Summary
Live beeldvorming van lysosomale exocytose op micropatterned cellen maakt een ruimtelijke kwantificering van dit proces mogelijk. Morfologie normalisatie met behulp van micropatronen is een uitstekend hulpmiddel om algemene regels over de ruimtelijke verdeling van cellulaire processen te ontdekken.
Abstract
Live beeldvorming van het pHluorine gelabeld Oplosbare N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-geassocieerd membraaneiwit 7 (VAMP7) door totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM) is een eenvoudige manier om de afscheiding uit het lysosomale compartiment te verkennen. Gebruikmakend van de celcultuur op micropatronen om de celvorm te normaliseren, werden verschillende statistische instrumenten gebruikt om een ruimtelijke analyse van secretoire patronen uit te voeren. Met behulp van Ripley's K-functie en een statistische test op basis van de dichtstbijzijnde buurafstand (NND), hebben we bevestigd dat afscheiding van lysosomen geen willekeurig proces is, maar significante clustering vertoont. Van nota, onze analyse toonde aan dat exocytose gebeurtenissen ook geclusterd in niet-hechting gebieden, wat aangeeft dat hechting moleculen zijn niet de enige structuren die kunnen leiden tot secretoire hot spots op het plasmamembraan. Toch ontdekten we dat celhechting de clustering verbetert. Naast nauwkeurig gedefinieerde lijm- en niet-belangrijke gebieden, maakt de cirkelvormige geometrie van deze micropatronen het gebruik van polaire coördinaten mogelijk, waardoor analyses worden vereenvoudigd. We gebruikten Kernel Density Estimation (KDE) en de cumulatieve distributiefunctie op polaire coördinaten van exocytosegebeurtenissen om verrijkte gebieden van exocytose te identificeren. In ringvormige micropatronen vond clustering plaats aan de grens tussen de lijm en niet-aangrenzende gebieden. Onze analyse illustreert hoe statistische instrumenten kunnen worden gebruikt om ruimtelijke verdelingen van diverse biologische processen te onderzoeken.
Introduction
Exocytose is een universeel cellulair proces waarbij een blaasje samensmelt met het plasmamembraan en de inhoud ervan vrijgeeft. De blaas kan ofwel volledig samensmelten met het plasmamembraan (volledige fusie) of een fusieporie creëren die gedurende een beperkte tijd open blijft (kiss-and-run)1. Zo komen nieuw gesynthetiseerde eiwitten vrij in het extracellulaire medium van akelige die afkomstig zijn van het Golgi-complex. Deze biosynthetische, anterograde route is primordiale, vooral in meercellige organismen, om signaal peptiden afscheiden (bijvoorbeeld hormonen, neurotransmitters) en extracellulaire matrix componenten (bijvoorbeeld collageen), evenals om transmembrane eiwitten te verhandelen naar het plasmamembraan. Bovendien kunnen afscheidingen optreden van verschillende endosomosomen: 1) recycling endosomes om transmembranen te hergebruiken; 2) multivesiculaire instanties (MVB's) om exosomen vrij te geven; en 3) lysosomen voor het vrijkomen van proteolytische enzymen. Endosomale afscheiding is aangetoond dat het belangrijk is voor neurite uitgroei, pseudopodia vorming, plasma membraan reparatie, en ATP-afhankelijke signalering2.
Om exocytose op eencellig niveau te bestuderen, zijn verschillende technieken toegepast. Patch-klem zorgt voor de detectie van enkele exocytose gebeurtenissen met een hoge temporele resolutie in een breed scala van levende cellen3. Deze methode geeft echter geen informatie over de lokalisatie van exocytosegebeurtenissen, noch uit welk compartiment het voorkomt. Elektronenmicroscopie maakt directe visualisatie van exocytische gebeurtenissen met hoge ruimtelijke resolutie mogelijk, en in combinatie met immunolabeling geeft informatie over de specificiteit van de betrokken compartimenten en moleculen. Een nadeel van deze aanpak is het gebrek aan informatie over de dynamiek van het proces, evenals het onvermogen om high-throughput studies uit te voeren. Lichte microscopie benaderingen zoals totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM), die gebruik maakt van de evanescente veld om fluoroforen te verlichten in de buurt van de coverslip (100 nm), biedt een goede temporele en ruimtelijke resolutie om exocytose gebeurtenissen te bestuderen. Deze methode is echter alleen compatibel met aanhangende cellen en kan alleen worden toegepast op het ventrale/inferieure deel van cellen.
Van belang, het plasmamembraan onthult significante heterogeniteit op basis van lijmcomplexen die alleen aanwezig zijn in gebieden met beperkte toegang. Deze heterogeniteit beperkt bijvoorbeeld de opname van verschillende liganden4. Ook is onlangs gemeld dat afscheiding van het Golgi-complex is geconcentreerd op "hot spots" in het plasmamembraan5. Bovendien is het bekend dat bepaalde ladingen worden afgescheiden door focal-adhesie-geassocieerde exocytose6. Er moet dus bijzondere aandacht worden besteed aan de vraag of exocytosegebeurtenissen willekeurig in de ruimte worden verspreid, of dat ze geconcentreerd zijn op specifieke gebieden van het plasmamembraan. Verschillende statistische instrumenten op basis van de K-functie van Ripley zijn voorgesteld om deze vragen te onderzoeken7,8,9. Onze aanpak combineert deze tools met micropatronen om celvorm en plasmamembraan heterogeniteit te controleren. Deze techniek biedt niet alleen een middel om onderscheid te maken tussen lijm- en niet-belangrijke gebieden, maar maakt ook vergelijking tussen verschillende cellen en omstandigheden mogelijk en verhoogt de kracht van statistische analyses.
Hier maken we gebruik van een verscheidenheid aan statistische instrumenten om de ruimtelijke verdeling van exocytosegebeurtenissen te bestuderen uit het lysosomale compartiment dat wordt bewaakt door TIRFM live celbeeldvorming van VAMP7-pHluorine in ringvormige micropattern-genormaliseerde hTert-RPE1-cellen. Er werd bevestigd dat afscheiding van lysosomen geen willekeurig proces8,9 is en dat exocytosegebeurtenissen clustering vertonen. Van nota, vonden we dat exocytose gebeurtenissen zijn ook geclusterd in niet-belangrijke gebieden, wat aangeeft dat hechting moleculen zijn niet de enige structuren die secretoire hot spots kan induceren op het plasmamembraan. Niettemin, celhechting heeft versterkt clustering. Consequent identificeerde onze analyse verrijkte gebieden van exocytose die zich op de grens tussen de lijm en niet-aangrenzende gebieden bevonden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van micropatronen
- Transfectie van cellen
- Een dag voor de transfectie, zaad 2,5 x 106 hTERT-RPE1 cellen in een put van een 12 put plaat (2 x 2 cm) in 1 mL van medium.
- Bereid op de dag van de overbesmetting het transfectiemengsel met VAMP7-pHluorin plasmid (100 μL buffer, 0,8 μg DNA, 3 μL transfectiemengsel). Incubeer gedurende 10 minuten.
OPMERKING: VAMP7 is een lysosomale v-SNARE, gefuseerd met een luminale pHluorin-tag. De pHluorine sonde wordt gedoofd door lage pH, maar tijdens exocytose protonen worden vrijgegeven en pHluorine begint het uitzenden van een signaal10,11. - Voeg de transfectiemix toe aan de cellen in hun medium.
- Verander het medium 4 uur na het toevoegen van de transfectie mix op de cellen.
- Gebruik de cellen voor experimenten tijdens de volgende 24-48 uur.
- Micropatroonvoorbereiding (fotolithografiemethode)
- Was de coverslips (25 mm diameter) in ethanol en laat ze 5 minuten drogen.
- Activeer coverslips door verlichting onder diepe UV gedurende 5 minuten.
- Maak een vochtige kamer door een papieren handdoek waarop een paraffinefilm is geplaatst grondig te bevochtigen. Voeg druppels (30 μL voor 22 mm coverslip) van Poly-L-Lysine-graft-Polyethyleen Glycol (PLL-g-PEG) oplossing (0,1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH = 7.4) en plaats coverslips met het geactiveerde oppervlak erop. Sluit de vochtige kamer met een top en incubeer coverslips voor 1 uur.
- Was coverslips 2x in PBS en 1x in gedestilleerd water en laat ze drogen.
- Was het kwartsfotomasker met gedestilleerd water en vervolgens met ethanol of propanol. Droog het fotomasker met gefilterde luchtstroom.
OPMERKING: Het quartz fotomasker is aan de ene kant bekleed met antireflecterend chroom dat gaten in de vorm van micropatronen bevat. In dit protocol wordt een fotomasker gebruikt met ringvormige micropatronen van 37 μm. Wanneer diepe UV op het fotomasker schittert, kan het licht alleen door deze gaten12gaan. - Stel het fotomasker (met chroom gecoate kant) gedurende 5 minuten bloot aan diepe UV om het oppervlak schoon te maken.
- Voeg kleine waterdruppels (10 μL voor een 20 mm coverslip) toe aan de met chroom bedekte kant van het fotomasker. Plaats de coverslip met hun PLL-g-PEG-behandelde kant op de druppel en droog het extra water. Zorg ervoor dat er zich geen luchtbellen vormen tussen het masker en de coverslips.
LET OP: De capillaire kracht van het water zal de coverslips immobiliseren. - Stel het fotomasker 5 minuten bloot aan diepe UV met de niet-chroom gecoate zijkant omhoog (de covers zijn bevestigd aan het onderste oppervlak).
LET OP: Het licht kan alleen door de gaten gaan en het PLL-g-PEG-behandelde oppervlak van covers onder het fotomasker aanpassen. - Verwijder de covers van het fotomasker door overtollig water toe te voegen.
LET OP: Coverslips moeten snel wegdrijven. - Incubeer de coverslips in een oplossing van extracellulaire matrixeiwitten (50 μg/mL fibronectin, 5 μg/mL fluorescerende fibrinogen verdund in water) op paraffinefilm in een vochtige kamer (zoals in stap 1.2.3) gedurende 1 uur onder een laminaire stroomkap om besmetting te voorkomen.
LET OP: Het experiment kan op dit punt worden onderbroken door de coverslips in PBS op 4 °C op te slaan.
- Celzaaien op micropatronen
- Gebruik een magnetische coverslip houder die past bij de grootte van de micropatterned coverslips om de coverslips te monteren. Verwarm op de dag van de verwerving de afdekkenhouder tot 37 °C om thermische schokken voor de cellen tijdens volgende stappen te voorkomen.
- Bereid het patroonmedium voor door DMEM/F12 medium aan te vullen met 20 mM HEPES en 2% penicilline/streptomycine.
- Plaats coverslips in de houder met de micropatterned side up en voeg patroonmedium toe zodra de coverslip zich op de houderbasis bevindt. Voeg de afdichting toe en immobiliseer met het magnetische apparaat. Vul de coversliphouder met het patroonmedium en sluit deze met het glazen deksel.
LET OP: Wees er snel bij, laat de afdekplaten niet drogen. Was de coversliphouder niet met ethanol tussen de experimenten door, omdat de afdichting mogelijk wat ethanol vasthoudt, wat kan reageren met PLL-g-PEG en kan leiden tot celstress. Was de coverslip houder alleen met zeepwater. Bovendien kan het gewricht worden geïncubeerd in het patroonmedium bij 37 °C gedurende 1 uur om het restproduct te verdunnen. - Verzamel transfected hTERT-RPE1 cellen door trypsinisatie (0,5 mL voor een 12 putplaat) en voeg 1 mL van 10% FBS DMEM/F12 medium toe.
- Voeg 0,5 x 106 transfected hTERT-RPE1 cellen toe aan de coversliphouder en sluit deze opnieuw af. Incubeer gedurende 10 minuten in de couveuse.
- Was de coverslip houder 5x met patroon medium om nonattached cellen en resterende FBS te verwijderen door het toevoegen van het patroon medium met een pipet en aspirating het medium met een andere pipet om een wasstroom te creëren. Houd altijd een klein volume patroonmedium in de coversliphouder om te voorkomen dat de cellen op de micropatroondekslip worden gedroogd, wat zal leiden tot celdood.
- Incubeer in de couveuse voor 3 uur om volledige cel verspreiding mogelijk te maken.
2. Verwerving van exocytosegegevens
- Beeldvorming van exocytosegebeurtenissen
- Plaats coversliphouder onder een TIRM. Het signaal moet worden gedetecteerd door een gevoelige camera ingesteld met de beste imaging formaat beschikbaar.
OPMERKING: In dit experiment werden een 100x lensdoelstelling en een EMCCD-camera met 512 x 512 pixeldetectiegebied gebruikt, wat leidde tot een pixelgrootte van 160 nm. - Zoek naar een cel die VAMP7-pHluorine uitdrukt die volledig is verspreid(figuur 1A).
OPMERKING: Cellen die VAMP7 uitdrukken zijn duidelijk herkenbaar, omdat ze een groen signaal vertonen. - Verander de hoek van de laser tot een TIRF-hoek die de visualisatie van VAMP7-pHluorine exocytose-gebeurtenissen mogelijk maakt. Voer een acquisitie van 5 minuten uit op een frequentie die compatibel is met de exocytosesnelheid en -tijdschaal (meestal 3 Hz, figuur 1D)met behulp van de microscoopsoftware.
LET OP: hTERT-RPE1 cellen hebben een lysosomale secretoire snelheid van ongeveer 0,3 Hz op micropatronen. Lysosomale exocytose heeft een typische duur van 1 s. Het wordt gekenmerkt door een piekintensiteit gevolgd door een exponentieel verval. De verspreiding van de sonde moet op dit moment duidelijk zijn(figuur 1B, C). - Voor elke cel, ook het uitvoeren van een overname van het micropatroon met behulp van de microscoop software (Figuur 1A).
- Plaats coversliphouder onder een TIRM. Het signaal moet worden gedetecteerd door een gevoelige camera ingesteld met de beste imaging formaat beschikbaar.
- Verwerving van exocytosecoördinaten
- Open de verkregen film met ImageJ/FIJI. Bestand gebruiken | Invoer | Afbeeldingsvolgorde. Vind exocytose gebeurtenissen door het oog. Een exocytose gebeurtenis wordt gekenmerkt door het verschijnen van een helder signaal dat zich naar buiten verspreidt(figuur 1).
- Gebruik het puntgereedschap om het midden van de exocytische gebeurtenis te markeren. Analyse gebruiken | Meet om X- en Y-coördinaten te meten, evenals de temporele coördinaat (segmentnummer). Voer deze metingen uit voor alle exocytose-gebeurtenissen van de film.
- De resultaten opslaan (Resultaten | Dossier | Opslaan als). Maak een tekstbestand voor elke geanalyseerde cel met de naam "Resultaten(cell_name).txt" dat de coördinaten slice, X-coördinaten en Y-coördinaten bevat voor alle exocytosegebeurtenissen in die volgorde.
Het tekstbestand zou er als volgt moeten uitzien:
ID X Y Feret's diameter Radius
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
LET OP: Zorg ervoor dat alle komma's worden vervangen door punten. - Meet het midden en de diameter van elke cel met behulp van het "Oval Tool". Plaats een perfecte cirkel (gebruik geen ovaal) en gebruik "Measure" om de X- en Y-coördinaten en Feret's diameter te verkrijgen. Sla de identiteit (ID), X- en Y-coördinaten van elke cel, de diameter van Feret en de straal (diameter/2) op in een tekstbestand met de naam "Sferische parameter.txt".
Het tekstbestand zou er als volgt moeten uitzien:
ID X Y Feret's diameter Radius
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
LET OP: Zorg ervoor dat alle komma's worden vervangen door punten. - Meet de dikte van de micropatternring (hechtingslengte) met het rechte gereedschap en sla de cel-ID, celradius (uit het bestand: "Sferische parameter.txt") en hechtingslengte op in een tekstbestand met de naam "Pattern parameter.txt". Bereken de genormaliseerde hechtingslengte door de hechtingslengte te delen door een celstraal.
LET OP: Zorg ervoor dat alle komma's door punten worden vervangen.
Het bestand moet er als volgt uitzien:
Id-celstraalhechtlengte Genormaliseerde hechtingslengte
RPE1_WT_Cell1 115 34 0,295652174
RPE1_WT_Cell2 115 35 0,304347826
3. Ruimtelijke analyse met één cel
- R-pakket en installatie
OPMERKING: Het R-pakket voor deze analyse maakt gebruik van het Spatstat-pakket13 om de tweedimensionale (2D)-dichtheid en de K-functie van Ripley te berekenen. De code is open-source en maakt gebruik van tekstbestanden die eerder zijn beschreven.- Download en installeer R van https://www.r-project.org/ (versie 3.5.2 werd gebruikt in deze analyse).
- Download het pakket (en de demo dataset) van: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
- Installeer het pakket op R Studio met "Tools" met "Installatiepakketten". Selecteer 'Pakketarchiefbestand (.zip; .tar.gz)voor de categorie "Installeren vanaf:" en kies het pakketbestand. Druk opInstalleren.
- Laad het pakket met de functie "library("ExocytoseSpatialAnalysis")" door deze opdracht in de R-studio te schrijven en opEnterte drukken.
- Voer het pakket uit met de functie "ESA()door deze opdracht in R studio te schrijven en opEnter tedrukken.
OPMERKING: Er wordt een gebruikersinterface geopend. - Selecteer de map voor de gegevensset (.txt-bestanden) en een map voor uitvoerplots.
OPMERKING: Parameters van de analyse (zie tekst hieronder) kunnen worden gewijzigd via een gebruikersinterface. - Dit script start en voert de analyse automatisch uit. Het biedt .pdf-bestanden van overeenkomstige plots en .txt-bestanden met numerieke resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De spatiotemporale kenmerken van exocytose-voorvallen werden geanalyseerd op lysosomen gevisualiseerd door VAMP7-pHluorine10,11 in hTert-RPE1 cellen. hTert-RPE1-cellen zijn niet-getransformeerde cellen die goed tot micropatronen worden gebruikt en die op grote schaal zijn gebruikt in eerdere micropatronen4,14. VAMP7 is een lysosomale v-SNARE15 die werd gelabeld met de super ecliptische pHluorine op zijn N-eindpunt en zich in het lumen van het lysosoom bevindt. In de cel werd de pHluorine-sonde gedoofd door de lage pH van het lysosoom, maar tijdens exocytose begon pHluorine een signaal uit te zenden omdat de pH toenam door protonafgifte. VAMP7-pHluorin werd gecontroleerd door TIRFM live celbeeldvorming op ringvormige micropatronen (Figuur 1A–B). Het pHluorine-signaal vertoonde een piek tijdens exocytose die de snelle afgifte van lysosomale protonen vertegenwoordigde, gevolgd door exponentieel verval, wat de 2D-diffusie van de sonde bij het plasmamembraan(figuur 1C)weergeeft. hTERT-RPE1-cellen presenteerden een belangrijke lysosomale afscheidingsactiviteit met een gemiddelde exocytosesnelheid van 0,28 Hz (figuur 1D). Echter, hoge heterogeniteit werd waargenomen in de exocytose snelheid tussen cellen (standaarddeviatie van 0,15 Hz), wat aangeeft dat er sterke cel-cel-cel variabiliteit in afscheiding van de lysosomen.
Eencellige ruimtelijke analyse om te onderzoeken of exocytose van lysosomen willekeurig is
Het was mogelijk om de 2D-verdeling van exocytose door KDE te visualiseren, zoals eerder uitgevoerd voor endomembranous compartimenten14, die verschillen in lokale dichtheden zou kunnen onthullen (figuur 2B). Deze benadering is relevant voor visualisatie van de gemiddelde verdeling van een populatie cellen, maar minder informatief in enkele cellen vanwege het beperkte aantal gedetecteerde gebeurtenissen (tientallen ten opzichte van de enkele duizenden verkregen door populatiegebaseerde analyse) en hoge cel-tot-cel variabiliteit. Deze benadering stelde ons bijvoorbeeld niet in staat om te beoordelen of de verdeling van exocytosegebeurtenissen volgde op een volledig ruimtelijk willekeur (Csr)-gedrag (d.w.z. overeenkomen met een uniforme puntverdeling in een waargenomen gebied voor een enkele cel). Een puntenpatroon volgt een MVO-gedrag wanneer de twee volgende hypothesen waar zijn: 1) de locatie van elk punt is onafhankelijk van die van de andere punten; en 2) de waarschijnlijkheid om een punt in een subregio te vinden is alleen afhankelijk van de verhouding tussen het gebied van deze subregio en het totale gebied. Er zijn drie mogelijke afwijkingen van MVO: 1) clustering (d.w.z. aggregatie); 2) spreiding (d.w.z. bestellen met constante afstand); of 3) een mengsel van clustering en dispersie (figuur 2C). Ripley's K-functie werd gebruikt om deze vraag te beantwoorden zoals in eerdere analyses7,8,9 ( Figuur2D). Ripley's K-functie is dicht bij πr² (met d is de genormaliseerde afstand van een gebeurtenis) in het geval van MVO, maar superieur (inferieur van de luchtwegen) tot πr² in het geval van clustering (respiratoire dispersie). Door πr² af te trekken van de K-functie van Ripley, moet de theoretische MVO-curve op 0 staan. Simulaties van MVO-gevallen werden uitgevoerd met hetzelfde aantal punten als de waargenomen exocytose-gebeurtenissen om de goedheid van de csr-case (grijze envelop rond de theoretische curve) te beoordelen. De getransformeerde Ripley's K-functie toegepast op de experimentele gegevens vertoonde positieve waarden buiten de envelop, met vermelding van clustering (Figuur 2D).
Om te onderzoeken of clustering van exocytose gebeurtenissen was te wijten aan celhechting zoals eerder gemeld6, voerden we een soortgelijke analyse op gegevens uit uitsluitend de niet-adhesive cel gebied in het centrum(Figuur 2A, lijm gebied in grijs, niet-hesieve cel centrum gebied in het wit). Van nota, vonden wij dat exocytosegebeurtenissen in het nietadhesieve gebied ook werden geclusterd (Figuur 2E),wat aangeeft dat adhesiemoleculen niet de enige structuren waren die secretoire hot spots op plasmamembranen veroorzaakten.
Omdat ripley's K-functie een beschrijvende statistiek is die geen P-waarde biedt, is een statistische test opgezet waarbij cellulaire exocytosegebeurtenissen worden vergeleken met MVO-simulaties. De dichtstbijzijnde buurman afstand NND(i) methode werd gebruikt. NDD wordt gedefinieerd als de minimale Euclides afstand tussen een punt i en alle andere punten. De gemiddelde NND(i) van alle exocytische gebeurtenissen van één cel werd berekend en vergeleken met MVO verkregen met een groot aantal Monte Carlo simulaties (figuur 2F). We ontdekten dat de gemiddelde NND van de in figuur 2F geanalyseerde eencellige cel lager was dan het gemiddelde van de gesimuleerde verdeling van de MVO-behuizing, wat duidt op gemiddeld dichtere buren en dus clustering. In het geval van dispersie werd een hogere waarde voor het gemiddelde NND verwacht (figuur 2C). Deze vergelijking stond de berekening van een P-waarde voor elke cel toe. De P-waarde vertegenwoordigt het percentage simulaties dat een extremere NND vertoonde (op een tweezijdige manier). Om precies te zijn, de onbevooroordeelde P-waarde werd berekend als (k+1)/(N+1) waarbij N het totale aantal Monte-Carlo-simulaties (10.000) was en k het aantal van deze simulaties dat extremer was dan de waargenomen measurent16. Het histogram van alle P-waarden werd uitgezet voor het totale celgebied(figuur 2G)en het niet-samenhangende celgebied(figuur 2I). Als H0: "Exocytose is een MVO-proces" waar was, werd een uniforme verdeling van de P-waarden verwacht. Als H0 vals was, werd een piek bij een lage P-waarde verwacht. Het uitvoeren van een Kolmogorov-Smirnov test op de P-waarde histogrammen, een P-waarde inferieur aan 0,001 werd verkregen, waaruit blijkt een aanzienlijke afwijking van MVO in beide gevallen (cijfers 2G en 2I). Bovendien gaf een clusteringcoëfficiënt van 0,955 voor het totale celgebied en 1.000 voor het niet-adhesieve celgebied aan dat lysosomale exocytose een geclusterd proces was dat onafhankelijk is van celhechting. De clusteringcoëfficiënt vertegenwoordigt het percentage cellen dat dichter bij een clustergedrag dan dispersie stond. Dit resultaat kwam overeen met ripley's K-functie.
Om de rol van celverkleving in clustering te evalueren, vergeleken we het gemiddelde NND in het niet-adhesieve gebied met dat in het totale gebied voor elke afzonderlijke cel(figuur 2H). Omdat de gemiddelde NND omgekeerd evenredig was met de oppervlaktedichtheid, normaliseerden we het gemiddelde NND van het niet-hechte gebied met behulp van homothety. De aanzienlijk grotere gemiddelde NND van exocytose voorvallen in het niet-belangrijke gebied wees op minder clustering(figuur 2H). Dus, hoewel afscheiding van lysosomen clusters in niet-adhesive gebieden, celhechting leek te versterken clustering.
Ruimtelijke analyse van exocytosegebeurtenissen met behulp van polaire coördinaten
De cirkelvormige geometrie van het ringvormige micropatroon maakte het gebruik van de gemeenschappelijke polaire coördinaten mogelijk, waardoor de analyses werden vereenvoudigd, zoals eerder17werden gevonden. Elke exocytosegebeurtenis zou zo door een modulus (afstand van de oorsprong, hier het centrum van het lagere vlak van de cel) en een hoek (volgens een vaste willekeurige as) kunnen worden beschreven. Bovendien kan de modulus worden genormaliseerd door deze te delen door de straal van de cel. Het histogram van exocytose gebeurtenissen werd uitgezet volgens de modulus voor een representatieve cel (Figuur 3A). Dit toonde een piek rond de grens tussen de lijm/niet-aangrenzende gebieden. Een grote variabiliteit tussen cellen werd ook waargenomen. Daarom hebben we n = 22 cellen samengevoegd om een gemiddelde verdeling van exocytosegebeurtenissen te verkrijgen. Om echter hetzelfde statistische gewicht aan elke cel te geven, werd willekeurig hetzelfde aantal gebeurtenissen uit elke cel geselecteerd. Deze willekeurige selectie veranderde niets aan de algemene patronen. Om een continue gemiddelde verdeling van de individuele verdelingen van enkele cellen te verkrijgen, werd een KDE gebruikt (figuur 3B). Echter, omdat de genormaliseerde modulus is tussen 0 en 1, rand voorwaarden moest in aanmerking worden genomen. Een bètakernel die van vorm verandert naast randen werdgebruikt 18. Een foutband werd berekend met een bootstrap strategie. De waargenomen gemiddelde verdeling werd vergeleken met een hypothetische MVO-verdeling die meer gebeurtenissen vertoonde bij een hogere modulus, omdat het gebied steeg met een hogere modulus. Omdat de integraal van een waarschijnlijkheidsdichtheid één zou moeten zijn, was de MVO-verdeling 2r (met zijn de genormaliseerde straal, zonder eenheden). Een vertrouwensband werd berekend rond de theoretische curve met behulp van een groot aantal Csr Monte Carlo simulaties (5.000 per stuk). De1e en 99e percentielen van de modulus verdeling van deze simulaties werden uitgezet.th We ontdekten dat de gemiddelde verdeling van exocytose voorvallen afweek van de hypothetische met 0,7rmax, wat overeenkomt met het begin van het kleefgebied van de cel.
We probeerden te testen of de waargenomen verdeling van de modulus anders was dan de theoretische. Omdat de gemiddelde verdelingen, zoals in dit geval, niet nauwkeurig kunnen worden getest door een goodness-of-fit-test (bijvoorbeeld Kolmogorov-Smirnov) werd een alternatieve methode gebruikt die Pecot et al. voorstelde. Deze methode meet het verschil tussen de variatie tussen een populatie en de variatie binnen een populatie, en maakt het dus mogelijk onafhankelijke testen voor elke coördinaat (d.w.z. modulus en hoek)17. Deze test werd gebruikt om onze gegevens te vergelijken met gesimuleerde gegevens die csr exocytose-gebeurtenissen vertegenwoordigen (hetzelfde aantal cellen en exocytosegebeurtenissen als de waargenomen gegevens), en vond een statistisch significant verschil in de variaties (p < 0,001 met de Wilcoxon-Mann-Whitney-test, n = 22 cellen), wat aangeeft dat de waargenomen gemiddelde exocytoseverdeling geen CSR was. Echter, toen twee MVO simulaties (met 5.000 simulaties elk) werden vergeleken, vonden we dat de P-waarde histogram niet een uniforme verdeling, maar tentoongesteld een piek in de buurt van 1, wat aangeeft dat deze test waarschijnlijk ontbrak gevoeligheid.
Omdat de KDE-schatting is gebaseerd op een niet-triviale keuze van kernelbandbreedte en gevoelig is voor randeffecten, werd ook de cumulatieve distributiefunctie berekend, die de problemen die inherent zijn aan de schatting van KDE(figuur 3D) overwint. Deze functie is gedefinieerd tussen 0 en 1 en bevat geen willekeurige parameters of vooroordelen (bijvoorbeeld randvooroordelen). Fout- en betrouwbaarheidsbanden werden berekend op dezelfde manier als voor de modulus-distributie. De cumulatieve distributiefunctie bevestigde dat exocytose-gebeurtenissen geen MVO-verdeling volgden, maar overgeconcentreerd waren op moduli rond 0,7rmax. Deze analyse stelde ons dus in staat om cellulaire gebieden te identificeren waar clustering plaatsvond. Een interessante vraag die dit resultaat oproept is of de overconcentratie bij 0,7 rmax was vanwege de aanwezigheid van lijm / niet-attensieve gebieden van de ring-vormige micropatroon of een effect van perifere / centrale secretie gebieden van cellen.
Omdat de gemiddelde verdeling van exocytosegebeurtenissen afweek van het MVO-geval in niet-belangrijke en kleefgebieden, vroegen we ons ook af waar de exocytosedichtheid het hoogst was. De oppervlaktedichtheden van exocytose in hechtings- en niet-hechtingsgebieden werden berekend en vergeleken. We ontdekten dat de oppervlaktedichtheid lager was in het hechtingsgebied dan in het niet-hechtingsgebied door een gepaarde analyse(figuur 3C). Dit kan worden verklaard door de sterke afname van exocytose aan de celperiferie (0,85 – 1rmax, figuur 3B).
Figuur 1. Exocytose van lysosomen in hTert-RPE1 cellen: (A) Ringvormige micropatroon (rood) en lijm hTert-RPE1 cel doorgegeven met VAMP7-pHluorine (groen) afgebeeld door TIRFM. De pijl toont een exocytose gebeurtenis. Schaalbalken = 10 μm. (B) Kymograaf van exocytose-voorvallen. Pijlen vertonen exocytose gebeurtenissen. Schaalbalk = 2 μm, schaalbalk in de tijd = 5 s. (C)Genormaliseerd intensiteitsprofiel van lysosomale exocytose uit 22 cellen. Elk punt is een gemiddelde van ten minste 1.530 exocytose gebeurtenissen. Gegevens worden gepresenteerd ± SEM. (D) Exocytose snelheid van de 22 cellen. De gemiddelde +/- standaarddeviatie wordt in het rood uitgezet. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Ruimtelijke analyse van lysosomale exocytosegebeurtenissen. (A) Scatter plot van exocytose gebeurtenissen tijdens 5 min acquisitie. Elke stip vertegenwoordigt een exocytose gebeurtenis. Het kleefgebied wordt grijs weergegeven. (B) 2D kernel density schatting (KDE) van scatter plot van A. De kleur vertegenwoordigt de lokale dichtheid van exocytose gebeurtenissen. cC) Schematische weergave van mogelijke puntpatronen. De vier gevallen, Complete Spatial Randomness (Csr), Clustering, Dispersie en Mixed worden weergegeven, en verschillende dichtstbijzijnde buurafstanden (NND) worden uitgezet (stippellijnen) om te laten zien hoe de gemiddelde NND is afgenomen in clustering en met spreiding is toegenomen. (D) Analyse van een representatieve cel met behulp van Ripley's K-functie. De rode stippellijn is gelijk aan "Ripley's K-functie - πr²" voor MVO-gebeurtenissen, de grijze envelop vertegenwoordigt de geschatte goedheid-van-fit van Monte Carlo simulaties met hetzelfde aantal punten als exocytose gebeurtenissen (Ngebeurtenis = 81). De zwarte vaste lijn is gelijk aan "Ripley's K-functie – πr²" voor waargenomen exocytose-gebeurtenissen(N-gebeurtenis = 81). De positieve afwijking van de rode curve van de grijze envelop duidt op clustering van exocytosegebeurtenissen. Ripley's K-functie werd genormaliseerd om een maximale waarde van 1 te hebben. (E) Analyse van het niet-ahesieve gebied van dezelfde cel met behulp van Ripley's K-functie als in D. De positieve afwijking van de rode curve buiten de grijze envelop duidt op een clustering van exocytosegebeurtenissen in het niet-naburige gebied. (F) Vergelijking van de gemiddelde NND-verdeling van één representatieve cel (rode lijn) met de KDE van de MVO verkregen uit Monte Carlo-simulaties (blauwe curve). De P-waarde werd berekend als het percentage gesimuleerde waarden dat extremer was dan de waargenomen waarde. (G) P-waarde histogram verkregen uit de NND-test zoals in F voor n = 26 cellen. De piek bij lage P-waarden betekent dat de nulhypothese "exocytose volgt MVO" werd afgewezen met een Kolmogorov-Smirnov-test, wat aangeeft dat lysosomale exocytose geen MVO was. (H) Box-plot van de gemiddelde NND van exocytose gebeurtenissen in niet-belangrijke gebieden (wit) en totale celgebieden (grijs). De twee gegevenspunten uit dezelfde cel worden vergezeld door een regel. De gemiddelde NND was groter in het niet-belangrijke gebied, p < 0,001 met een gepaarde Wilcoxon-test (n = 25 cellen), wat aangeeft aanzienlijk minder clustering in het niet-naburige gebied. (I) Hetzelfde als G voor het niet-hechte gebied voor n = 26 cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Ruimtelijke analyse van gepoolde lysosomale exocytosegebeurtenissen: (A) Histogram van de exocytose-voorvallen van één representatieve cel tijdens een 5 min-acquisitie met n = 161 exocytose-voorvallen als functie van de genormaliseerde modulus; 0 vertegenwoordigt het celcentrum en 1 de celperiferie. Het kleefgebied van de cel wordt grijs weergegeven en komt overeen met moduli van 0,65–1 voor de getoonde cellen. Er is een piek aan het begin van het lijmgebied rond moduli tussen 0,6 en 0,7. (B) KDE van de exocytosegebeurtenissen als functie van de genormaliseerde modulus voor n = 22 cellen met 56 voorvallen in elke cel; 0 vertegenwoordigt het celcentrum en 1 de celperiferie. Het gemiddelde lijmgebied wordt grijs weergegeven en komt gemiddeld overeen met moduli van 0,61–1. De gestippelde blauwe curve is de theoretische curve die wordt verwacht in het geval van MVO. Deze theoretische curve gaat gepaard met een envelop die de 1e-99e percentielen van MVO vertegenwoordigt die zijn verkregen met behulp van de Monte Carlo-simulatie. De KDE-curve van de waargenomen gegevens is in het rood en wordt begeleid door een foutband gegenereerd door bootstrapping. Het kleefgebied bevindt zich in grijs +/- SEM. (C) Gekoppelde analyse van de oppervlaktedichtheden in hechtings- en niet-hechtingsgebieden. De exocytose oppervlaktedichtheid werd berekend als het aantal gebeurtenissen per genormaliseerd gebied en per seconde. Hier, *p < 0,05 van een gekoppelde student t-test (n = 22 cellen). Normaliteit werd eerder getest door een Shapiro-Wilk test. (D)Cumulatieve verdelingsfunctie van de gegevens in B (rode lijn) en van Monte Carlo Csr-simulaties (stippelblauwe lijn). Enveloppen werden gegenereerd zoals in B. Merk op dat de rode lijn afwijkt van de theoretische MVO op ongeveer 0,7rmax. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We monitorden exocytosegebeurtenissen uit het lysosomale compartiment door TIRFM live celbeeldvorming van VAMP7-pHluorine in ringvormige micropattern-genormaliseerde cellen en voerden een rigoureuze statistische analyse uit van de ruimtelijke parameters van exocytosegebeurtenissen. In dienst van de getransformeerde Ripley's K-functie en een statistische test op basis van de dichtstbijzijnde afstand van de buren, bevestigden we dat afscheiding van lysosomen geen willekeurig proces is8,,9. Beide statistische analyses toonden overtuigend aan dat exocytose-gebeurtenissen clustering vertonen (cijfers 2D en 2G). Door soortgelijke instrumenten toe te passen op het niet-belangrijke celgebied, ontdekten we dat exocytosegebeurtenissen ook zijn geclusterd in niet-belangrijke gebieden(figuren 2E en 2I). Dus, hechting moleculen die eerder zijn gemeld om clustering6 mogelijk te maken zijn niet de enige structuren die secretoire hot spots kan induceren op het plasmamembraan. Echter, celhechting verbeterde clustering: de gemiddelde dichtstbijzijnde buur afstand tussen exocytose gebeurtenissen was aanzienlijk groter in niet-aangrenzende gebieden (Figuur 2H). Consequent identificeerde onze analyse op basis van de schatting van de kerneldichtheid en de cumulatieve distributiefunctie verrijkte gebieden van exocytose die zich op de grens tussen de lijm en niet-aangrenzende gebieden in ringvormige micropatronen bevonden. Er is meer werk nodig om de moleculaire mechanismen te bepalen die ten grondslag liggen aan clustering, zoals hechting of een specifieke targeting van lysosoom voor deze regio. Interessant is dat we een hoge heterogeniteit waargenomen in de exocytosesnelheid in hTERT-RPE1-cellen (standaarddeviatie van 0,15 Hz voor een gemiddelde exocytosesnelheid van 0,28 Hz, figuur 1D), wat aangeeft dat afscheiding van lysosomen een hoge intercellulaire variatie heeft. Daarom moeten subpopulatieanalyses in de toekomst worden overwogen. Het zou vooral interessant zijn om te onderzoeken of deze variatie de diversiteit van lysosomale compartimenten, verschillen in ladingen of afhankelijkheid van exocytosemachines weerspiegelt.
Deze resultaten illustreren hoe statistische instrumenten kunnen worden gebruikt om ruimtelijke parameters van diverse biologische processen te onderzoeken. Bovendien vergemakkelijken micropatronen de studie van het effect van celhechting op een onbevooroordeelde manier met behulp van verschillende micropatronen (bijvoorbeeld ringvormige versus diskshaped). Met name het gebruik van ronde vormen vergemakkelijkt analyses omdat polaire coördinaten kunnen worden gebruikt. Omdat statistische tools vereisen dat een bepaalde hoeveelheid gegevens zinvol is, werden cellen met meer dan 30 gebeurtenissen gebruikt voor onze analyse. Er is echter een mogelijkheid dat cellen met 30 of minder gebeurtenissen zinvol zijn. Zo kunnen bemonsteringscellen met 30 of minder gebeurtenissen worden uitgevoerd om voldoende gebeurtenissen te verkrijgen voor analyse om te bepalen of dit het geval is. Ook is het moeilijk in te schatten hoeveel cellen moeten worden geanalyseerd, vooral als er een sterke intercellulaire variatie is. Een manier om dit te omzeilen is om willekeurig te selecteren hetzelfde aantal gebeurtenissen uit elke cel om hetzelfde statistische gewicht te geven aan elke cel bij het bundelen van hen. We raden echter aan om analyses op minder dan 15 cellen uit voorzorg te laten uitvoeren. Aangezien de gemiddelde verdelingen van gepoolde cellen niet nauwkeurig kunnen worden getest door goodness-of-fit tests (bijvoorbeeld Kolmogorov-Smirnov) hebben we een door Pecot et al. voorgestelde teststatistiek gebruikt die het verschil in variaties van populatiesmeet 17. Hoewel deze test ons in staat stelde om een statistisch significant verschil te vinden in de variaties in de gemiddelde verdelingen, vermoeden we dat deze test een lage gevoeligheid heeft omdat het P-waarde histogram niet vlak was (d.w.z. uniforme verdeling vertoonde) bij het vergelijken van verschillende MVO-simulaties voor p-waarden dicht bij 1. Daarom kan het nodig zijn deze statistische procedure te verbeteren.
Een nadeel van onze analyses is de handmatige detectie van exocytose-gebeurtenissen, die de snelheid van de analyse drastisch verminderen. Beperkingen in automatische detectie zijn vaak te wijten aan sterke heterogeniteit in de unieke en eenvoudige parameter die wordt geanalyseerd (bijvoorbeeld intensiteit van exocytose-gebeurtenissen). Neurale netwerken kunnen potentieel krachtig zijn voor automatische detectie, omdat ze kunnen worden getraind om veel functies te herkennen.
De hier gepresenteerde analyse kan worden toegepast op andere dynamische processen die door TIRFM worden waargenomen, zoals afscheiding uit andere compartimenten en de verdeling van het membraanmicrodomein of antigeenpresentatie. Soortgelijke analyses kunnen ook worden toegepast op vaste cellen om de ruimtelijke verdeling van eiwitten te bestuderen. We hopen dat ons werk de toenemende belangstelling voor ruimtelijke distributieanalyse in de celbiologie zal vergroten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We erkennen Thierry Galli (Center of Psychiatry and Neurosciences, INSERM) voor het leveren van de VAMP7-pHluorine plasmide. Wij danken Tarn Duong voor advies over statistische analyse en leden van het GOUD laboratorium voor vruchtbare discussies. De auteurs erkennen sterk de Cell and Tissue Imaging Facility (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg en PICT-IBiSA @Pasteur) en Nikon Imaging Center, Institut Curie (Parijs), lid van de Franse National Research Infrastructure France-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. werd ondersteund door de Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) en P.M. ontving financiering uit het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie in het kader van marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. Dit werk werd ondersteund door subsidies van INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), de Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) en Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), evenals het Centre National de la Recherche Scientifique en Institut Curie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
References
- Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
- Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
- Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
- Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914 (2013).
- Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
- Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , CRC Press. Indianapolis, IN. (2015).
- Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
- Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
- North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
- Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311 (2018).
- Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).
