الموقف حيث يتم الحصول على أعلى عدد الفلوريسنس من التركيز. في حالة وجود هدف الغمر النفط دون حلقة التصحيح، وضبط معامل الانكسار من زيت الغمر الذي يزيد من العد الفلوريسنس في التركيز. | |
| مجال الرؤية غير شاغر (الشكل 7) | في حالة الصور المرجعية للمعايرة البيولوجية، متوسط العديد من الصور. في حالة من الصور المرجعية أو المجال الساطع، استخدم المحاذاة المحلية. | |
| خطأ برنامج غير معروف | الإبلاغ عن المشكلة من خلال GitHub (https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues) | |
| فشل تصحيح الصورة الهدف | يتم فقدان بيانات التعريف لملف الصورة | استخدام تنسيق ملف المجهر الأصلي الذي يحتوي على بيانات تعريف كاملة، وتجنب تحويل إلى ملف tiff متعددة الصفحات قبل المعالجة. استخدم نفس ترتيب القنوات كما هو مكتوب في البروتوكول 3.3. |
| طرق محاذاة خاطئة للمجهر المعطى | لا تطبق طريقة المحاذاة المحلية عند القياس من الصور المرجعية للمعايرة البيولوجية إلى الصور المستهدفة. لا تستخدم الصور المرجعية عبر التوك اغير من المجهر واسع المجال. | |
| الاختلافات في ظروف التصوير | الاحتفاظ بـ شروط التصوير ثابتة بين المرجع والصور الهدف كما هو مكتوب في البروتوكول 2.3.3. | |
| الاختلافات في العينة (بما في ذلك غطاء) | دائما استخدام نفس المتوسطة المتصاعدة، coverlip (على سبيل المثال. 1.5H) وعمق مماثل من التركيز. | |
| المجهر الانجراف منذ تم إجراء آخر معايرة | إجراء معايرة في كثير من الأحيان كما كل أسبوعين. الحفاظ على درجة الحرارة ثابتة، واستخدام طاولة عائمة لتجنب الانجراف الأجهزة من المجهر. |
الجدول 2: استكشاف الأخطاء وإصلاحها من أجل التصحيح اللوني.
الشكل 7: أمثلة على الصور المرجعية. المغلف النووي في خلايا الخميرة الانشطار المسمى مع GFP وmcherry. تم الحصول على الصور باستخدام المجهر التقليدي واسع المجال. تم تصحيح التحولات اللونية باستخدام Chromagnon دون محاذاة محلية باستخدام الصور نفسها كصور مرجعية. ثم تم فك تفكيك الصور لإظهار التفاصيل. (أ) مثال جيد مع العديد من الكائنات في مجال الرؤية. (B) مثال سيئ مع الكائنات فقط في الزاوية العلوية اليسرى. عدم المحاذاة واضح في منطقة معينة من الصورة. (C) مثال غير مرغوب فيه حيث يكون أحد الـ quadrisection (مفصول بخطوط منقطة) فارغًا. يشير شريط المقياس في اللوحة A إلى 5 ميكرومتر للعرض الميداني الكامل و1.25 ميكرومتر للعرض الموسع وينطبق على جميع اللوحات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في هذا البروتوكول، وصفنا ثلاثة أنواع مرجعية مختلفة(الجدول 1). ومن بينها، تحتاج الصور المرجعية عبر الحوار والصور المرجعية للمعايرة البيولوجية إلى مزيد من المناقشة الدقيقة. للصور المرجعية عبر التوك، يمكن استخدام عينات ملطخة DAPI أو Hoechst 33342، وشنت في الجلسرين أو الوسائط التجارية تصاعد بكفاءة لمحاذاة القنوات الزرقاء والأخضر والأحمر. وبالمثل، يمكن استخدام أليكسا فلور 488 لمحاذاة القنوات الخضراء والأحمر. ومع ذلك ، فإن الحصول على الفلورس الحديث المتبادل غالبًا ما يكون صعبًا لأن العديد من الأصباغ الزرقاء باستثناء DAPI و Hoechst باهتة وتسوس أسرع من معظم الأصباغ الخضراء والحمراء. وعلاوة على ذلك، فإن أطياف انبعاث الأصباغ الحديثة أضيق، مما يجعل محاذاة أكثر من ثلاث قنوات بهذه الطريقة صعبة. وينبغي أيضا إيلاء الاهتمام لبعض الأصباغ الحمراء الشائعة (على سبيل المثال، اليكسا دقيق 568 و 594، ولكن ليس اليكسا فلور 555) التي يمكن أن تكون متحمس من قبل الضوء البنفسجي، والتي تمنع الحصول على صور عبر التباين عالية من الأصباغ الزرقاء. عيب آخر هو أن هذه الطريقة لا يمكن قياس انحراف لوني من مسارات الضوء الإثارة في الإثارة متعددة الألوان، لأنه يتم استخدام الطول الموجي واحد فقط الإثارة للإثارة(الجدول 1). كما يستخدم معظم المجهرية المتقدمة البصريات الإضاءة المعدلة، وتطبيق هذه الطريقة محدودة. ومع ذلك، فإن دقة التصحيح الأعلى لها مفيدة بما فيه الكفاية لكي يتم وصفها في هذا البروتوكول. بشكل عام، يجب التقاط صورة عبر الحديث بعد صورة الهدف لمنع التبييض أو الآثار الضوئية. بالنسبة لـ SMLM التي تمت ملاحظتها مع وضع المجال الواسع، يجب الحصول على صورة مرجعية قبل الحصول على صورة مستهدفة حيث يمكن تبييض الأصباغ الفلورية أثناء التصوير.
تسمح الصور المرجعية للمعايرة البيولوجية للمستخدمين بمحاذاة أي عدد من القنوات المرغوب فيه بسهولة على حساب إعداد عينة إضافية. ومن المزايا الأخرى للصور المرجعية للمعايرة البيولوجية توافر مراجع متعددة "متوسط" تساعد على ملء جميع مجالات الرؤية. قد تعاني هذه الطريقة من الاختلافات في ظروف التصوير إذا تم إعداد عينة المعايرة على شريحة مختلفة. ويمكن حل معظم هذه المشكلة إذا تم إعداد كل من الأهداف والمراجع على نفس الشريحة باستخدام نظارات غطاء تجارية(الجدول 1)،وتبقى ظروف التصوير الأخرى ثابتة كما هو الحال في الخطوة بروتوكول 2.3.3. في هذه الحالة، يمكن توقع دقة تصحيح مشابهة لتلك التي من الصور المرجعية عبر التوك يمكن توقع3. بروتوكول لاستخدام phalloidin كما هو مبين هنا هي واحدة من أسهل الطرق لطخة بنية خلوية واحدة مع ألوان متعددة. هناك العديد من السيناريوهات الممكنة لإعداد عينات المعايرة البيولوجية. بالنسبة للمناعة، يمكن تسمية العينة بواسم مضاد أولي واحد متبوعاً بصبغة مع أجسام مضادة ثانوية ذات ألوان متعددة. بهذه الطريقة، يمكن تسمية بنية هدف واحد بألوان متعددة. بدلا من ذلك، 5-ethynyl-2'-deoxyuridine، التي اكتشفتها "انقر" تسميات الكيمياء توليفها حديثا الحمض النووي في ألوان متعددة في كثافة عالية، كما هو موضح في التفاصيل سابقا8. للخلايا الحية، من المفيد إعداد سلالة محورة وراثيا إيواء نسختين من الجينات التي تنصهر إلى GFP أو mCherry لتسمية نفس الهيكل مع اثنين من الألوان. إذا كان عدد نسخة الجين حرجة كما لوحظ في كثير من الأحيان للبروتينات الغشاء، يمكن أن تكون نسخة واحدة من الجين تنصهر جنبا إلى جنب إلى GFP و mCherry(الشكل 7). ويمكن أيضاً استخدام البروتينات الفلورية القابلة للإضاءة الضوئية، مثل mEOS218،عن طريق إضاءة مستوى معتدل من الضوء البنفسجي للحصول على كل من أنواع البروتينات مع أو بدون تحويل ضوئي. في ظل ظروف منخفضة من الأكسجين، يمكن أيضا أن تستخدم GFP كبروتين تحويل ضوئي من الأخضر إلى الأحمر19،20. وبالتالي فإن اختيار عينة المعايرة الصحيحة سيجعل التجربة أكثر قوة.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعمت هذه الدراسة من قبل JSPS KAKENHI أرقام المنح JP19H03202 إلى A.M. JP18H05528 وJP17H03636 إلى T.H.، وJP17H01444 وJP18H055533 إلى H.Y. L.S. يعترف بالدعم من قبل جوائز الترحيب الاستئماني الاستراتيجية 091911 و 107457/Z/15/Z تمويل التصوير المتقدم في ميكرون أكسفورد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% formaldehyde solution | Polyscience | 18814-10 | |
| 35 mm glass-bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Alexa Fluor 405 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A30104 | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16170078 | |
| Coverslip | Matsunami | No. 1S HT | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate | Nacalai Tesque | 08458-16 | |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1) | Described in Ref 15. | ||
| Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well) | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
| Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1) | A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased. | ||
| Secondary antibody with Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | |
| Secondary antibody with Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21424 | |
| Secondary antibody with Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| TetraSpeck Microspheres, 0.2 µm | Thermo Fisher Scientific | T7280 |
References
- Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
- Manders, E. M. M. Chromatic shift in multicolour confocal microscopy. Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).
- Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 7583 (2018).
- Grünwald, D., Singer, R. H. In vivo imaging of labelled endogenous β-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport. Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Schulz, O., et al. Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).
- Müller, C. B., Enderlein, J. Image Scanning Microscopy. Physical Review Letters. 104 (19), 198101 (1981).
- Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
- Yorifuji, H., et al. Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane. Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).
- Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies. Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Sawin, K. E., Nurse, P. Photoactivation of green fluorescent protein. Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).
- Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. Photoactivation turns green fluorescent protein red. Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).
