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Biology

Quantifizierung der raumzeitlichen Parameter der zellulären Exozytose in mikrogemusterten Zellen

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/60801
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 1,2,3
1Unité Mixte de Recherche 144 CNRS, Molecular Mechanisms of Intracellular Transport group, Institut Curie, 75005 Paris, France, 2PSL Research University, Paris, France, 3Sorbonne Université, Paris, France, 4INRIA, Université Paris-Sud, PSL

Summary

Die Live-Bildgebung der lysosomalen Exozytose auf mikromusterten Zellen ermöglicht eine räumliche Quantifizierung dieses Prozesses. Morphologie-Normalisierung mit Mikromustern ist ein hervorragendes Werkzeug, um allgemeine Regeln über die räumliche Verteilung zellulärer Prozesse aufzudecken.

Abstract

Die Live-Bildgebung des pHluorin-markierten Soluble N-Ethylmaleimid-sensitive-Faktor Attachment-Proteins REceptor (v-SNARE) Vesicle-assoziiertes Membranprotein 7 (VAMP7) durch totale interne Reflexionfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ist eine einfache Möglichkeit, die Sekretion aus dem lysosomalen Fach zu erforschen. Unter Ausnutzung der Zellkultur auf mikrogemusterten Oberflächen, um die Zellform zu normalisieren, wurden eine Vielzahl statistischer Werkzeuge eingesetzt, um eine räumliche Analyse von sekretohierten Mustern durchzuführen. Mit Ripleys K-Funktion und einem statistischen Test basierend auf der nächsten Nachbarentfernung (NND) haben wir bestätigt, dass die Sekretion von Lysosomen kein zufälliger Prozess ist, sondern signifikante Clustering zeigt. Bemerkenswert erweise hat unsere Analyse ergeben, dass Exozytose-Ereignisse auch in Nonadhesionsbereichen gruppiert sind, was darauf hindeutet, dass Haftmoleküle nicht die einzigen Strukturen sind, die sekretole Hot Spots an der Plasmamembran induzieren können. Dennoch haben wir festgestellt, dass die Zellhaftung das Clustering verbessert. Neben genau definierten Klebe- und Nicht-Klebstoffbereichen ermöglicht die kreisförmige Geometrie dieser Mikromuster die Verwendung von Polarkoordinaten und vereinfacht analysen. Wir verwendeten Kernel Density Estimation (KDE) und die kumulative Verteilungsfunktion auf Polarkoordinaten von Exozytoseereignissen, um angereicherte Bereiche der Exozytose zu identifizieren. In ringförmigen Mikromusterzellen kam es an der Grenze zwischen den Klebstoff- und nicht-klebstoffen Bereichen zu Clustering. Unsere Analyse zeigt, wie statistische Werkzeuge eingesetzt werden können, um räumliche Verteilungen verschiedener biologischer Prozesse zu untersuchen.

Introduction

Exozytose ist ein universeller zellulärer Prozess, bei dem ein Vesikel mit der Plasmamembran verschmilzt und seinen Inhalt freisetzt. Das Vesikel kann entweder vollständig mit der Plasmamembran (Vollfusion) verschmelzen oder eine Fusionspore erzeugen, die während einer begrenzten Zeit offen bleibt (Kiss-and-Run)1. So werden beispielsweise neu synthetisierte Proteine aus Vesikeln, die aus dem Golgi-Komplex stammen, in das extrazelluläre Medium freigesetzt. Dieser biosynthetische, anterograde Weg ist vor allem bei mehrzelligen Organismen primordial, um Signalpeptide (z. B. Hormone, Neurotransmitter) und extrazelluläre Matrixkomponenten (z. B. Kollagen) sowie den Verkehr von Transmembranproteinen an die Plasmamembran zu sezernieren. Zusätzlich können Sekrete aus verschiedenen Endosomen auftreten: 1) Recycling von Endosomen zur Wiederverwendung von Transmembranproteinen; 2) mehrschichtige Körper (MVBs) zur Freisetzung von Exosomen; und 3) Lysosomen zur Freisetzung von proteolytischen Enzymen. Die endosomale Sekretion hat sich als wichtig für das Neuritenwachstum, die Pseudopodienbildung, die Plasmamembranreparatur und die ATP-abhängige Signalisierung2erwiesen.

Um die Exozytose auf Einzelzellebene zu untersuchen, wurden mehrere Techniken eingesetzt. Patch-Clamp ermöglicht die Detektion einzelner Exozytose-Ereignisse mit einer hohen zeitlichen Auflösung in einer Vielzahl von lebenden Zellen3. Diese Methode liefert jedoch keine Informationen über die Lokalisierung von Exozytose-Ereignissen, noch aus welchem Fach sie auftritt. Die Elektronenmikroskopie ermöglicht die direkte Visualisierung exozytischer Ereignisse mit hoher räumlicher Auflösung und liefert in Kombination mit Der Immunolabeling Informationen über die Spezifität der beteiligten Kompartimente und Moleküle. Ein Nachteil dieses Ansatzes ist der Mangel an Informationen über die Dynamik des Prozesses sowie seine Unfähigkeit, Hochdurchsatzstudien durchzuführen. Lichtmikroskopische Ansätze wie die totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM), die das evaneszierende Feld nutzt, um Fluorophore in der Nähe des Deckslips (100 nm) zu beleuchten, bieten eine gute zeitliche und räumliche Auflösung, um Exozytose-Ereignisse zu untersuchen. Diese Methode ist jedoch nur mit anhaftenden Zellen kompatibel und kann nur auf den ventralen/unteren Zellteil angewendet werden.

Bemerkenswert ist, dass die Plasmamembran eine signifikante Heterogenität auf der Grundlage von Klebstoffkomplexen aufzeigt, die nur in eingeschränkten Bereichen vorhanden sind. Diese Heterogenität schränkt z.B. die Aufnahme verschiedener Ligandenein 4. In ähnlicher Weise wurde kürzlich berichtet, dass die Sekretion aus dem Golgi-Komplex an "Hotspots" in der Plasmamembran5konzentriert ist. Darüber hinaus ist bekannt, dass bestimmte Ladungen durch fokaladad-assoziierte Exozytose6abgesondert werden. Daher sollte besonderes Augenmerk auf die Frage zu richten, ob Exozytoseereignisse zufällig im Weltraum verteilt sind oder ob sie auf bestimmte Bereiche der Plasmamembran konzentriert sind. Mehrere statistische Instrumente, die auf Ripleys K-Funktion basieren, wurden vorgeschlagen, um diese Fragen zu untersuchen7,8,9. Unser Ansatz kombiniert diese Werkzeuge mit Mikromusterung zur Steuerung der Zellform und der Heterogenität der Plasmamembran. Diese Technik bietet nicht nur die Möglichkeit, zwischen Klebstoff- und Nichtklebstoffbereichen zu unterscheiden, sondern ermöglicht auch den Vergleich zwischen verschiedenen Zellen und Bedingungen und erhöht die Leistungsfähigkeit statistischer Analysen.

Hier verwenden wir eine Vielzahl statistischer Werkzeuge, um die räumliche Verteilung von Exozytose-Ereignissen aus dem lysosomalen Fach zu untersuchen, das durch TIRFM-Livezellenbildgebung von VAMP7-pHluorin in ringförmigen mikromusternormalisierten hTert-RPE1-Zellen überwacht wird. Es wurde bestätigt, dass die Sekretion von Lysosomen kein zufälliger Prozessist 8,,9 und dass Exozytose-Ereignisse Clustering aufweisen. Bemerkenswert erweise gilt, dass Exozytose-Ereignisse auch in nicht-klebenden Bereichen gruppiert sind, was darauf hindeutet, dass Haftmoleküle nicht die einzigen Strukturen sind, die sekretore Hot Spots an der Plasmamembran induzieren können. Dennoch hat die Zellhaftung das Clustering verbessert. Konsequenterweise identifizierte unsere Analyse angereicherte Bereiche der Exozytose, die sich an der Grenze zwischen den Klebstoff- und nicht-klebstoffen Bereichen befanden.

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Protocol

1. Herstellung von mikrogemusterten Zellen

  1. Transfektion von Zellen
    1. Einen Tag vor der Transfektion 2,5 x 106 hTERT-RPE1-Zellen in einen Brunnen einer 12-Well-Platte (2 x 2 cm) in 1 ml Medium.
    2. Am Tag der Transfektion die Transfektionsmischung mit VAMP7-pHluorin-Plasmid (100 l Puffer, 0,8 g DNA, 3 l Transfektionsgemisch) vorbereiten. 10 min inkubieren.
      HINWEIS: VAMP7 ist ein lysosomales v-SNARE, das mit einem luminalen pHluorin-Tag verschmolzen ist. Die pHluorin-Sonde wird durch niedrigen pH-Wert abgeschreckt, aber während der Exozytose werden Protonen freigesetzt und pHluorin beginnt, ein Signal10,11auszusenden.
    3. Fügen Sie die Transfektionsmischung zu den Zellen in ihrem Medium hinzu.
    4. Ändern Sie das Medium 4 h nach dem Hinzufügen der Transfektionsmischung auf den Zellen.
    5. Verwenden Sie die Zellen für Experimente während der nächsten 24-48 h.
  2. Mikromustervorbereitung (Photolithographiemethode)
    1. Die Deckellipsen (25 mm Durchmesser) in Ethanol waschen und 5 min trocknen lassen.
    2. Aktivieren Sie Abdeckungen durch Beleuchtung unter tiefem UV für 5 min.
    3. Erstellen Sie eine feuchte Kammer, indem Sie ein Papiertuch, auf dem ein Paraffinfilm platziert ist, gründlich befeuchten. Tropfen (30 l für 22 mm Deckblatt) der Poly-L-Lysin-Transplantat-Polyethylenglycol-Lösung (PLL-g-PEG) (0,1 mg/ml, 10 mM HEPES, pH = 7,4) hinzufügen und Abdeckungen mit der aktivierten Oberfläche darauf legen. Schließen Sie die feuchte Kammer mit einer Oberseite und inkubieren Sie Dielipse für 1 h.
    4. Coverlips 2x in PBS und 1x in destilliertem Wasser waschen und trocknen lassen.
    5. Die Quarz-Fotomaske mit destilliertem Wasser und dann mit Ethanol oder Propanol waschen. Trocknen Sie die Fotomaske mit gefiltertem Luftstrom.
      HINWEIS: Die Quarz-Fotomaske ist einseitig mit antireflektierendem Chrom beschichtet, das Löcher in Form von Mikromustern enthält. In diesem Protokoll wird eine Fotomaske verwendet, die ringförmige Mikromuster von 37 m enthält. Wenn tiefeS UV auf die Fotomaske gestrahlt wird, kann das Licht nur durch diese Löcher12gehen.
    6. Setzen Sie die Fotomaske (verchromte Seite) 5 min lang tief UV-Strahlung aus, um die Oberfläche zu reinigen.
    7. Kleine Wassertropfen (10 l für einen 20 mm Coverslip) auf die verchromte Seite der Fotomaske geben. Den Deckelzettel mit der PLL-g-PEG-behandelten Seite auf den Tropfen legen und das zusätzliche Wasser trocknen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen zwischen der Maske und den Abdeckungen bilden.
      HINWEIS: Die Kapillarkraft des Wassers wird die Abdeckungen immobilisieren.
    8. Setzen Sie die Fotomaske für 5 min mit der nicht verchromten Seite nach oben (die Abdeckungen sind auf der unteren Oberfläche befestigt) tief UV-aussetzen.
      HINWEIS: Das Licht kann nur durch die Löcher gehen und die PLL-g-PEG-behandelte Oberfläche von Abdeckungen unterhalb der Fotomaske modifizieren.
    9. Entfernen Sie die Abdeckungen von der Fotomaske, indem Sie überschüssiges Wasser hinzufügen.
      HINWEIS: Coverslips sollten schnell abschwimmen.
    10. Inkubieren Sie die Abdeckungen in einer Lösung von extrazellulären Matrixproteinen (50 g/ml Fibronectin, 5 g/ml in Wasser verdünntes fluoreszierendes Fibrinogen) auf Paraffinfolie in einer feuchten Kammer (wie in Schritt 1.2.3) für 1 h unter einer laminaren Strömungshaube, um eine Kontamination zu vermeiden.
      HINWEIS: Das Experiment kann an dieser Stelle angehalten werden, indem die Abdeckungen in PBS bei 4 °C gespeichert werden.
  3. Zellsaataufung auf mikrogemusterten Oberflächen
    1. Verwenden Sie einen magnetischen Deckelhalter, der der Größe der mikrogemusterten Abdeckungen entspricht, um die Abdeckungen zu montieren. Am Tag der Erfassung den Deckelschlupfhalter auf 37 °C erhitzen, um thermischen Schock für die Zellen in den nachfolgenden Schritten zu vermeiden.
    2. Bereiten Sie das Mustermedium vor, indem Sie DMEM/F12 medium mit 20 mM HEPES und 2% Penicillin/Streptomycin ergänzen.
    3. Legen Sie Deckellipsen mit der mikrogemusterten Seite nach oben in den Halter und fügen Sie Mustermedium hinzu, sobald sich der Deckelschlupf auf der Halterbasis befindet. Fügen Sie die Dichtung hinzu und immobilisieren Sie mit dem magnetischen Gerät. Füllen Sie den Deckelhalter mit dem Mustermedium und schließen Sie ihn mit dem Glasdeckel.
      HINWEIS: Seien Sie schnell, um den Deckelrutsch nicht trocknen zu lassen. Waschen Sie den Deckelhalter zwischen den Experimenten nicht mit Ethanol, da die Dichtung etwas Ethanol behalten könnte, das mit PLL-g-PEG reagieren und zu Zellstress führen kann. Waschen Sie den Deckelhalter nur mit Seifenwasser. Darüber hinaus kann das Gelenk im Mustermedium bei 37 °C für 1 h inkubiert werden, um das Restprodukt zu verdünnen.
    4. Sammeln Sie transfizierte hTERT-RPE1-Zellen durch Trypsinisierung (0,5 ml für eine 12-Well-Platte) und fügen Sie 1 ml 10% FBS DMEM/F12 medium hinzu.
    5. 0,5 x 106 transfizierte hTERT-RPE1-Zellen in den Deckelschlupfhalter geben und wieder schließen. 10 min im Inkubator inkubieren.
    6. Waschen Sie den Coverslip-Halter 5x mit Mustermedium, um nicht angefügte Zellen und Rest-FBS zu entfernen, indem Sie das Mustermedium mit einer Pipette hinzufügen und das Medium mit einer anderen Pipette ansieren, um einen Waschfluss zu erzeugen. Halten Sie immer ein kleines Volumen des Mustermediums im Deckelhalter, um das Trocknen der Zellen auf dem mikrogemusterten Deckelzuschlag zu vermeiden, was zum Zelltod führt.
    7. Inkubieren Sie im Inkubator für 3 h, um eine vollständige Zellausbreitung zu ermöglichen.

2. Erfassung von Exozytosedaten

  1. Abbildung von Exozytose-Ereignissen
    1. Platzieren Sie den Deckelhalter unter einem TIRM. Das Signal muss von einer empfindlichen Kamera mit dem besten verfügbaren Bildformat erkannt werden.
      HINWEIS: In diesem Experiment wurden ein 100-faches Objektiv objektiv und eine EMCCD-Kamera mit 512 x 512 Pixel-Erkennungsbereich verwendet, was zu einer Pixelgröße von 160 nm führte.
    2. Suchen Sie nach einer Zelle, die VAMP7-pHluorin exprosient, die vollständig verbreitet ist (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Zellen, die VAMP7 exemiten, sind eindeutig identifizierbar, da sie ein grünes Signal aufweisen.
    3. Ändern Sie den Winkel des Lasers, bis ein TIRF-Winkel erreicht ist, der die Visualisierung von VAMP7-pHluorin-Exozytose-Ereignissen ermöglicht. Führen Sie eine Erfassung von 5 min bei einer Frequenz durch, die mit der Exozytoserate und der Zeitskala (typischerweise 3 Hz, Abbildung 1D) mit der Mikroskopsoftware kompatibel ist.
      HINWEIS: hTERT-RPE1-Zellen haben eine lysosomale Sekretoretorerate von etwa 0,3 Hz auf Mikromustern. Die lysosomale Exozytose hat eine typische Dauer von 1 s. Es zeichnet sich durch eine Spitzenintensität, gefolgt von einem exponentiellen Zerfall aus. Die Diffusion der Sonde sollte zu diesem Zeitpunkt offensichtlich sein (Abbildung 1B, C).
    4. Führen Sie für jede Zelle auch eine Erfassung des Mikromusters mit der Mikroskopsoftware durch (Abbildung 1A).
  2. Erfassung von Exozytose-Koordinaten
    1. Öffnen Sie den erworbenen Film mit ImageJ/FIJI. Datei File verwenden | Import | Bildsequenz. Finden Sie Exozytose-Ereignisse mit dem Auge. Ein Exozytose-Ereignis zeichnet sich durch das Auftreten eines hellen Signals aus, das sich nach außen ausbreitet (Abbildung 1).
    2. Verwenden Sie das Punktwerkzeug, um den Mittelpunkt des exozytischen Ereignisses zu markieren. Verwenden von Analyze | Messen, um X- und Y-Koordinaten sowie die zeitliche Koordinate (Slice-Zahl) zu messen. Führen Sie diese Messungen für alle Exozytose-Ereignisse des Films durch.
    3. Speichern der Ergebnisse (Ergebnisse | Datei | Speichern unter). Bereiten Sie eine Textdatei für jede analysierte Zelle mit dem Namen "Results(cell_name.txt" vor, die das Slice, die X-Koordinaten und die Y-Koordinaten für alle Exozytoseereignisse in dieser Reihenfolge enthält.

      Die Textdatei soll wie folgt aussehen:
      ID X Y Ferets Durchmesser Radius
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115

      HINWEIS: Achten Sie darauf, alle Kommas durch Punkte zu ersetzen.
    4. Messen Sie den Mittelpunkt und Den Durchmesser jeder Zelle mit dem "Oval Tool". Passen Sie einen perfekten Kreis an (verwenden Sie kein Oval) und verwenden Sie "Messen", um die X- und Y-Koordinaten und den Feret-Durchmesser zu erhalten. Speichern Sie die Identität (ID), die X- und Y-Koordinaten, die Feret-Koordinaten und den Radius (Durchmesser/2) in einer Textdatei mit dem Namen "Spherical parameter.txt".

      Die Textdatei soll wie folgt aussehen:
      ID X Y Ferets Durchmesser Radius
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115

      HINWEIS: Achten Sie darauf, alle Kommas durch Punkte zu ersetzen.
    5. Messen Sie die Dicke des Mikromusterrings (Haftungslänge) mit dem geraden Werkzeug und speichern Sie die Zellen-ID, den Zellradius (aus der Datei: "Sphärischer parameter.txt") und die Haftungslänge in einer Textdatei mit dem Namen "Pattern parameter.txt". Berechnen Sie die normalisierte Haftlänge, indem Sie die Haftlänge durch den Zellradius dividieren.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, alle Kommas durch Punkte zu ersetzen.

      Die Datei sollte wie folgt aussehen:
      ID Zellradius Haftlänge Normalisierte Haftungslänge
      RPE1_WT_Cell1 115 34 0,295652174
      RPE1_WT_Cell2 115 35 0,304347826

3. Einzelzellige räumliche Analyse

  1. R-Paket und Installation
    HINWEIS: Das R-Paket für diese Analyse nutzt das Spatstat-Paket13, um die zweidimensionale (2D) Dichte und Ripleys K-Funktion zu berechnen. Der Code ist Open-Source und verwendet Zuvor beschriebene Textdateien.
    1. Herunterladen und Installieren von R von https://www.r-project.org/ (Version 3.5.2 wurde in dieser Analyse verwendet).
    2. Laden Sie das Paket (und das Demo-Dataset) herunter von: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
    3. Installieren Sie das Paket auf R Studio mit "Tools" mit "Install Packages". Wählen Sie "Package Archive File (.zip; .tar.gz)" für die Kategorie "Install from :" und wählen Sie die Paketdatei aus. Drücken Sie "Installieren".
    4. Laden Sie das Paket mit der Funktion "library("ExocytosisSpatialAnalysis")", indem Sie diesen Befehl in R studio schreiben und"Enter" drücken.
    5. Führen Sie das Paket mit der Funktion "ESA()" aus, indem Sie diesen Befehl im R-Studio schreiben und "Enter" drücken.
      HINWEIS: Eine Benutzeroberfläche wird geöffnet.
    6. Wählen Sie das Verzeichnis für das Dataset (.txt-Dateien) und ein Verzeichnis für Ausgabediagramme aus.
      HINWEIS: Parameter der Analyse (siehe Text unten) können über eine Benutzeroberfläche geändert werden.
    7. Dieses Skript wird automatisch gestartet und führt die Analyse durch. Es bietet .pdf Dateien von entsprechenden Plots und .txt Dateien mit numerischen Ergebnissen.

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Representative Results

Die räumlich zeitlichen Eigenschaften von Exozytose-Ereignissen wurden anhand von Lysosomen analysiert, die durch VAMP7-pHluorin10,11 in hTert-RPE1-Zellen visualisiert wurden. hTert-RPE1-Zellen sind nicht transformierte Zellen, die sich gut an Mikromustern ereignen und in früheren Mikromuster-basierten Studien4,14ausgiebig verwendet wurden. VAMP7 ist ein lysosomales v-SNARE15, das mit dem superekliptischen pHluorin an seinem N-Terminus markiert wurde und sich im Lumen des Lysosoms befindet. Innerhalb der Zelle wurde die pHluorin-Sonde durch den niedrigen pH-Wert des Lysosoms abgeschreckt, aber während der Exozytose begann pHluorin ein Signal auszusenden, weil der pH-Wert aufgrund der Protonenfreisetzung zunahm. VAMP7-pHluorin wurde von TIRFM Live Cell Imaging auf ringförmigen Mikromustern überwacht (Abbildung 1A–B). Das pHluorin-Signal zeigte während der Exozytose einen Höhepunkt, der die schnelle Freisetzung von lysosomalen Protonen darstellte, gefolgt von exponentiellem Zerfall, der die 2D-Diffusion der Sonde an der Plasmamembran darstellte (Abbildung 1C). hTERT-RPE1-Zellen zeigten eine wichtige lysosomale Sekretionsaktivität mit einer durchschnittlichen Exozytoserate von 0,28 Hz (Abbildung 1D). Allerdings wurde eine hohe Heterogenität in der Exozytoserate zwischen den Zellen beobachtet (Standardabweichung von 0,15 Hz), was darauf hindeutet, dass es eine starke Zell-zu-Zell-Variabilität in der Sekretion von den Lysosomen gab.

Einzelzellige räumliche Analyse zur Untersuchung, ob die Exozytose von Lysosomen zufällig ist
Es war möglich, die 2D-Verteilung der Exozytose durch KDE zu visualisieren, wie zuvor für endomembranöse Fächer14durchgeführt, die Unterschiede in der lokalen Dichte offenbaren konnten (Abbildung 2B). Dieser Ansatz ist für die Visualisierung der durchschnittlichen Verteilung einer Zellpopulation relevant, in einzelnen Zellen jedoch weniger informativ, aufgrund der begrenzten Anzahl der erkannten Ereignisse (Zehner im Vergleich zu mehreren Tausend, die durch populationsbasierte Analyse erzielt wurden) und einer hohen Zell-zu-Zell-Variabilität. Dieser Ansatz erlaubte es uns beispielsweise nicht zu beurteilen, ob die Verteilung von Exozytoseereignissen einem vollständigen räumlichen Zufallsverhalten (CSR) entsprach (d. h. einer einheitlichen Punktverteilung in einer beobachteten Region für eine einzelne Zelle entsprach). Ein Punktemuster folgt einem CSR-Verhalten, wenn die beiden folgenden Hypothesen wahr sind: 1) Die Position jedes Punktes ist unabhängig von der Position der anderen Punkte; und 2) Die Wahrscheinlichkeit, einen Punkt in einer Subregion zu finden, hängt nur vom Verhältnis zwischen der Fläche dieser Teilregion und der Gesamtfläche ab. Es gibt drei mögliche Abweichungen von CSR: 1) Clustering (d. h. Aggregation); 2) Streuung (d. h. Bestellung mit konstantem Abstand); oder 3) eine Mischung aus Clustering und Dispersion (Abbildung 2C). Ripleys K-Funktion wurde verwendet, um diese Frage wie in früheren Analysen zu beantworten7,8,9 ( Abbildung2D). Ripleys K-Funktion ist im Falle von CSR nahe an der Funktion von sr2 (wobei d der normalisierte Abstand zu einem Ereignis ist), bei Clustering (Atemdispersion) jedoch überlegen (atemmäßig minderwertig) als .r2). Durch Subtraktion von der K-Funktion von Ripley sollte die theoretische CSR-Kurve bei 0 liegen. Simulationen von CSR-Fällen wurden mit der gleichen Anzahl von Punkten wie die beobachteten Exozytose-Ereignisse durchgeführt, um die Güte der Anpassung für den CSR-Fall (graue Hülle um die theoretische Kurve) zu bewerten. Die transformierte Ripley-K-Funktion, die auf die experimentellen Daten angewendet wurde, zeigte positive Werte außerhalb der Hüllkurve, was auf Clustering hinweist (Abbildung 2D).

Um zu untersuchen, ob die Clusterbildung von Exozytose-Ereignissen auf die Zellhaftung zurückzuführen ist, wie zuvor berichtet6, haben wir eine ähnliche Analyse an Daten aus ausschließlich dem nicht klebenden Zellbereich in der Mitte durchgeführt(Abbildung 2A, Klebstofffläche in grauer, nicht klebender Zellmittelbereich in Weiß). Bemerkenswert erweise galt, dass Exozytose-Ereignisse im nicht-klebstoffen Bereich ebenfalls gruppiert wurden (Abbildung 2E), was darauf hindeutet, dass Haftmoleküle nicht die einzigen Strukturen waren, die sekretore Hot Spots an Plasmamembranen induzierten.

Da Ripleys K-Funktion eine beschreibende Statistik ist, die keinen P-Wert liefert, wurde ein statistischer Test eingerichtet, der zelluläre Exozytoseereignisse mit CSR-Simulationen vergleicht. Die NND(i)-Methode für die nächste Nachbarentfernung wurde verwendet. NDD ist definiert als der minimale euklidische Abstand zwischen einem Punkt i und allen anderen Punkten. Der durchschnittliche NND(i) aller exozyttischen Ereignisse einer Zelle wurde berechnet und mit CSR verglichen, der mit einer hohen Anzahl von Monte-Carlo-Simulationen erzielt wurde (Abbildung 2F). Wir fanden heraus, dass die durchschnittliche NND der in Abbildung 2F analysierten Einzelzelle unter dem Durchschnitt der simulierten Verteilung des CSR-Falls lag, was auf engere Nachbarn im Durchschnitt und damit Clustering hindeutet. Bei der Streuung wurde ein höherer Wert für den durchschnittlichen NND erwartet (Abbildung 2C). Dieser Vergleich ermöglichte die Berechnung eines P-Werts für jede Zelle. Der P-Wert stellt den Prozentsatz der Simulationen dar, die einen extremeren NND (in einer zweiseitigen Weise) aufweisen. Um genau zu sein, wurde der unvoreingenommene P-Wert als (k+1)/(N+1) berechnet, wobei N die Gesamtzahl der Monte-Carlo-Simulationen (10.000) und k die Anzahl dieser Simulationen war, die extremer war als die beobachtete Messgröße16. Das Histogramm aller P-Werte wurde für die gesamte Zellfläche (Abbildung 2G) und den nicht klebenden Zellbereich (Abbildung 2I) dargestellt. Wenn H0: "Exozytose ist ein CSR-Prozess" wahr war, wurde eine gleichmäßige Verteilung der P-Werte erwartet. Wenn H0 falsch war, wurde ein Spitzenwert bei einem niedrigen P-Wert erwartet. Durch die Durchführung eines Kolmogorov-Smirnov-Tests an den P-Werthistogrammen wurde ein P-Wert unter 0,001 ermittelt, der in beiden Fällen eine signifikante Abweichung von CSR zeigte (Abbildungen 2G und 2I). Darüber hinaus deutete ein Clustering-Koeffizient von 0,955 für die gesamte Zellfläche und 1.000 für den nicht klebenden Zellbereich darauf hin, dass die lysosomale Exozytose ein clusterierter Prozess unabhängig von der Zelladhäsion war. Der Clusterkoeffizient stellt den Prozentsatz der Zellen dar, die näher an einem Clusterverhalten als an der Dispersion waren. Dieses Ergebnis entsprach der K-Funktion von Ripley.

Um die Rolle der Zellhaftung beim Clustering zu bewerten, haben wir die durchschnittliche NND im nicht klebenden Bereich mit der im Gesamtbereich für jede einzelne Zelle verglichen (Abbildung 2H). Da der durchschnittliche NND umgekehrt proportional zur Oberflächendichte war, normalisierten wir den durchschnittlichen NND des nicht-klebenden Bereichs mit Homothety. Die signifikant größeren durchschnittlichen NND von Exozytose-Ereignissen im nicht-klebstoffen Bereich deuteten auf weniger Clustering hin (Abbildung 2H). Obwohl also die Sekretion von Lysosomen-Clustern in nicht-klebstoffen Bereichen, schien die Zellhaftung die Clusterbildung zu verbessern.

Räumliche Analyse von Exozytoseereignissen mit Polarkoordinaten
Die kreisförmige Geometrie des ringförmigen Mikromusters ermöglichte die Verwendung der gemeinsamen Polarkoordinaten, was Analysen vereinfachte, wie zuvor17gefunden wurde. Jedes Exozytoseereignis könnte somit durch einen Modul (Entfernung vom Ursprung, hier die Mitte der unteren Ebene der Zelle) und einen Winkel (entsprechend einer festen beliebigen Achse) beschrieben werden. Darüber hinaus kann der Modul moduliert werden, indem er durch den Radius der Zelle dividiert wird. Das Histogramm der Exozytose-Ereignisse wurde gemäß dem Modul für eine repräsentative Zelle dargestellt (Abbildung 3A). Dies ergab einen Höhepunkt um die Grenze zwischen den Klebstoff-/Nichtklebstoffbereichen. Eine große Variabilität zwischen den Zellen wurde ebenfalls beobachtet. Daher haben wir n = 22 Zellen gepoolt, um eine durchschnittliche Verteilung von Exozytose-Ereignissen zu erhalten. Um jedoch jeder Zelle das gleiche statistische Gewicht zu geben, wurde die gleiche Anzahl von Ereignissen aus jeder Zelle nach dem Zufallsprinzip ausgewählt. Diese zufällige Auswahl änderte nichts an den insgesamt beobachteten Mustern. Um eine kontinuierliche durchschnittliche Verteilung der einzelnen Verteilungen einzelner Zellen zu erhalten, wurde ein KDE verwendet (Abbildung 3B). Da der normalisierte Modul jedoch zwischen 0 und 1 liegt, mussten Randbedingungen berücksichtigt werden. Ein Beta-Kernel, der die Form neben Kanten ändert, wurde18verwendet. Ein Fehlerband wurde mit einer Bootstrap-Strategie berechnet. Die beobachtete durchschnittliche Verteilung wurde mit einer hypothetischen CSR-Verteilung verglichen, die mehr Ereignisse bei einem höheren Modul zeigte, da die Fläche mit einem höheren Modul zunahm. Da das Integral einer Wahrscheinlichkeitsdichte eins sein sollte, war die CSR-Verteilung 2r (mit dem normalisierten Radius, ohne Einheiten). Ein Konfidenzband wurde um die theoretische Kurve mit einer großen Anzahl von CSR Monte-Carlo-Simulationen (jeweils 5.000) berechnet. Die1. und99. Perzentile der Modulverteilung aus diesen Simulationen wurden dargestellt. Wir fanden heraus, dass die durchschnittliche Verteilung der Exozytose-Ereignisse von der hypothetischen bei 0,7rmaxabwich, was dem Beginn der Klebefläche der Zelle entspricht.

Wir versuchten zu testen, ob sich die beobachtete Verteilung des Moduls von der theoretischen unterscheidet. Da durchschnittse Verteilungen, wie in diesem Fall, nicht durch einen Güte-of-Fit-Test (z. B. Kolmogorov-Smirnov) genau getestet werden können, wurde eine alternative Methode angewandt, die von Pecot et al. vorgeschlagen wurde. Diese Methode misst den Unterschied zwischen der Variation zwischen einer Grundgesamtheit und der Variation innerhalb einer Grundgesamtheit und ermöglicht somit unabhängige Tests für jede Koordinate (d. h. Modul und Winkel)17. Dieser Test wurde verwendet, um unsere Daten mit simulierten Daten zu vergleichen, die CSR-Exozytose-Ereignisse darstellen (die gleiche Anzahl von Zellen und Exozytose-Ereignissen wie die beobachteten Daten), und fand einen statistisch signifikanten Unterschied in den Variationen (p < 0.001 mit dem Wilcoxon-Mann-Whitney-Test, n = 22 Zellen), was darauf hindeutet, dass die beobachtete durchschnittliche Exozytose-Verteilung nicht CSR war. Als jedoch zwei CSR-Simulationen (mit jeweils 5.000 Simulationen) verglichen wurden, stellten wir fest, dass das P-Werthistogramm keine gleichmäßige Verteilung zeigte, sondern einen Spitzenwert in der Nähe von 1 zeigte, was darauf hindeutet, dass dieser Test wahrscheinlich nicht empfindlich war.

Da die KDE-Schätzung auf einer nicht trivialen Auswahl der Kernelbandbreite beruht und empfindlich auf Kanteneffekte reagiert, wurde auch die kumulative Verteilungsfunktion berechnet, die die Probleme der KDE-Schätzung überwindet (Abbildung 3D). Diese Funktion ist zwischen 0 und 1 definiert und enthält keine beliebigen Parameter oder Verzerrungen (z. B. Kantenverzerrungen). Fehler- und Konfidenzbänder wurden auf die gleiche Weise wie für die Modulverteilung berechnet. Die kumulative Verteilungsfunktion bestätigte, dass Exozytoseereignisse nicht einer CSR-Verteilung folgten, sondern bei Moduli um 0,7rmaxüberkonzentriert waren. Diese Analyse ermöglichte es uns somit, zelluläre Bereiche zu identifizieren, in denen Clustering stattgefunden hat. Eine interessante Frage, die dieses Ergebnis aufwirft, ist, ob die Überkonzentration bei 0,7rmax auf das Vorhandensein von Klebstoff-/Nichtklebstoffbereichen des ringförmigen Mikromusters oder auf eine Wirkung von peripheren/zentralen Sekretionsbereichen von Zellen zurückzuführen ist.

Da die durchschnittliche Verteilung der Exozytoseereignisse vom CSR-Gehäuse in nicht-klebenden als auch in Klebstoffbereichen abwich, fragten wir uns auch, wo die Exozytosedichte am höchsten war. Die Oberflächendichten der Exozytose in Haft- und Nonadhesionsbereichen wurden berechnet und verglichen. Wir fanden heraus, dass die Oberflächendichte im Haftbereich geringer war als im Nonadhesionsbereich durch eine gepaarte Analyse (Abbildung 3C). Dies könnte durch die starke Abnahme der Exozytose an der Zellperipherie erklärt werden (0,85 – 1rmax, Abbildung 3B).

Figure 1
Abbildung 1. Exozytose aus Lysosomen in hTert-RPE1-Zellen: (A) Ringförmiges Mikromuster (rot) und Klebstoff hTert-RPE1-Zelle transfiziert mit VAMP7-pHluorin (grün) von TIRFM. Der Pfeil zeigt ein Exozytoseereignis. Skalenstäbe = 10 m (B) Kymograph der Exozytose-Ereignisse. Pfeile zeigen Exozytose-Ereignisse. Skala bar = 2 'm, Skalenbalken in der Zeit = 5 s. (C) Normalisiertes Intensitätsprofil der lysosomalen Exozytose aus 22 Zellen. Jeder Punkt ist ein Durchschnitt von mindestens 1.530 Exozytose-Ereignisse. Die Daten werden dargestellt - SEM. (D) Exozytoserate der 22 Zellen. Die durchschnittliche +/- Standardabweichung ist rot dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2. Räumliche Analyse lysosomaler Exozytoseereignisse. (A) Streudiagramm von Exozytoseereignissen während der 5 min Erfassung. Jeder Punkt stellt ein Exozytoseereignis dar. Der Klebebereich ist grau dargestellt. (B) 2D-Kerneldichteschätzung (KDE) des Streudiagramms von A. Die Farbe stellt die lokale Dichte von Exozytoseereignissen dar. (C) Schematische Darstellung möglicher Punktmuster. Die vier Fälle Complete Spatial Randomness (CSR), Clustering, Dispersion und Mixed werden angezeigt, und mehrere nächste Nachbarabstände (NND) werden dargestellt (gestrichelte Linien), um zu zeigen, wie der durchschnittliche NND beim Clustering abnahm und mit der Streuung zunahm. (D) Analyse einer repräsentativen Zelle mit Ripleys K-Funktion. Die rote gestrichelte Linie entspricht "Ripleys K-Funktion - 'r2" für CSR-Ereignisse, der graue Umschlag stellt die geschätzte Güte der Anpassung aus Monte-Carlo-Simulationen mit der gleichen Anzahl von Punkten wie Exozytose-Ereignisse dar(N-Ereignis = 81). Die schwarze Durchzahllinie entspricht "Ripleys K-Funktion – 'r2" für beobachtete Exozytose-Ereignisse(N-Ereignis = 81). Seine positive Abweichung von der roten Kurve von der grauen Hüllkurve zeigt die Clusterbildung von Exozytoseereignissen an. Ripleys K-Funktion wurde normalisiert, um einen maximalen Wert von 1 zu haben. (E) Analyse des nicht klebenden Bereichs derselben Zelle mit Ripleys K-Funktion wie in D. Die positive Abweichung von der roten Kurve außerhalb der grauen Hüllkurve zeigt eine Clusterung von Exozytoseereignissen im nicht klebenden Bereich an. (F) Vergleich der durchschnittlichen NND-Verteilung von einer repräsentativen Zelle (rote Linie) mit dem KDE des CSR aus Monte-Carlo-Simulationen (blaue Kurve). Der P-Wert wurde als Prozentsatz der simulierten Werte berechnet, die extremer waren als der beobachtete Wert. (G) P-Wert-Histogramm aus dem NND-Test erhalten wie in F für n = 26 Zellen. Der Peak bei niedrigen P-Werten bedeutet, dass die Nullhypothese "Exozytose folgt CSR" mit einem Kolmogorov-Smirnov-Test abgelehnt wurde, was darauf hindeutet, dass die lysosomale Exozytose nicht CSR war. (H) Box-Plot des durchschnittlichen NND aus Exozytose-Ereignissen in nicht-klebenden Bereichen (weiß) und Gesamtzellbereichen (grau). Die beiden Datenpunkte aus derselben Zelle werden durch eine Linie verbunden. Der durchschnittliche NND war im nicht-klebenden Bereich größer, p < 0,001 mit einem gekoppelten Wilcoxon-Test (n = 25 Zellen), was auf deutlich weniger Clustering im nicht-klebstoffen Bereich hindeutet. (I) Gleich g für den nicht klebenden Bereich für n = 26 Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3. Räumliche Analyse von gepoolten lysosomalen Exozytoseereignissen: (A) Histogramm der Exozytoseereignisse einer repräsentativen Zelle während einer 5 min Erfassung mit n = 161 Exozytoseereignissen in Abhängigkeit vom normalisierten Modul; 0 stellt das Zellenzentrum und 1 die Zellperipherie dar. Die Klebefläche der Zelle ist grau dargestellt und entspricht Moduli von 0,65–1 für die dargestellten Zellen. Es gibt einen Spitzenwert am Anfang der Klebefläche um Moduli zwischen 0,6 und 0,7. (B) KDE der Exozytoseereignisse in Abhängigkeit vom normalisierten Modul für n = 22 Zellen mit 56 Ereignissen in jeder Zelle; 0 stellt das Zellenzentrum und 1 die Zellperipherie dar. Die durchschnittliche Klebefläche ist grau dargestellt und entspricht im Durchschnitt Moduli von 0,61–1. Die gestrichelte blaue Kurve ist die theoretische Kurve, die im Fall von CSR erwartet wird. Diese theoretische Kurve wird von einem Umschlag begleitet, der die 1.-99. Perzentile von CSR darstellt, die mit der Monte-Carlo-Simulation erhalten wurden. Die KDE-Kurve aus den beobachteten Daten ist rot und wird von einem Fehlerband begleitet, das durch Bootstrapping generiert wird. Die Klebefläche ist in grau +/- SEM. (C) Gepaarte Analyse der Oberflächendichten in Haftungs- und Nonadhesionsbereichen. Die Exozytose-Oberflächendichte wurde als Anzahl der Ereignisse pro normalisierter Fläche und pro Sekunde berechnet. Hier* *p < 0,05 aus einem gekoppelten Studenten-T-Test (n = 22 Zellen). Die Normalität wurde zuvor durch einen Shapiro-Wilk-Test getestet. (D) Kumulative Verteilungsfunktion der Daten in B (rote Linie) und aus Monte Carlo CSR-Simulationen (gepunktete blaue Linie). Umschläge wurden wie in Bgeneriert. Beachten Sie, dass die rote Linie von der theoretischen CSR bei etwa 0,7rmax.abweicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Wir überwachten Exozytose-Ereignisse aus dem lysosomalen Fach durch TIRFM-Livezellbildgebung von VAMP7-pHluorin in ringförmigen mikromusternormalisierten Zellen und führten eine strenge statistische Analyse der räumlichen Parameter von Exozytoseereignissen durch. Unter Verwendung der transformierten Ripley-Funktion K und eines statistischen Tests auf der Grundlage der nächsten Nachbardistanz bestätigten wir, dass die Sekretion von Lysosomen kein zuzufälliger Prozess ist8,9. Beide statistischen Analysen zeigten überzeugend, dass Exozytose-Ereignisse Clustering aufweisen (Abbildungen 2D und 2G). Unter Anwendung ähnlicher Werkzeuge auf den nicht klebenden Zellbereich fanden wir heraus, dass Exozytoseereignisse auch in nicht klebenden Bereichen gruppiert sind (Abbildungen 2E und 2I). So sind Adhäsionsmoleküle, die zuvor berichtet wurden, um Clustering6 zu ermöglichen, nicht die einzigen Strukturen, die sekretore Hot Spots an der Plasmamembran induzieren können. Die Zellhaftung verbesserte jedoch die Clusterbildung: Die durchschnittliche Entfernung des nächsten Nachbarn zwischen Exozytoseereignissen war in nicht-klebstoffen Bereichen signifikant größer(Abbildung 2H). Konsequenterweise identifizierte unsere Analyse auf Basis der Kerneldichteschätzung und der kumulativen Verteilungsfunktion angereicherte Bereiche der Exozytose, die sich an der Grenze zwischen den Klebstoff- und nicht-klebstoffen Bereichen in ringförmigen Mikromusterzellen befanden. Es ist mehr Arbeit erforderlich, um die molekularen Mechanismen zu bestimmen, die dem Clustering zugrunde liegen, wie z. B. Die Haftung oder eine spezifische Ausrichtung von Lysosos auf diese Region. Interessanterweise beobachteten wir eine hohe Heterogenität der Exozytoserate über hTERT-RPE1-Zellen (Standardabweichung von 0,15 Hz bei einer durchschnittlichen Exozytoserate von 0,28 Hz, Abbildung 1D), was darauf hindeutet, dass die Sekretion von Lysosomen eine hohe interzelluläre Variation aufweist. Daher sollten Subpopulationsanalysen bei künftigen Arbeiten berücksichtigt werden. Es wäre besonders interessant zu untersuchen, ob diese Variation die Vielfalt der lysosomalen Kompartimente, die Unterschiede in den Ladungen oder die Abhängigkeit von Exozytosemaschinen widerspiegelt.

Diese Ergebnisse veranschaulichen, wie statistische Werkzeuge eingesetzt werden können, um räumliche Parameter verschiedener biologischer Prozesse zu untersuchen. Darüber hinaus erleichtern Mikromuster die Unvoreingenommenheit der Zellhaftung mit Hilfe verschiedener Mikromustergeometrien (z. B. ringförmig gegen scheibenförmig). Insbesondere die Verwendung von runden Formen erleichtert Analysen, da Polarkoordinaten eingesetzt werden können. Da statistische Tools eine bestimmte Datenmenge erfordern, um aussagekräftig zu sein, wurden Zellen mit mehr als 30 Ereignissen für unsere Analyse verwendet. Es besteht jedoch die Möglichkeit, dass Zellen mit 30 oder weniger Ereignissen sinnvoll sind. Daher könnten Samplingzellen mit 30 oder weniger Ereignissen durchgeführt werden, um genügend Ereignisse für die Analyse zu erhalten, um festzustellen, ob dies der Fall ist. Ebenso ist es schwierig abzuschätzen, wie viele Zellen analysiert werden sollten, insbesondere wenn es eine starke interzelluläre Variation gibt. Eine Möglichkeit, dies zu umgehen, besteht darin, nach dem Zufallsprinzip die gleiche Anzahl von Ereignissen aus jeder Zelle auszuwählen, um jeder Zelle beim Poolen das gleiche statistische Gewicht zugeben. Wir empfehlen jedoch, Analysen an weniger als 15 Zellen vorsorglich durchzuführen. Da die durchschnittliche Verteilung von gepoolten Zellen nicht durch Güte-von-Fit-Tests (z.B. Kolmogorov-Smirnov) genau getestet werden kann, haben wir eine von Pecot et al. vorgeschlagene Teststatistik verwendet, die den Unterschied in den Variationen der Populationen misst17. Obwohl dieser Test es uns ermöglichte, einen statistisch signifikanten Unterschied in den Variationen der durchschnittlichen Verteilungen zu finden, vermuten wir, dass dieser Test eine geringe Empfindlichkeit aufweist, da das P-Werthistogramm nicht flach war (d. h. eine gleichmäßige Verteilung zeigte), wenn man verschiedene CSR-Simulationen für p-Werte nahe 1 vergleicht. Daher muss dieses statistische Verfahren möglicherweise verbessert werden.

Ein Nachteil unserer Analysen ist die manuelle Erkennung von Exozytoseereignissen, die die Geschwindigkeit der Analyse drastisch reduziert. Einschränkungen bei der automatischen Erkennung sind häufig auf eine starke Heterogenität in dem einzigartigen und einfachen Parameter zurückzuführen, der analysiert wird (z. B. Intensität von Exozytoseereignissen). Neuronale Netzwerke können potenziell leistungsfähig für die automatische Erkennung sein, da sie trainiert werden können, um viele Funktionen zu erkennen.

Die hier vorgestellte Analyse kann auf andere dynamische Prozesse angewendet werden, die von TIRFM beobachtet werden, wie z. B. die Sekretion aus anderen Fächern und die Verteilung der Membranmikrodomäne oder Antigendarstellung. Ähnliche Analysen können auch auf feste Zellen angewendet werden, um die räumliche Verteilung von Proteinen zu untersuchen. Wir hoffen, dass unsere Arbeit das wachsende Interesse an räumlicher Verteilungsanalyse in der Zellbiologie steigern wird.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir würdigen Thierry Galli (Center of Psychiatry and Neurosciences, INSERM) für die Bereitstellung des VAMP7-pHluorin-Plasmids. Wir danken Tarn Duong für die Beratung zur statistischen Analyse und den Mitgliedern des GOUD-Labors für fruchtbare Diskussionen. Die Autoren würdigen die Cell and Tissue Imaging Facility (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg und PICT-IBiSA @Pasteur) und das Nikon Imaging Center, Institut Curie (Paris), Mitglied der französischen Nationalen Forschungsinfrastruktur France-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. wurde von der Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) unterstützt und P.M. erhielt Mittel aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skodowska-Curie-Zuschussvereinbarung Nr. 666003. Diese Arbeit wurde durch Stipendien von INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), dem Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) und Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) sowie dem Centre National de la Recherche Scientifique und Institut.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chamlide Magnetic Chamber Chamlide
DMEM/F12 Gibco 21041-025
Fibrinogen Molecular Probes, Invitrogen F35200
Fibronectin bovine plasma Sigma F1141
HEPES (1M) Gibco 15630-056
hTert RPE1 cell line https://www.atcc.org
ImageJ http://rsbweb.nih.gov/ij/ n/a Authored by W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfection reagent Polyplus 114-07
Penicilin/Streptomycin Gibco 15140-122
Photomask Delta Mask
PLL-g-PEG solution Surface Solutions PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software https://www.r-project.org/ n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X) Gibco 12605-010
UV ozone oven Jelight Company Inc 342-220
VAMP7-pHFluorin plasmid n/a n/a Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis.
J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200.
Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis.
Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.

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References

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Biologie Ausgabe 163 Mikromuster Lysosom Exozytose TIRFM CSR VAMP7
Quantifizierung der raumzeitlichen Parameter der zellulären Exozytose in mikrogemusterten Zellen
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Lachuer, H., Mathur, P., Bleakley, K., Schauer, K. Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (163), e60801, doi:10.3791/60801 (2020).

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