Summary
3차원(3D) 다색 형광 현미경 이미지의 색채 이동 보정은 정량적 데이터 분석에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 적절한 참조 이미지의 획득 및 오픈 소스 소프트웨어, 크로마그논과의처리를 통해 생물학적 샘플의 색채 변화를 측정하고 교정하기 위해 개발되었습니다.
Abstract
정량적 다색 형광 현미경 검사는 서로 다른 파장에서 획득 한 색상 채널의 신중한 공간 일치에 의존합니다. 색수차와 카메라의 불완전한 정렬로 인해 각 채널에서 획득한 이미지가 이동하고 확대될 수 있을 뿐만 아니라 3차원 중 어느 한 쪽에서 서로 에 대해 회전할 수 있습니다. 고전적인 교정 방법을 사용하면 색소 시프트는 커버슬립 표면에 부착된 다색 구슬에 의해 측정되며, 이러한 교정 샘플에서 색채 의 변화를 측정할 수 있는 다수의 소프트웨어가 사용된다. 그러나, 색수차는 깊이에 따라 다를 수 있고, 관찰 조건에 따라 변화하며 생물학적 샘플 자체에 의해 유도될 수 있으므로, 따라서 관심 있는 시료및 부피 전반에 걸쳐 색채 변동의 실제 양에 대한 결정을 방해할 수 있다. 정확도가 높은 색채 시프트를 교정하는 것은 약간의 색채 시프트만이 정량적 분석에 영향을 미치고 다색 이미지의 해석을 바꿀 수 있는 초해상도 현미경 검사법과 특히 관련이 있습니다. 우리는 생물학적 샘플의 3D 색색 변화를 측정하고 수정하기 위해 오픈 소스 소프트웨어 크로마뇽및 동반 방법을 개발했습니다. 여기서는 생물학적 시료의 색채 변화를 측정하기 위한 샘플 준비, 데이터 수집 및 소프트웨어 처리를 위한 특별한 요구 사항을 포함하는 상세한 응용 프로토콜을 제공합니다.
Introduction
다색 화상 진찰은 다른 분자 또는 구조물의 공간 관계가 중요한 관심사인 경우에, 생물학 형광 현미경 검사법의 근본적인 양상의 한개입니다. 탈색 수차, 분산으로 인한 다색 광의 광학 수차, 관심있는 색깔의 물체의 명백한 위치를 변경합니다. 마찬가지로, 각 색상을 획득하는 데 전념하는 여러 대의 카메라가 장착된 현미경은 광학 요소의 차이와 채널 간의 불완전한 정렬로 인해 더 복잡한 색채 변화가 있습니다. 따라서, 이러한 색소 변화는 사용자가 명시적으로 수정하지 않는 한 잘못된 결론으로 이어질 수 있습니다. 현미경 검사법의 해상도가 고전적인 해상도 제한에 의해 제한되는 한 색색 교대는 큰 문제가되지 않았지만, 최근 초해상도 현미경검사법 1의 개발은 색소 교대의 보다 정확한 교정의 필요성을 자극하고있다.
다색 비드 교정 슬라이드2를사용하여 현미경 시스템의 색변화 변화를 측정하는 것이 일반적인 관행이었다. 상기 비드 기반 교정 방법은 현미경의 전체 광학에서 커버슬립2의표면으로의 색색 이동을 측정하는 데 적합하다. 그러나 이 방법은 관심 있는 생물학적 샘플의 색채 변화를 측정할 수 없습니다. 많은 생물학적 샘플이 3차원(3D)이며, 이러한 샘플의 색채 변화는 커버슬립 의 표면과 다르다는 점에 유의해야 한다. 더욱이, 색채 변화는 이미징 조건2,,3로변화한다. 우리는 3D 생물학적 샘플에서 색채 변화를 측정하고 색채 시프트의 불확실성이 종종 고전적인 멀티 컬러 비드 교정 방법에 의해 350 nm만큼이었다는 것을 발견했다3. 따라서, 색색 교대는 관심의 깊이와 사용되는 이미징 조건하에서 생물학적 샘플에서 측정될 필요가 있다.
여기에서, 우리는 생물학 견본에 있는 색채 교대를 측정하고 우리의 소프트웨어, Chromagnon3를사용하여 이 교대를 정정하는 절차를 기술합니다. 생물학적 샘플의 색채 변화를 측정하기 위해 당사의 방법은 두 가지 종류의 데이터 세트, "대상" 이미지 및 "참조" 이미지를 사용합니다. "대상" 이미지는 DNA, 핵 봉투 및 마이크로투블러에 얼룩진 이미지와 같은 여러 가지 관심 이미지입니다. 이러한 이미지에서 색채 의 변화를 측정하는 것은 종종 불가능합니다. 따라서 샘플의 색채 변화를 측정하기 위해 전념하는 "참조" 이미지가 필요합니다. "참조" 이미지의 유일한 정의는 동일한 개체의 다중 색상 이미지입니다. 이러한 의미에서 멀티 컬러 비즈 이미지는 참조 이미지의 유형이기도 합니다. 여기서는 생물학적 샘플의 색채 변화를 측정하는 데 사용되는 세 가지 유형의 참조 이미지를 설명합니다: "크로스토크 참조 이미지", "밝은 필드 참조 이미지" 및 "생물학적 교정 참조 이미지". 참조 이미지의 유형은 사용되는 현미경의 유형 또는 표 1에요약된 데 필요한 보정 정확도에 따라 달라집니다.
| 누화 | 밝은 필드 | 생물학적 교정(다른 슬라이드에서) | 생물학적 교정(동일한 슬라이드) | |
| 정확도는 | +++ | + | ++b | +++ |
| 단순 | ++ | +++ | ++ | ++ |
| 해당 현미경 검사법 | 와이드 필드 | 와이드 필드 | 모든 | 모든 |
| 로컬 정렬 가용성 | + | + | -c | -c |
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a: "+"의 수는 증가 등급을 나타냅니다. 싱글 플러스는 약 50 nm이며 3 플러스는 3D에서 약 15 nm입니다. b: 정확도는 가변 이미징 조건이 일정하게 유지되는 정도에 따라 달라집니다. c: 다색 비드 샘플에 의해 측정된 국소 교정은 프로토콜 섹션 4에 설명된 바와 같이 결합될 수 있다. |
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표 1: 참조 이미지 유형을 선택할 때 매개 변수입니다.
"크로스토크 기준 이미지"는 보정 정확도가 가장 높으며3,,4(표 1)를달성하기가 비교적 간단합니다. 단점은 여기 경로에서 색채 변화를 측정할 수 없습니다 인해 현미경 응용 프로그램에서의 한계입니다. 또한, 이러한 이미지를 얻기 위해 현미경에는 다단제 이색 거울, 그리고 흡개 필터 또는 광원으로부터 독립적으로 제어되는 방출 필터가 장착되어있어야 한다. 적합한 현미경 검사법은 광활성 국소 광학 현미경/스토카즘 광학 재건 현미경 검사법(PALM/STORM)5,6 및 확장 현미경 검사법7과 같은 기존의 광야 현미경 검사법, 단일 분자 국소화 현미경(SMLM)을 포함한다., 크로스토크 참조 이미지는 대상 샘플 자체에서 획득됩니다. 모든 필수 채널에서 얻은 염료의 크로스토크(출혈-스루) 형광의 이미지입니다. 형광 방출은 항상 더 긴 파장을 향해 확장, 따라서 가장 짧은 방출 파장을 가진 염료는 더 긴 파장의 채널에서 크로스 토크 형광을 얻기 위해 흥분된다. 예를 들어, 시료가 파란색, 녹색 및 빨간색으로 염색되면 파란색 염료만 흥분되고 방출 광만 파란색, 녹색 및 빨간색 채널에서 가져옵니다. 이 프로토콜에서, DNA는 4′,6-diamidino-2-페닐린돌 (DAPI)로 염색된 크로스토크 형광을 얻기 위하여 이용되었습니다.
"밝은 필드 참조 이미지"는 "크로스 토크 참조 이미지"에 대한 더 쉽고 적은 광독성 대안이지만 가장 정확한3 (표1)입니다. 대상 이미지에 사용되는 모든 색상 채널에서 획득한 대상 샘플의 밝은 필드 이미지입니다.
"생물학적 교정 기준 이미지"는 각심 및 방출 경로3,,8 (표 1)에서모두 색색 이동을 측정하는 능력으로 인해 모든 유형의 현미경 검사법에 적용될 수 있다는 장점이 있다. 적합한 현미경 검사법은 넓은 필드 현미경 검사법, 공초점 현미경 검사법, 광시트 현미경 검사법, 자극 방출 고갈 (STED)9,구조화 된 조명 현미경 검사법 (SIM)10,Airyscan /SORA11,,12,SMLM이 총 내부 반사 형광 (TIRF) 모드, Olympus 해상도로 관찰된13가지 표면 현미경 검사법을 포함한다. 생물학적 교정 기준 이미지는 표적 샘플로 유사하게 제조된 교정 샘플에서 획득되지만, 여러 색으로 단일 구조의 염색을 한다. 교정 정확도는 대부분의 초해상도 현미경 검사법의 해상도를 우수하며 생물학적 교정 샘플을 준비하는 것은 비교적 간단할 수 있습니다. 또 다른 장점은 여러 참조 이미지를 "평균"으로 사용할 수 있다는 것입니다. 따라서 개별 이미지에 색채 이동 측정에 대한 정보가 불량하더라도 여러 이미지를 평균화하여 정보 콘텐츠를 늘릴 수 있습니다. 정확도는 이미징 조건이 일정하게 유지되는 양에 따라 달라집니다. 이와 관련하여, 대상 및 기준 샘플이 동일한 슬라이드에 있을 때 최상의 성능을 얻을 수 있으며, 예를 들어, 8웰 챔버 커버글래스(표1,오른쪽 대부분)를 사용한다. 이 프로토콜에서, 판로이드의 3색으로 염색된 액틴은 생물학적 교정으로 사용되었다.
참조 이미지를 얻으면 소프트웨어 크로마뇽에의해 색채 이동을 측정하고 수정합니다. 크로마뇽이 색채 이동을 측정하고 수정할 수 있는 채널, Z 섹션 및 시간 프레임의 수에는 제한이 없습니다. 크로마뇽은 두 단계로 색채 의 변화를 측정합니다. 첫 번째 단계는 X, Y, Z 축, X, Y, Z 축을 따라 배율 및 Z 축 주위의 회전에서 번역의 "전역" 또는 "affine" 정렬 매개 변수를 획득합니다. 글로벌 정렬의 계산 정확도는 ~16 nm3D및 ~8nm2D이다. 두 번째 단계는 더 높은 정확도를 얻기 위해 투영 된 이미지에 대한 선택적 2D 반복적 인 "로컬 정렬"입니다. 로컬 정렬 프로세스에서 이미지는 여러 영역으로 세분화되고 이러한 로컬 영역의 색도 변화가 측정됩니다. 이어서, 영역은 더 나누어지고 하위 영역의 색채 이동이 영역의 픽셀 수가 최소 픽셀 수(일반적으로 60 x 60 픽셀)에 도달할 때까지 반복적으로 측정됩니다. 결과 로컬 정렬 맵은 전역 정렬 매개 변수와 결합되며 탄성 변환에 의해 대상 이미지에 적용됩니다. 이 단계에 이어, 계산 정확도는 3D에서 ~14nm, 2D에서 ~6nm로 향상된다. 국소 정렬은 생물학적 교정 기준 이미지에 적합하지 않은데, 이는 기준내의 생물학적 구조가 표적내와 다르기때문이다(표 1). 따라서 생물학적 교정 참조 이미지에는 전역 정렬만 사용됩니다.
로컬 색소 변화는 두 가지 소스에서 비롯됩니다. 현미경 기악국 왜곡 및 생물학적 구조적 불동성. 현미경 기악국 왜곡은 일정하기 때문에, 이것은 다색 구슬 참조 샘플에서 측정하고 고정 파라미터로 수정될 수 있다. 크로마뇽은 생물학적교정(표 1)으로부터현미경 기악국 왜곡 맵 및 글로벌 정렬 파라미터를 결합할 수 있다. 이 방법을 이용하여, 생물학적 교정의 평균 정확도는 추가 1-2 nm에 의해 향상될 것으로 예상된다.
여기서는 가장 쉬운 로우 엔드에서 최고 정확도에 이르기까지 소프트웨어 크로마뇽을사용하여 3D 형광 이미지의 색변화를 수정하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 예를 들어 HeLa 세포의 면역 염색을 사용하고 3D 광필드 현미경 검사법과 3D-SIM을 사용하여 관찰했습니다. 첫 번째 섹션에서는 표적 샘플 및 생물학적 교정 샘플을 준비하는 방법을 설명합니다. 프로토콜의 이 부분은 연구의 특정 목표에 최적화되어야 합니다. 두 번째 섹션에서는 현미경으로 3가지 종류의 참조 이미지에 대한 획득 방법을 설명합니다. 가정은 파란색, 녹색 및 빨간색 채널을 얻는 것이었지만 채널 조성은 연구의 특정 목표와 현미경의 설정에 의해 수정되어야합니다. 현미경에 단일 카메라 또는 여러 카메라가 장착되어 있는지 여부는 중요하지 않습니다. 세 번째 섹션에서는 참조 이미지를 사용하여 대상 이미지의 색색 변화를 측정하고 수정하기 위해 소프트웨어를 사용하는 방법을 설명합니다. 마지막으로, 네 번째 섹션에서는 현미경의 기악국 보정을 사용하여 생물학적 교정 기준 이미지를 보완하는 방법을 설명합니다.
Protocol
1. 샘플 준비
- 대상 샘플 준비
- 종자 2.5 x 105 HeLa 세포는 35mm 유리 바닥 접시에 그들을 성장 하 고 성장 매체의 2 mL에서 성장 (덜베코의 수정 된 독수리 매체 L-글루타민과 나트륨 피루바테 10% 태아 소 혈청 [FBS]) 37°C와 CO2 농도 5%. 대안적으로, 종자 6 x104 HeLa 세포는 8웰 챔버 커버글래스에 37°C에서 성장 배지의 0.5mL및CO2 농도 5%로 성장한다. 고해상도 현미경 검사용 #1.5 커버글래스(두께 0.170mm)를 사용하십시오.
참고: 용기 유형에 관계없이 100μl인 1.1.5, 1.1.6, 1.1.8, 1.1.11 및 1.2.5 단계를 제외한 추가 단계에 8웰 챔버 커버글래스에 1/4 볼륨을 사용합니다. - 약 24h의 인큐베이션 후, 용액을 인산염 완충식식염수(PBS)에서 3.7%의 포름알데히드2mL로 바꿉니다. 부드러운 혼합 후 회전 플랫폼에서 실온(RT)에서 15분 동안 셀을 계속 수정합니다.
주의: 연기 후드에서 작업하십시오. - PBS2mL로 셀을 세척하고 회전 플랫폼에서 5-10 분 동안 각각 3 배.
참고: 현지 규정을 준수하여 포름알데히드 폐기물을 폐기하십시오. - 회전 플랫폼에서 5분 동안 PBS에서 0.1% 트리톤 X-100의 2mL로 세포를 페메아빌화한 다음, 회전 플랫폼에서 각각 5-10분 동안 PBS 2mL로 3개의 세차처리가 뒤따릅니다.
- 회전 플랫폼에서 RT에서 1 시간 동안 PBS에서 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 100 μL에서 세포를 배양합니다.
- 1차 항체의 혼합물의 100 μL(항에메린 폴리클론 항체14 및 항튜룰린 단일 클론 항체15)으로용액을 PBS의 1% BSA에서 적절한 희석제(안티 에메린의 경우 1/500, 항튜룰린의 경우 1/100)로 대체하고, 하룻밤 사이에 100μL을 사용한다.
- PBS2mL로 셀을 세척하고, 회전 플랫폼에서 10분 동안 각각 3-5배.
- 1/500 희석에서 PBS에서 1% BSA에서 1% BSA에서 이차 항체(알렉사 플루어 488을 곁들인 항토끼 IgG 및 알렉사 플루어 555를 가진 항마우스 IgG)의 혼합물100 μL로 용액을 교체하고 RT에서 3-4h의 배양을 한다.
- PBS2mL로 셀을 세척하고, 회전 플랫폼에서 5 분 동안 각각 3-4 배.
- PBS에서 0.5 μg/mL DAPI의 2mL로 솔루션을 교체하여 회전 플랫폼에서 RT에서 30분 동안 DNA를 염색합니다.
참고: DAPI 대신, 동일한 농도의 Hoechst 33342도 사용할 수 있습니다. - 마운팅 매체의 ~100 μL(재료표)로 용액을교체합니다.
- 종자 2.5 x 105 HeLa 세포는 35mm 유리 바닥 접시에 그들을 성장 하 고 성장 매체의 2 mL에서 성장 (덜베코의 수정 된 독수리 매체 L-글루타민과 나트륨 피루바테 10% 태아 소 혈청 [FBS]) 37°C와 CO2 농도 5%. 대안적으로, 종자 6 x104 HeLa 세포는 8웰 챔버 커버글래스에 37°C에서 성장 배지의 0.5mL및CO2 농도 5%로 성장한다. 고해상도 현미경 검사용 #1.5 커버글래스(두께 0.170mm)를 사용하십시오.
- 생물학적 교정 샘플의 준비
- 단계 1.1.1-1.1.4에 설명된 바와 같이 고정 된 세포를 준비합니다.
참고: 바람직하게는, 샘플은 동일한 커버슬립(표1,오른쪽-대부분)에 별도의 챔버에 대상 및 기준 샘플을 모두 배치하기 위해 챔버 커버글래스에 제조된다. 이 제제는 실험에서 가장 높은 보정 정확도가 필요한 경우에 바람직하다. 시료를 일반 커버슬립에 준비해야 하는 경우 두께가 낮은 정밀 커버립("No. 1.5H")을 사용하여 재현성을 보장합니다. - 형광염-컨쥬게이트 프할로이드의 스톡 용액을 메탄올 1.5mL로 준비하고 -20°C에 보관한다. 다음 희석에 PBS에 phalloidin 주식 솔루션을 혼합: 1/100 알렉사 플루어와 팔로이드에 대 한 405, 알렉사 플루어와 프할로이드에 대 한 1/1,000 알렉사 플루어와 함께 1/200 알렉사 플루어와 함께 하는 파로이신에 대 한 594.
- 1.2.2 단계에서 제조된 팜로이드 혼합물의 1mL로 용액을 교체하고 회전 플랫폼에서 RT에서 30분 동안 배양한다.
- PBS2mL로 셀을 세척하고, 회전 플랫폼에서 10분 동안 각각 3-5배.
- 솔루션을 ~100 μL의 장착 매체로 교체합니다.
참고: 교정 샘플은 반복적으로 사용하기 위해 4°C 또는 -20°C로 저장할 수 있습니다.
- 단계 1.1.1-1.1.4에 설명된 바와 같이 고정 된 세포를 준비합니다.
2. 참조 이미지 수집
- 크로스토크 레퍼런스 이미지
- 넓은 필드 현미경에 1.1 단계에서 준비된 표적 샘플을 놓습니다.
- 파란색, 녹색 및 빨간색 채널에서 대상의 형광 이미지를 획득합니다.
참고: 3D 이미지의 경우 이미지 파일에 단계 크기에 대한 정보가 포함된 한 참조 이미지의 Z 단계 크기는 대상 이미지에서 와 다를 수 있습니다. 참조 및 표적 이미지에 대한 Z 단계 크기는 바람직하게는 Z 축의 광학 해상도의 절반 미만이며, 이는
굴절 제한 현미경 검사법에 의해 계산되며, 여기서 λ는 나노미터내의 파장이고 NA는 목표 렌즈의 수치 조리개이다. 예를 들어 축 해상도가 550nm인 경우 275nm보다 작은 Z 단계를 사용합니다. 참조 이미지에는 타임시리즈가 필요하지 않습니다. - 이어서, 참조의 형광 영상을 획득하기 위해, DAPI에 대해서만 흥분라이트를 선택하고 파란색, 녹색 및 빨간색 채널로 획득하도록 선택한다. 3D 스택의 경우 동일한 스테이지 위치와 Z 높이에서 참조 이미지를 정확하게 획득합니다.
참고: 더 긴 방출 파장의 경우 조명 강도와 노출 시간이 증가합니다.
- 밝은 필드 참조 이미지
- 넓은 필드 현미경에 1.1 단계에서 준비된 표적 샘플을 놓습니다.
- 파란색, 녹색 및 빨간색 채널에서 대상의 형광 이미지를 획득합니다.
참고: Z 단계 크기는 바람직하게는 2.1.2 단계에서 설명된 바와 같이 나이퀴스트 기준을 충족시다. - 대상의 밝은 필드 이미지를 파란색, 녹색 및 빨간색 채널에서 정확히 동일한 스테이지 위치에서 2.2.2 및 3D 스택의 경우 동일한 Z 높이로 획득합니다.
- 생물학적 교정 참조 이미지
- 3D-SIM 현미경에 1.1 단계에서 준비된 표적 샘플을 놓습니다.
- 3D-SIM에 의해 파란색, 녹색 및 빨간색 채널에서 대상의 형광 이미지를 획득합니다. 수퍼로 해결된 이미지를 재구성합니다.
참고: 현미경의 종류는 3D-SIM, 공초점, STED 등과 같은 모든 유형일 수 있습니다. Z 단계 크기는 바람직하게는 단계 2.1.2에 설명된 바와 같이 나이퀴스트 기준을 충족시다. - 3D-SIM에 의해 대상 이미지(단계 2.3.2)와 유사한 상이한 스테이지 위치에서 1.2단계에서 제조된 참조의 다중 형광 영상을 획득한다. 수퍼로 해결된 이미지를 재구성합니다.
참고: XY의 총 픽셀 수는 모든 참조 이미지에서 동일해야 합니다. Z의 단계 크기는 모든 참조 이미지에서 동일해야 합니다. Z 섹션의 총 수는 대상 이미지와 동일하지만 절대 요구 사항은 아닙니다. 이러한 기준 이미지의 단계별 XY 위치는 위치 또는 커버슬립이 대상 샘플의 위치와 이미 다르며 단일 커버슬립의 색색 시프트의 차이가 15nm3미만이기 때문에 중요하지 않다. 객관적인 렌즈, 관찰 온도, 침수 오일, 공초점 현미경 검사법의 핀홀 크기, 고도로 기울어진 조명 현미경검사법 16의기울기 각도 를 포함한 이미징 조건은 모두 최상의 성능을 위한 기준과 일치해야 합니다. 현미경이 여러 카메라를 장착하여 동시에 여러 채널을 획득하는 경우 참조 이미지를 매주 자주 획득하여 기악 드리프트를 수정해야 합니다.
굴절 제한 현미경 검사법에 의해 계산되며, 여기서 λ는 나노미터내의 파장이고 NA는 목표 렌즈의 수치 조리개이다. 예를 들어 축 해상도가 550nm인 경우 275nm보다 작은 Z 단계를 사용합니다. 참조 이미지에는 타임시리즈가 필요하지 않습니다.3. 크로마뇽 소프트웨어를 이용한 색채 변속 보정
- 웹 브라우저를 사용하여 https://github.com/macronucleus/Chromagnon/releases가서 Chromagnon의최신 바이너리 릴리스를 다운로드하십시오.
참고: 바이너리 릴리스는 Windows, Mac 및 일부 Linux 버전에서 사용할 수 있습니다. - 프로그램을 추출하고 실행 파일을 편리한 위치에 배치합니다. Windows 또는 Mac에서 파일을 두 번 클릭하여 열거나 Linux 시스템의 명령줄에서 이진 파일을 실행합니다.
참고: 그림 1과 같은 그래픽 사용자 인터페이스가 열립니다. 보안 이유로 처음으로 두 번 클릭하여 프로그램을 열 수 없습니다. 이 경우 플랫폼 종속 방법을 사용하여 인터넷에서 다운로드한 프로그램을 엽니다.
그림 1: 크로마뇽 그래픽 사용자 인터페이스의 스크린샷입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 참조 파일을 "참조 상자"(그림1)에서드래그 앤 드롭하거나 참조 파일(그림 1A)을클릭하여 파일 선택자 대화 상자를 엽니다. 파일 형식에 따라 프로그램이 Java 개발 키트(JDK)를 설치하도록 요청하는 경우 예를 누르고 사용자가 다운로드 페이지로 이동합니다. 지시에 따라 운영 체제에 대한 JDK를 다운로드하고 설치합니다. 크로마뇽은 프로그램을 다시 시작한 후 이미지 파일 형식을 읽을 수 있어야 합니다.
참고: 크로마뇽은 대부분의 이미지 파일 형식(다페이지 'tif', 'czi', nd2', 'oib', 'lif', 'dv' 등)을 읽을 수 있습니다. 이미지 형식을 여러 페이지 tif 파일로 변환할 때 메타데이터를 손실할 수 있으므로 이 단계에서 원본 현미경 이미지 형식이 선호됩니다. 채널 이름이 528, 609(그림2A,녹색 상자)와 같은 파장 대신 0, 1, 2 등으로 표시되면 크로마뇽은 이미지내 채널의 ID를 알지 못한다. 이 경우 참조 파일의 채널 순서와 픽셀 크기가 대상 파일의 순서와 일치하는지 확인합니다. 예를 들어 참조의 채널 순서가 녹색과 빨간색인 경우 대상의 채널 순서도 녹색과 빨간색이어야 하지만 빨간색과 녹색은 아닙니다.
그림 2: 여러 파일을 로드하는 예제 스크린샷입니다. (A)모든 참조 이미지가 해당 대상 이미지를 갖는 경우. 채널 이름은 이 예제에서 사용되는 이미지 파일의 파장(녹색 상자로 표시)으로 올바르게 식별됩니다. (B)단일 참조 이미지가 여러 대상 이미지를 수정하는 데 사용되는 경우입니다. (C)여러 참조 이미지(빨간색 상자로 표시)의 평균값과 평균화 후 생성된 참조 이미지가 여러 대상 이미지를 보정하는 데 사용되는 경우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 대상 파일을 "대상 상자"(그림1)에드래그앤 드롭하거나 대상 파일(그림 1B)을클릭하여 파일 선택기 대화 상자를 엽니다.
참고: 여러 대상 이미지가 있고 각 이미지마다 해당 참조 이미지가 있는 경우 해당 참조 이미지와 대상 이미지가 각각 참조 및 대상상자(그림 2A)에서동일한 행에 있어야 합니다. 단일 참조 이미지를 사용하여 여러 대상이미지(그림 2B)를정렬할 수도 있습니다. - 선택하지 않은 경우 자르기 여백 확인란을 선택합니다(그림1C).
참고: 이 확인란을 선택하면 정렬에서 발생하는 마진이 자른 다. 이 옵션을 일반 사용으로 확인하지만 정렬 전후 의 이미지 간에 픽셀 수준 비교가 필요한지 여부를 확인하지 않습니다. - 선택목록(그림 1D)에서출력 이미지 형식을 선택합니다.
참고: 사용 가능한 형식은 'tif'(ImageJ17 형식), 'dV', 'ome.tif'입니다. 'ome.tif' 형식은 JDK를 설치한 후에만 사용할 수 있습니다. - 대상 파일 이름에 추가되는 출력 파일이름(그림 1E,기본 값은 '_ALN')에 대한 접미사를 지정합니다.
- 신호 대 잡음 비율이 높은 크로스토크 참조 이미지의 경우 로컬 정렬(그림 1F)의선택 목록에서 로컬 정렬을 사용하여 투영을 선택하고 사용하지 않도록 설정하지 않도록 설정합니다. 최소 창 크기 는 60(그림 1G)을사용합니다.
참고: 로컬 정렬을 사용하는 경우 모든 대상 이미지에 해당 참조이미지(그림 2A)가있어야 합니다. 국소 색색 시프트가 한 샘플에서 다른 샘플로 다르므로 생물학적 교정 기준 이미지에 대해서는 국소 정렬이 권장되지않습니다(표 1). 같은 이유로 단일 로컬 정렬은 많은 대상이미지(그림 2B)에적용할 수 없습니다. 예외로, 관심 있는 샘플이 커버슬립의 표면에만 있을 때 사용할 수 있으며, 시야는 다색 형광 비드 샘플과 마찬가지로 밝은 물체로 채워져 있습니다. - 다중 생물학적 교정 기준 이미지의 경우 평균 참조 옵션(도1H)을확인하여 평균 된 이미지에서 단일 정렬 매개 변수를 측정하고 단일 정렬 매개 변수가 모든 대상 이미지(그림 2C)에적용됩니다. 로컬 정렬에 대해 없음을 선택합니다(그림1F).
- 측정을 시작하려면 모두실행(그림 1I)을클릭합니다. 정렬 매개 변수가 대상 이미지에 적용됩니다.
참고: 참조 파일에서 색채 이동을 측정한 후 프로그램은 확장된 "크로마그논.csv" 또는 "크로마그논.tif"가 있는 파일을 만듭니다. 출력 파일의 유형은 로컬 정렬이 적용되는지 여부에 따라달라집니다(그림 1F). 로컬 정렬 없이 정렬이 수행되는 경우 출력은 "크로마그논.csv"이며 로컬 정렬을 사용하는 경우 출력은 "크로마그논.tif"입니다. 파일 이름은 지정된 접미사(그림1J,기본값은 접미사가 없는 경우)와 확장("크로마그논.csv" 또는 "크로마그논.tif")을 제외한 참조 파일과 동일합니다. 정렬 프로세스에 대한 자세한 설명은 동일한 폴더에서 만든 "Chromagnon.log" 파일에서 찾을 수 있습니다. - 보정된 이미지가 뷰어에 표시될 때까지기다립니다(그림 3).
참고: 마우스로 이미지를 드래그하면 이미지가 이동하고 마우스 휠을 이동하면 줌이 변경됩니다. 슬라이더(그림Figure 33A)를이동하여 디스플레이에 대한 Z(및/또는 해당되는 경우 T) 섹션을 변경합니다. 뷰어가 이미지를 새로 고칠 속도가 너무 느리면 전체 데이터를 메모리 버튼(그림 3B)으로로드하여 하드 디스크의 데이터에 액세스하지 못하도록 합니다. 색상 상자의 왼쪽 또는 오른쪽 가장자리를드래그(그림 3C)는표시를 위한 최소 값 또는 최대 값을 제어할 수 있습니다. 각 채널의 버튼을클릭(그림3D)은뷰어에 선택한 채널을 표시하거나 숨기는 사이에 전환합니다. 색상상자(그림3D)를마우스 오른쪽 단추로 클릭하면 사용자가 디스플레이 색상을 선택하거나 색상 막대의 표시 옵션을 변경할 수 있으며 사용자가 "scale..."을 선택하여 디스플레이 배율조정에 대한 정확한 최소 값과 최대 값을 지정할 수 있습니다. 직교 보기 버튼(그림3E)을클릭하면 ZY 및 XZ 뷰의 이미지가 표시됩니다. 크로스선을 이동하면 측면 뷰에 표시할 위치가 변경됩니다.
그림 3: 이미지 뷰어의 스크린샷입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 측정이 올바르게 수행되었는지 확인하려면 참조 이미지를 "참조 상자"와 "대상 상자"로 드래그앤드롭합니다. 프로그램을 실행하고 이미지가 완벽하게 겹쳐 있는지 확인합니다.
참고: 사용 가능한 경우 "크로마그논.csv" 또는 "크로마그논.tif" 파일을 참조로 사용하여 측정을 건너뛸 수 있습니다. 이미지의 색채 변화가 수정되지 않은 상태로 유지되면 표 2에요약된 솔루션을 시도해 보십시오. - 샘플의 정렬 매개 변수에 액세스하거나 정렬 매개 변수를 수동으로 편집해야 하는 경우 텍스트 편집기 또는 스프레드시트 소프트웨어와 직접 "chromagnon.csv" 파일을 엽니다. 편집되면 "csv"로 저장합니다.
참고: 값은 "tz", "ty", "tx", 그리고 "r"에 대한 각도및 "mz", "my"및 "mx"에 대한 배율 계수에 픽셀로 표시됩니다.- 또는 크로마뇽의참조 또는 대상 상자에 "크로마그논.csv" 또는 "크로마그논.tif"Figure 1파일을 로드한 다음 두 번 클릭하여 정렬 편집기를 엽니다(그림4).
- 매개 변수를 편집할 때 채널이 이동되는 양을 보려면 참조 이미지 파일을 아래쪽영역(그림 4A)에드래그앤드롭하여 편집기에서 이미지를 엽니다. 테이블의 값을 편집하고Figure 4B 입력/반환 키를 누르면 값이 변경될 때 해당 채널의 이미지가 어떻게 움직이는지 관찰합니다. 편집 후 변경 내용을 저장하려면 저장을 클릭합니다.Figure 4C
그림 4: 정렬 매개 변수 편집기의 스크린샷입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 로컬 정렬 맵을 확인하려면 크로마뇽의참조 또는 대상상자(그림 1)를통해 "크로마그논.tif"를 로드하고 두 번 클릭하여 정렬 편집기(그림4)를엽니다. 보기(그림 4D)를클릭하여 배율 선택 목록에 지정된 계수에 의해 길이가 확대되는 선별로 표시된 로컬 시프트를 봅니다(그림 Figure 44E).
참고: "원본 이미지 파일"(그림4F)을지정하여 시프트가 원본 이미지와 함께 매핑됩니다.
4. 현미경 별 로컬 정렬 맵 생성
- 에탄올의 18 μL에 직경 200 nm의 다색 형광 구슬 2 μL을 희석.
- 용액을 소용돌이치고 유리 바닥 접시의 중앙에 비드 용액의 10 μL을 배치합니다. 고해상도 현미경 검사법에 #1.5 커버 글래스(두께 0.170mm)를 사용해야 합니다.
- 접시를 RT에 1시간 동안 그대로 두어 완전히 건조시다.
- 접시를 현미경에 놓고 형광 구슬에 집중하십시오.
- 교정할 현미경 검사기로 2D 또는 3D 이미지를 가져옵니다. 스테이지 위치를 변경하여 여러 이미지를 가져옵니다.
- 크로마뇽 그래픽 사용자 인터페이스를 엽니다.
- "참조 상자"(그림1)에비드 이미지 파일을 드래그앤드롭하거나 참조 파일(그림 1A)을클릭하여 파일 선택자 대화 상자를 엽니다.
- 평균 참조 옵션(그림1H)을확인합니다. 로컬 정렬(그림 1Figure 1F)의선택 목록에서 프로젝션을선택합니다. 최소 창 크기 는 60(그림 1G)을사용합니다. 측정을 시작하려면 모두실행(그림 1I)을클릭합니다.
참고: 현미경의 로컬 정렬 맵이 저장되는 ".chromagnon.tif" 파일이 만들어집니다. - 측정 후 추가 매개 변수(그림 1K)를클릭합니다. 현미경 기기 상자의 로컬 왜곡에서 선택 목록을 클릭하고 새 를 선택하여 대화 상자를 엽니다. 4.8 단계에서 생성된 "크로마그논.tif" 파일을 파일 이름 상자에 드래그앤드롭하거나 파일 선택자 대화 상자를 열기 위해 파일 단추를 선택합니다. 현미경의 이름을 입력하고 확인을 클릭합니다.
- 크로스토크 또는 생물학적 교정 기준 이미지에서 색채 변화를 측정할 때 추가 매개변수(그림 1K)를클릭합니다. 현미경 기기 상자의 로컬 왜곡에서 4.9 단계에서 지정된 현미경의 이름을 선택합니다. 확인을 클릭합니다.
참고: 프로그램이 종료된 후 "현미경 기기의 로컬 왜곡"의 선택은 저장되지 않습니다. - 섹션 3에서와 같이 로컬 정렬없이 색조정으로 진행합니다.
참고: 현미경 교정 외에도 로컬 정렬을 사용할 수도 있습니다. 이 경우 로컬 정렬은 현미경 보정으로 시작됩니다.
Representative Results
크로스토크 참조 이미지를 이용한 색변식 보정의 예가 도 5에도시된다. 이 이미지는 단일 카메라가 장착된 넓은 시야 현미경으로 얻어졌습니다. DAPI로부터의 형광 방출은 파란색, 녹색 및 빨간색 채널을 보정하기 위해참조(도 5A,B)로사용되었다. 이미지는 각각 256 x 256 픽셀로 구성된 60 Z 슬라이스의 3 채널로 구성됩니다. 이미지는 색색 시프트를 측정하기 전에 장식되었습니다. 크로마뇽을 사용하여 로컬 색조 변화를 측정하는 것은 인텔 코어 i7 (쿼드 코어, 8 스레드, 2.7 GHz), 16 GB RAM 및 1 TB 플래시 스토리지와 맥에 51 s했다. 정렬 매개 변수는 기준 이미지와 정확히 동일한 수의 복셀을 가지고 있는 대상이미지(도 5C,D)에적용되었다. 정렬된 파일을 준비하는 데 3s가 걸렸습니다. 정렬 프로세스(도 1C의자르기 개수 확인란)에서 가장자리 픽셀을 트리밍한 결과 정렬 후 복셀 수가 감소하였다(그림5B,51 Z 슬라이스, 252 x 251 픽셀). 상반신 교량(화살표헤드로 표시된)의 DNA는 정렬 전 핵 봉투 의 외부에서 잘못 볼 수있지만(그림 5C,XZ 뷰를 나타내는 하단 패널에서 명백함), 그러나 정렬 후 봉투 내부에서 예상되는 바와 같이(도5D).
생물학적 교정 기준 영상을 이용한 색소시 변속 보정의 예가 도 6에도시된다. 이미지는 세 대의 카메라가 장착된 SIM 현미경으로 얻어졌습니다. 파랑, 녹색, 빨간색 염료에 컨쥬게이트된 플라로이드인으로 염색된 HeLa 세포의 3개의 이미지는 평균하였다(그림6A). 참조 이미지는 각각 1,024 x 1,024 픽셀로 구성된 76 Z 슬라이스의 3 채널로 구성됩니다. 로컬 정렬없이 크로마뇽을 사용하여 색조정체를 측정하려면 위에서 설명한 Mac 시스템에서 194s가 필요했습니다. 매개 변수는 각각 1,024 x 1,024 픽셀로 구성된 73 Z 슬라이스의 3 채널로 구성된 대상 이미지에 적용되었습니다. 정렬된 파일의 생성은 25s를 차지했습니다. XZ 뷰는 Z를 따라 잘못된 채널 위치를 나타내고 X방향(그림 6A,C)을약간 따라 표시하지만 이 잘못된 등록은 정렬 후 수정되었습니다(그림6B,D).
그림 5: 크로스토크 참조 이미지와 정렬의 예입니다. HeLa 세포는 DNA를 위한 DAPI(마젠타에 도시됨), 핵 봉투에 대한 알렉사 플루소 488(노란색으로 표시됨), 미생물에 대한 알렉사 플루어 555(파란색으로 표시됨)로 염색하였다. 이미지는 단일 카메라와 3D 와이드 필드 현미경 검사법에 의해 획득하고 deconvolved. (A,B) 크로마뇽에의한 정렬 전후DAPI 방출을 이용한 대표적인 크로스토크 기준 이미지. 세 가지 색상 채널이 오버레이로 표시됩니다. (C,D) 정렬 전후세 채널에서 3D 스택의 광학 섹션입니다. 축 색 수차는 화살촉에 의해 표시된 무상 다리에서 명백합니다. 패널 A의 배율 막대는 모든 패널에 대해 5 μm을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 생물학적 교정 기준 이미지와 의 일치의 예 3대의 카메라가 장착된 3D-SIM을 통해 이미지를 획득했습니다. (A,B) 참조 이미지는(A)및 이후(B)정렬 전에 세 가지 이미지에서 평균. HeLa 세포는 알렉사 플루어 405, 488 또는 594와 결합된 판로이드진으로 염색되었다. (C,D) 대상 이미지 전(C)및 이후(D)정렬. HeLa 세포는 DNA를 위한 DAPI(마젠타에 도시됨), 핵 봉투에 대한 알렉사 플루소 488(노란색으로 표시됨), 미생물용 알렉사 플루어 594(파란색으로 표시됨)로 염색하였다. 패널 A의 배율 막대는 모든 패널에 대해 5 μm을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
색채 보정 절차는 정확성과 노력 사이의 절충입니다. 불필요한 노력을 절약하기 위해 연구에 얼마나 많은 정확도가 필요한지 아는 것이 좋습니다. 기존의 와이드 필드(live) 이미징에는 가장 높은 정확도가 필요하지 않을 수 있으므로 밝은 필드 참조 이미지는 종종 색의 변화를 교정하기에 충분합니다. 마찬가지로, 이미징 상태와 환경이 일정할 때 생물학적 교정을 반복적으로 사용하면 시간을 절약할 수 있습니다. 한편, 매우 정확한 등록이 필요한 경우 고품질의 크로스토크 또는 생물학적 교정 기준 이미지가 필요합니다. 최상의 성능을 위해 참조 이미지는 가능한 한 대상 이미지와 유사한 조건과 타이밍을 가져와야 합니다. 동일한 현미경 검사법에 의해 참조 및 표적 이미지를 모두 획득하는 한, 더 높은 공간 해상도는 보정 정확도를 향상시킵니다. 참조 및 대상 이미지 모두에 대한 deconvolution을 사용할 수 있는 경우 수정 전에 이를 구현하면 보정 정확도가 향상될 수 있습니다. 또한, 최상의 성능을 위해, 광학(Z) 축에 대한 샘플링 정리는 정확한 서브픽셀 보간(프로토콜 단계 2.1.3)을 위한 기준 및 대상 파일 모두에서 이루어져야 한다.
색변화 시프트를 수정하지 못하면 잘못된 결론이 발생합니다. 또한 잘못된 교정을 사용하면 수정보다는 색의 변화가 악화될 수 있으므로 이를 피해야 합니다. 표 2에서실패의 가능한 원인과 공통 해결 방안을 요약했습니다. 실패의 원인을 검사하기 위해, 처음에, 참조 이미지의 색채 변화가 정확하게 수정되었는지 여부를 시각적으로 확인할 필요가 있다(프로토콜 단계 3.12). 대부분의 오류는 참조 이미지의 품질에 기인하며 표 2의설명에 따라 쉽게 해결됩니다. 참조 이미지의 품질에 관해서는 전체 시야가 샘플로 채워지지 않으면 전역 정렬의 정확도가 저하된다는 점에 유의해야합니다(그림 7, 표 2). 도 7A에나타난 좋은 예와 비교하여 도 7B에 표시된 나쁜 예는 왼쪽 위 부위에 3개의 핵 봉투만 포함하고 있으며, 크로마뇽은 이 이미지의 일부를 정렬하지 못했다. 이는 크로마뇽의 글로벌 정렬 방식이 높은 정확도3로회전 및 배율의 차이를 측정하기 위해 시야를 4개 영역(도7C)으로분할하기 때문이다. 이 방법은 올바르게 작동하는 경우 로그 극지 변환 및 심플렉스 메서드3과같은 다른 선형 메서드보다 한 순서더 더 정확합니다. 네 개의 영역 중 어느 것을 사용할 수 없는 경우 Chromagnon은 덜 효과적인 선형 메서드로 전환됩니다. 따라서 최상의 성능을 위해 그림 7B 및 그림 7C에 표시된 예제는 바람직하지 않으며 네 영역은 개체로 채워야 합니다. 사용자는 로그 파일을 보고 측정할 수 없는 시야의 이차 영역이 있는지 확인할 수 있습니다("Chromagnon.log"; 프로토콜 단계 3.10 참조). 다행히도, 이 문제는 다중 생물학적 교정 이미지를 평균화하거나 크로스토크 또는 밝은 필드 참조이미지(표 2)에대한 로컬 정렬을 사용하여 쉽게 극복할 수 있다. 참조 이미지를 수정하지 못하는 경우와 달리 대상 이미지를 수정하지 못하는 경우를 식별하기가 더 어렵습니다. 이러한 오류는 파일 형식, 이미징 조건, 이미징 타이밍, 참조 및 대상 이미지 사이의 이미징/정렬방법(표 2)의차이로 인해 발생하므로 대상 이미지에서 다른 조건/타이밍에서 얻은 참조 이미지를 사용할 때 는 항상 주의해야 합니다. 일부 예제 이미지는 좋은 예 이미지의 구체적인 아이디어를 얻기 위해 테스트(https://github.com/macronucleus/Chromagnon)에사용할 수 있습니다.
| 문제 | 원인 | 솔루션 |
| 참조 이미지를 수정하지 못했습니다. | 낮은 대비 | 가능하면 더 높은 대비 이미지를 얻습니다. 밝은 필드 참조 이미지를 사용하는 경우 수성 솔루션에서 이미지를 다시 수집하여 셀의 더 높은 대비를 얻습니다. 또는 계산 노이즈 감소(예: 가우시안 필터링)를 적용해 보십시오. 노이즈에 더 민감한 로컬 정렬을 끕니다. |
| 관련없는 이미지의 오염 | 가능한 경우 샘플에서 관련없는 이미지의 소스를 제거합니다. 크로스토크 참조 이미지의 경우 대상 이미지에 사용되는 염료의 여기 스펙트럼을 확인합니다. 염료가 크로스토크 이미지(예: 알렉사 플루서 568 또는 594)를 획득하는 동안 흥분되는 경우 다른 염료(예: 알렉사 플루어 555)를 고려하십시오. 카메라 칩의 먼지가 명백한 채널 차이를 생성하는 경우 카메라 칩을 청소하거나 계산 플랫 필딩 방법을 사용합니다. | |
| 우주 광선에 의해 만들어진 매우 밝은 자리 | 가능하면 이미지를 다시 획득합니다. 또는 계산 노이즈 감소(예: 중앙값 또는 가우시안 필터링)를 적용해 보십시오. | |
| 절충 공유물(축 및 측면 가장자리의 인공 신호) | 감소 후 가장자리 픽셀 또는 Z 섹션을 다듬습니다. 한쪽이 트리밍되면 이미지 중심을 유지하려면 다른 쪽도 트리밍해야 합니다. | |
| Z 스텝 크기도 희소 | Z 스택 프로토콜 2.1.3에 기록 된 나이퀴스트 기준을 충족 하기 위해 취득 해야 합니다. | |
| 광학 수차 | 구형 수차는 사용자에 의해 발생 하는 주요 수차. 시료에 적합한 객관적렌즈를 선택하고 170μm의 커버슬립 두께를 사용합니다. 객관적인 렌즈에 보정 링이 장착된 경우, 가장 높은 형광 수가 초점에서 얻어지는 위치를 찾기 위해 조정한다. 보정 링없이 오일 침지 목표의 경우, 초점에 형광 수를 증가 침지 오일의 굴절 지수를 조정합니다. | |
| 시야가 채워지지 않습니다(그림 7) | 생물학적 교정 참조 이미지의 경우, 평균 많은 이미지. 크로스토크 또는 밝은 필드 참조 이미지의 경우 로컬 정렬을 사용합니다. | |
| 확인되지 않은 소프트웨어 버그 | GitHub(https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)를 통해 문제를 보고하십시오. | |
| 대상 이미지를 수정하지 못했습니다. | 이미지 파일의 메타데이터가 손실되었습니다. | 전체 메타데이터가 포함된 원본 현미경 파일 형식을 사용하고 처리하기 전에 여러 페이지 의 tiff 파일로 변환하지 마십시오. 프로토콜 3.3에 기록된 것과 동일한 채널 순서를 사용합니다. |
| 주어진 현미경 검사법에 대한 잘못된 정렬 방법 | 생물학적 교정 참조 이미지에서 측정할 때 로컬 정렬 방법을 대상으로 하여 적용하지 마십시오. 와이드 필드 현미경 검사법 이외의 크로스토크 참조 이미지를 사용하지 마십시오. | |
| 이미징 조건의 차이 | 프로토콜 2.3.3에 기록된 참조와 대상 이미지 사이에 이미징 조건을 일정하게 유지합니다. | |
| 샘플의 차이(커버슬립 포함) | 항상 동일한 장착 매체, 커버슬립(예: 1.5H) 및 유사한 초점 깊이를 사용합니다. | |
| 교정이 마지막으로 만들어진 이후 현미경 드리프트 | 2주에 한 번씩 교정을 합니다. 온도를 일정하게 유지하고 부동 테이블을 사용하여 현미경의 하드웨어 드리프트를 방지합니다. |
표 2: 색조정을 위한 문제 해결.
그림 7: 참조 이미지의 예입니다. 핵분열 효모 세포의 핵 봉투는 GFP와 mCherry로 표시되어 있습니다. 이미지는 기존의 광시야 현미경으로 획득되었다. 색칠 변화는 이미지 자체를 참조 이미지로 사용하여 로컬 정렬없이 크로마뇽을 사용하여 수정되었습니다. 그런 다음 이미지가 장식되어 세부 사항을 표시했습니다. (A)시야에 많은 객체가 있는 좋은 예입니다. (B)왼쪽 상단 모서리에만 오브젝트가 있는 나쁜 예입니다. 이미지의 특정 영역에서 정렬 불량이 분명합니다. (C)사분면(점선으로 구분)중 하나가 비어 있는 바람직하지 않은 예. 패널 A의 스케일 바는 전체 시야에 대해 5 μm, 확대된 뷰의 경우 1.25 μm을 나타내며 모든 패널에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 프로토콜에서는 세 가지 다른 참조유형(표 1)을설명했습니다. 그 중, 크로스 토크 참조 이미지와 생물학적 교정 참조 이미지는 더 신중한 논의가 필요합니다. 크로스토크 레퍼런스 이미지의 경우, DAPI 또는 Hoechst 33342로 염색된 샘플과 글리세롤 또는 상업용 마운팅 미디어에 장착된 샘플은 파란색, 녹색 및 빨간색 채널을 효율적으로 정렬하는 데 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 알렉사 플루어(488)는 녹색 및 빨간색 채널을 정렬하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 DAPI와 Hoechst를 제외한 많은 파란색 염료가 대부분의 녹색 과 빨간색 염료보다 더 어둡고 부패하기 때문에 크로스 토크 형광을 얻는 것은 종종 어렵습니다. 또한 현대 염료의 배출 스펙트럼은 좁아이 방법에 의해 세 개 이상의 채널의 정렬을 어렵게 만듭니다. 주의는 또한 몇 가지 일반적인 빨간 염료에 지불 해야 한다 (예를 들어, 알렉사 밀가루 568 그리고 594, 하지만 알렉사 플루머 555) 보라색 빛에 의해 흥분 될 수 있는, 블루 염료에서 고대비 크로스 토크 이미지를 얻기 방지. 또 다른 단점은 이 방법이 다색 여기로 여기광경로의 색수차를 측정할 수 없다는 것이다.Table 1 대부분의 고급 현미경 검사는 변경된 조명 광학을 사용하므로 이 방법의 적용은 제한적입니다. 여전히 보정 정확도가 높을수록 이 프로토콜에 설명될 수 있을 만큼 충분히 유리합니다. 일반적으로, 크로스토크 이미지는 표백 또는 광독성 효과를 방지하기 위해 대상 이미지 후에 취해야 한다. 광시야 모드로 관찰된 SMLM의 경우, 이미징 하는 동안 형광 염료가 표백될 수 있기 때문에 대상 이미지를 획득하기 전에 기준 이미지를 획득해야 합니다.
생물학적 교정 참조 이미지를 통해 사용자는 추가 샘플 준비 비용을 절감하여 원하는 수의 채널을 쉽게 정렬할 수 있습니다. 생물학적 교정 참조 이미지의 또 다른 장점은 모든 시야를 채우는 데 도움이 되는 "평균화" 여러 참조의 가용성입니다. 이 방법은 교정 샘플이 다른 슬라이드에서 제조되는 경우 이미징 조건의 차이로 고통받을 수 있습니다. 이러한 문제의 대부분은 상용 챔버 커버글래스(표1)를사용하여 동일한 슬라이드에서 표적과 참조를 모두 제조하고 다른 이미징 조건이 프로토콜 단계 2.3.3에서와 같이 일정하게 유지되는 경우 해결할 수 있다. 이 경우, 크로스토크 참조 이미지와 유사한 보정 정확도를 기대할 수 있습니다3. 여기에 표시된 것과 같이 phalloidin을 사용하는 프로토콜은 여러 색상으로 단일 셀룰러 구조를 염색하는 가장 쉬운 방법 중 하나입니다. 생물학적 교정 샘플을 준비하는 시나리오는 여러 가지가 있습니다. 면역 염색을 위해, 견본은 다중 색깔의 이차 항체로 염색하는 뒤에 단 1차 항체로 표지될 수 있습니다. 이러한 방식으로 단일 대상 구조에 여러 색상으로 레이블을 지정할 수 있습니다. 대안적으로, 5-에티닐-2'-deoxyuridine, "클릭" 화학 라벨에 의해 검출된 고밀도에서 여러 색으로 DNA를 새로 합성, 자세히 설명 하 여8. 살아있는 세포의 경우, GFP 또는 mCherry에 융합된 유전자의 2개의 사본을 품고 있는 형질균균을 두 가지 색상으로 동일한 구조로 표시하는 것이 유용하다. 유전자의 카피 수가 종종 막 단백질에 대해 관찰되는 것만큼 중요하면, 유전자의 단일 사본은 GFP 및 mCherry(도7)에나란히 융합될 수 있다. mEOS218과같은 광변환형 형광 단백질은 광변환 유무에 관계없이 적당한 수준의 바이올렛 빛을 조명하여 사용할 수 있다. 낮은 산소 조건하에서, GFP는 또한 녹색에서 적색19,,20까지광변환단백질로 사용될 수 있다. 따라서 올바른 교정 샘플을 선택하면 실험이 더욱 견고해집니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 JSPS KAKENHI 보조금 번호 JP19H03202에 의해 지원되었다. JP18H05528 및 JP17H03636 - T.H., JP17H01444 및 JP18H055333 @ L.Y.L.S.는 옥스포드에서 고급 이미징을 위한 웰컴 트러스트 전략상 091911 및 107457/Z/Z 펀딩의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% formaldehyde solution | Polyscience | 18814-10 | |
| 35 mm glass-bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Alexa Fluor 405 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A30104 | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16170078 | |
| Coverslip | Matsunami | No. 1S HT | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate | Nacalai Tesque | 08458-16 | |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1) | Described in Ref 15. | ||
| Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well) | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
| Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1) | A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased. | ||
| Secondary antibody with Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | |
| Secondary antibody with Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21424 | |
| Secondary antibody with Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| TetraSpeck Microspheres, 0.2 µm | Thermo Fisher Scientific | T7280 |
References
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